專利名稱：：用于dna氧化損傷防護的中藥制劑、制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于中藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種中藥制劑、制備方法及其應(yīng)用，尤其涉及一種用于DNA氧化損傷防護的中藥制劑、制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
："DNA氧化損傷是一切損傷之母"，機體的代謝每時每刻都有氧自由基產(chǎn)生，據(jù)報道,人體吸入的氧氣中約有2%在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為活性氧自由基(ROS),過量的ROS能損傷脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA等多種生物大分子,破壞機體正常的生理過程,據(jù)估計，包括癌癥、心腦血管疾病等在內(nèi)的約90%的疾病發(fā)生與自由基有關(guān)。羥自由基和單線態(tài)氧可以攻擊DNA鏈上的鳥嘌呤堿基使C-8位發(fā)生羥化而生成加合物8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-2，-deoxyguanosine,8-OHdG)，后者是DNA氧化損傷的主要產(chǎn)物之一。在復(fù)制過程中,DNA鏈上8-OHdG可以與C以外的其它堿基配對形成點突變,其中GC—TA突變的發(fā)生已為大量研究所證實,并被認為是氧化應(yīng)激因素致癌、致突變的主要機理之一。正常情況下，機體可通過自身修復(fù)機制及時將受損的DNA分子修補，從而維持遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性，8-OHdG主要在8—羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶(human8-oxoguanineDNAglycosylasehOGGl)等酶的作用下從DNA鏈上切除并重新?lián)饺胝５镍B嘌呤堿基,而切下的8-OHdG則可入血經(jīng)尿液排出體外。如果機體細胞修復(fù)8-OHdG的能力降低或喪失，就可能使這種個體罹患腫瘤的風險增高。目前機體8-OHdG水平已被廣泛接受為DNA氧化損傷的標志物,并用來估計氧化應(yīng)激相關(guān)癌癥發(fā)生的危險性。鑒于8-OHdG的強致突變作用，人們己將其作為腫瘤發(fā)生過程中氧化損傷的敏感標志物。一旦氧化與抗氧化平衡失衡，細胞中的DNA將會因氧化應(yīng)激而受損,最終導致疾病的發(fā)生。如何阻斷DNA氧化損傷，提高機體DNA氧化損傷修復(fù)酶的活力，減少DNA氧化損傷及其基因突變在體內(nèi)的蓄積，從而減低患癌的可能性，已成為腫瘤預(yù)防研究的一個重要方面。正常情況下，機體可通過自身修復(fù)機制及時將受損的DNA分子修補，從而維持遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性；但是，當DNA分子受到嚴重損傷或反復(fù)遭到損害時，機體細胞的自身修復(fù)系統(tǒng)就不能及時地加以修復(fù)，即使在添加脫氧嘌呤和噴啶核苷底物或補充核酸內(nèi)切酶，也不能有效地促進DNA的修復(fù)。由此可見，研究如何降低有害物質(zhì)的危害和減少DNA損傷比研究促進DNA損傷修復(fù)更為重要。因此，探討抗氧化與遺體穩(wěn)定的關(guān)系已成為近年來分子生物學、毒理學與抗衰老醫(yī)學領(lǐng)域的研究重點之一。DNA氧化損傷與衰老有密切的關(guān)系，衰老是一個極為復(fù)雜的過程，許多學者已經(jīng)注意到氧化磷酸化的老年變化。在電子傳遞呼吸鏈中產(chǎn)生的自由基可以導致線粒體DNA損傷，以及使一些線粒體DNA的包涵體進入細胞核基因組，體內(nèi)抗DNA氧化損傷能力的減退與衰老有密切關(guān)系?？寡趸烙w系的生理和藥理功能主要體現(xiàn)在以下三個環(huán)節(jié)預(yù)防、阻斷和修復(fù)。第一道防御體系是預(yù)防形成活性自由基組分的物理和生化中間體;第二道防線是阻斷損傷和轉(zhuǎn)變對細胞敏感的氧化物生成反應(yīng)；第三道防線是修復(fù)更新。研究表明，人體除了酶系統(tǒng)如SOD、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等能有效地清除氧自由基外，目前常用的抗氧化營養(yǎng)素或抗氧化劑則主要作為第一、第二道防御體系發(fā)揮抗氧化作用?？寡趸瘎┓N類很多，只有在時空上互相配合、互相補充、各施所長，以維持總抗氧化能力的情況下才能發(fā)揮整體防御功能；過度防御弊多利少，而且一些抗氧化劑同時也是促氧化劑，需要平衡其用量才能起到抗氧化作用。另外，現(xiàn)有的DNA氧化損傷防護研究較少，主要側(cè)重于第一道防御體系作用的論證，幾乎沒有涉及利用DNA氧化損傷的分子生物標志物8-OHdG的報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于，提供一種改善氧化應(yīng)激狀態(tài)下機體的抗DNA氧化防御功能、具有抗氧化性、防護效果好的用于DNA氧化損傷防護的中藥制劑。本發(fā)明進一步要解決的技術(shù)問題在于，提供一種能原料豐富、工藝簡單的用于DNA氧化損傷防護的中藥制劑的制備方法。本發(fā)明另外要解決的技術(shù)問題在于，提供一種中藥制劑在DNA氧化損傷的輔助治療、制備抗衰老藥品與防癌保健品上的應(yīng)用。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是一種用于DNA氧化損傷防護的中藥制劑，是由以下重量份數(shù)的原料制成山稔子3060份、銀杏2040份、靈芝1030份、火麻仁820份。用于DNA氧化損傷防護的用于DNA氧化損傷防護的中藥制劑，優(yōu)選由以下重量份數(shù)的原料制成山稔子3545份、銀杏2535份、靈芝1525份、火麻仁815份。用于DNA氧化損傷防護的中藥制劑，是由山稔子、銀杏、靈芝、火麻仁為原料制成的藥劑學上允許的所有口服劑型。用于DNA氧化損傷防護的中藥制劑，是由山稔子、銀杏、靈芝、火麻仁為原料的水浸提取后制成的片劑、顆粒劑、膠囊劑或口服液。用于DNA氧化損傷防護的中藥制劑的制備方法為將山稔子、銀杏、靈芝、火麻仁分別水浸泡后，靈芝先煎煮，再加入其他原料煎煮，過濾，濾液濃縮，再次過濾得到中藥粗提物，備用。所述用于DNA氧化損傷防護的中藥制劑的制備方法為將山稔子、銀杏、靈芝、火麻仁分別水浸泡30分鐘1小時，先將靈芝加熱煮沸后維持2030分鐘，再加入其他原料加熱至沸騰后維持30分鐘1小時，將藥液過濾，濾液繼續(xù)加熱濃縮，再次過濾得到中藥粗提物，精制后再制成口服劑型。所述的中藥制劑可在DNA氧化損傷的輔助治療、制備抗衰老藥品與防癌保健品上具有應(yīng)用價值。本發(fā)明采用山稔子、銀杏、靈芝、火麻仁為原料。山稔子(FructusRhodomyrti)為雙子葉植物藥桃金娘科植物——桃金娘的果實，野生山稔子盛產(chǎn)廣東、廣西等地。山稔子含有的黃酮甙、酚類、維生素C等，為抗氧化活性成分。銀杏(GinkgoBiloba)又名白果，富含銀杏總黃酮、萜類、酚類、硒、維生素C等，抗氧化活性成分豐富。靈芝(GanodermaLucidum)富含硒、靈芝多糖肽、三萜類化合物、核苷類、甾醇類、生物堿類、呋喃衍生物、氨基酸多肽類、脂肪酸等?？寡趸钚猿煞重S富?；鹇槿?FructusCannabis)為桑科植物大麻的成熟果實，以長壽鄉(xiāng)廣西巴馬產(chǎn)火麻仁最富盛名?；鹇槿屎鹇榉印⒒鹇槎?、火麻黃酮、維生素E，脂肪酸等。具有特殊的抗氧化活性成分。本發(fā)明結(jié)合利用單細胞凝膠電泳技術(shù)和DNA氧化損傷的分子生物標志物8-OHdG對本發(fā)明的中藥制劑在DNA氧化損傷防護方面進行了實驗論證通過小鼠脾淋巴細胞體外抗氧化實驗，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的中藥制劑具有較強抗氧化作用，明顯地降低和延遲DNA氧化損傷，起到了保護作用，并對DNA斷鏈具有抑制作用。該中藥制劑可作用于氧化損傷的不同環(huán)節(jié)，能維持DNA雙鏈完整性對抗DNA氧化損傷。通過小鼠體內(nèi)抗氧化實驗，分析生化指標與生物標志物，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明中藥制劑可以改善氧化應(yīng)激狀態(tài)下小鼠的一般狀況，提高血液和組織中TAP和GSH含量，抑制組織中MDA和8-OHdG的生成，在不同程度上增強機體抗氧化防御機制，并可能增強DNA修復(fù)功能，減少氧化應(yīng)激造成的DNA損傷。本發(fā)明動物體外及動物體內(nèi)試驗均表明，所提供的中藥制劑具有較強的抗氧化作用，具有DNA氧化損傷防護與修復(fù)作用，中藥制劑保護DNA的總體效果顯著?？梢宰鳛檠趸瘬p傷高危人群預(yù)防相關(guān)慢性疾病的保健藥物或治療用輔助藥物。本發(fā)明采用山稔子、銀杏、靈芝、火麻仁為原料，制成藥劑學上所接受的所有口服劑型，例如片劑、顆粒劑、膠囊劑、口服液、散劑、酒劑等，產(chǎn)品多樣，能滿足不同人群的需要。本發(fā)明制備工藝簡單，常先用煎煮提取中藥粗提物，再精制成其他各種劑型，方便實用，有利于工業(yè)推廣。下面將結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步說明，附圖中圖1是正常小鼠脾淋巴細胞的在激光共聚焦顯微鏡下的熒光圖像；圖2是小鼠脾淋巴細胞與25Kimol/LH202作用20min后的在激光共聚焦顯微鏡下的熒光圖像；圖3是小鼠脾淋巴細胞與50nmol/LH2O2作用20min后的在激光共聚焦顯微鏡下的熒光圖像；圖4是小鼠脾淋巴細胞與125拜ol/L&02作用20min后的在激光共聚焦顯微鏡下的熒光圖像；圖5是體外實驗中，陰性對照組的小鼠脾淋巴細胞在激光共聚焦顯微鏡下的熒光圖像；圖6是體外實驗中，陽性對照組的小鼠脾淋巴細胞在激光共聚焦顯微鏡下的熒光圖像；圖7是體外實驗中，在80倍稀釋中藥制劑保護下，小鼠脾淋巴細胞在激光共聚焦顯微鏡下的熒光圖像；圖8是體外實驗中，在40倍稀釋中藥制劑保護下，小鼠脾淋巴細胞在激光共聚焦顯微鏡下的熒光圖像；圖9是體外實驗中，在20倍稀釋中藥制劑保護下，小鼠脾淋巴細胞在激光共聚焦顯微鏡下的熒光圖像；圖10是體外實驗中，在10倍稀釋中藥制劑保護下，小鼠脾淋巴細胞在激光共聚焦顯微鏡下的熒光圖像。具體實施例方式本發(fā)明實施例19中選用以下重量份數(shù)的原料:<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>用于DNA氧化損傷防護的中藥制劑的制備方法為選用上述表格中重量份數(shù)的原料山稔子、銀杏、靈芝、火麻仁干品，水浸泡30分鐘1小時，對不同的實施例可選擇30、40、50、60分鐘來浸泡，先對靈芝加熱煮沸2030分鐘后，靈芝加熱煮沸的時間根據(jù)不同實施例可選擇20、25、28、30分鐘，再加入其他原料加熱至沸騰后維持30分鐘1小時，全部原料加熱煮沸的時間不同實施例可選擇30、40、50、60分鐘，將藥液過濾，濾液繼續(xù)加熱濃縮，再次過濾得到中藥粗提物，該藥物粗提取物經(jīng)過正常的滅菌可以直接作為藥物，也可以經(jīng)過進一步加工如提純、制粒、噴霧干燥等制成其它劑型的藥物,如片劑、顆粒劑、口服液等等。目前對DNA氧化損傷的檢測可分為直接和間接兩方面的檢測，直接檢測DNA損傷比較常用的方法是測量DNA單鏈斷裂，即彗星試驗。間接檢測DNA氧化損傷較常用的指標是測定血清與尿中8-羥基脫氧鳥苷(8-OH-dG)，正常情況下，8-羥基脫氧鳥苷在DNA修復(fù)機制的作用下被及時剪切，形成8-羥基脫氧鳥苷隨尿液排出體外。所以血清與尿中8-OH-dG可作為DNA氧化性損傷的分子生物學標記物。本發(fā)明的功能驗證以中藥原料的粗提取物進行。實驗材料1、天然植物山稔子、銀杏、靈芝、火麻仁(干品)由廣州中醫(yī)藥大學提供。2、制備方法山稔子40g、銀杏30g、靈芝20g、火麻仁10g用等體積去離子水浸泡30分鐘，靈芝先加熱煮沸30分鐘，再加入其他原料加熱至沸騰后維持30分鐘，將藥液過濾，此后繼續(xù)加熱濃縮至100ml，再次過濾，裝入無菌玻璃瓶中，4QC保存，此時得到藥物粗提取物濃度為lg/ml。該濃度為本發(fā)明實驗中所用濃度，具體藥物濃度可以根據(jù)具體的藥用標準擴大或縮小。3、實驗動物體重18-22g昆明種小白鼠，清潔級，雌雄兼用。由南方醫(yī)科大學醫(yī)學實驗動物中心提供。4、主要試劑和和儀器設(shè)備低熔點瓊脂糖、Triton-X100、十二烷基肌氨酸鈉均購自Sigma公司(USA)，正常熔點瓊脂糖為Promega公司產(chǎn)品，RPMI1640培養(yǎng)基、Tris購自GibcoBRL公司(USA)，新生小牛血清購自北京邦定公司，溴化乙錠購自Fluka公司，H202(分析純)購自中國藥品生物制品檢定所，其它常用試劑均為國產(chǎn)分析純。抗8-OHdG和8-OHdGELISA檢測試劑盒購自日本老年醫(yī)學研究所；還原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、和總抗氧化能力(TAP)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。激光共聚焦顯微鏡為Leica公司(USA)產(chǎn)品，PAC200型轉(zhuǎn)移電泳儀為BIO-RAD公司(USA)產(chǎn)品，DYY-III型轉(zhuǎn)移電泳槽為(北京六一儀器廠)產(chǎn)品。LY/03-2型臭氧發(fā)生器(清華大學臭氧技術(shù)開發(fā)中心)；SY-2型液晶顯示體溫計(北京師范大學產(chǎn)品)；臭氧檢測管(勞動部毒物檢測技術(shù)指導站)。一、體外抗氧化實驗1、天然植物的配制及使用劑量本發(fā)明中藥制劑的制備原料干品經(jīng)打碎—浸泡—靈芝先煮沸30分鐘，再加入其他原料煮沸30分鐘—過濾—濃縮—再次過濾獲得的粗提提取物。實驗前用磷酸鹽緩沖溶液(PBS溶液)配置成lg/ml的儲存液，沸水浴30min后，4^低溫保存?zhèn)溆?。實驗時再根據(jù)需要配成合適濃度。體外實驗中，山稔子、銀杏、靈芝、火麻仁按干燥重量4:3:2:1組合，實驗濃度為lg/ml。在整個體外實驗過程中，以蒸餾水作空白對照，并以公認的抗氧化劑維生素C作為陽性對照(0.1g/m)。2、DNA氧化損傷的抑制實驗脾淋巴細胞的提取和培養(yǎng)實驗小鼠斷頭處死，充分放血以減少臟器積血。無菌分離完整脾臟，置37GC預(yù)溫的PBS溶液中，沖去浮血，剝除脾包膜及脂肪成分，將脾組織剪成大小lmmS小塊，在胰酶中消化12min，然后置于PBS液中的金屬濾網(wǎng)上(孔徑為200目)，用一次性注射器針栓輕輕將組織磨碎，使細胞從網(wǎng)眼濾出。將細胞懸液靜置10min后，1000r/min離心35min，棄上清液，用0.01mol/LTris-NH4C1裂解紅細胞lmin，再用PBS溶液離心洗滌，最后將細胞懸浮于含10。/。小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，臺盼蘭染色，活細胞計數(shù)〉95%。將脾細胞調(diào)節(jié)成5xl(^10々ml的密度，置37^、5%(^02的孵箱中孵育。不同濃度11202對脾淋巴細胞DNA氧化損傷的檢測原代培養(yǎng)24h的脾淋巴細胞懸液，1000r/min離心35min，棄上清液，用不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，將脾細胞調(diào)節(jié)成5xlOVml的密度，臺盼蘭染色，活細胞計數(shù)〉95%。取滅菌離心管12只，各加入脾細胞懸液lml，隨機分為4組，每組3復(fù)管。各管分別加入不同濃度的H202溶液25pl，使其終濃度分別25nmol/L、50pmol/L和125pmol/L，空白對照組加入等量的PBS溶液，4Gc處理20min，收獲細胞進行單細胞凝膠電泳(SCGE)。本發(fā)明中藥制劑對脾淋巴細胞DNA氧化損傷的檢測同法制備原代培養(yǎng)24h的脾淋巴細胞，調(diào)節(jié)密度為lxl07/ml。另取滅菌離心管18只，各加入脾淋巴細胞懸液lml,隨機分為空白對照組，&02染毒組和本發(fā)明處理組I、II、III、IV，每組3管。本發(fā)明處理組加入不同濃度的本發(fā)明的提取液lml,空白對照組和H202染毒組以RPMI1640培養(yǎng)基代替，置37GC、5%C02的孵箱終孵育60min，再加入50pmol/L的11202溶液25^1，空白對照組以PBS溶液代替，4GC下染毒20min，立即收獲細胞，進行SCGE。單細胞凝膠電泳采用經(jīng)改良的Singh等方法。制片，在堿性條件下細胞裂解、堿處理及電泳，中和、EB染色和閱片。閱片時將載玻片置于激光共聚焦顯微鏡下，使用488nm的激發(fā)波，放大10x20倍。隨機數(shù)100個細胞，計算DNA遷移的細胞率(拖尾率)，并測量總彗星長度(彗星電泳方向的最大長度)，以表示細胞拖尾的長度。實驗結(jié)果不同濃度H202溶液對脾淋巴細胞DNA的氧化損傷作用圖14為原代培養(yǎng)的小鼠脾淋巴細胞經(jīng)不同濃度11202損傷一定時間，在堿性條件下電泳，激光共聚焦顯微鏡下采集的熒光圖像。在圖中淋巴細胞的DNA被溴化乙錠染成橘紅色，沒有發(fā)生DNA斷裂的細胞只有一個致密的圓形頭部，損傷細胞DNA遷移形成彗星樣拖尾；如圖l所示為正常小鼠脾淋巴細胞可見少量彗星樣細胞；如圖2所示，脾淋巴細胞與25pmol/LH202作用20min后，彗星樣拖尾細胞明顯增多；如圖3、4所示，隨著11202濃度增加到50和125pmol/L，彗星細胞的尾長明顯增長。用激光共聚焦顯微鏡的圖像處理分析功能，測量總彗星長度，評價DNA的損傷程度，結(jié)果顯示11202處理的各組，彗星細胞總長明顯大于空白對照組(P<0.01)，見表1。表lH202誘發(fā)脾淋巴細胞DNA損傷的單細胞凝膠電泳結(jié)果(n=100)組別Quantityofcometcells/%Cometlength/(Am空白對照組H20225拜ol/LH20250nmol/LH202125pmol/L15.088.0*100.0*100.0'^=298.528.12±6.7542.89±9.25*50.45±8.64*53.28±9.58*F=259.2與空白對照組比較，'P<0.01本發(fā)明中藥制劑對脾淋巴細胞DNA氧化損傷的保護脾淋巴細胞經(jīng)中藥制劑預(yù)處理lh后，加入50pmol/LH2O2作用20min，立即收獲細胞進行單細胞凝膠電泳，見表2、圖510。表2中藥制劑對H202所致脾淋巴細胞DNA氧化損傷的影響(n=100)組別Quantityofcometcells/%Cometlength/|xm陰性對照組(A)陽性對照組(B)本發(fā)明(lg/ml)稀釋倍數(shù)80倍(C)40倍(D)20倍(E)10倍(F)16.098.085.0*62.0"33.0**45.0**5C'=198.722.73±4.5449.23±7.2742.51±8.33*35.29±7.81"27.45±4.65*'32.36±8.12"F=163.5與陽性對照組相比，'P<0.05，"P<0.01圖510中顯示的為本發(fā)明中藥制劑對H202所致脾淋巴細胞DNA損傷的抑制作用的情況。其中圖5為陰性對照組，圖6為陽性對照組，圖710分別為本發(fā)明中藥制劑在稀釋80、40、20、IO倍的保護組。結(jié)果顯示，不同濃度的中藥制劑均能顯著降低11202對脾淋巴細胞DNA的損傷，顯示一定的保護作用，其中稀釋倍數(shù)10-80倍的濃度范圍內(nèi)，隨著中藥制劑濃度的增加(稀釋倍數(shù)減少)，抗損傷作用加強，以稀釋20倍保護效果最好；而隨著提取物濃度的進一步增加，彗星細胞的拖尾率和總彗星長度又有所增加，但與陽性對照組相比，仍有顯著性差異(P<0.01)，二、體內(nèi)抗氧化實驗1、實驗原理與觀察分析指標生物機體針對代謝過程中產(chǎn)生大量的活性氧自由基代謝物(reactiveoxygenspecies,ROS)形成了一套較為完整的抗氧化防御體系，以利于機體在有氧環(huán)境下生存。某些外來化合物能激活并與體內(nèi)抗氧化防御體系一起起到抗氧化保護DNA的作用?？寡趸烙w系的生理和藥理功能主要體現(xiàn)在以下三個環(huán)節(jié)預(yù)防、阻斷和修復(fù)。第一道防御體系是預(yù)防形成活性自由基組分的物理和生化中間體；第二道防線是阻斷損傷和轉(zhuǎn)變對細胞敏感的氧化物生成反應(yīng)；第三道防線是修復(fù)更新。研究表明，人體除了酶系統(tǒng)如SOD，過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等能有效地清除氧自由基外，抗氧化營養(yǎng)素則可作為第二道防御體系發(fā)揮抗氧化作用。本發(fā)明的DNA氧化損傷防護作用可作為第二、第三道防御體系發(fā)揮抗氧化作用。谷胱甘肽(GSH)是一種低分子清除劑，它不僅是組織中主要的非蛋白巰基化合物，還是GSH—PX和GST兩種酶類的底物，是它們分解過氧化物所必須的組分，GSH還能穩(wěn)定含巰基的酶，并預(yù)防血紅蛋白及其他輔助因子受到氧化損傷，因而GSH含量的多少是衡量機體抗氧化能力大小的重要因素。機體代謝過程產(chǎn)生的活性氧能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化，并形成脂質(zhì)過氧化物。其中，部分分解產(chǎn)物能引起細胞代謝及功能障礙，甚至死亡。氧自由基不但通過生物膜中多不飽和脂肪酸的過氧化引起細胞損傷，而且還能通過脂質(zhì)過氧化物的分解產(chǎn)物一起細胞代謝異常。因此，通過檢測MDA的水平可以反映集體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化水平，并間接反映出細胞受損傷的程度。8-OHdG是DNA氧化損傷后堿基修飾的主要產(chǎn)物，作為DNA氧化的標志物，8-OHdG可引起G:C—T:A顛換突變，在細胞癌變和機體衰老過程中發(fā)揮重要作用。目前機體8-OHdG水平已被廣泛接受為DNA氧化損傷的標志物,并用來估計氧化應(yīng)激相關(guān)癌癥發(fā)生的危險性。鑒于8-OHdG的強致突變作用，人們已將其作為腫瘤發(fā)生過程中氧化損傷的敏感標志物?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，隨著年齡增加，機體組織器官中8-OHdG的水平逐漸升高，因此血清中8-OHdG的含量變化可反映機體內(nèi)DNA氧化損傷的情況。生物大分子如DNA的氧化損傷一直是自由基生物學研究的熱點。2、小鼠氧化應(yīng)激模型及DNA氧化指標觀察用體重18-22g昆明種小白鼠建立小鼠氧化應(yīng)激模型，將小鼠隨機分為三個組，設(shè)正常小鼠對照組、氧化應(yīng)激模型組和氧化應(yīng)激模型藥物保護組。除對照組外，另外兩組均吸入臭氧模擬氧化應(yīng)激狀態(tài)。將小鼠在實驗動物中心適應(yīng)12天后，放于半封閉的超凈臺中，將臭氧發(fā)生器放于封閉端一定高度，小鼠置于半開放端，調(diào)節(jié)臭氧發(fā)生器與鼠籠的距離，使鼠籠中心的臭氧濃度高達2mg/m3，每天吸入10小時。通過預(yù)實驗選擇最佳給藥劑量并考慮便于操作，按小鼠體表面積計算小鼠每天攝入藥物量為500mg/kg，每天每只小鼠灌胃量為0.2ml,氧化損傷模型組服用蒸餾水作為對照。實驗開始前及結(jié)束前一天，稱量小鼠體重并測量其肛溫。灌胃開始于臭氧吸入前兩天，并且灌胃時間與臭氧吸入時間錯開4小時，吸入臭氧期間，隨時監(jiān)測臭氧濃度。實驗結(jié)束后，以眼球放血法處死小鼠，收集血清，同時把分離出的肝臟、脾臟和胸腺組織一起凍存于-80GC,待測。將分離得到的部分胸腺和肝臟制備成10%組織勻漿，根據(jù)TAP測定試劑盒、GSH測定試劑盒、MDA測定試劑盒及8-0HdGELASA檢測試劑盒的操作說明，分別測定血清總抗氧化能力(TAP)，胸腺還原型谷胱甘肽(GSH)含量、肝臟組織中丙二醛(MDA)生成量以及血清中8-OHdG的濃度。實驗結(jié)果見表3。表3小鼠體內(nèi)抗氧化指標分析(均值士標準差)GSH(mg/mgMDA(nmol/lOmgTAP(U/ml)8-OHdG(ng/ml)~protein)protein)氧化模型組21.35±1.228.05±0.529.98±1.8552.66±4.13陰性對照組38.67±1.89*3.08±0.17*24.78±2.52*25.02±2.35*本發(fā)明保護組25.21±0.81*3.62±0.28*19.63±1.59*31.45±2.31**與氧化損傷模型組相比P<0.01由表3所示，模型組小鼠的抗氧化能力明顯下降，表現(xiàn)為血清TAP含量從正常對照組的25.56士2.47降至11.33±2.05U/ml，胸腺組織GSH濃度從正常的36.46±2.01減至19.87±1.05mg/mgprotein,而氧化損傷代謝產(chǎn)物含量顯著升高，肝臟組織中脂質(zhì)過氧化物MDA的含量從正常對照的2.80±0.14增至7.66±0.43nmol/10mgprotein,血清中DNA氧化損傷產(chǎn)物8-OHdG含量從正常的23.66士2.00升高至54050士3.91ng/ml。相同條件下，用藥后模型小鼠的抗氧化能力得以明顯改善，其水平高于模型組，如血清TAP含量18.26士1.63U/ml，胸腺組織GSH濃度24.54±0.74mg/mgprotein,肝臟組織MDA的含量3.51土0.22nmol/10mgprotein和血清8-OHdG含量33.29±2.16ng/ml。上述結(jié)果表明被測試的本發(fā)明中藥制劑可以不同程度的逆轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激造成的損傷，并在一定程度上保護了機體的抗氧化防御體系。特別是血清中8-OHdG的含量，本發(fā)明保護組與陰性對照組十分接近，血清中8-OHdG的含量變化可反映機體內(nèi)DNA氧化損傷的總體情況，說明本發(fā)明保護DNA的總體效果顯著。通過上述體內(nèi)外實驗驗證，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明中藥制劑有以下特點一、體外抗氧化作用本發(fā)明中藥制劑具有較強抗氧化作用，明顯的降低和延遲DNA氧化損傷的保護作用，對DNA斷鏈具有抑制作用。該中藥制劑可能作用于氧化損傷的不同環(huán)節(jié)，維持DNA雙鏈完整性對抗DNA氧化損傷。二、體內(nèi)抗氧化作用本發(fā)明中藥制劑可以改善氧化應(yīng)激狀態(tài)下小鼠的一般狀況，提高血液和組織中TAP和GSH含量，抑制組織中MDA和8-OHdG的生成，從而在不同程度上增強機體抗氧化防御機制，并可能增強DNA修復(fù)功能，減少氧化應(yīng)激造成的DNA損傷。中藥制劑保護DNA的總體效果顯著。綜合上述結(jié)果，本發(fā)明的中藥制劑有利于改善氧化應(yīng)激狀態(tài)下機體的抗DNA氧化防御功能，具有抗氧化性，可進一步開發(fā)成抗衰老藥品與防癌保健品。本發(fā)明的中藥制劑主要應(yīng)用人群為老年人群、慢性病患者、亞健康人群、應(yīng)激狀態(tài)者和劇烈運動人員等。另一方面，本發(fā)明中藥制劑的粗提物作為活性成分與其他可接受的輔料或載體組合可以形成新的具有抗DNA氧化功能的抗衰老的保健品，具體可以制成片劑、顆粒劑、膠囊、口服液以及其他劑型等，甚至可以制成保健食品、保健酒，關(guān)于劑型配制方法的介紹很多，可根據(jù)需求進行選擇和制作，本說明書不予贅述。權(quán)利要求1、一種用于DNA氧化損傷防護的中藥制劑，其特征在于，是由以下重量份數(shù)的原料制成山稔子30～60份、銀杏20～40份、靈芝10～30份、火麻仁8～20份。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于DNA氧化損傷防護的中藥制劑，其特征在于，是由以下重量份數(shù)的原料制成山稔子3545份、銀杏2535份、靈芝1525份、火麻仁815份。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于DNA氧化損傷防護的中藥制劑，其特征在于，是由山稔子、銀杏、靈芝、火麻仁為原料制成的藥劑學上允許的所有口服劑型。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于DNA氧化損傷防護的中藥制劑，其特征在于，是由山稔子、銀杏、靈芝、火麻仁為原料的水浸提取后制成的片劑、顆粒劑、膠囊劑或口服液。5、用于DNA氧化損傷防護的中藥制劑的制備方法，其特征在于，將山稔子、銀杏、靈芝、火麻仁分別水浸泡后，靈芝先煎煮，再加入其他原料煎煮，過濾，濾液濃縮，再次過濾得到中藥粗提物，備用。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述用于DNA氧化損傷防護的中藥制劑的制備方法，其特征在于，將山稔子、銀杏、靈芝、火麻仁分別水浸泡30分鐘1小時，先將靈芝加熱煮沸后維持2030分鐘，再加入其他原料加熱至沸騰后維持30分鐘1小時，將藥液過濾，濾液繼續(xù)加熱濃縮，再次過濾得到中藥粗提物，精制后再制成口服劑型。7、權(quán)利要求14所述的中藥制劑在DNA氧化損傷的輔助治療、制備抗衰老藥品與防癌保健品上的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種用于DNA氧化損傷防護的中藥制劑、制備方法及其應(yīng)用，中藥制劑是由以下原料制成山稔子、銀杏、靈芝、火麻仁。中藥制劑的制備方法為將山稔子、銀杏、靈芝、火麻仁分別水浸泡后，靈芝先煎煮，再加入其他原料煎煮，過濾，濾液濃縮，再次過濾得到中藥粗提物，備用。本發(fā)明的中藥制劑有利于改善氧化應(yīng)激狀態(tài)下機體的抗DNA氧化防御功能，具有抗氧化性，可制成抗衰老藥品與防癌保健品。本發(fā)明中藥制劑的粗提物也作為活性成分與其他可接受的輔料或載體組合形成新的具有抗DNA氧化功能的抗衰老的保健品。文檔編號A61K36/185GK101653478SQ20081014248公開日2010年2月24日申請日期2008年8月19日優(yōu)先權(quán)日2008年8月19日發(fā)明者柯躍斌申請人:柯躍斌