專利名稱：：用于口蹄疫的合成肽疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及肽組合物作為免疫原的應(yīng)用，其中包含的每種肽包括一種來(lái)源于口蹄疫病毒(FMDV)VPI衣殼蛋白的目標(biāo)抗原位點(diǎn)，所述抗原位點(diǎn)共價(jià)連接一種輔助T細(xì)胞表位，以及優(yōu)選地，優(yōu)選通過(guò)常規(guī)肽鍵經(jīng)直接合成連接其它免疫刺激序列，用于預(yù)防FMDV感染和根除口蹄疫(FMD)。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及應(yīng)用該肽組合物作為免疫原在動(dòng)物包括豬、牛、羊、山羊、和易感野生動(dòng)物品種中誘導(dǎo)高效價(jià)的多克隆抗體，該抗體能夠在體外中和FMDV的多種株系或血清型，以及應(yīng)用該組合物作為預(yù)防和/或減少不論何種血清型的FMDV感染的發(fā)生率。本發(fā)明還涉及用于該組合物的肽，以及含有一種或多種所述肽或其片段的免疫分析和/或診斷試劑盒。
背景技術(shù)：
：口蹄疫(FMD)是一種最有經(jīng)濟(jì)影響的家畜疾病。偶蹄目偶蹄動(dòng)物，例如牛、豬、羊和山羊易受感染。致病因子，口蹄疫病毒(FMDV)，是小核糖核酸病毒屬家族(其正有義RNA基因組編碼四種衣殼蛋白(VP1-VP4)和非結(jié)構(gòu)多肽)的一種口瘡病毒。圖1示意地顯示了FMDV基因組，衣殼和非結(jié)構(gòu)蛋白的編碼區(qū)，以及蛋白質(zhì)被剪切的加工途徑。FMD隨著感染和接觸動(dòng)物的隔離檢疫和銷(xiāo)毀以及通過(guò)使用化學(xué)滅活的病毒組合物免疫得以控制。配制這種疫苗的重大困難在于FMDV的顯著的抗原多樣性。已經(jīng)描述了七種不同的血清型A、O、C、Asia、和南非型SAT-1、2、和3，它們中的每一種還可以繼續(xù)分成多種亞型。血清型A、O、和Asia型最為常見(jiàn)。血清型A病毒最多變種，具有超過(guò)30中亞型。血清型之間沒(méi)有交叉保護(hù)，因此從感染中恢復(fù)的動(dòng)物或用一種血清型病毒接種的動(dòng)物仍然容易被其它六種血清型的病毒感染。而且，在一種血清型中抗原變異的程度如此之大，以至有效地抗一種亞型的疫苗可能對(duì)同一血清型中的另一種亞型沒(méi)有保護(hù)性。因此，目前的疫苗是基于含有各種參照株系的相關(guān)血清型或亞型的滅活病毒的混合物，所述參照株系通過(guò)監(jiān)測(cè)局部流行中的病毒株系來(lái)確定。需要對(duì)野生分離株包括出現(xiàn)的變異體之間的抗原關(guān)系進(jìn)行周期性監(jiān)視，并且需要能夠用于疫苗制品的病毒，以防止爆發(fā)。因此，目前疫苗的生產(chǎn)需要生長(zhǎng)幾種病毒株系并對(duì)其滅活，同時(shí)確保它們每一種的效力，必須用最新的野生株系周期性重新配制該產(chǎn)品，以防止由于新變異體的出現(xiàn)喪失保護(hù)效力。在面對(duì)抗原變異的情況下，用于維持免疫原功效的制備多病毒株的方法導(dǎo)致制造期間病毒株對(duì)病毒株之間效力及產(chǎn)量的不確定的問(wèn)題。周期性依次改變滅活病毒疫苗的需要在疫苗制造上產(chǎn)生新的缺點(diǎn)。當(dāng)將疫苗改變成適應(yīng)一種新發(fā)展的野生株系引起的爆發(fā)時(shí)，爆發(fā)株系必須經(jīng)人工調(diào)整以使其在組織培養(yǎng)中有效生長(zhǎng)。適應(yīng)組織培養(yǎng)的篩選方法會(huì)導(dǎo)致保護(hù)性免疫原性的減小，導(dǎo)致生產(chǎn)的進(jìn)一步延遲。(Barteling和Breeswijk,疫苗，1991;9:75-88;Brown,疫苗，1992;10:1022-1026)。滅活FMDV疫苗的其它明顯缺點(diǎn)與生物安全性和穩(wěn)定性問(wèn)題有關(guān)。病毒必須在高度密封的設(shè)備中生產(chǎn)，以防止污染周?chē)h(huán)境。這種潛在的危害將有資格的疫苗供應(yīng)商限制為極少的數(shù)目，并限制了疫苗的可用供應(yīng)性，并妨礙世界上以前不存在FMDV的區(qū)域爆發(fā)FMD時(shí)的應(yīng)變能力。這種滅活病毒制品的無(wú)害性不能絕對(duì)保證。最近歐洲的幾起疾病事件追溯到不完全滅活病毒。這種危害導(dǎo)致無(wú)此疾病的區(qū)域不推薦使用該類(lèi)疫苗，導(dǎo)致以前未被感染的區(qū)域缺乏免疫保護(hù)。產(chǎn)品的不穩(wěn)定性及各批產(chǎn)品間的變異性來(lái)源于滅活病毒疫苗的復(fù)雜及不明確的組成。這些復(fù)雜混合物必須在固定時(shí)間進(jìn)行檢査，以確保免疫效力。在某些國(guó)家，這可以每年進(jìn)行三次。需要一種冷箱以維持這種不穩(wěn)定產(chǎn)品的效力，通常這在某些國(guó)家難以得到保證。存在有害效果的可能性是這種復(fù)雜組合物的另一種結(jié)果。過(guò)敏性休克雖是不常發(fā)生的問(wèn)題，但一旦發(fā)生就足以造成嚴(yán)重問(wèn)題。這些缺點(diǎn)已由Brown(《小核糖核酸病毒感染和檢測(cè)的分子方面》(MolecularAspectsofPic或navirusInfectionandDetection)第11章，Semler和Ehrenfeld編，美洲微生物協(xié)會(huì)Washington,DC,1989,pp179-191)綜合回顧。由于目前FMDV疫苗的復(fù)雜組成導(dǎo)致的其它缺點(diǎn)是它不能通過(guò)血清學(xué)實(shí)驗(yàn)分辨被免疫動(dòng)物和己感染動(dòng)物(Lubroth等，疫苗，1996:14:419-427)。基于位點(diǎn)特異性免疫原的疫苗將有利于設(shè)計(jì)分辨疫苗誘導(dǎo)抗體和感染誘導(dǎo)抗體的免疫診斷試劑盒，并因此確保接種程序的有效性?，F(xiàn)有商業(yè)疫苗的缺點(diǎn)鼓勵(lì)用更安全更明確的亞單元制品取代它們的研究。然而，為了達(dá)到接受性，這些制品將必須與目前提供的滅活病毒疫苗具有相同的免疫原性，并且將需要提供對(duì)抗抗原變異體的廣泛的保護(hù)譜。設(shè)計(jì)一種用于FMDV的明確亞單元疫苗的努力從打碎病毒顆粒開(kāi)始，然后鑒定其組成蛋白質(zhì)，如圖1所示。這導(dǎo)致與完整滅活病毒顆粒相比，免疫活性明顯喪失(Brown，1989)。然而，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)的衣殼蛋白(目前被統(tǒng)一命名為VP1)自身接種的牛和豬具有誘發(fā)中和抗體和免疫的能力，雖然其活性為亞型特異性的及數(shù)量級(jí)低于完整滅活病毒的數(shù)量級(jí)。沒(méi)有其它病毒蛋白質(zhì)誘發(fā)中和活性(Lapore等，CRAcadSciParis,1973;276:3399-3401和Bachrach等，免疫學(xué)雜志，1975，115:1636-1641)。VP1的中和活性使人們將注意力集中于該蛋白質(zhì)，而且一開(kāi)始它就被慎重地考慮為基因工程亞單元疫苗的侯選物(Kleid等，科學(xué)，1981:214:1125-1129)。近來(lái)清楚地認(rèn)識(shí)到重組VP1的免疫原性不足以保護(hù)動(dòng)物(Brown,1989;Brown,1992)。盡管如此，這項(xiàng)工作導(dǎo)致VP1上免疫決定簇的發(fā)現(xiàn)，使基于合成肽的更強(qiáng)效區(qū)域特異性亞單元疫苗成為可能。Strohmaier等(JGenVirol,1982;59:295-306)實(shí)驗(yàn)了通過(guò)溴化氰和蛋白水解消化產(chǎn)生的VP1的酶切產(chǎn)物；Bittle和Lerner(WO83/03547)實(shí)驗(yàn)了相應(yīng)于最高變異性區(qū)域的氨基酸序列的合成肽；Acharya等(自然，1989，337:709-711)通過(guò)X-射線結(jié)晶照相術(shù)驗(yàn)證了FMDV上的表面暴露位點(diǎn)；Pfaff等(EMBOJ，1982，7:869-874)通過(guò)預(yù)測(cè)一種VP1的重要兩親螺旋構(gòu)型篩選出一種誘導(dǎo)中和抗體的肽，由此對(duì)VP1的免疫原區(qū)進(jìn)行了作圖。所有這四項(xiàng)研究得出VP1的一種具有137-160個(gè)殘基的環(huán)形區(qū)域攜帶誘導(dǎo)中和抗體的決定簇。對(duì)應(yīng)于VPl的141-160區(qū)域的血清型-特異性肽，也被稱為"G-H環(huán)"，得自所有七種血清型的FMDV分離株，已顯示在豚鼠中誘導(dǎo)保護(hù)水平的中和抗體(Francis等，免疫學(xué)，1990，69:171-176)。顯然該區(qū)域含有一種主要的免疫原性位點(diǎn)，其也攜帶病毒的血清型特異性。通過(guò)結(jié)合于載體蛋白KLH(匙孔帽貝血藍(lán)蛋白)的合成肽實(shí)現(xiàn)了對(duì)這種141-160VP1肽的免疫原性的最初觀察，此過(guò)程忽略了生產(chǎn)明確定義的合成免疫原的優(yōu)點(diǎn)。然而，DiMarchi和Brook(US專利號(hào)4732971)表明來(lái)源于亞型O分離株的、連接在200-213Pro-Pro-Ser-141-158-Pro-Cys-Gly嵌合構(gòu)建體中的兩個(gè)VPl序列，誘導(dǎo)保護(hù)牛抵抗接種的抗體水平，由此他們推動(dòng)VPl合成免疫原的發(fā)展。盡管如此，該肽免疫原的低免疫原性限制了這種作用的功效。需要1-5—mg的高劑量才能獲得對(duì)同型舌頭皮下接種的保護(hù)，接受5mg劑量的三只動(dòng)物中的一只沒(méi)有得到保護(hù)。實(shí)際應(yīng)用要求一種僅少量肽免疫原即可對(duì)無(wú)論同型還是異型接種均提供完全保護(hù)作用的疫苗制劑。針對(duì)FMDV的有效肽疫苗的一個(gè)重要元件是從VPl的G-H環(huán)區(qū)中選擇一個(gè)確切的序列，其對(duì)呈遞能夠誘導(dǎo)中和抗體的B細(xì)胞表位是最適的。一種肽結(jié)構(gòu)域的最佳呈遞的框架可以被小至單個(gè)氨基酸位置的轉(zhuǎn)移而受影響(Moore,《合成肽，用戶指南》第2章，Grant,WH編，F(xiàn)reeman和Company:NewYork,1992，pp63-67)。公開(kāi)了含有中和抗原決定簇的免疫結(jié)構(gòu)域G-H環(huán)的優(yōu)選合成免疫原，其包括殘基141-160(WO83/0357;F認(rèn)cis等，1990)，141-158(US4732971),142-158(Parry等，WO91/03255)，137-168(Morgan和Moore.,AmJVetRes,19卯；51:40-45)，138-156(Taboga等，病毒學(xué)雜志，1997，7h2602-2614)，以及一些選自130-160(WO83/03547)的20個(gè)氨基酸的連續(xù)序列。顯然，對(duì)于呈遞G-H環(huán)VP1中和位點(diǎn)的優(yōu)化的VP1獨(dú)特片段沒(méi)有達(dá)成一致。另外，在現(xiàn)有肽疫苗中的有限種類(lèi)的B細(xì)胞表位不足以刺激廣泛反應(yīng)性的、抗髙度可變FMDV的保護(hù)作用所需的中和抗體。到目前為止，僅誘導(dǎo)相對(duì)有限的特異性的抗體，甚至由于長(zhǎng)期發(fā)生點(diǎn)突變產(chǎn)生逃脫突變體，使這些有限特鼻性的價(jià)值還存在進(jìn)一步的限制(Taboga等，1997)。需要提供一種免疫原性廣泛到足以克服多種株系之間的抗原變異和由于逃脫突變體的出現(xiàn)所致的臨時(shí)變異的肽疫苗的替換方法。影響用于FMDV疫苗的合成肽的免疫原性的其它重要因素是呈遞給免疫系統(tǒng)一種適合于宿主的T-輔助細(xì)胞表位。短的合成肽，只有當(dāng)它們除含有抗體結(jié)合位點(diǎn)之外，還含有與輔助T-細(xì)胞受體和II類(lèi)MHC分子反應(yīng)的結(jié)構(gòu)域時(shí)，才能夠了解它們作為疫苗的潛力(Babbitt等，自然，1985，317:359-361)。單獨(dú)的141-160VP1肽對(duì)豚鼠和小鼠具有某種程度的免疫原性，表明該序列中存在適合于這些物種的T細(xì)胞表位。相對(duì)于這些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的結(jié)果，在牛和豬中的疫苗實(shí)驗(yàn)表明對(duì)該VP1結(jié)構(gòu)域的T-細(xì)胞表位的免疫反應(yīng)性變異太大，所以不能為這些具經(jīng)濟(jì)意義的遠(yuǎn)親后代種的個(gè)體提供適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)(Rodriguez等，病毒學(xué)，1994，205:24-33;和Taboga等，病毒學(xué)雜志，1997，71:2606-2614)。最近，鑒定對(duì)應(yīng)FMDV結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)域的其它合成肽為T(mén)-輔助細(xì)胞區(qū)域。發(fā)現(xiàn)在牛中對(duì)應(yīng)VP1氨基酸21-40的肽能夠?qū)P1中和環(huán)結(jié)構(gòu)提供T細(xì)胞輔助(Collen等，免疫學(xué)雜志，1991，146:749-755);然而，這些T細(xì)胞表位不足以給牛提供穩(wěn)定的保護(hù)(Taboga等，1997)。仍然沒(méi)有關(guān)于選擇足夠的T輔助細(xì)胞決定簇的信息，也沒(méi)有關(guān)于已知FMDV疫苗中B-和T-細(xì)胞表位的最佳取向。需要提供一種基于合成肽的、具有優(yōu)越于經(jīng)典疫苗的效力和fe范圍的FMDV疫苗。前面討論的現(xiàn)有技術(shù)肽不足以提供這種需要。本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種符合上述需要的合成肽FMD疫苗。實(shí)現(xiàn)該目的的方法是1.一種鑒定高親合性表位的有效方法，2.通過(guò)組合化學(xué)，表現(xiàn)一種具有較少數(shù)目的肽綜合體的增大B細(xì)胞和T細(xì)胞表位功能的的方法，3.通過(guò)將B細(xì)胞目標(biāo)表位與強(qiáng)效T輔助細(xì)胞(Th)表位結(jié)合并使Th表位適應(yīng)一種種群的可變免疫反應(yīng)性，來(lái)增強(qiáng)B細(xì)胞目標(biāo)表位的免疫原性的方法，和4.通過(guò)引入一種環(huán)狀限制穩(wěn)定所需構(gòu)象特征。曾用合成肽進(jìn)行"表位作圖"，以鑒定蛋白質(zhì)表面的免疫結(jié)構(gòu)域決定簇或表位，用于研制新的疫苗和診斷試劑。表位作圖應(yīng)用一系列目標(biāo)蛋白質(zhì)上相應(yīng)區(qū)域的重疊肽，以鑒定參與抗體-免疫原決定簇相互作用的位點(diǎn)。通常，表位作圖應(yīng)用長(zhǎng)度相對(duì)較短的肽，以精確檢測(cè)線形決定簇。一種被稱為"PEPSCAN"的最快的表位作圖法是基于同時(shí)合成數(shù)百個(gè)長(zhǎng)度為S-14個(gè)氨基酸、、結(jié)合于固相支持物的重疊肽。測(cè)試結(jié)合肽結(jié)合抗體的能力。該研究方法對(duì)于定位線形決定簇有效，但研制疫苗所需的免疫結(jié)構(gòu)域表位通常為高度親和力的不連續(xù)表位，難于通過(guò)PEPSCAN法鑒定(Meloen等，AnnBiolClin，1991,49:231-242)。一種替代方法依賴于一系列長(zhǎng)度范圍從15-60個(gè)殘基不等的嵌套重疊肽合成物。這些較長(zhǎng)的肽通過(guò)一系列煩瑣的獨(dú)立固相肽合成法合成，而不是通過(guò)快速同步PEPSCAN合成。然后得到的一系列嵌套重疊肽可以用于抗體結(jié)合研究，和實(shí)驗(yàn)免疫以鑒定最佳呈遞免疫決定簇的長(zhǎng)肽，包括簡(jiǎn)單的混雜表位。該方法通過(guò)Wang等關(guān)于來(lái)自HTLVI/II(US5476765)和HCV(US5106726)的免疫結(jié)構(gòu)域位點(diǎn)作圖研究示例說(shuō)明。它被用于選擇gpl20序列上HIV中和表位最佳呈遞的精確位置(Wang等，科學(xué)，1991，254:285-288)。組合肽文庫(kù)已經(jīng)設(shè)計(jì)為覆蓋由于地域或人種差異及高度可變性抗原的臨時(shí)變異表現(xiàn)出的廣泛范圍的序列，同時(shí)設(shè)計(jì)超越個(gè)體肽免疫原的有限能力。例如，可以將一種特定肽免疫原設(shè)計(jì)為含有多種由一種不變殘基的結(jié)構(gòu)框架組織圍繞起來(lái)的位置取代。該組合維持了免疫結(jié)構(gòu)域位點(diǎn)的構(gòu)型，并適應(yīng)當(dāng)前和預(yù)期的抗原變異。該組合肽，對(duì)應(yīng)HIV和HCV的高可變免疫結(jié)構(gòu)域位點(diǎn)，已由Gras-Masse等(肽研究，1992，5:211-216)描述為"混合表位"，由Wang等(WO95/11998)描述為"構(gòu)建的合成抗原文庫(kù)"或"SSAL"。"構(gòu)建的合成抗原文庫(kù)"或SSAL由一組能夠保持該位點(diǎn)抗原性、診斷價(jià)值或治療生物活性的嵌入較大不變結(jié)構(gòu)框架的有序的相關(guān)肽序列組成。式1提供了SSAL氨基酸序列的一種代表。AA"AA2j…AAij…AAxjf"式〃序列AA13到AAxj代表SSAL中的肽從N-端到C-端的氨基酸序列。文庫(kù)中各肽的長(zhǎng)度為x，對(duì)于每一個(gè)文庫(kù)x是恒定值。在每個(gè)氨基酸中，位置i、j從l到n變化，其中n代表第l位置上已知的(或所需的)不同氨基酸數(shù)目。缺口或插入的人為引入或自然發(fā)生，例如，表1中VP1序列排列中的那些，由x值不同的單獨(dú)SSAL的合成提供。式2是代表SSAL序列中特定可變位置i上氨基酸相對(duì)比率的總合的數(shù)學(xué)式。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>式2描述在每個(gè)位置i，n個(gè)單獨(dú)氨基酸的摩爾份數(shù)總合是一致的。位置I上的第j個(gè)氨基酸[AAij]由實(shí)踐者基于以下原則選擇(1)在自然界發(fā)現(xiàn)的FMDV血清型中的病毒株之間AAij的普遍性，和任選地(2)需要包括相似氨基酸，以便預(yù)期逃脫突變體。AAl3的氨基酸通常將從天然氨基酸中選擇，但可以包括修飾氨基酸，例如鳥(niǎo)氨酸和正亮氨酸和非天然氨基酸例如D-氨基酸。按照這些公式，可以在一步合成中同時(shí)制備長(zhǎng)度為x的SSAL的所有變異序列。SSAL的序列通過(guò)排列抗原相關(guān)家族的一級(jí)氨基酸序列，然后鑒定排列中的不變和可變位置。不變位置通常代表SSAL的結(jié)構(gòu)框架。SSAL中的簡(jiǎn)并性通過(guò)具有相對(duì)于一種任意原型序列包含不同氨基酸殘基的排列中的位置確定。確定了每個(gè)不變位置上的氨基酸之后，SSAL文庫(kù)中可變位置的簡(jiǎn)并性程度從提供各替代氨基酸的變異體數(shù)目確定。然后用不變位置上的單一氨基酸和可變位置上必需的簡(jiǎn)并性合成SSAL?？勺兾恢蒙系陌被釟埢南鄬?duì)比率可以設(shè)置為彼此相同，或者也可以由不同比率代表。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，在一種或多種可變位置上的氨基酸比率設(shè)置為能夠反應(yīng)天然序列中發(fā)現(xiàn)的各氨基酸的相對(duì)普遍性。表2和3中示例說(shuō)明的SSAL文庫(kù)代表該優(yōu)選實(shí)施方式，其中下標(biāo)代表SSAL中各可變位置上個(gè)體殘基的相對(duì)量。應(yīng)當(dāng)注意，SSAL中出現(xiàn)的肽的大分?jǐn)?shù)可能代表自然界中尚未觀察到的可變氨基酸的組合。SSAL的這種特征增加了由本發(fā)明的肽組合物賦予的抗新出現(xiàn)FMDV病毒株的FMDV感染的保護(hù)作用的程度。因此，在一個(gè)簡(jiǎn)單方式中，特定氨基酸，以及任選地它們?cè)赟SAL中每個(gè)位置的出現(xiàn)頻率，通過(guò)排列中應(yīng)用的不同抗原的一級(jí)序列而確定。在預(yù)期逃脫突變體時(shí)，排列表位中變異位置上尚未發(fā)現(xiàn)天然存在的氨基酸可以任選地插入該文庫(kù)。例如，可以將特定氨基酸類(lèi)型(例如疏水、帶電荷、中性或極性)中的幾種或全部殘基插入任何可變位置。插入特定位置的氨基酸類(lèi)型可以通過(guò)抗原排列中該可變位置上出現(xiàn)的氨基酸的主要類(lèi)型確定(WO95/11998)。被稱為"混雜Th"的表位誘導(dǎo)有效的T細(xì)胞輔助，并能夠與自身具備很低免疫原性的合成B細(xì)胞表位混合，產(chǎn)生強(qiáng)效肽免疫原。設(shè)計(jì)良好的混雜Th/B細(xì)胞表位嵌合肽能夠在表現(xiàn)多樣性MHC單倍體的遺傳多樣性種群的大多數(shù)成員中誘導(dǎo)Th應(yīng)答以及隨之而來(lái)的抗體應(yīng)答。來(lái)源于強(qiáng)效病毒和細(xì)菌來(lái)源的免疫原的特異性序列能夠提供混雜Th，包括麻疹病毒F蛋白、乙型肝炎病毒表面抗原、和沙眼衣原體主要外膜蛋白。一些已知的混雜Th已經(jīng)顯示在強(qiáng)化對(duì)應(yīng)十肽激素LHRH的低免疫原性肽方面是有效的(US5759551)。強(qiáng)效Th表位在長(zhǎng)度LHRH中的長(zhǎng)度范圍為約15-約50個(gè)氨基酸殘基(US5759551)，通常具有共同的結(jié)構(gòu)特征，可以含有特異性標(biāo)志序列。例如，共同特征是兩性分子螺旋，它是疏水氨基酸殘基占據(jù)螺旋一面，帶電荷和極性殘基占據(jù)周?chē)娴腶-螺旋結(jié)構(gòu)(Cease等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院科學(xué)進(jìn)展，1987，84:4249-4253)。表位通常含有其它的一級(jí)氨基酸模式，例如一個(gè)Giy或帶電荷殘基后跟隨兩到三個(gè)疏水殘基，其后依次跟隨一個(gè)帶電荷或極性殘基。該模式描述了一種被稱為Rothbard序列的模式。另外，Th表位通常遵循l、4，5、8規(guī)則，其中一個(gè)帶正電荷的殘基后第四位、第五位和第八位跟隨疏水殘基。因?yàn)樗羞@些結(jié)構(gòu)由共同的疏水、帶電荷和極性氨基酸構(gòu)成，所以各結(jié)構(gòu)能夠在同一個(gè)Th表位中同時(shí)存在(Partidos等，遺傳病毒學(xué)雜志(JGenVirol),1991,72:1293-99;Alexander等，免疫學(xué)，1994，1:751-761)。即使不是全部，但大多數(shù)混雜T細(xì)胞表位含有至少一個(gè)上述周期性。這些特征可以被插入"理想化人工Th位點(diǎn)"的設(shè)計(jì)，包括能夠在與識(shí)別多樣化MHC分子有關(guān)的位置上提供簡(jiǎn)并性并保留不變位置的SSALTh表位?？勺兾恢煤蛢?yōu)選氨基酸的列表由MHC-結(jié)合基元提供(Meister等，疫苗，1995;13:581-591)。例如，按照從麻疹病毒F蛋白質(zhì)中得到一種混雜表位，模擬被稱為"SSAL1TH1"的簡(jiǎn)并Th表位(Partidos等，1991)。將SSAL1TH1(WO95/11998)設(shè)計(jì)為與LHRH目標(biāo)肽順序連接。象麻疹表位一樣，SSAL1TH1遵循Rothbard序列和1、4、5、8規(guī)則(參見(jiàn)，例如，SSALTH1中的6、9、10和13位)151015Asp-Leu-Ser-Asp-Leu-Lys-Gly-Leu-Leu-Leu-His-Lys-Leu-Asp-Gly-Leu-GlulieGlulieArglielielieArglieGlulieValValValValValValValPhePhePhePhePhePhePhe將帶電荷殘基Gki或Asp加在位置l，以增加Th疏水側(cè)周?chē)碾?荷。然后在兩性螺旋疏水側(cè)的2、5、8、9、10、13和16位保留疏水殘基，2、5、8、9、10、13和16位的可變性提供了一種具有結(jié)合廣泛MHC限制元件能力的表面。SSAL特征的靜作用在于增大了人工Th的免疫抑制的范圍(WO95/11998)。在一個(gè)單一的固相肽合成中同時(shí)產(chǎn)生該SSAL中的所有變異體，其依次連接目標(biāo)B細(xì)胞表位和其它序列。肽免疫原通常比蛋白質(zhì)更柔韌，不易保持任何優(yōu)選結(jié)構(gòu)。因此通過(guò)引入環(huán)形限制來(lái)穩(wěn)定肽免疫原是有用的。一種準(zhǔn)確環(huán)化的肽免疫原可以模擬和保守目標(biāo)表位的構(gòu)象，由此誘導(dǎo)真正分子上與該位點(diǎn)具有交叉反應(yīng)性的抗體(Moore，合成肽第二章用戶指南，ed.Grant,WHFreemanandCompany:NewYork,1992,pp/63-67)。這已經(jīng)在一種代表FMDV免疫結(jié)構(gòu)域VP1環(huán)區(qū)的肽上，通過(guò)在氨基和羧基末端添加半胱氨酸殘基并通過(guò)氧化這兩個(gè)半胱氨酸殘基環(huán)化實(shí)現(xiàn)(WO83/03547)。然而，仍然需要更有效的VP1環(huán)區(qū)的肽類(lèi)似物。本發(fā)明提供了具有更為有效的免疫構(gòu)象的肽。這通過(guò)發(fā)現(xiàn)形成對(duì)天然表位更準(zhǔn)確模擬的半胱氨酸殘基的位置實(shí)現(xiàn)(Valero等，生物醫(yī)學(xué)肽，蛋白質(zhì)和核酸，1995:1:133-140)。發(fā)明概述本發(fā)明提供了提供利用肽技術(shù)和前面討論的肽設(shè)計(jì)元素即，精確的表位作圖、SSAL文庫(kù)肽、強(qiáng)效Th表位的設(shè)計(jì)、和環(huán)狀限制設(shè)計(jì)的肽免疫原。這些肽免疫原是有效的合成FMDV疫苗的基礎(chǔ)。這些肽是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈兂蔬f具有優(yōu)化位置和構(gòu)象限制的VP1中和位點(diǎn)、由于它們呈遞FMDV血清型變異體必需的寬范圍序列、以及由于它們廣泛的反應(yīng)性Th應(yīng)答。本發(fā)明進(jìn)一步提供了應(yīng)用該肽組合物作為免疫原，其中包含的每一種肽含有一種來(lái)源于口蹄疫病毒(FMDV)VPl衣殼蛋白的目標(biāo)抗原位點(diǎn)，優(yōu)選所述抗原位點(diǎn)與一種輔助T細(xì)胞表位共價(jià)連接，和任選地，其它免疫刺激序列，優(yōu)選經(jīng)常規(guī)肽鍵通過(guò)直接合成連接，用于預(yù)防FMD感染和根除FMD。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及應(yīng)用該肽組合物作為免疫原，在動(dòng)物包括豬、牛、羊、山羊、和FMDV易感野生動(dòng)物品種中誘導(dǎo)產(chǎn)生高效價(jià)的、能夠在體外有效中和FMDV的多種病毒株或血清型的多克隆抗體，以及應(yīng)用該組合物作為有效預(yù)防、和/或降低FMDV感染的發(fā)生率，盡管存在抗原多樣性，并因此導(dǎo)致FMD的根除。本發(fā)明還涉及組合物中應(yīng)用的肽，以及含有一種或多種這些肽或其片段的免疫分析和/或診斷試劑盒。-本發(fā)明的目標(biāo)抗原位點(diǎn)通過(guò)基于來(lái)源于FMDVA12病毒株的VPl蛋白質(zhì)的氨基酸序列信息進(jìn)行表位作圖選擇，其代表FMDVVP1蛋白質(zhì)上中和抗原決定簇，氨基酸134-168的最佳呈遞框架。這些殘基在表1中表示為氨基酸"134-169"(SEQIDNO:1)，這是由于位置142存在一個(gè)為、了排列引入的缺口。.為了方便，它們?cè)谡闹幸脖环Q為氨基酸134-169，但應(yīng)當(dāng)理解討論的真正片段是殘基134-168(SEQIDNO:1)。本發(fā)明的目標(biāo)抗原位點(diǎn)優(yōu)選從天然G-H環(huán)區(qū)的FMDVVPl序列修飾而成，其通過(guò)將兩個(gè)天然氨基酸取代為半胱氨酸，然后在這兩個(gè)半胱氨酸之間形成一個(gè)二硫鍵，以產(chǎn)生一種兩個(gè)半胱氨酸之間約由20-25個(gè)殘基的環(huán)狀結(jié)構(gòu)(例如，SEQIDNO:2)。VPl其它血清型的相應(yīng)目標(biāo)位點(diǎn)可以來(lái)源于相關(guān)血清型的同源G-H環(huán)區(qū)片段。本發(fā)明進(jìn)一步提供了與不變結(jié)構(gòu)框架中攜帶高度可變位置的SEQIDNO:.1的優(yōu)化框架具有共有序列的FMDVVPl目標(biāo)抗原位點(diǎn)，其中提供了每種高度可變位置的最常使用的氨基酸，所述氨基酸通過(guò)對(duì)來(lái)自與一種特定FMDV血清型有關(guān)的FMDV亞型的VPl序列分析確定。本發(fā)明進(jìn)一步提供了按照SEQIDNO:1的優(yōu)化目標(biāo)抗慮肽框架的構(gòu)建的合成抗原文庫(kù)(或SSAL)，其中每種SSAL由一組有序的通過(guò)在一個(gè)單一肽合成步驟中同時(shí)合成的相關(guān)肽組成，所述肽具有應(yīng)用于能夠維持目標(biāo)抗原肽抗原性的不變結(jié)構(gòu)框架的序列。另外，本發(fā)明的肽及其類(lèi)似物的目標(biāo)抗原位點(diǎn)經(jīng)依次共價(jià)連接合成的免疫刺激元件的組合而被賦午免疫原性，所述免疫刺激元件包括一種來(lái)自耶爾森氏鼠疫桿菌的免疫刺激侵染素肽(Inv)(SEQIDNO:22)，來(lái)源于外源性病原體的混雜Th表位；來(lái)源于FMDV蛋白質(zhì)的自體固有Th表位(例如SEQIDNO:24，表5)，人工Th表位(例如，SEQIDNOS:25和26，表6)以及通過(guò)直接合成的其它成分。本發(fā)明的肽可以由下式表示(A)n-(FMDV抗原)-(B)。-(Th)m-X或(A)n-(Th)m-(B)。-(FMDV抗原)-X或(FMDV抗原)-(B)。-(Th)m-(A)n-X或(Th)m-(B)。-(FMDV抗原)-(A)n-X其中各A獨(dú)立地為一種氨基酸，或一種一般性免疫剌激肽；各B獨(dú)立地為一種氨基酸或一種下面將進(jìn)一步限定的化學(xué)鍵；每個(gè)Th獨(dú)立地為一種構(gòu)成一種輔助T細(xì)胞表位的氨基酸序列，或免疫增強(qiáng)類(lèi)似物或其片段；"FMDV抗原"是一種下面將進(jìn)一步定義的合成肽抗原；x為一種氨基酸的a—COOH或a-CONH2;n為從O到約10;m為從1到約4;和o為從0到約10。還提供了佐劑和/或傳送載體和疫苗制劑常規(guī)使用的其它成分，以及劑量說(shuō)明書(shū)，以便能夠產(chǎn)生針對(duì)FMDVVP1目標(biāo)抗原位點(diǎn)的多克隆抗體。本發(fā)明涉及應(yīng)用肽組合物作為免疫原，誘導(dǎo)包括豬、牛、羊、山羊、和FMDV-易感野生動(dòng)物^種在內(nèi)的動(dòng)物產(chǎn)生高效價(jià)多克隆抗體。由抗體介導(dǎo)和由'本發(fā)明的肽組合物誘導(dǎo)的FMDV的保護(hù)機(jī)制將在體外有效中和FMDV的無(wú)論何種血清型或亞型的多種病毒株，并因此導(dǎo)致對(duì)FMDV感染的保護(hù)性免疫和幫助根除FMD。附圖簡(jiǎn)述圖1描繪了FMDV基因組的結(jié)構(gòu)圖，翻譯產(chǎn)物被酶切成病毒蛋白質(zhì)的處理途徑，以及衣殼和非結(jié)構(gòu)蛋白的命名。圖2A描繪了構(gòu)建的合成抗原文庫(kù)"SSAL(1)(完全)(134-169)"的氨基酸組成。下標(biāo)代表相應(yīng)位置上每種氨基酸的相對(duì)量。圖2B描繪了構(gòu)建的合成抗原文庫(kù)"SSAL(1)(完全)[134(N—C)-158(Q—C)-169]"的氨基酸組成。圖3A描繪了構(gòu)建的合成抗原文庫(kù)"SSAL(2)(完全)(134-169)"的氨基酸組成。''圖3B描繪了構(gòu)建的合成抗原文庫(kù)"SSAL(2)(完全)(134(N—C)-158(Q—C)-169]"的氨基酸組成。圖4A描繪了構(gòu)建的合成抗原文庫(kù)"OSSAL(完全)(134-169)"的氨基酸組成。圖4B描繪了構(gòu)建的合成抗原文庫(kù)"0SSAL(完全)(134-158(Q—C)-169)"的氨基酸組成。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及應(yīng)用肽組合物作為免疫原，所述組合物含有一種或優(yōu)選多種肽，其中包含的每一種肽含有一種來(lái)源于口蹄疫病毒(FMDV)的VP1衣殼蛋白的目標(biāo)抗原肽，所述抗原肽優(yōu)選與一種輔助T細(xì)胞表位和任選的其它免疫刺激序列共價(jià)連接。共價(jià)鍵優(yōu)選通過(guò)肽鍵經(jīng)直接合成產(chǎn)生。該肽組合物用于預(yù)防動(dòng)物中的FMDV感染，以及期望幫助根除FMD。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及應(yīng)用該肽組合物作為免疫原，在動(dòng)物包括豬、牛、羊、山羊、和易感野生動(dòng)物品種中誘導(dǎo)產(chǎn)生高效價(jià)多克隆抗體，所述抗體能夠在體外有效中和FMDV的多種病毒株或血清型，以及應(yīng)用該組合物作為疫苗，預(yù)防無(wú)論何種血清型的FMDV感染，并因此實(shí)現(xiàn)對(duì)FMD的根除。本發(fā)明還涉及組合物中應(yīng)用的肽，以及含有一種或多種這些肽的免疫分析和/或診斷試劑盒。含有一種或多種這些肽或其片段的免疫分析和/或診斷試劑盒將用于鑒定疫苗誘導(dǎo)的抗體和感染誘導(dǎo)的抗體，并因此能夠用于篩選FMDV感染的存在和/或監(jiān)測(cè)接種程序的有效性。本發(fā)明提供了診斷哺乳動(dòng)物中FMDV感染的方法，包括以下步驟..(a)按照權(quán)利要求i將肽結(jié)合到固體支持物上，(b)將所述結(jié)合于固體支持物的肽與含有來(lái)自所述哺乳動(dòng)物的抗體的樣品在有助于抗體與肽結(jié)合的條件下接觸，和(C)檢測(cè)與結(jié)合在所述固體支持物上的所述肽結(jié)合的抗體的存在。在考慮潛在環(huán)化構(gòu)象和G-H環(huán)的殘基表面暴露的基礎(chǔ)上，優(yōu)化含有FMDVVP1(G-H環(huán))的主要中和決定簇的目標(biāo)抗原序列，如從internet土也址為tittp:〃www.pdb.bnl.gov/pdb.bin/pdbids白勺Brookhaven國(guó)立實(shí)驗(yàn)室和Acharya等，自然337:709-711，1989提供的FMDVVPI的三維結(jié)構(gòu)推測(cè)的那樣。將環(huán)化的侯選位置插入肽構(gòu)建體的設(shè)計(jì)，通過(guò)連續(xù)合成共價(jià)結(jié)合混雜Th表位以及有或沒(méi)有其它免疫剌激物質(zhì)合成修飾的和未修飾的序列。將特定二硫鍵引入其中，合成環(huán)狀的修飾肽構(gòu)建體，以便將易變動(dòng)的肽穩(wěn)定成為潛在的更具生物相關(guān)性的構(gòu)象。通過(guò)制備超免疫血清和實(shí)驗(yàn)該血清在FMDV中和分析中的效力，鑒定含有相關(guān)免疫原性的VP1抗原位點(diǎn)的合成構(gòu)建體。具體地說(shuō)，通過(guò)基于FMDV病毒株Au的VPl蛋白質(zhì)的氨基酸序列的表位作圖選擇本發(fā)明的目標(biāo)抗原位點(diǎn)(實(shí)施例2)。發(fā)現(xiàn)目標(biāo)抗原肽的框架，如表1中的AA134-169(SEQIDNO:1)所示，對(duì)于FMDVVP1上的G-H環(huán)中和決定簇的免疫呈遞是優(yōu)化的?？乖牡哪繕?biāo)抗原位點(diǎn)可以從天然FMDVVP1序列修飾得到，即通過(guò)將134位上的天然天冬氨酸和157位上的谷氨酰胺取代為半胱氨酸，在兩個(gè)取代半胱氨酸之間形成一個(gè)二硫鍵，從而產(chǎn)生一種環(huán)狀結(jié)構(gòu)(SEQIDNO:2)。所述環(huán)狀結(jié)構(gòu)還含有1-13個(gè)選自VP1的134-157片段的任意末端的附加氨基酸，只要保留如表l(SEQIDNO:3)所示的單一二硫鍵環(huán)狀結(jié)構(gòu)。作為本發(fā)明的一種目標(biāo)抗原肽的實(shí)例，提供了具有下列序列的FMDVVP1的目標(biāo)位點(diǎn)(半胱氨酸取代表示為黑Cys-Lys-Tyr-Ser-AIa-Ser-Gly-Ser-Gly-Val-Arg-Giy-Asp-Phe-Gty-Ser-Leu-Ala-Pro-Arg_Val-AIa-Arg-C〗7s-Leu-Pro-AIa-Ser-Phe-Asn-Tyr-Gly-Ala-Ile-Lys(SE,QIDNO.:2)或者，VP1的其它血清型的相應(yīng)目標(biāo)位點(diǎn)可以來(lái)源于相關(guān)血清型的同源片段。例如，可以按照來(lái)自FMDV血清型O和Asia型的相應(yīng)序列，通過(guò)序列分別如下的表1中所示的序列排列，制備取代的肽類(lèi)似物Cys-Lys-Tyr-Ser-Ser-Lys-Ala-Val-Pro-Asn-Val-Arg-Gly-Asp-Leu-Asn-Val-Leu-Glu-Gin-lys廠Ala-Ala-Arg-Cys-Leu-Pro-Thr-Ser-Phe-Asn-Tyr-Gly-Ala-Ile-Lys.(SEQIDNO:5)和Cys-Pro-Tyr-Gly-Glu-丁hr-Thr-Ser-Arg-Arg-Gly-Asp-M6t-Ala-Ma-Leu-Ala-Gln-Arg-Leu-Ser-Ala-Cys-Leu_Pro_Thr-Ser_Phe_Asn-Tyr-Gly-Ala_Va:L-;Lys(SEQIDNO:7)本發(fā)明進(jìn)一步提供了環(huán)狀和線形的FMDVVP1目標(biāo)抗原肽，與高度可變位置置于不變結(jié)構(gòu)框架中的SEQIDNO:1(AA134-169)的優(yōu)化框架具有相同序列，其中提供了所述框架中高度可變位置上最常使用的氨基酸，其通過(guò)分析來(lái)自一組與特定FMDV血清型有關(guān)的病毒的VP2序列而確定。作為本發(fā)明這種共有序列的例子，提供了六種共有序列，它們是來(lái)源于血清型A的FMDV變異體的共有序列(SEQIDNOS:8,9)、血清型O的FMDV變異體的共有序列(SEQIDNOS:10、11)和血清型Asia型的FMDV變異體的共有序列(SEQIDNOS:12、13)，如表1所示。本發(fā)明進(jìn)一步提供了按照SEQIDNO:1的優(yōu)化目標(biāo)抗原肽框架的，環(huán)化和線形的構(gòu)建的合成抗原文庫(kù)(或SSAL)，其中每個(gè)SSAL由一組有序的、在一個(gè)單一肽合成中同時(shí)產(chǎn)生的、具有用于能夠維持目標(biāo)抗原肽的抗原性的不變結(jié)構(gòu)框架的序列的相關(guān)肽組成。作為這種本發(fā)明的這種SSAL的例子，提供了九種具有組合序列的SSAL，所述組合序列來(lái)源于編輯的FMDV亞型組，它們是分別如表2、3、4和IO的血清型A(SEQIDNOS:14-17)、血清型O(SEQIDNOS:、18、19)禾QAsia血清型(SBQIDNOS:20、21、35)。目標(biāo)VP1位點(diǎn)是短肽序列。當(dāng)合成它們自身作為本發(fā)明的肽時(shí)，這些肽通常具有較弱的免疫原性。通過(guò)化學(xué)連接來(lái)源于外源病原體的混雜Th表位，這些短肽可以被免疫加強(qiáng)，所述外源病原體包括但不限于，例如，乙肝病毒表面和核心抗原輔助T細(xì)胞表位(HBsTH禾PHBcTh)、百日咳毒素輔助T細(xì)胞表位(PTTh)、破傷風(fēng)毒素輔助T細(xì)胞表位(TTTh)、麻疹病毒F蛋白輔助T細(xì)胞表位(MVFTh)、沙眼衣原體主要外膜蛋白輔助T細(xì)胞表位(CTTh)、白喉毒素輔助T細(xì)胞表位(DTTh)、鐮狀瘧原蟲(chóng)環(huán)孢子體輔助T細(xì)胞表位(PFTh)、曼森氏血吸蟲(chóng)三糖磷酸鹽異構(gòu)酶輔助T細(xì)胞表位(SMTh)，及大腸桿菌TraT輔助T細(xì)胞表位(TraTTh)。病原體衍生的Th在US5759551中的SEQIDNOS:2-9和42-52列出；衣原體輔助位點(diǎn)Pll在Stagg等，免疫學(xué)，1993，79:1-9中列出；HBc肽50-69在Ferrari等，臨床研究雜志，1991，88:214-222中列出，它們經(jīng)參考插入本文?；祀sTh還包括來(lái)源于FMDV蛋白質(zhì)的自體固有Th表位(表5，例如，SEQIDNO:24)，被參考插入本文，或者設(shè)計(jì)的人工Th表位，如表6所示(例如，SEQIDNOS:25、26、36、37、和38)。本發(fā)明的免疫原均具有位點(diǎn)-特異性免疫反應(yīng)性，以提供精確的指向FMDV的主要中和決定簇。提供了具體實(shí)施例，作為本發(fā)明肽的實(shí)施方式，例如，SEQIDNOS:2、11。提供了進(jìn)一步實(shí)施例，作為提供將合成的免疫刺激物質(zhì)連接到FMDVVP2抗原位點(diǎn)上的本發(fā)明的優(yōu)選肽(例如，表7-10中的SEQIDNOS:27-34),從而在遺傳多樣性宿種群種產(chǎn)生了抗FMDVVP1蛋白質(zhì)上的目標(biāo)抗原位點(diǎn)的廣泛反應(yīng)性的強(qiáng)效中和抗體。這些抗-VPl抗體導(dǎo)致對(duì)FMDV的有效中和，并因此保護(hù)免受FMDV感染。對(duì)于主動(dòng)免疫，本文中所指的術(shù)語(yǔ)"免疫原"涉及能夠誘導(dǎo)抗FMDV的VP1蛋白質(zhì)上存在的G-H環(huán)區(qū)抗體的肽組合物，產(chǎn)生對(duì)多種血清型FMDV的有效中和，因此預(yù)防FMDV感染。本發(fā)明的肽組合物優(yōu)選包括含有混雜輔助T細(xì)胞表位(Th表位)和任選地其它免疫剌激物質(zhì)的合成肽。Th肽經(jīng)間隔區(qū)(例如，GIy-Giy)共價(jià)結(jié)合于FMDVVP1目標(biāo)抗原區(qū)(例如，SEQIDNOS:1-21、35)，從而結(jié)合于目標(biāo)抗原位點(diǎn)的N-或C-末端，以便誘導(dǎo)有效的抗體應(yīng)答。免疫原還可以包括一般性免疫刺激氨基酸序列，例如，相應(yīng)于源自耶爾森氏鼠疫桿菌屬的侵染素蛋白的結(jié)構(gòu)域(Brett等，歐洲免疫學(xué)雜志，1993，23:1608-1614)(SEQIDNO:22)。如果存在，一般性免疫刺激結(jié)構(gòu)域可以包括一種間隔區(qū)，用于通過(guò)肽結(jié)合。本發(fā)明的完全合成肽可以由下式表示(A)n-(FMDV抗原)-(B)。-(Th)m-X或(A)n-(Th)m-(B)0-(FMDV抗原)-X或(FMDV抗原)-(B)。-(Th)m-(A)n-X或(Th)m-(B)。-(FMDV抗原)-(A)n-X其中每個(gè)A獨(dú)立地為一種氨基酸、或一種一般性免疫刺激序列；每個(gè)B獨(dú)立地選自氨基酸、-NHCH(X)CH2SCH2CO-、-NHCH(X)CH2SCH2CO(s-N)Lys-、-NHCH(X)CH2S-琥珀酰亞胺基(s-N)Lys-、和-NHCH(X)CH2S-(琥珀酰亞胺)-;每個(gè)Th獨(dú)立的是一種構(gòu)成輔助T細(xì)胞表位的氨基酸序列，或一種免疫增強(qiáng)類(lèi)似物或其片段；"FMDV抗原"是一種合成的肽抗原，如下面的進(jìn)一步定義；X為一種氨基酸的oc-COOH或a-CONHr，n為0至約10;m為1至約4;和o為0至約10。''一本發(fā)明的肽免疫原包括約35到100個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選約45到90個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選約50到75個(gè)氨基酸殘基。如果A為一種氨基酸，它可以是任何天然的或非天然的氨基酸。非天然的氨基酸包括但不限于D-氨基酸、g-丙氨酸、鳥(niǎo)氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、羥脯氨酸、甲狀腺氨酸、Y-氨基丁酸、高絲氨酸、瓜氨酸等。天然氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、和纈氨酸。而且，如果m大于l，二個(gè)或三個(gè)A基團(tuán)為氨基酸，那么每個(gè)氨基酸可以獨(dú)立地相同或不同。如果A為一種侵染素的結(jié)構(gòu)域，則它可以是來(lái)自耶爾森氏鼠疫桿菌種侵染素蛋白的免疫刺激表位。這種免疫刺激特性來(lái)源于這種侵染素結(jié)構(gòu)域與T細(xì)胞，特別是活化的免疫或記憶T細(xì)胞上存在的e1整聯(lián)蛋白分子相互作用的能力。Brett等描述了與P1整聯(lián)蛋白相互作用的侵染素結(jié)構(gòu)域的特定序列(歐洲免疫學(xué)雜志，1993;23:1608)。在US5759551中已經(jīng)描述過(guò)用于連接混雜Th表位的侵染素結(jié)構(gòu)域(Irw)的一種優(yōu)選實(shí)施方式，其經(jīng)參考插入本文。Iiw結(jié)構(gòu)域優(yōu)選具有如下序列Thr-Ala-Lys-Ser-Lys-Lys-Phe-Pro-Ser-Tyr-Thr-Ala-Thr-Tyr-Gin-Phe(SEQIDNO:22)，或?yàn)閬?lái)源于另一種耶爾森氏鼠疫桿菌種侵染素蛋白相應(yīng)區(qū)域的其免疫刺激類(lèi)似物。因此這種類(lèi)似物可以含有氨基酸殘基的取代、刪除或插入，以適應(yīng)株系變異，只要類(lèi)似物保留免疫刺激特性。(A)n優(yōu)選包括一種間隔區(qū)，例如Gly-Gly，通過(guò)它所述侵染素結(jié)構(gòu)域與肽連接。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，(A)3依次為一種侵染素結(jié)構(gòu)域(Inv)、甘氨酸和甘氨酸，即(Iiw)-Gly-Gly。B為一種間隔區(qū)，是一種上述的天然氨基酸或非天然氨基酸。每個(gè)B獨(dú)立地相同或不同。B的氨基酸還可以在混雜Th表位和FMDVVP1抗原位點(diǎn)(例如，SEQIDNOS:1-21和35)或其反應(yīng)性和免疫功能類(lèi)似物之間提供一種間隔區(qū)，例如Gly-Gly。除了使Th表位與B細(xì)胞表位物理分隔，Gly-Gly間隔區(qū)可以破壞Th表位與FMDVVPl抗原位點(diǎn)結(jié)合產(chǎn)生的所有人工二級(jí)結(jié)構(gòu)，因此減弱了Th和/或B細(xì)胞應(yīng)答之間的干擾。B的氨基酸還可以構(gòu)成一種作為增強(qiáng)Th和FMDVVPl目標(biāo)抗原位點(diǎn)分隔作用的柔韌性絞鏈的間隔區(qū)。在免疫球蛋白重鏈絞鏈區(qū)中發(fā)現(xiàn)了編碼柔韌性絞鏈的序列的實(shí)例。柔韌性絞鏈序列通常富含脯氨酸。一種特別有用的柔韌性絞鏈為序列Pro-Pro-Xaa-Pm-Xaa-Pro(SEQIDNO:23)，其中Xaa為任意氨基酸，優(yōu)選為天冬氨酸。由B的氨基酸提供的構(gòu)象間隔使本發(fā)明的肽免疫原和合適Th細(xì)胞和B細(xì)胞之間的相互作用更為有效，由此增強(qiáng)了對(duì)Th表位和抗體-誘導(dǎo)性表位以及它們的交叉相互反應(yīng)性和免疫功能類(lèi)似物的免疫應(yīng)答。Th是一種含有Th表位的氨基酸序列(天然或非天然氨基酸)。Th表位可以由連續(xù)或不連續(xù)表位構(gòu)成。因此不是Th的每一個(gè)氨基酸一定是表位的一部分。因此，Th表位，包括Th表位的類(lèi)似物和片段，能夠增強(qiáng)或刺激對(duì)FMDVVP1抗原位點(diǎn)(例如，SEQIDNOS:1-21和35)及其免疫功能類(lèi)似物的免疫應(yīng)答。表現(xiàn)為免疫結(jié)構(gòu)域和混雜的Th表位在動(dòng)物和人群中與廣泛的趨異進(jìn)化MHC型具有高度和廣泛的反應(yīng)性(Partidos等，1991;US5759551)。本發(fā)明肽的Th結(jié)構(gòu)域約具有10到50個(gè)氨基酸，優(yōu)選約具有10到30個(gè)氨基酸。當(dāng)出現(xiàn)多重Th表位(即m》2)，則每個(gè)Th表位獨(dú)立地相同或不同。Th片段是Th表位的連續(xù)部分，其足以增強(qiáng)或刺激對(duì)FMDVVP1抗原位點(diǎn)的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的表位包括例如，但不限于，來(lái)源于外源病原體的Th，例如HBsTH、HBcTh、PTTh、TTTh、MVFTh、CTTh、DTTh、DFTh、SMTh，和TraTTh;來(lái)源于FMDV蛋白質(zhì)的自體固有Th(表5，例如，SEQIDNO:24)，被稱為人工Th(例如，表6，SEQIDNOS:25、26、36、37、和38)，以及免疫功能類(lèi)似物。免疫功能Th類(lèi)似物包括免疫增強(qiáng)類(lèi)似物、反應(yīng)性類(lèi)似物和任何這些Th表位的片段。Th的免疫功能類(lèi)似物優(yōu)選在Th表位中插入保守取代、添加、刪除，而基本上不改變Th表位的Th刺激功能。"FMDVVP1抗原位點(diǎn)"指FMDVA12病毒株的VPl蛋白質(zhì)的134-168位氨基酸(即，SEQIDNO:1)，還指不同于FMDVA!2病毒株的其它FMDV病毒株的VP1蛋白質(zhì)片段的肽，其與FMDVAu病毒株的VPl蛋白質(zhì)的134-168位氨基酸同源。FMDVVPl抗原位點(diǎn)還指相應(yīng)于FMDVA。病毒株的VPl蛋白質(zhì)的134-168位氨基酸的、具有來(lái)源于血清型為A、O或Asia型的FMDV病毒株VPl蛋白質(zhì)氨基酸序列的共有序列的肽；以及符合SEQIDNOS:14、16、18和20的一般定義的肽。'FMDVVPl抗原位點(diǎn)還指為本文定義的SSAL的成員的肽。按照本發(fā)明，F(xiàn)MDVVP1抗原位點(diǎn)(例如，SEQ'IDNOS:1-21、35)的反應(yīng)性和免疫功能類(lèi)似物可以進(jìn)一步含有保守取代、添加、刪除、或插入1至約4個(gè)氨基酸殘基，只要肽類(lèi)似物能夠誘導(dǎo)與FMDVVP1.抗原位點(diǎn)(例如，SEQIDNOS;1-21和35)反應(yīng)的免疫應(yīng)答。保守取代、添加、和插入可以用本文定義的天然或非天然氨基酸實(shí)現(xiàn)。目標(biāo)抗原位點(diǎn)優(yōu)選從G-H環(huán)區(qū)的天然FMDVVP1序列通過(guò)將134位的天然天冬氨酸和157位的谷氨酰胺取代為半胱氨酸，在這兩個(gè)半胱氨酸之間形成二硫鍵從而產(chǎn)生一種環(huán)狀結(jié)構(gòu)，修飾而成。(SEQIDNO:2)。這些環(huán)狀結(jié)構(gòu)還可以含有1-13個(gè)來(lái)自VP1的134-157片段的任意末端的附加氨基酸，只要保留單一二硫鍵環(huán)狀結(jié)構(gòu)(SEQIDNO:3)。對(duì)天然序列的修飾在表1中被表示為(N—C)、(Q—C)、(R—C)以及下劃線的氨基酸。含有引入的半胱氨酸的肽序列可以提供為SSAL，例如，SEQIDNOS:15、17、和19，這些SSAL也可以被用作FMDVVP2抗原肽位點(diǎn)。因此，本發(fā)明的優(yōu)選的肽免疫原是含有FMDVVP1抗原位點(diǎn)(例如，SEQIDNOS:1-21和35)或其免疫功能類(lèi)似物和Th肽的肽。更優(yōu)選的肽免疫原是下述構(gòu)建體，即含有一種FMDVVP1抗原位點(diǎn)或一種其反應(yīng)性和免疫功能類(lèi)似物；一種間隔區(qū)(例如，Gly-Gly);—種Th表位，艮卩HBsTH、HBcTh、PTTh、TTTh、MVFTh、CTTh、DTTh、DFTh、SMTh、TraTTh、FMDV蛋白質(zhì)的自體固有Th(例如，SEQIDNO:24)、或人工Th(例如，表6，SEQIDNOS:25、26、36、37、和38)，或其類(lèi)似物；以及，任選地，一種Inv結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:22)或其類(lèi)似物。含有本發(fā)明肽免疫原和兩種或多種Th表位的混合物的疫苗可以增強(qiáng)更廣泛種群的免疫效力，由此提供一種對(duì)FMDVVP1抗原位點(diǎn)的改善的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的肽免疫原可以通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的化學(xué)合成法制備。參見(jiàn)，例如，F(xiàn)ields等，《合成肽用戶指南》第三章，Grant,W.H.編，F(xiàn)reeman禾QCo.，NY，1992，p.77。因此，可以應(yīng)用固相合成法——自動(dòng)匹配Merrifield技術(shù)，用t-Boc或Fmoc化合物保護(hù)ci-NH2，并應(yīng)用側(cè)鏈保護(hù)的氨基酸，在例如，430A或431型應(yīng)用生物系統(tǒng)肽合成儀(theAppliedBiosystems肽SynthesizerModels43OA或431)上合成肽?？梢酝ㄟ^(guò)以設(shè)計(jì)中具體說(shuō)明的適當(dāng)比例提供用于結(jié)合到一個(gè)特定可變位置上的選擇氨基酸混合物，制備B或T細(xì)胞表位的含有構(gòu)建的合成抗原文庫(kù)(SSAL)的肽構(gòu)建體。完成所需肽免疫原的裝配后，按照標(biāo)準(zhǔn)程序處理樹(shù)脂，以從樹(shù)脂上切除肽，并使氨基酸側(cè)鏈上的功能基團(tuán)脫封閉。通過(guò)HPLC純化游離肽，通過(guò)例如氨基酸分析或通過(guò)測(cè)序鑒定生化特征。肽的純化和特征鑒定方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。其它產(chǎn)生本發(fā)明的含有VP1G-H環(huán)和Th位點(diǎn)的肽構(gòu)建體的化學(xué)方法包括通過(guò)形成一種"硫醚"鍵連接鹵族乙?；桶腚装滨；摹＠?，可以將一個(gè)半胱氨酸加到含Th肽的C末端，半胱氨酸的巰基可以用于與結(jié)合到FMDVVP1抗原位點(diǎn)(例如，SEQIDNOS:1-21)或其反應(yīng)性和免疫功能類(lèi)似物的N-末端的親電基團(tuán)，例如N。氯乙酰修飾的或馬來(lái)酰亞胺基來(lái)源的賴氨酸殘基的a-或e-NH2基形成一個(gè)共價(jià)鍵。在該模式中，可以得到Th-(FMDVVP1抗原位點(diǎn))或其反向連接物，(FMDVVP1抗原)-Th。本發(fā)明的免疫原還可以是聚合的?？梢酝ㄟ^(guò)將免疫原與交聯(lián)劑利用常規(guī)方法反應(yīng)實(shí)現(xiàn)，例如通過(guò)戊二醛和賴氨酸殘基的-NH2之間通過(guò)常規(guī)方法的反應(yīng)。通過(guò)另一種方法，即通過(guò)應(yīng)用一個(gè)添加到合成免疫原N-末端的附加半胱氨酸殘基使合成肽免疫原聚合或共聚合。N-末端半胱氨酸的巰基可以用于與結(jié)合到分支的多聚-賴氨酰核心分子(例如，K2K、K4K2K或KsK4K2K)的鹵族乙酰基修飾的氨基酸或一種馬來(lái)酰亞胺來(lái)源的賴氨酸殘基的a-或s-NH2形成一種"硫醚"鍵。還可以通過(guò)在一種分支的多聚賴氨酰核心樹(shù)脂上直接合成所需的肽結(jié)構(gòu)，制備一種分支聚合物的本發(fā)明的免疫原(Wang等，科學(xué)，1991;254:285-288)?；蛘撸^長(zhǎng)的合成肽免疫原可以通過(guò)公知的重組DNA技術(shù)合成。一些關(guān)于分子克隆技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)提供了詳細(xì)的通過(guò)表達(dá)重組DNA和RNA制備本發(fā)明肽的方法。為了構(gòu)建編碼本發(fā)明肽的基因，將氨基酸序列逆向翻譯成一種核酸序列，優(yōu)選利用應(yīng)用于基因?qū)⒃谄渲斜磉_(dá)的有機(jī)體的優(yōu)化密碼子。接著，制備編碼肽的基因，通常通過(guò)合成編碼肽和必需調(diào)控元件的重疊寡核苷酸。將合成基因整合入或插入適當(dāng)?shù)目寺≥d體。本發(fā)明包括的合成核酸序列包括編碼本發(fā)明的肽、免疫功能同源物和類(lèi)似物、以及特征在于非編碼序列改變但沒(méi)有改變被編碼肽的免疫特性的核酸構(gòu)建體的核酸序列。還提供了包含編碼本發(fā)明肽序列的核酸。將合成基因插入適當(dāng)?shù)目寺≥d體，得到重組體并鑒定特征。然后在選擇的表達(dá)系統(tǒng)和宿主適合的適當(dāng)條件下表達(dá)肽。本發(fā)明肽組合物的效果可以通過(guò)將免疫原制劑(例如SEQIDNOS:27-34、36)注射動(dòng)物，例如豚鼠和豬，然后監(jiān)測(cè)對(duì)FMDVVP1抗原位點(diǎn)(例如，SEQIDNOS:1-21、35，和其反應(yīng)性和免疫功能類(lèi)似物)的激素免疫應(yīng)答，而證實(shí)，如實(shí)施例說(shuō)明的那樣。本發(fā)明的另一方面提供了一種在一種藥物可接受的傳送系統(tǒng)中含有一種免疫有效量的一種或多種本發(fā)明的肽免疫原的藥物組合物。因此，可以應(yīng)用佐劑、藥物可接受載體或其它疫苗組合物中常規(guī)提供的成分將本發(fā)明的肽組合物配制成一種疫苗組合物?？梢杂糜诒景l(fā)明的佐劑或乳化劑包括明礬、不完全弗氏佐劑、liposyn、皂甙、角鯊烯、L121、emulsigen、單磷脂酰脂類(lèi)A(MPL)、二甲基-二-十八烷基溴化氨(DDA)、QS21、ISA206、和ISA720，以及其它已知的有效佐劑和乳化劑。所述制劑包括速釋和/或緩釋制劑，以及用于誘導(dǎo)系統(tǒng)免疫性和/或誘導(dǎo)局部粘膜免疫性的制劑，其可以通過(guò)，例如，免疫原包封或與微粒共同給藥實(shí)現(xiàn)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠容易地確定所述制劑。本發(fā)明的疫苗可以通過(guò)任何常規(guī)途徑給藥，包括皮下、口服、肌內(nèi)、或其它非腸道或腸道途徑給藥。同樣，免疫原可以作為單劑量或多劑量給藥。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠容易地確定免疫方案。'上述核酸自身可以用作稱之為'"DNA疫苗"的成分。在本發(fā)明的所述實(shí)施方式中，通過(guò)將編碼所述肽的核酸導(dǎo)入患者自身細(xì)胞，誘導(dǎo)本發(fā)明的免疫原性肽在那些細(xì)胞中表達(dá)。制備和應(yīng)用DNA疫苗的方法公開(kāi)于US專利5580859，5589466，和5703055;同時(shí)參見(jiàn)WO97/02840和W.McKonnell和F,Askari,新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志，1996，334:2-45，它們均經(jīng)被參考插入本文。認(rèn)為制備和應(yīng)用本發(fā)明的肽和肽結(jié)合物的方法在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明的免疫原性組合物含有一種有效量的一種或多種本發(fā)明的肽免疫原和一種藥物可接受的載體。在一種適當(dāng)劑量單位劑型中的組合物通常含有每公斤體重約0.5yg到約1mg的免疫原。如果以多劑量給藥，可以方便地分成每劑量單位制劑適當(dāng)量。例如，初始劑量，例如0.2-2.5mg;優(yōu)選1mg由本發(fā)明的肽組合物表示的免疫原將通過(guò)注射優(yōu)選肌肉內(nèi)注射給藥，然后施用重復(fù)劑量(增強(qiáng)量)。劑量將根據(jù)患者的年齡、體重和一般健康狀況而定，正如疫苗和治療領(lǐng)域公知的那樣。對(duì)FMDVVP1抗原位點(diǎn)免疫原的免疫應(yīng)答可以通過(guò)捕獲在O，Hagan等(疫苗，1991;9:768)描述類(lèi)型的生物可降解微粒中或其上傳送來(lái)改進(jìn)。可以將免疫原與或不與佐劑包封入生物可降解微粒，以強(qiáng)化免疫應(yīng)答，包括局部粘膜免疫，并提供用于口服給藥和用于具備給藥的延時(shí)或周期應(yīng)答的時(shí)間控制釋放(O'Hagan等，1991;和Eldridge等，1991;2S:287)。該肽組合物用于誘導(dǎo)對(duì)FMDV的中和抗體，并用作預(yù)防和根除FMD的疫苗。在下面的實(shí)施例中提供了具體肽免疫原和組合物，用于舉例說(shuō)明本發(fā)明。這些實(shí)施例的目的僅在于說(shuō)明，不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何方式的限制。實(shí)施例的目標(biāo)抗原位點(diǎn)肽通過(guò)實(shí)施例1中描述的固相法合成。舉例說(shuō)明的是從已知病毒分離株修飾得到的線形和環(huán)狀FMDVVP1抗原位點(diǎn)，包括來(lái)自其它FMDV血清型和亞型的類(lèi)似物和肽同源物(例如，SEQIDNOS:1-7)和共有區(qū)域(例如，SEQIDNOS:8-13)和SSAt肽(例如，SEQIDNOS:14-21和35)。用于這些實(shí)施例的每種肽在免疫原元'件(例如，SEQIDNOS:30-32)之間具有Gly-Gly間隔區(qū)，但本發(fā)明的肽還可以含有其它間隔區(qū)(例如，SEQIDNO:23)或沒(méi)有間隔區(qū)。Th包括來(lái)源于外源病原體例如乙肝病毒的混雜輔助位點(diǎn)，以及其它被參考插入本文的Th，來(lái)源于FMDV的自體固有Th(例如，SEQIDNO:24)，和人工Th(例如，SEQIDNOS:25、26、和36-38)。這些實(shí)施例的肽還包括一種任選的一般性免疫刺激位點(diǎn)(例如，SEQIDNO:22)。實(shí)施例1評(píng)價(jià)目標(biāo)抗原,肽的典型程序合成肽涉及的FMDV通過(guò)Merrifield固相合成技術(shù)，在應(yīng)用生物系統(tǒng)自動(dòng)匹配肽合成儀(430、431和433A型)上，用Fmoc化合物合成具有來(lái)源于FMDVVP1G-H環(huán)區(qū)序列的肽?？梢酝ㄟ^(guò)以表2、3、4、6和10中所示的用于SSAL的設(shè)計(jì)公式中具體說(shuō)明的適當(dāng)比例，或者如果設(shè)計(jì)公式中沒(méi)有具體說(shuō)明則以等摩爾比例，提供用于結(jié)合到一個(gè)特定可變位置上的選擇氨基酸混合物，制備B或T細(xì)胞表位的含有構(gòu)建的合成抗原文庫(kù)(SSAL)的肽構(gòu)建體，例如，"OSSAL"(SEQIDNO:19)或"1、4、9PALINDROMICTh"(SEQIDNO:26)。完成所需肽免疫原的組裝后，應(yīng)用三氟乙酸按照標(biāo)準(zhǔn)程序處理樹(shù)脂，以從樹(shù)脂上切除肽，并使氨基酸側(cè)鏈上的功能基團(tuán)脫封閉。對(duì)于環(huán)狀肽，將切除下來(lái)的肽在15。/。DMSO的水溶液中溶解48小時(shí)，以促進(jìn)半胱氨酸之間鏈間二硫鍵的形成。切除、提取和清洗的肽通過(guò)HPLC純化，通過(guò)質(zhì)譜和反相HPLC鑒定特征。將它們用作研制疫苗的免疫原或評(píng)價(jià)其與免疫動(dòng)物獲得的血清的反應(yīng)性的抗原底物。豚鼠和豬的免疫，將三只DuncanHartley豚鼠(雌性，9周齡，450gm，未感染病毒)和豬'(雌性，9周齡)構(gòu)成的實(shí)驗(yàn)組用于和合成FMDVVP1目標(biāo)抗原肽免疫原的免疫原性研究。用每劑量100ug的含有本發(fā)明的肽組合物的單獨(dú)目標(biāo)抗原肽或其在特定佐劑制劑中乳化而成的混合FMDV疫苗，在第0周和第3周肌內(nèi)注射免疫每只動(dòng)物。在0、3、5和8或10周對(duì)動(dòng)物取血，進(jìn)行免疫原性測(cè)試。免疫原性評(píng)價(jià)合成目標(biāo)抗原肽免疫原的免疫原性測(cè)試通過(guò)基于合成FMDVVPl肽的ELISA，利用僅含目標(biāo)中和位點(diǎn)的相應(yīng)FMDVVPl目標(biāo)抗原肽僅作為固相抗原進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)連續(xù)稀釋的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清，陽(yáng)性效價(jià)表示為稀釋度倒數(shù)的Logl。。血清陽(yáng)性樣品收集成組，通過(guò)確定抗下述多種FMDV分離株的中和活性擴(kuò)大免疫原性測(cè)試?；诤铣蒝Pl(AA134-168)肽的ELISA在用100uL5ug/mlFMDVVPl位點(diǎn)肽的10mLNaHC03緩沖液(pH9.5)于37'C保溫1小時(shí)涂布的96孔肽涂布平板中，進(jìn)行基于肽的ELISA。將250uL3%重量百分比的明膠PBS溶液加入肽涂布孔中，于37'C保溫1小時(shí)，以阻斷非特異性蛋白結(jié)合位點(diǎn)，用含有體積比為0.05%TWEEN20的PBS沖洗3次，然后干燥。用含有體積比20%的正常山羊血清、重量比1°/。的明膠、和體積比0.05%的TWEEN的PBS溶液，以1:20(體積體積)的稀釋度稀釋實(shí)驗(yàn)樣品，除非另有說(shuō)明。將100uL稀釋樣品加入各孔，使其在37T:反應(yīng)1小時(shí)。然后用體積比0.05%TWEEN20的PBS沖洗各孔6次，除去未結(jié)合的標(biāo)記抗體。將lOOtxL辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗-豚鼠或抗豬IgG以預(yù)先確定的優(yōu)化稀釋度在體積比1%的正常山羊血清、體積比0.05%的TWEEN20的PBS中形成的溶液加入各孔，在37。C保溫15分鐘。用體積比0.05%TWEEN20的PBS沖洗各孔6次，除去未結(jié)合的標(biāo)記抗體結(jié)合物，然后與100UL含有重量比0.04%的間苯二胺(OPD)和體積比0.12%的過(guò)氧化氫的檸檬酸鈉緩沖液(pH5.0)反應(yīng)15分鐘。加入100uL1.0MH2S04中止反應(yīng)，測(cè)定492mn(A492)的吸收度。在對(duì)吸收度進(jìn)行線性回歸分析，并將截止點(diǎn)六492設(shè)置為0.5的基礎(chǔ)上，計(jì)算表示為L(zhǎng)og^的ELISA效價(jià)。EMDV病毒在密封條件下，在PlumIsland動(dòng)物疾病中心，USDA(Greenport，NY)，基本上如Brown和Cartwright(遺傳微生物雜志，1963，31:179-186)所述將各種FMDV病毒株(例如，血清型A的A^和A24、血清型O的O!、02等)在小倉(cāng)鼠腎(BHK)細(xì)胞單層中生長(zhǎng)，然后，用1%SDS或l%NonidetP-40處理沉淀，之后進(jìn)行15-45%蔗糖梯度離心純化。將各離心管中的內(nèi)容物泵入波長(zhǎng)設(shè)置在260nm的流動(dòng)細(xì)胞分光光度計(jì)，鑒定和分離純化的病毒峰。FMDV中和活性的血清學(xué)評(píng)價(jià)從豬(前大靜脈)和豚鼠(心臟穿刺)采集的血液處理血清樣品，在-2CTC保藏直到用于實(shí)驗(yàn)。通過(guò)在一系列不斷增加病毒濃度，應(yīng)用上述制備的各種血清型等分樣(10000MPD5Q)進(jìn)行中和確定，對(duì)由l:100稀釋度的血清樣品中和的病毒進(jìn)行列舉。通過(guò)操作的實(shí)驗(yàn)方法(Morgan和Moore,AmJVetRes,1990，51:40-45)產(chǎn)生的在l:100稀釋度時(shí)提供FMDV微噬斑降低2.5LoglO的血清的動(dòng)物，對(duì)于抗FMDV感染的保護(hù)性免疫是高度可預(yù)測(cè)的。實(shí)施例2通過(guò)序列信息和免疫刺激元件優(yōu)化'FMDV目標(biāo)抗原肽表7中描述了7種FMDVVPl血清型A肽。排列它們相應(yīng)的VPl氨基酸序列，并如表1中那樣編號(hào)。該組的攜帶Th的肽具有鑒定作表5中描述的VPl21-40(SEQIDNO:24)的自體固有FMDVTh，其序列如下Glu-Thr-Gln-Ile-Gln-Arg-Arg-Gin-His-Thr-Asp-Val-Ser-Phe-Ile-Met-Asp-Arg-Phe-Val(SEQIDNO:24)。詳細(xì)描述了表7中七個(gè)構(gòu)建體中的五個(gè)的序列，表示為SEQIDNOS:1、2、和27-29。合成了這些肽，產(chǎn)生的免疫血清進(jìn)行免疫原性評(píng)價(jià)。通過(guò)肽-ELISA分析了初始免疫5周后得到的血清的FMDVVPl肽的反應(yīng)性，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)FMDV中和分析，應(yīng)用病毒株AFP作為目標(biāo)病毒分析了其中和FMDV血清型A的能力。血清的效力表示為血清稀釋度為1:IOO時(shí)，Log!?？笷MDVVPlELISA效價(jià)和Log1Q被中和的FMDVAfp(MPD50)。結(jié)果無(wú)Th和環(huán)化的A^(134-159)肽p2228a，以及無(wú)環(huán)化的p2229c分別在三只動(dòng)物中的一只和三只動(dòng)物中的二只誘導(dǎo)抗-肽抗體應(yīng)答。相比較而言，較長(zhǎng)的肽p2224a、A12(134-169)，以及較長(zhǎng)的環(huán)化肽在三只動(dòng)物中的三只均具有免疫原性。另外，環(huán)化的Au(134-159)肽p2233c在三只豚鼠中的三只均具有免疫原性。在免疫反應(yīng)血清樣品中，所有七個(gè)肽構(gòu)建體的ELISA效價(jià)相似。然而，通過(guò)評(píng)價(jià)血清中和活性，肽構(gòu)建體之間觀察到明顯的差異，其順序排列為p2228a<p2224a<p2229c<p2225c<p2223a<p2236c.基于該中和效力的排列順序，得出下列關(guān)于優(yōu)化的FMDVVP1抗原肽的結(jié)論(1)覆蓋從134-169位氨基酸殘基的較長(zhǎng)肽構(gòu)建體提供較高的中和效力，因此比其它較短序列(AA134-159)(例如，p2224a〉p2228a，p2225c>p2229c,andp2236c>p2233c)更為優(yōu)選；(2)人工環(huán)化合成構(gòu)建體提供更理想的構(gòu)象，因此比它們的相應(yīng)非環(huán)化構(gòu)建體(例如，p2223a>p2229candp2236c>p2225c)更為優(yōu)選；含有免疫刺激元件的合成構(gòu)建體提供更高的中和效力，因此比沒(méi)有免疫刺激元件的構(gòu)建體(例如，p2236c>p2223a;p2229c>p2228a;andp2225c>p2224a)更為優(yōu)選。實(shí)施例3應(yīng)用提供廣泛FMDV中和作用的VP1蛋白質(zhì)的超可變區(qū)共有序列的合成構(gòu)建體按照表l(SEQIDNO:11)所示的共有血清型O序列，設(shè)計(jì)應(yīng)用共有VP1目標(biāo)抗原位點(diǎn)的兩個(gè)合成的環(huán)狀構(gòu)建體。用包括Irw結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:22)和表6所示的人工SSALTh(SEQIDNO:26)的免疫刺激元件合成一種共有序列肽。合成了無(wú)附加免疫刺激元件序列的其它構(gòu)建體。這些FMDVVP'1構(gòu)建體的全部結(jié)構(gòu)描述為表8a的p2569a(SEQIDNO:11)，和表8b(SEQIDNO:30)的p2570c。對(duì)超免疫豚鼠初始免疫3和5周后得到的血清，通過(guò)肽ELISA評(píng)價(jià)其F'MDVVP1肽的反應(yīng)性，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)FMDV中和分析，應(yīng)用FMDV病毒株AFP、O-IPI、O-lTaiwan、OFran、OTaiwan、Okauf和Asia1作為目標(biāo)病毒評(píng)價(jià)它們中和FMDV多種血清型O、A和Asia的能力。當(dāng)單次免疫證明兩種合成FMDV免疫原的高免疫效力后的第3周，觀察到高抗-FMDVVPl肽抗體效價(jià)。然而，早在初始免疫后第3周看到的血清的高中和活性，以及其對(duì)交叉血清型A、O、和Asia的特異性的寬范圍是沒(méi)有預(yù)料到的。該廣泛范圍的中和活性在甚至從滅活病毒儲(chǔ)備液制得的最好FMDV疫苗中也很少觀察到。FMDV目標(biāo)抗原肽的共有序列設(shè)計(jì)為廣泛反應(yīng)性中和活性的FMDV疫苗提供了基礎(chǔ)。實(shí)施例4改善FMDVVP1免疫原性和FMDV中和范圍寬度的人工Th和SSAL目標(biāo)抗原肽設(shè)計(jì)了兩種目標(biāo)抗原肽，pl522b(SEQIDNO:31)和pl592c(SEQIDNO:32)，每種具有作為構(gòu)建的合成抗原文庫(kù)(SSAL)的FMDV目標(biāo)抗原位點(diǎn)。這兩種肽在表9中描述。pl522b(SEQIDNO:31)的SSAL目標(biāo)抗原位點(diǎn)是從表3中的血清型0亞型編輯得到的G-H環(huán)VPl區(qū)的一種完全代表。該目標(biāo)抗原位點(diǎn)按照表3所示的"OSSAL(完全)"序列(SEQIDNO:19)設(shè)計(jì)。同樣，.pl592c含有一種代表表4列出的血清型Asia亞型的所有G-H環(huán)序列的SSAL目標(biāo)抗原位點(diǎn)。該Asia的SSAL位點(diǎn)按照表4所示的"AsiaSSAL"序列(SEQIDNO:21)設(shè)計(jì)。將在表6中被稱為"SynTh(1、2、4)"(SEQIDNQ:25)的人工Th連接于1522b和pl592c，以產(chǎn)生免疫原性，將Inv免疫刺激位點(diǎn)(SEQIDNO:22)偶聯(lián)到pl592c上。合成了這兩種SSAL目標(biāo)抗原肽，用于如實(shí)施例1所述超免疫3只豚鼠的實(shí)驗(yàn)組。通過(guò)肽-ELISA評(píng)價(jià)初始免疫后五周和十周得到的血清的FMDVVPl肽反應(yīng)性，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)FMDV中和分析，應(yīng)用FMDV病毒株Al、A12FP、AFL、A23、0-iJH、O-lp2、和Asial作為目標(biāo)病毒評(píng)價(jià)它們中和FMDV血清型O、A和Asia的能力。結(jié)杲如表9所示。pl522b和pl592c初始免疫后5周均誘導(dǎo)高抗目標(biāo)抗原位點(diǎn)(>5.0Log1())抗-肽效價(jià)(沒(méi)有進(jìn)行更早的取血)。觀察到這兩種抗血清對(duì)屬于三種不同血清型(即，A、O和Asia)的所有七種FMDV病毒株具有廣泛和有效FMDV中和作用，盡管這些病毒株和血清型序列之間存在廣泛的變異。這證明了SSAL在設(shè)計(jì)針對(duì)高可變性目標(biāo)抗原/功能位點(diǎn)的基于合成肽的疫苗中的有用性。SSAL用于設(shè)計(jì)FMDV目標(biāo)抗原肽提供了廣泛反應(yīng)性中和活性FMDV疫苗的基礎(chǔ)。實(shí)施例5保護(hù)性FMDV中和作用的多種血清型混合物表10中描述了具有合成肽pl520b、pl522b、和pl888b(SEQIDNO:33、31和34)的三種SSAL目標(biāo)抗原肽混合物。該混合物包括連接于人工Th表位"SynTh(1、2、4)"(SEQIDNO:25)的代表血清型A(SEQIDNO:15，表2)、血清型0(SEQIDNO:19，表3)、和血清型Asia(SEQIDNO:35，表10)的SSAL目標(biāo)抗原位點(diǎn)。該混合物用于接種3只豚鼠的動(dòng)物組。將100ug劑量0周在弗氏完全佐劑中，第3周在弗氏不完全佐劑中分3周給藥。通過(guò)用于FMDVVP1抗原位點(diǎn)的肽ELISA，和FMDV中和分析，其中來(lái)自最近一次爆發(fā)的未知VP1序列的病毒株，Ol-Taiwan用作目標(biāo)病毒，評(píng)價(jià)初始免疫之后得到的血清的免疫原性。所有三只豬對(duì)免疫均產(chǎn)生高抗-肽反應(yīng)性的應(yīng)答(平均FMDVVPlELISA效價(jià)未3.7LogH))。盡管FMDV01-TaiwanVP1序列的性質(zhì)未知，從三次接種的宿主得到的1:IOO稀釋的濃縮血清證明其具有顯著的中和活性，即4.5Log!o。該水平的中和活性預(yù)測(cè)可用于FMDV感染的保護(hù)性免疫?；赑himIsland動(dòng)物疾病中心，USDA(M或gan和Mo或e,1990)在預(yù)測(cè)一種疫苗的FMDV保護(hù)性質(zhì)方面積累的大量經(jīng)驗(yàn)來(lái)看，在體外分析中能夠中和2Log1QFMDV(MPD50)的血清預(yù)期在接種宿主中對(duì)抗FMDV感染具有有效的保護(hù)作用。該觀察與用本發(fā)明的保護(hù)豬(一種疫苗的目標(biāo)宿主)免受感染的具保護(hù)作用的肽組合物接種的免疫應(yīng)答相關(guān)。證明了本發(fā)明的FMDVVP1肽組合物作為一種有效的普遍性FMDV疫苗(即，有效地抗多種血清型的抗原性可變分離株)的潛力，以及自從早在二十世紀(jì)五十年代應(yīng)用滅活FMDV疫苗以來(lái)沒(méi)有實(shí)現(xiàn)的任務(wù)。實(shí)施例6評(píng)價(jià)免疫狀況的肽將本發(fā)明的肽加入ELISA實(shí)驗(yàn)，用于評(píng)價(jià)有接觸FMDV和接種的已知狀況畜群的血清反應(yīng)性。選擇使用的肽為具有代表性的用于接種的FMDV病毒株，認(rèn)為該肽與動(dòng)物可能接觸的野生病毒株具有同樣的血清型。制備用于診斷實(shí)驗(yàn)的試劑盒，其曾在"基于合成VP1(AA134-168)肽的ELISA"實(shí)施例l部分中描述過(guò)。將平板用相應(yīng)于病毒株OlCampos(p2463=AA128-158(T—C)-169)和病毒株OlManisa(p2466=AA128-158(T—C)-169)的VP1肽作為固相抗原涂布。將這些試劑盒用于測(cè)試從曾經(jīng)歷FMD爆發(fā)9個(gè)月的農(nóng)村畜群收集到的血清樣品。將這些畜群按照它們的已知狀況分成"可能感染"和"由于接種可能感染"(從經(jīng)歷爆發(fā)的區(qū)域)、"接種"、和"正常"(從認(rèn)為沒(méi)有FMDV的區(qū)域)。吸收度顯示在或高于強(qiáng)烈反應(yīng)性對(duì)照的吸收度截止點(diǎn)0.2倍的樣品記錄為反應(yīng)性。結(jié)果如表11所示。這些結(jié)果表明，基于肽的ELISA對(duì)畜群的接觸具有預(yù)測(cè)性。接觸的畜群表現(xiàn)明顯的反應(yīng)性，約為20%，而來(lái)自正常畜群的動(dòng)物沒(méi)有反應(yīng)性。如果在比9個(gè)月更接近爆發(fā)的時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，接觸畜群的20%反應(yīng)性可能還會(huì)高。應(yīng)用來(lái)自幾個(gè)供應(yīng)商的常規(guī)疫苗的各種接種程序的功效中，接種畜群的結(jié)果表現(xiàn)了出乎意料的可變性程度、高可變性的反應(yīng)性。本發(fā)明引證的所有參考文獻(xiàn)被參考插入其中。<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><image>imageseeoriginaldocumentpage36</image>表3<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>表4FMDV血清型Asia亞型的VP1序列排列<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>bacchiestrain"表示"疫苗病毒株"<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>表7FMDV目標(biāo)抗原肽的序列、構(gòu)象和免疫刺激元件的優(yōu)化<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>a天然VP1序列的N134由C取代。b天然VP1序列的Q158由C取代。c初始免疫后第5周，3只動(dòng)物實(shí)驗(yàn)組的應(yīng)答動(dòng)物數(shù)目。dELISA反應(yīng)性動(dòng)物的匯集血清的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。e用于中和分析的稀釋I:100的血清。<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>a天然序列的T158取代為C。b初始后免疫的周數(shù)。cELISA-反應(yīng)性動(dòng)物中得到的匯集血清的反應(yīng)性。d用于稀釋1:100的中和分析的血清。200810144138.3轉(zhuǎn)溢齒被37/1005t<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>有效FMDV中和作用的多種血清型混合物<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>a初始免疫后第3周收集血清樣品。bELISA-反應(yīng)性動(dòng)物中得到的匯集血清的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。c用于的中和分析的稀釋l:IOO的血清。dA2/Asia調(diào)整的SSAL[134(N—C)-158(Q—C)-169](SEQIDNO:35)200810144138.3勢(shì)s步被39/1005x表11<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人Wang,ChangYiShen，Ming(ii)發(fā)明名稱口蹄疫的合成肽疫苗(iii)序列號(hào)37(iv)通訊地址(A)地址Morgan&Finnegan,L.L.R(B)街道345ParkAvenue(C)城市NewYork(D)州NY(E)國(guó)家USA(F)ZIP:10154-0054(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體形式:軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBMPC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)Windows95(D)軟件Word97(vi)當(dāng)前申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)朥S09/100,600(B)申請(qǐng)日20-Jun-1998(C)分類(lèi)號(hào)(viii)代理人/代理信息(A)姓名MariaC.H.Lin(B)注冊(cè)號(hào)29,323(C)參考/案巻號(hào)1151-4156(ix)電訊信息.(A)電話212-758-4800(B)傳真212-75卜6849(2)SEQIDNO:1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度35氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線形(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQIDNO:l:AsnLysTyrSerAlaSerGlySerGlyValArgGly1510AspPheGlySerLeuAlaProArgValAlaArgGin1520LeuProAlaSerPheAsnTyrGlyAlalieLys253035(2)SEQIDNO:2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度35氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線形(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQIDNO:2:CysLysTyrSerAlaSerGlySerGlyValArgGly1510AspPheGlySerLeuAlaProArgValAlaArgCys1520LeuProAlaSerPheAsnTyrGlyAlalieLys253035(2)SEQIDNO:3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度46氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線形(ii)分子類(lèi)型肽ValLeuAlaThrValTyrAsnGlyThrCysLysTyr1510SerAlaSerGlySerGlyValArgGlyAspPheGly1520SerLeuAlaProArgValAlaArgCysLeuProAla253035SerPheAsnTyrGlyAlalieLysAlaGlu4045(2)SEQIDNO:4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度36氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線形(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQIDNO:4:CysLysTyrSerSerLysAlaValProAsnValArg1510GlyAspLeuAsnValLeuGluGinLysAlaAlaArg1520ThrLeuProThrSerPheAsnTyrGlyAlalieLys253035(2)SEQIDNO:5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度36氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線形(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQIDNO:5:CysLysTyrSerSerLysAlaValProAsnValArg1510GlyAspLeuAsnValLeuGluGinLysAlaAlaArg1520CysLeuProThrSerPheAsnTyrGlyAlalieLys253035(2)SEQIDNO:6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度34氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線形(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQIDNO:6:ArgProTyrGlyGluThrThrSerArgArgGlyAsp1510MetAlaAlaLeuAlaGinArgLeuSerAlaArgLeu1520ProThrSerPheAsnTyrGlyAlaValLys2530(2)SEQIDNO:7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度34氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線形(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQIDNO:7:CysProTyrGlyGluThrThrSerArgArgGlyAsp1510MetAlaAlaLeuAlaGinArgLeuSerAlaCysLeu1520ProThrSerPheAsnTyrGlyAlaValLys2530(2)SEQIDNO:8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度35氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線形(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQIDNO:8:AsnLysTyrSerValSerGlySerGlyArgArgGly1510AspLeuGlySerLeuAlaAlaArgValAlaLysGin1520LeuProAlaSerPheAsnTyrGlyAlalieLys253035(2)SEQIDNO:9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度35氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線形(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQIDNO:9:CysLysTyrSerValSerGlySerGlyArgArgGly1510AspLeuGlySerLeuAlaAlaArgValAlaLysCys1520LeuProAlaSerPheAsnTyrGlyAlalieLys253035(2)SEQIDNO:10的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度36氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線形(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQIDNO:10:CysLysTyrGlyGluAsnAlaValThrAsnValArg1510GlyAspLeuGinValLeuAlaGinLysAlaAlaArg1520ThrLeuProThrSerPheAsnTyrGlyAlalieLys253035(2)SEQIDNO:ll的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度36氨基酸(B)類(lèi)型氮基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線形(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQIDNO:11:CysLysTyrGlyGluAsnAlaValThrAsnValArg1510GlyAspLeuGinValLeuAlaGinLysAlaAlaArg1520CysLeuProThrSerPheAsnTyrGlyAlalieLys(2)SEQIDNO:12的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度34氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線形(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQIDNO:12:ThrThrTyrGlyThrGinProSerArgArgGlyAsp1510MetAlaAlaLeuAlaGinArgLeuSerArgArgLeu1520ProThrSerPheAsnTyrGlyAlaValLys2530(2)SEQIDNO:13的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度:34氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線形(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQIDN0:13:CysThrTyrGlyThrGinProSerArgArgGlyAsp1510MetAlaAlaLeuAlaGinArgLeuSerArgCysLeu1520ProThrSerPheAsnTyrGlyAlaValLys2530C2)SEQIDNO:14的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度35氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線形(ii)分子類(lèi)型肽(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置1(D)其它信息/注="Asn，Ser或Gly"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置4(D)其它信息/注="Ser,Thr或Ala"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置5(D)其它信息/注="Val或Ala"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置6(D)其它信息/注-"Ser，Gly或Asp"(ix)特征:(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置8(D)其它信息/注="Ser,Thr或Met"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置9(D)其它信息/注="Gly或Asn"(ix)特征:(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置10(D)其它信息/注="Arg或Val"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置14(D)其它信息/注="Leu，Met或Phe"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置15(D)其它信息/注="Gly或Glu"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置16(D)其它信息/注="Ser或Pro"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置19(D)其它信息/注="Ala或Pro"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置22(D)其它信息/注="Ala或Val"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置23(D)其它信息/注="Lys,Arg或Ala"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置24(D)其它信息/注="Gin或Ala"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置27200810144138.3說(shuō)明書(shū)第53/100頁(yè)(D)其它信息/注="Ala或Thr"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置31(D)其它信息/注="Tyr或Phe"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置34(D)其它信息/注="lie或Val"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置35(D)其它信息/注="Lys或GIn"(xi)序列描述SEQIDNO:14:XaaLysTyrXaaXaaXaaGlyXaaXaaXaaArgGly1510AspXaaXaaXaaLeuAlaXaaArgValXaaXaaXaa1520LeuProXaaSerPheAsnXaaGlyAlaXaaXaa253035(2)SEQIDNO:15的信息:(i)序列特征:(A)長(zhǎng)度:35氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線形(ii)分子類(lèi)型肽(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置4(D)其它信息/注—'Ser,Thr或Ala"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置5(D)其它信息/注="Val或Ala"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置6(D)其它信息/注="Ser，Gly或Asp"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置8(D)其它信息/注="Ser,Thr或Met"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置9(D)其它信息/注^'Gly或Asn"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置10(D)其它信息/注="Arg或Val"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置14(D)其它信息/注="Leu，Met或Phe"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置15(D)其它信息/注="Gly或Glu"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置16(D)其它信息/注="Ser或Pro"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置19(D)其它信息/注-"Ala或Pro"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置22(D)其它信息/注？Ala或Var(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置23(D)其它信息/注="Lys，Arg或Ala"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置27(D)其它信息/注="Ala或Thr"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置31(D)其它信息/注—Tyr或Phe"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置34(D)其它信息/注="lie或Val"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置35(D)其它信息/注="Lys或Gln"(xi)序列描述SEQIDNO:15:CysLysTyrXaaXaaXaaGlyXaaXaaXaaArgG!y1510AspXaaXaaXaaLeuAlaXaaArgValXaaXaaCys1520LeuProXaaSerPheAsnXaaGlyAlaXaaXaa253035(2)SEQIDNO:16的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度34氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線形(ii)分子類(lèi)型肽(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置1(D)其它信息/注-"Asn,Ser或Gly"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置2(D)其它信息/注="Lys或Arg"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置:3(D)其它信息/注="Tyr或Ser"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置4(D)其它信息:/注="Ser或Pro"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置:5(D)其它信息/注="Thr，Ala,Pro,Arg,Ser或Asn"(ix)特征CA)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置6(D)其它信息/注="Asp，Gly,Ser,Ala,Pro或Leu"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置7(D)其它信息/注—'Gly，Asp或Arg"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置8(D)其它信息/注^'Pro，Ser，Arg,Thr，Val,Gln或Leu"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置9(D)其它信息/注="Arg,Gly或Tyr"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置10(D)其它信息/注="Arg，Ser,Ala,Gly或Pro"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置11(D)其它信息/注="Gly或Asp"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置12(D)其它信息/注="Asp或Pro"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置13(D)其它信息/注="Leu，Met,Thr或Arg"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置14(D)其它信息/注="Gly,Pro或Trp"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置15(D)其它信息/注^Ser，Pro,Ala或Arg"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置16(D)其它信息/注="Leu，Pro，Thr或lie"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置17(D)其它信息/注="Ala,Thr,Leu，Arg或lie"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置18(D)其它信息/注="Ala,Gly,Thr或Gin"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置19(D)其它信息/注="Arg,Glu或Lys"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置20(D)其它信息/注="Ala,Val,Asp,Thr或Tyr"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置21(D)其它信息/注？Ala或Arg"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置22(D)其它信息/注="Lys,Thr,Arg或Ala"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置24(D)其它信息/注="Leu或Pro"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置25(D)其它信息/注—'Pro或Ser"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置26(D)其它信息/注="Ala或Thr"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置30(D)其它信息/注="Tyr或Phe"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置33(D)其它信息/注="lie或Val"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置34(D)其它信息/注="Arg，Lys或Gin"(xi)序列描述SEQIDNO:16:XaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaa1510XaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaGinXaa1520XaaXaaSerPheAsnXaaGlyAlaXaaXaa2530(2)SEQIDNO:17的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度34氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線形(ii)分子類(lèi)型肽(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置2(D)其它信息/注="Lyr或Arg"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置:3(D)其它信息/注="Tyr或Ser"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置4(D)其它信息/注="Ser或Pro"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置5(D)其它信息/注="Thr,Ala,Pro，Arg,Ser或Asn"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置6(D)其它信息/注="Asp，Gly,Ser,Ala,Pro或Leu"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置7(D)其它信息/注="Asp,Gly或Arg"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置8(D)其它信息/注-"Pro，Ser,Arg,Thr,Val,Gln或Leu"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置9(D)其它信息/注="Arg，Gly或Tyr"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置10(D)其它信息/注="Arg，Ser,Ala,Gly或Pro"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置11(D)其它信息勝="Gly或Asp"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置12(D)其它信息:勝="Asp或Pro"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置13(D)其它信息/注="Leu，Met,Thr或Arg"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置14(D)其它信息/注="Gly,Pro或Trp"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置15(D)其它信息/注="Ser,Pro,Ala或Arg"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置16(D)其它信息/注="Leu，Pro,Thr或lie"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置17(D)其它信息/注="Ala,Thr，Leu,Arg或lie"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置18(D)其它信息/注="Ala，Gly,Thr或Gin"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置19(D)其它信息/注-"Arg,Glu或Lys"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置20(D)其它信息/注="Ala，Bal，Asp，Thr或Tyr"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置21(D)其它信息/注="Ala或Arg"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置22(D)其它信息/注="Lys，Thr,Arg或AIa"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置24(D)其它信息/注="Leu或Pro"(ix)特:征:(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置25(D)其它信息/注="Pro或Ser"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置26(D)其它信息:/注="Ala或Thr"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置30(D)其它信息勝="Tyr或Phe"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置33(D)其它信息/注y'Ile或Val"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置34(D)其它信息/注="Arg，Lys或Gin"(xi)序列描述<image>imageseeoriginaldocumentpage71</image>(2)SEQIDNO:18的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度36氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線形(ii)分子類(lèi)型肽(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置1(D)其它信息/注="Cys或Ser"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置2(D)其它信息/注="Lys,Arg或Gin"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置4(D)其它信息/注="Gly,Ser或Asn"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置5(D)其它信息/注="Glu,Ser,Asp，Thr，Lys或Asn"(ix)特征'(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置6(D)其它信息/注="Asn，Ser,Gly,Val或Trp"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置7(D)其它信息/注="Ala,Ser,Thr或Gly"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置9(D)其它信息/注="Thr，Pro或AIa"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置10(D)其它信息/注="Asn或Ala"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置11(D)其它信息/注="Val,Ile或Leu"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置15(D)其它信息/注="Leu,Pro或Gin"(ix)特征:(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置16(D)其它信息/注="Gin或Asn"(ix)特征:(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置17(D)其它信息/注—'Val，Ala或Leu"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置19(D)其它信息/注="Ala，Glu或Ser"(ix)特征:(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置20(D)其它信息:/注="Gln或Arg"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置22(D)其它信息/注="Ala或Val"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置23(D)其它信息/注="Ala或Glu"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置25(D)其它信息/注-"Thr，Ala或Met"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置:28(D)其它信息/注—Thr或AIa'1(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置29(D)其它信息/注-"Ser或Tyr"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置36(D)其它信息/注="Lyr或Arg"(xi)序列描述SEQIDN0:18:XaaXaaTyrXaaXaaXaaXsaValXaaXaaArg1510GlyAspXaaXaaXaaLeuXaaXaaLysXaaXaaArg1520XaaLeuProXaaXaaPheAsnTyrGlyAlalieXaa253035(2)SEQIDNO:19的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度:36氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線形(ii)分子類(lèi)型肽(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置2(D)其它信息/注="Lys,Arg或Gin"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置4(D)其它信息/注="Gly,Ser或Asn"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置5(D)其它信息/注="Glu,Ser,Asp,Lys或Asn"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置6(D)其它信息/注="Asn,Ser,Gly或T卬"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置7(D)其它信息/注="Ala,Ser或Thr"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置9(D)其它信息:/注="Thr，Pro或Ala"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置10(D)其它信息/注="Asn或Ala"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置ll(D)其它信息/注="Val,Ile或Leu"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置15(D)其它信息/注="Leu,Pro或Gin"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置16(D)其它信息/注="Gin或Asn"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置17(D)其它信息/注="Val,Ala或Leu"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置19(D)其它信息/注="Ala，Glu或Ser"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置20(D)其它信息/注="Gln或Arg"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置22(D)其它信息/注—'Ala或Val"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置23(D)其它信息/注-"Ala或Glu"(ix)特征:(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置25(D)其它信息/注一'Thr,Ala或Met"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置28(D)其它信息/注='Thr或Ala"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置29(D)其它信息/注="Ser或Tyr"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置36(D)其它信息/注="Lyr或Arg"(xi)序列描述SEQIDNO:19:CysXaaTyrXaaXaaXaaXaaValXaaXaaXaaArg1510GlyAspXaaXaaXaaLeuXaaXaaLysXaaXaaArg1520XaaLeuProXaaXaaPheAsn丁yrGlyAlaHeXaa253035(2)SEQIDNO:20的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度34氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線形(ii)分子類(lèi)型肽(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置1(D)其它信息/注="Thr,Pro或Arg"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置2(D)其它信息/注-"Thr或Pro"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置5(D)其它信息/注^Thr,Glu或Lys"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置6(D)其它信息/注="Gin或Thr"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置7(D)其它信息/注^Pro或Thr"(ix)特征(A)名稱/耍點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置8(D)其它信息/注="Ser或Thr"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置13(D)其它信息/注="Met或Leu"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置15(D)其它信息:/注？Ala或Val"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置20(D)其它信息/注="Leu或Val"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置22(D)其它信息/注-"Arg,Asn或Ala"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置23(D)其它信息/注="Arg或Gin"(xi)序列描述SEQIDNO:20:XaaXaaTyrGlyXaaXaaXaaXaaArgArgGlyAsp15iOXaaAlaXaaLeuAlaGinArgXaaSerXaaXaaLeu1520ProThrSerPheAsnTyrGlyAlaValLys2530(2)SEQIDNO:21的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度34氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線形(ii)分子類(lèi)型肽(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置2(D)其它信息/注="Thr或Pro"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置5(D)其它信息/注="Thr，Glu或Lys"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置6(D)其它信息/注="Gln或Thr"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置7(D)其它信息/注="Pro或Thr"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置8(D)其它信息/注="Ser或Thr"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置13(D)其它信息/注="Met或Leu"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置15(D)其它信息/注="Ala或Val"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置20(D)其它信息/注="Leu或Val"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置22(D)其它信息/注="Arg，Asn或Ala"(xi)序列描述SEQIDN0:21:CysXaaTyrGlyXaaXaaXaaXaaArgArgGlyAsp1510XaaAlaXaaLeuAlaGinArgXaaSerXaaCysLeu1520ProThrSerPheAsnTyrGlyAlaValLys2530(2)SEQIDNO:22的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度16氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線形(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQIDNO:22:ThrAlaLysSerLysLysPheProSerTyrThrAla1510ThrTyrGinPhe15(2)SEQIDNO:23的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度:6氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線形(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQIDNO:23:ProProXaaProXaaPro15(2)SEQIDNO:24的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度:20氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線形(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQIDNO:24:GIuThrGinlieGinArgArgGinHisThrAspVal1510SerPhelieMetAspArgPheVal1520(2)SEQIDNO:25的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線形(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQIDNO:25:LysLysLyslielieThrlieThrArglielieThr510lielieThrThrlieAsp15(2)SEQIDNO:26的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線形(ii)分子類(lèi)型肽(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置4(D)其它信息/注="Ser或Thr"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置7(D)其它信息/注="Lyr或Arg"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置8(D)其它信息/注="Gly或Thr"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置12(D)其它信息/注="His或Thr"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置13(D)其它信息/注="Ser或Thr"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置13(D)其它信息/注="Lys或Arg"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置16(D)其它信息/注="Gly或Thr"(xi)序列描述SEQIDNO:26:lieSerlieXaaGlulieXaaXaaVallieValXaa1510XaalieGluXaalieLeuPhe15(2)SEQIDNO:27的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度:65氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線形(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQIDNO:27:ThrAlaLysSerLysLysPheProSerTyrThrAla1510ThrTyrGinPheGlyGlyGluThrGinlieGinArg1520ArgGinHisThrAspValSerPhelieMetAspArg253035PheValGlyGlyCysLysTyrSerAlaSerGlySer4045GlyValArgGlyAspPheGlySerLeuAlaProArg505560ValAlaArgCysLeu65(2)SEQIDNO:28的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度75氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線形(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQIDNO:28:ThrAlaLysSerLysLysPheProSerTyrThrAla1510ThrTyrGinPheGlyGlyGluThrGinHeGinArg1520ArgGinHisThrAspValSerPhelieMetAspArg253035PheValGlyGlyAsnLysTyrSerAlaSerGlySer4045GlyValArgGlyAspPheGlySerLeuAlaProArg505560ValAlaArgGinLeuProAlaSerPheAsnTyrGly6570AlalieLys75(2)SEQIDNO:29的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度75氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線形(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQIDNO:29:ThrAlaLysSerLysLysPheProSerTyrThrAla1510ThrTyrGinPheGlyGlyGluThrGinlieGinArg1520ArgGinHisThrAspValSerPhelieMetAspArg253035PheValGlyGlyCysLysTyrSerAlaSerGlySer4045GlyValArgGlyAspPheGlySerLeuAlaProArg505560ValAlaArgCysLeuProAlaSerPheAsnTyrGly6570AlalieLys75(2)SEQIDNO:30的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度80氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線形(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQIDNO:30:ThrAlaLysSerLysLysPheProSerTyrThrAla1510ThrTyrGinPheGlyGlylieSerlieSerGlulie1520LysGlyVallieValHisLyslieGluGlylieLeu253035PheGlyGlyValTyrAsnGlyAsnCysLysTyrGly4045GluAsnAlaValThrAsnValArgGlyAspLeuGin505560ValLeuAlaGinLysAlaAlaArgCysLeuProThr6570SerPheAsnTyrGlyAlalieLys7580(2)SEQIDNO:31的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度56氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線形(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQIDNO:31:LysLysLyslielieThrlieThrArglielieThr1510lielieThrThrlieAspGlyGlyCysLysTyrGly1520GluAsnAlaValThrAsnValArgGlyAspLeuGin253035ValLeuAlaGinLysAlaAlaArgCysLeuProThr4045SerPheAsnTyrGlyAlalieLys5055(2)SEQIDNO:32的信息(i)序列特征:(A)長(zhǎng)度72氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線形(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQIDNO:32:ThrAlaLysSerLysLysPheProSerTyrThrAla1510ThrTyrGinPheGlyGlyLysLysLysHelieThr520lieThrArglielieThrlielieThrThrlieAsp253035GlyGlyCysThrTyrGlyThrGinProSerArgArg4045GlyAspMetAlaAlaLeuAlaGinArgLeuSerArg505560CysLeuProThrSerPheAsnTyrGlyAlaValLys6570(2)SEQIDNO:33的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度55氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線形(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQIDNO:33:LysLysLyslielieThrlieThrArglielieThr510lielieThrThrlieAspGlyGlyCysLysTyrSer1520ValSerGlySerGlyArgArgGlyAspLeuGlySer253035LeuAlaAlaArgValAlaLysCysLeuProAlaSer4045PheAsnTyrGlyAlalieLys5055(2)SEQIDNO:34的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度54氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線形(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQIDNO:34:LysLysLyslielieThrlieThrArgHeHeThr1510HelieThrThrlieAspGlyGlyCysLysTyrSer1520ThrAspGlyProArgArgGlyAspMetGlySerLeu253035AlaAlaArgAlaAlaLysCysLeuProAlaSerPhe4045AsnTyrGlyAlalieArg50(2)SEQIDNO:35的信息:(i)序列特征(A)長(zhǎng)度:34氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線形(ii)分子類(lèi)型肽(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置:2(D)其它信息/注="Lys,Thr,Pro或Arg"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置3(D)其它信息:/注="Tyr或Ser"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置4(D)其它信息/注="Ser,Gly或Pro"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置5(D)其它信息/注'Thr、Ala、Glu、Lys、Asn，Pro,Arg或Ser"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置6(D)其它信息/注」'Asp、Gly,Gln,Ser、Ala、Pro、Leu或Thr"(ix)特征:(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置7(D)其它信息/注="Gly、Pro、Asp、Arg或Thr"(ix)特:征:(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置8(D)其它信息/注-"Pro、Ser、Thr、Arg、Val、Gln或Leu"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置9(D)其它信息/注="Arg,Gly或Thr"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置10(D)其它信息/注="Arg、Ser、Ala、Gly或Pro"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置11(D)其它信息:/注="Gly或Asp"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置12(D)其它信息/注—'Asp或Pro"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置〗3(D)其它信息/注="Met、Leu、Thr或Arg"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置14(D)其它信息/注="Gly、Ala、Pro或Trp"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置15(D)其它信息/注^'Ser、Pro、Ala、Val或Arg"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置16(D)其它信息/注="Leu、Pro、Thr或lie"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置17(D)其它信息/注二Ala、Thr、Leu、lie或Arg"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置18(D)其它信息/注="Ala、Gln、Gly或Thr"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置19(D)其它信息/注—'Arg、Glu或Lys"(ix)特征:(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置20(D)其它信息/注="Ala、Val、Leu、Asp、Thr或Arg"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置21(D)其它信息/注="Ala、Ser或Arg"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置22(D)其它信息/注="Lys、Arg、Thr、Asn或Ala"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置24(D)其它信息/注="Leu、Pro或Thr"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置25(D)其它信息/注="Pro或Ser"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置26(D)其它信息:/注—Ala或Thr"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置30(D)其它信息/注="Tyr或Phe"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置33(D)其它信息/注—'Ile或Val"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置34(D)其它信息/注—Arg、Lys或Gln"(xi)序列描述SEQIDNO:35:CysXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaa1510XaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaCysXaa1520XaaXaaSerPheAsnXaaGlyAlaXaaXaa2530(2)SEQIDNO:36的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線形(H)分子類(lèi)型肽(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置1(D)其它信息/注^Ile、Met或Leu"(ix)特征(A)名稱/耍點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置2(D)其它信息/注」Ser或Thr"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置4(D)其它信息/注-"Ile或Arg"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置5(D)其它信息:/注="Lys或Thr"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置10(D)其它信息/注="His或Thr"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置11(D)其它信息/注="Lys或Arg"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置12(D)其它信息/注y'Ile、Met或Leu"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置14(D)其它信息/注="Gly或Thr"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置15(D)其它信息/注="Ile、Met或Val"(xi)序列描述SEQIDNO:36:XaaX犯GluXaaXaaGlyVallieValXaaXaaXaa1510GluXaaXaa15(2)SEQIDNO:37的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15氨基酸(B)類(lèi)型氮基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線形(ii)分子類(lèi)型肽(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置:2'(D)其它信息/注="Ser或Thr"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置5(D)其它信息/注="Lys或Arg"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置6(D)其它信息:/注="Gly或Thr"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置10(D)其它信息/注="His或Thr"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置11(D)其它信息:/注="Lys或Arg"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置14(D)其它信息/注="Gly或Thr"(xi)序列描述SEQIDNO:37:lieXaaGlulieXaaXaaVallieValXaaXaalie1510GluXaalie15(2)SEQIDNO:38的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線形(ii)分子類(lèi)型肽(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置3(D)其它信息/注—'Ile，Met或Leu"(ix)特征:(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置4(D)其它信息/注="Ser或Thr"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置7(D)其它信息/注="Lys或Arg"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置8(D)其它信息:/注="Gly或Thr"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置12(D)其它信息/注="His或Thr"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置13(D)其它信息/注="Lys或Arg"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置14(D)其它信息/注="He,Met或Leu"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置16(D)其它信息/注="Gly或Thr"(ix)特征(A)名稱/要點(diǎn)修飾位點(diǎn)(B)位置17(D)其它信息/注="lie,Met或Val"(xi)序列描述SEQIDNO:38:lieSerXaaXaaGlulieXaaXaaVallieValXaa1510XaaXaaGluXaaXaaLeuPhe1權(quán)利要求1.一種肽，其包含與Th表位綴合的FMDV的B細(xì)胞表位，所述B細(xì)胞表位選自由SEQIDNO1，4，6，8，10和12組成的組。2.根據(jù)權(quán)利要求l的肽，其中所述Th表位選自由SEQIDNO:25，26，36，37和38組成的組。3.根據(jù)權(quán)利要求2的肽，其中所述Th表位是SEQIDNO:37。4.根據(jù)權(quán)利要求1，2或3的肽，其還包含侵染素結(jié)構(gòu)域肽SEQIDNO:22。5.—種由下式代表的肽或肽綴合物(A)n-(FMDV抗原)－(B)。-(Th)m-X或(A)n-(Th)m-(B)。-(FMDV抗原)-X或(FMDV抗原)-(B)。-(Th)m-(A)n-X或(Th)m-(B)。-(FMDV抗原)－(A)n-X其中每個(gè)A獨(dú)立地為一種氨基酸、或一種一般性免疫刺激序列；每個(gè)B獨(dú)立地選自由下列各項(xiàng)組成的組氨基酸、-NHCH(X)CH2SCH2CO-、-NHCH(X)CH2SCH2CO(s-N)Lys-、-NHCH(X)CH2S-琥珀酰亞胺基ON)Lys-、和-NHCH(X)CH2S-(琥珀酰亞胺)-;每個(gè)Th獨(dú)立的是一種構(gòu)成輔助T細(xì)胞表位的氨基酸序列，或一種免疫增強(qiáng)類(lèi)似物或其片段；"FMDV抗原"是選自由SEQIDNO:l，4，6，8，10和12組成的組的氨基酸序列；X為氨基酸的a-COOH或a-CONH2;n為0至約10;m為1至約4;禾口o為0至約10。6.權(quán)利要求5的肽或肽綴合物，其中Th表位選自由下列各項(xiàng)組成的組已知的FMDVTh、來(lái)自外源病原體的已知Th、SEQIDNOS:25、26、36、37和38，及其免疫刺激類(lèi)似物或片段。7.權(quán)利要求5的肽或肽綴合物，其中至少一個(gè)A是侵染素結(jié)構(gòu)域(Inv)。8.權(quán)利要求7的肽或肽綴合物，其中侵染素結(jié)構(gòu)域選自由SEQIDNO:22及其免疫類(lèi)似物和片段組成的組。9.權(quán)利要求5的肽或肽綴合物，其中至少一個(gè)B為Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(SEQIDNO:23)，其中Xaa是任意氨基酸。10.權(quán)利要求5的肽或肽綴合物，其中n為3，(A)3是(侵染素結(jié)構(gòu)域)-Gly-Gly。11.一種藥物組合物，含有免疫有效量的一種或多種權(quán)利要求6的肽和藥用載體。12.權(quán)利要求11的藥物組合物，其中所述免疫有效量是每劑量每公斤體重約0.5嗎到約1mg。13.權(quán)利要求ll的藥物組合物，其中至少一種肽選自由SEQIDNOS:1-21和SEQIDNO:35組成的組。14.權(quán)利要求11的藥物組合物，其中一種或多種肽選自由SEQIDNOS:1-21和SEQIDNO:35組成的組。15.—種在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)抗-FMDV抗體的方法，包括在一定時(shí)間和一定條件下給所述哺乳動(dòng)物施用權(quán)利要求11的藥物組合物，以在所述哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生所述抗體。16.權(quán)利要求15的方法，其中所述哺乳動(dòng)物選自由牛、豬、綿羊和山羊組成的組。17.—種具有編碼權(quán)利要求1的肽序列的核酸。18.—種診斷哺乳動(dòng)物中FMDV感染的方法，包括以下步驟(a)將權(quán)利要求1的肽結(jié)合到固體支持物上，(b)使結(jié)合到固體支持物上的所述肽，在有助于抗體和肽結(jié)合的條件下，接觸含有來(lái)自所述哺乳動(dòng)物抗體的樣品，和(C)檢測(cè)與所述肽結(jié)合的抗體的存在，所述肽結(jié)合于所述固體支持物。全文摘要本發(fā)明涉及一種肽組合物作為免疫原的應(yīng)用，其中含有的每種肽包含一種來(lái)源于口蹄疫病毒(FMDV)VP1衣殼蛋白的目標(biāo)抗原位點(diǎn)。該抗原位點(diǎn)與一種輔助T細(xì)胞表位，以及優(yōu)選與其它免疫刺激序列共價(jià)連接，優(yōu)選通過(guò)直接合成的常規(guī)肽鍵共價(jià)連接，用于預(yù)防FMDV感染和根除口蹄疫(FMD)。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及應(yīng)用該肽組合物作為免疫原，在動(dòng)物包括豬、牛、羊、山羊和易感野生動(dòng)物品種中誘導(dǎo)產(chǎn)生高效價(jià)多克隆抗體，該抗體能夠在體外有效地中和FMDV的多種病毒株或血清型，以及應(yīng)用該組合物作為疫苗，防止、和/或減少無(wú)論何種血清型的FMDV感染的發(fā)生率，并因此實(shí)現(xiàn)根除FMD。本發(fā)明還涉及組合物中應(yīng)用的肽，以及含有一種或多種該肽的免疫分析和/或診斷試劑盒，以及應(yīng)用該材料在哺乳動(dòng)物中診斷FMDV的方法。文檔編號(hào)A61K39/00GK101386641SQ200810144138公開(kāi)日2009年3月18日申請(qǐng)日期1999年6月21日優(yōu)先權(quán)日1998年6月20日發(fā)明者明沈,王長(zhǎng)怡申請(qǐng)人:美國(guó)聯(lián)合生物醫(yī)學(xué)公司