專利名稱：減毒的活疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及減毒黃病毒(flavivirus)活疫苗。
背景技術(shù)：
黃病毒科包括三個屬，即黃病毒屬(genus flaviviridae)，瘕病毒屬(genuspestiviruses)以及肝炎病毒屬(genus hepaciviruses)。
黃病毒屬主要包括由蚊子或蜱傳播的病毒，這些病毒中許多是人類，同時也是動物的重要病原體。尤其重要的是黃熱(YF)病毒(yellow fevervirus),曰本腦炎(JE)病毒(Japanese encephalitis virus),登革(Den)病毒(dengueviruses)的四種血清型，蜱傳腦炎(TBE)病毒(tick-borne encephalitis virus)以及
(West Nile virus)。
瘟病毒屬包含極有經(jīng)濟(jì)意義的動物病原體，即典型豬發(fā)熱(CPV)病毒(classical porcine fever),牛病毒性腹渴(BVD)病毒(bovine viral diarrhea virus)以及邊界病病毒(border disease virus)(BDV)。
肝炎病毒屬包含丙型肝炎病毒(hepatitis C virus)(HCV)的不同亞型以及相關(guān)的病毒，如庚型肝炎病毒(hepatitis G virus)(HGV)。
這三個屬都屬于黃病毒科的成員，因?yàn)樵摷易宓乃写沓蓡T都有幾乎相同的基因組結(jié)構(gòu)，并且在許多結(jié)構(gòu)和功能特性方面都顯示一致性。所有的黃病毒都是相對小的，有包膜的病毒，包含單鏈RNA分子，具有以mRNA作為基因組的傾向?；蚪M有較長可讀框，編碼以多蛋白(polyprotein)形式存在的所有蛋白。單個成熟的病毒蛋白通過病毒和細(xì)胞的蛋白酶酶切形成。單個病毒蛋白在基因組中的排列對所有黃病毒來說是相同的，即5，端開始是衣殼蛋白，然后是表面蛋白和一系列非結(jié)構(gòu)蛋白，最后是病毒的
4聚合酶。瘟病毒還有一特殊的特征，即在衣殼蛋白之前還含有自身蛋白酶
(autoprotease)。黃病毒的核衣殼僅由單一病毒蛋白即衣殼蛋白形成，核衣殼包繞病毒基因組。所述衣殼呈現(xiàn)二十面體對稱。
人們還不知道任何一種黃病毒衣殼蛋白準(zhǔn)確的三維結(jié)構(gòu)。但已知的氨基酸序列有許多相關(guān)性，因此很可能這些衣殼蛋白存在多種結(jié)構(gòu)相似性。在這種情況下，同一屬的代表之間的相似性自然會比不同屬的代表之間的相似性更大。在所有情況下，衣殼蛋白都是相當(dāng)小的蛋白，長度大約100到190個氨基酸。其中有異乎尋常高比例的堿性氨基酸，即賴氨酸和精氨酸。推測這些堿性氨基酸對于與病毒RNA之間的相互作用是重要的'(Khromykh和Westaway， 1996)。另外，所有黃病毒衣殼蛋白還有特征性的疏水區(qū)(圖1)。這類疏水區(qū)通常是由羧基末端約20個氨基酸形成。該區(qū)在基因組序列中充當(dāng)隨其后的表面結(jié)構(gòu)蛋白的內(nèi)部信號序列。該信號序列在蛋白合成過程中與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合，使衣殼蛋白開始時錨定到所述膜上。然后，此錨通過蛋白裂解切除。此外，還存在內(nèi)部疏水區(qū)。在黃病毒屬的代表中，內(nèi)部疏水區(qū)功能的重要性已由Markoff等描述。作者指出對一系列黃病毒而言該區(qū)的邊界如下登革病毒l: 46-67，登革病毒2: 46-66，登革病毒3: 46-67,登革病毒4: 45 -65，日本腦炎病毒46-62，西尼羅病毒46-62,墨累山谷腦炎(Murray Valley encephalitis)病毒46-62，圣路易腦炎(Saint louis encephalitis)病毒45 — 61,黃熱病毒43 — 58， Langat: 42-54,玻瓦散病毒(Powassan): 40-52， TBE: 42- 54。對于丙型肝炎病毒，已鑒定出一個在功能方面重要的內(nèi)部疏水區(qū)(Hope and Mclauchlan, 2000)，該區(qū)是從氨基酸119延伸到氨基酸145，尤其是氨基酸125 - 144。瘟病毒具有短的主要具有疏水特性的內(nèi)部區(qū)。
疫苗已成功地用于抗御一些黃病毒。已有活疫苗抗御YF病毒，JE病毒和CPF病毒，滅活疫苗用來抗御JE和TBE。鑒于黃病毒在人類醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)方面極其重要，所以極需開發(fā)新的改進(jìn)的疫苗。
已知有一系列減毒的黃病毒，其減毒是基于對基因組的不同區(qū)域突變
進(jìn)行的。減毒性突變可見于天然產(chǎn)生的菌抹中，也可通過實(shí)驗(yàn)室中病毒的一系列傳代獲得，或通過在中和抗體存在下篩選突變體而制備，或者借助于重組克隆技術(shù)通過靶向引入突變而獲得。數(shù)種黃病毒的感染性cDNA克隆是已知存在的，且本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何制備這樣的克隆。借助于這些感染性cDNA克隆，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，即可將突變特異性地導(dǎo)入黃病毒基
因組中。
減毒黃病毒的已知突變在基因組的如下部分
包膜蛋白已發(fā)現(xiàn)大部分減毒突變與黃病毒屬的包膜蛋白E有關(guān)(參見McMinn， 1997; new e.g. Mandl et al.， 2000)。同樣，也有文獻(xiàn)描述了存在于癍病毒屬蛋白E(rns)中的減毒突變(Meyers et al., 1999)。
非結(jié)構(gòu)蛋白在Kunjin病毒的NSl蛋白中的點(diǎn)突變導(dǎo)致延遲復(fù)制，并因此導(dǎo)致減毒(Hall et al., 1999)。在蛋白NS3(Butrapet et al., 2000)和NS5(Xieet al., 1999)中的減毒突變也已有描述。
非編碼的基因組區(qū)通過3，末端非編碼區(qū)缺失所致的TBE病毒的減毒已有描述(Mandl et al.， 1998)。對于登革病毒，已制備出在5，和3，非編碼區(qū)都有缺失的實(shí)驗(yàn)性疫苗(Laietal., 1998)。據(jù)推測，這些病毒減毒的分子基礎(chǔ)是通過所述突變對病毒復(fù)制產(chǎn)生不良作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供減毒黃病毒的其它可能途徑，從而產(chǎn)生主要適合預(yù)防黃病毒所致疾病的活疫苗。
根據(jù)本發(fā)明，所述目的可以通過包含黃病毒突變體的減毒黃病毒活疫苗達(dá)到，該疫苗的特征在于所述黃病毒突變體在衣殼蛋白中有至少4個以上連續(xù)的氨基酸的缺失，其中，羧基末端疏水區(qū)不受所述缺失的影響。盡管如上所述，現(xiàn)有技術(shù)中已描述了一系列基于突變而減毒的黃病毒，但至今沒有人描述將衣殼蛋白中的突變，尤其是缺失作為黃病毒減毒的基礎(chǔ)。而令人驚奇的是，在衣殼蛋白中包含本發(fā)明突變的黃病毒可導(dǎo)致對黃病毒的可靠的減毒，并可用作黃病毒活疫苗。盡管對所述衣殼蛋白進(jìn)行了本發(fā)明的突變，但在以活疫苗形式給藥依照本發(fā)明的病毒后，在接受接種的受試者體內(nèi)所述減毒病毒仍可以增殖。這便產(chǎn)生了超越滅活疫苗的一 系列優(yōu)點(diǎn)。
衣殼蛋白中的缺失構(gòu)成了一種全新的黃病毒減毒的理論。至今，從沒有人考慮過將衣殼蛋白在本領(lǐng)域中作為相關(guān)對象。因此，如下發(fā)現(xiàn)更令人驚奇，即本發(fā)明所描述的缺失突變體實(shí)際上可成功產(chǎn)生減毒的黃病毒活疫苗，而該疫苗對回復(fù)成為有毒力的表型有抗性，因此非常適于廣泛應(yīng)用于人類。
對于常規(guī)的滅活疫苗的制備而言，制備大量的有感染性且有毒力的病—毒是必需的。對于重組制備的滅活疫苗，須制備大量的抗原并進(jìn)行純化。對于活疫苗，需制備的量大大減少，因?yàn)橐呙绫旧砜稍诒唤臃N的受試者體'內(nèi)增殖，由此，活疫苗制備的成本通常比制備滅活疫苗的成本低很多。而且，因其是無毒力的非致病的病毒，因此該制備不危及健康。常規(guī)的滅活黃病毒疫苗通過用甲醛處理滅活感染性的病毒顆粒來制備，可導(dǎo)致抗原結(jié)'構(gòu)的一定變化。在被接種的受試者體內(nèi)，主要誘導(dǎo)出針對抗原結(jié)構(gòu)與其天然形式不完全吻合的結(jié)構(gòu)蛋白的體液免疫應(yīng)答，而未誘導(dǎo)對持久免疫力的
建立和細(xì)胞毒性T細(xì)胞的形成非常重要的非結(jié)構(gòu)蛋白的免疫應(yīng)答。
相反，用本發(fā)明的疫苗，可獲得針對體內(nèi)產(chǎn)生的且以其完全天然形式存在的表面蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，從而獲得依照本領(lǐng)域目前的狀況而言持續(xù)的時間比滅活疫苗長很多的保護(hù)性免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的減毒黃病毒活疫苗，尤其是優(yōu)選實(shí)施方案中的那些，還有超過常規(guī)活疫苗和用基因工程制備的實(shí)驗(yàn)性活疫苗的其他優(yōu)點(diǎn)。
目前所使用的黃病毒活疫苗已在實(shí)驗(yàn)室中傳代許多次，這導(dǎo)致了多處突變的產(chǎn)生，這些突變對這些病毒的生物學(xué)意義人們還沒有完全詳細(xì)地了解，并且它們各自對這些病毒的減毒所起的作用，以及各個減毒突變之間的相互作用人們也沒有完全了解(對于JE,參照Nitayaphan等，1990;對于YF,參照Post等，1992;對于CPF參照Bjorklund等，1988)。 一些突變也位于對免疫應(yīng)答尤其重要的抗原中，如表面蛋白E中。因此， 一些抗原決定基與野生型病毒相比其存在形式發(fā)生了改變。這些病毒減毒的基因基礎(chǔ)的復(fù)雜性使作為減毒基礎(chǔ)的一些規(guī)律不能夠直接應(yīng)用于其它黃病毒。
相反，在本發(fā)明的疫苗中，僅僅是確定的和通常可應(yīng)用的減毒突變被引入到衣殼蛋白中，因此不必要改變對免疫應(yīng)答尤其重要的蛋白(包膜蛋白或一些非結(jié)構(gòu)蛋白，如黃病毒屬的NS1)。
依照本發(fā)明的活疫苗的優(yōu)選實(shí)施方案因此不包含任何進(jìn)一步的突變，尤其不包含包膜蛋白以及與免疫應(yīng)答有關(guān)的其它蛋白中的突變。
如上所述，已報道了一系列基因工程改造的減毒的黃病毒，其中所述減毒是基于點(diǎn)突變。它們相對比較易于發(fā)生遺傳回復(fù)。而且，已有人報導(dǎo)通過點(diǎn)突變減毒的病毒，通過第二個點(diǎn)突變回復(fù)成為有毒力的表型(Mandletal.,2000)。相反，依照本發(fā)明的活疫苗中，減毒是通過缺失獲得的，因此向野生型的回復(fù)是不可能的。
在已報導(dǎo)的一些情況下，減毒是基于對免疫應(yīng)答而言重要的包膜蛋白中的改變，或者是基于對復(fù)制和翻譯而言重要的基因組部分中的改變。如果想產(chǎn)生盡可能天然和有效的免疫應(yīng)答，那么在包膜蛋白的抗原結(jié)構(gòu)中的變化和對復(fù)制或翻譯的實(shí)質(zhì)性的負(fù)作用都是不希望的。這些缺點(diǎn)都被本發(fā)明克服了，本發(fā)明僅改變了內(nèi)部的結(jié)構(gòu)成分，而沒有改變?nèi)魏伟さ鞍?，非結(jié)構(gòu)蛋白或調(diào)控性的非編碼區(qū)。
也有人報導(dǎo)通過組合各種病毒(嵌合病毒)制備了黃病毒疫苗(Guirakhooetal.，2000)。因?yàn)樵谇逗喜《具@樣的生物中，致病性病毒的基因彼此以非天然方式被重新組合在一起，因此，這些嵌合病毒通過免疫接種釋放時將會帶來形成無法預(yù)測其特性的新病毒的危險。相反，新的疫苗不是由各種病毒基因組的組合而構(gòu)成，因此免疫接種釋放時就不會引起非天然病毒種的產(chǎn)生。
將本發(fā)明的缺失通過例如重組技術(shù)導(dǎo)入到黃病毒的衣殼蛋白中，對本領(lǐng)域的任何技術(shù)人員而言，用已知方法本身，不需要不必要的試驗(yàn)即可賣現(xiàn)。編碼各個衣殼蛋白的基因區(qū)對基因組序列目前已被闡明的所有黃病毒而言都是已知的，而對于新的黃病毒序列，該基因區(qū)可通過序列比較很容易地確定。當(dāng)然，在這種情況下所述缺失一定不要引起可讀框的任何移動，以使羧基末端疏水區(qū)不要受到缺失的影響。較嚴(yán)格保持羧基末端疏水區(qū)，-使其不受缺失的影響是非常必要的。而用所提及的技術(shù)，制備在其增殖ii程中除衣殼蛋白外所有的病毒蛋白都以其天然形式來形成的那種突變的感染性病毒是可能的。這些病毒的復(fù)制和翻譯將不會受到限制，或基本不會受到限制。通過在細(xì)胞培養(yǎng)基中的增殖，可從這些病毒制備出用作疫苗的制品。與未進(jìn)行改變的野生型病毒不同，依照本發(fā)明的病毒，接種到合適的宿主生物后，可呈現(xiàn)減毒的表型，即它們不引起疾病。但它們誘導(dǎo)特異性的免疫應(yīng)答。用本發(fā)明的黃病毒活疫苗免疫的宿主生物將受到保護(hù)而免于有毒力的野生型病毒的隨后感染，也就是說，與未被保護(hù)的生物不同，該宿主生物將不發(fā)生由野生型病毒導(dǎo)致的疾病。
如果在制備適合用作疫苗的突變體的過程中能注意到可使疫苗的特性得到改善的許多方面，那么本發(fā)明在衣殼蛋白區(qū)的缺失便尤其適合用于制備適合作為活疫苗的突變體。為制備適當(dāng)?shù)臏p毒的免疫原性病毒，依照本
發(fā)明提供的缺失在任何情況下都須大于4個氨基酸，因?yàn)槿笔е炼?個氨基酸時病毒仍然可呈現(xiàn)與野生型病毒類似的有毒力的表型。而且，只有達(dá)到上述水平的缺失才能夠排除向有毒力的病毒類型的回復(fù)。
進(jìn)一步地，依照本發(fā)明的缺失一定不要涉及衣殼蛋白羧基末端疏水區(qū)。已知該序列對基因組中隨后的包膜蛋白的正確形成是必需的，且其可通過蛋白水解性切割從成熟衣殼蛋白除去。該信號序列的長度在不同黃病毒之間不同，但可通過繪制親水圖(參照圖l)很容易地確定。因此，依照本發(fā)明的缺失一定不要涉及該羧基末端區(qū)。
羧基末端疏水區(qū)至少涉及該區(qū)中依照圖1所示親水性得分等于和小于-1的所有氨基酸。尤其優(yōu)選，依照圖1親水性在0以下的C末端區(qū)保持不變。
依照本發(fā)明優(yōu)選的缺失涉及內(nèi)部疏水結(jié)構(gòu)域的區(qū)域。從圖l可以看到，所有黃病毒的衣殼序列，除了羧基末端的上述疏水信號序列外，還包含另
外明顯親水性氨基酸鏈中部的 一些具有顯著疏水特性的區(qū)域。將這些內(nèi)部
疫苗。因?yàn)橹辽偎心切﹨^(qū)域都被認(rèn)為是"內(nèi)部的疏水結(jié)構(gòu)域"，它們?nèi)鐖D1所示親水性得分為負(fù)值。
在圖2中，尤其優(yōu)選的疏水區(qū)域，即依照本發(fā)明可在疫苗中至少部分缺失的區(qū)域是許多黃病毒的特征。這些區(qū)域可通過計(jì)算各個氨基酸序列的疏水圖來確定。在圖2中下面劃線的這些區(qū)域已用Kyte和Doolittle(1982)1算法，以窗口大小(window size)為5算出?；蛘?，疏水區(qū)域也可以用5到13個氨基酸殘基的窗口大小計(jì)算，或用其它算法，如Hopp和Woods(1981)算法，其中通常選擇3到11的窗口大小。
圖1的親水性圖是依照Kyte和Doolittle(1982)算法，以9個氨基酸殘基的窗口大小計(jì)算的，或依照hopp和Woods(1981)算法，以7個氨基酸殘基的窗口大小計(jì)算的。優(yōu)選的疏水區(qū)域選自登革病毒l: 46-67,登革病毒2: 46-66，登革病毒3: 46-67，登革病毒4: 45 -65，日本腦炎病毒；46-62,西尼羅病毒46-62，墨累山谷腦炎病毒46-62，圣路易腦炎病毒45 — 61，黃熱病毒43 — 58， Langat: 42 — 54，玻瓦散病毒40 — 52,TBE: 42- 54，以及HCV: 119—145，尤其是125 — 144。
9減毒疫苗的具體實(shí)施方案是衣殼缺失，即除去內(nèi)部疏水結(jié)構(gòu)域的大部 分以使所產(chǎn)生的突變體基因組不能產(chǎn)生能在細(xì)胞培養(yǎng)中傳代的病毒。這些 基因組能復(fù)制且能有效翻譯除天然形式的衣殼蛋白外的所有蛋白，而且它 們還可能形成非感染性的亞病毒顆粒。通過導(dǎo)入另外的能增加衣殼蛋白疏 水性的點(diǎn)突變或插入，可將這種缺失突變體制成能傳代并適合作為活疫苗, 的病毒突變體。這些插入物是不同于原始所缺失序列的序列。適當(dāng)?shù)念~外
的突變可例如如下制備和鑒定將不再能在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中復(fù)制的缺失突 變體導(dǎo)入比細(xì)胞培養(yǎng)基更敏感的擴(kuò)增系統(tǒng)中(例如用于黃病毒屬病毒的實(shí)驗(yàn) 小鼠中，瘟病毒的天然宿主中，如果是丙型肝炎病毒則導(dǎo)入豬，羊，?；?黑猩猩中)，且適當(dāng)?shù)耐蛔凅w通過在該系統(tǒng)中傳代得到制備和選擇。在這種 情況下，尤其優(yōu)選的更敏感的系統(tǒng)是動物，尤其是小鼠，大鼠，家兔，野 兔，豬，綿羊，牛或靈長類動物，例如黑猩猩。所產(chǎn)生的病毒突變體構(gòu)成 尤其安全的疫苗，因?yàn)轭~外突變的任何回復(fù)都會產(chǎn)生不能擴(kuò)增的病毒或只 能非常有限擴(kuò)增的病毒。而缺失的回復(fù)據(jù)推理是不可能的。
優(yōu)選的減毒的黃病毒活疫苗包含黃病毒突變體，該突變體衣殼蛋白中 具有5到70個，優(yōu)選6到25個，尤其是7到20個連續(xù)氨基酸的缺失。達(dá) 到這種優(yōu)選等級的缺失均以其減毒傳代行為中性質(zhì)發(fā)生改變的特性為特 征。如果缺失大于20個連續(xù)的氨基酸，在宿主細(xì)胞中制備該活疫苗時傳代 能力可能丟失。這種丟失傳代能力的特性將依賴于宿主細(xì)胞的敏感性，對 各自的宿主細(xì)胞而言，通過一些額外的突變，其可以恢復(fù)。這種恢復(fù)可通 過使衣殼蛋白疏水性增加的一種或多種突變實(shí)現(xiàn)。這種進(jìn)一步的突變優(yōu)選 是選自使衣殼蛋白疏水性增加的點(diǎn)突變，或是將具有顯著疏水特性的氨基 酸區(qū)段的插入到衣殼蛋白基因中。衣殼蛋白疏水區(qū)域的重復(fù)證明是尤其有 利的。特別優(yōu)選的點(diǎn)突變包括將帶電荷的，或親水性氨基酸(如，例如天冬 氨酸，谷氨酸，賴氨酸，精氨酸，組氨酸，色氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺， 酪氨酸，絲氨酸等)分別替換成極性較小的氨基酸或非極性氨基酸(如，例如 異亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，丙氨酸，纈氨酸等)。這種額外突 變尤其優(yōu)選通過導(dǎo)入到更敏感系統(tǒng)中自動產(chǎn)生。對這些額外突變的選擇也 通過其恢復(fù)傳代能力而自動實(shí)現(xiàn)。 '
通常， 一個僅帶來氨基酸極性方面輕微改變的單個突變就足以恢復(fù)傳 代能力(例如將脯氨酸更換為亮氨酸或?qū)⒗i氨酸更換為苯丙氨酸)。
10優(yōu)選，所述缺失可以達(dá)到至氨基末端的15個氨基酸和/或緊鄰羧基末端 信號序列起始之前。盡管至今推測黃病毒衣殼蛋白的(或編碼該氨基酸的基
因組區(qū)段的)開始的20個氨基酸對復(fù)制而言是絕對必需的(Khromykh和 Westaway, 1997)，但也可成功制備能夠復(fù)制和擴(kuò)增，并具有延伸到該區(qū)域的 缺失的病毒，這也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明對黃病毒所有的代表抹而言都是適用的。在本申請的范圍內(nèi)， 術(shù)語"黃病毒"涉及黃病毒科的所有代表，除了在表述時指出其僅指黃病 毒屬的代表。能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明的黃病毒的尤其優(yōu)選的代表選自黃熱病毒，. 日本腦炎病毒，登革病毒的四種血清型，蜱傳腦炎病毒，西尼羅病毒，墨: 累山谷腦炎病毒，圣路易腦炎病毒，玻瓦散病毒，典型豬發(fā)熱病毒，牛病 毒性腹瀉病毒，邊界病病毒，丙型肝炎病毒或庚型肝炎病毒。這些代表尤 其適合本發(fā)明，因?yàn)樗鼈儗θ撕蛣游锏闹虏⌒允且阎?，對這些代表而言， 尤其需要適當(dāng)?shù)臏p毒活疫苗。
本發(fā)明涉及一種包含黃病毒屬病毒突變體的減毒的黃病毒屬病毒活疫 苗，其特征在于所述黃病毒屬病毒突變體在衣殼蛋白中有5到70個連續(xù)的 氨基酸的缺失，其中，羧基末端疏水區(qū)不受該缺失的影響。
本發(fā)明還涉及一種黃病毒屬病毒疫苗，特征在于其包含編碼缺失的衣 殼蛋白的核酸，所述衣殼蛋白有5到70個連續(xù)的氨基酸的缺失，其中，羧 基末端疏水區(qū)不受該缺失的影響。
對依照本發(fā)明的活疫苗而言，有效免疫僅需要少量的病毒，所以，每 次給藥時，本發(fā)明的活疫苗中有101-107，優(yōu)選102 - 106，尤其103-105 的黃病毒感染單位即足夠。優(yōu)選，活疫苗以該感染單位的量單劑給藥。
優(yōu)選，依照本發(fā)明的活疫苗包含另外的活性物質(zhì)或輔助物質(zhì)。尤其優(yōu) 選的是添加抗生素，如新霉素或卡那霉素，防腐劑，如石克柳汞，以及穩(wěn)定 劑，如人白蛋白，乳糖-山梨糖醇，山梨糖醇-明膠，polygeline或鹽，如 MgCl2或MgS04。通常，優(yōu)選氨基酸，多糖和(緩沖)鹽用作添加劑。
在依照本發(fā)明的活疫苗的制備中，如果是施用于人，推薦用非轉(zhuǎn)化的 宿主細(xì)胞，因?yàn)檫@樣既可避免特性改變的危險(例如容易導(dǎo)入新的不希望的 突變)，又可避免污染這些細(xì)胞的成分的危險。
依照本發(fā)明的另一方面，黃病毒疫苗也可以以核酸疫苗的形式提供，' 所述核酸即編碼依照本發(fā)明的缺失的衣殼蛋白。優(yōu)選，這樣的核酸黃病毒疫苗除所述核酸以外還包括氨基糖戒類抗生素，如新霉素或卡那霉素，正
如FDA為質(zhì)粒疫苗推薦的。現(xiàn)有技術(shù)已描述了用"棵露"核酸進(jìn)行接種的 整個一系列最具變化的策略(參照例如WO 90/11092， WO 94/29469， WO 97/47197， 已納入本文做參考，liopsome-mediated nucleic acid transfer,' preferably nucleic acid transfer with (preferably biodegradable) microspheres, )。
另外，本發(fā)明還涉及制備依照本發(fā)明的活疫苗的方法，該方法的特征 在于以下步驟
*提供黃病毒或黃病毒核酸，其中黃病毒或黃病毒核酸包含本發(fā)明的
衣殼蛋白中的缺失， *在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中擴(kuò)增黃病毒或黃病毒核酸， *回收通過宿主細(xì)胞擴(kuò)增的病毒顆粒，和 *將病毒顆粒制備成活疫苗。
本發(fā)明涉及一種制備黃病毒屬病毒活疫苗的方法，其特征在于以下步 驟 *提供黃病毒屬病毒或黃病毒屬病毒核酸，其中黃病毒屬病毒或黃病
毒屬病毒核酸在衣殼蛋白中具有5到70個連續(xù)氨基酸的缺失，其中,
羧基末端疏水區(qū)不受該缺失的影響， *在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中擴(kuò)增黃病毒屬病毒或黃病毒屬病毒核酸， *回收由宿主細(xì)胞擴(kuò)增的病毒顆粒，以及 *將病毒顆粒制備成活疫苗。
優(yōu)選的宿主細(xì)胞選自雞胚細(xì)胞，原代雞胚細(xì)胞，人二倍體細(xì)胞系(例如 WI-38，MRC-5)，非洲綠猴腎細(xì)胞系細(xì)胞(vero cells),原代倉鼠腎細(xì)胞，原 代犬腎細(xì)胞或恒河猴(rhesus)二倍體胎兒肺細(xì)胞。
最后，本發(fā)明還涉及在衣殼蛋白中有本發(fā)明缺失的黃病毒核酸在制備 預(yù)防黃病毒感染的疫苗方面的用途。
本發(fā)明涉及黃病毒核酸在制備預(yù)防黃病毒感染的疫苗中的應(yīng)用，所述 黃病毒核酸在衣殼蛋白中具有5到70個連續(xù)氨基酸的缺失，其中，羧基末 端疏水區(qū)不受該缺失的影響。
以下實(shí)施例和附圖用來更詳細(xì)地解釋本發(fā)明，而非對本發(fā)明進(jìn)行限制。


圖1A-C顯示黃病毒科3個屬中，每個屬3種代表病毒的衣殼蛋白的 親水性圖。負(fù)值表示有顯著疏水特性的區(qū)域。羧基末端疏水區(qū)是基因組中 隨后的包膜蛋白的信號序列。對每種蛋白都已計(jì)算出親水性并通過實(shí)例加 以說明， 一次是依照Kyte和Doolittle(1982)的算法，采用的窗口大小為9 個氨基酸殘基(上圖)， 一次是按照Hopp和Woods(1981)算法，采用的窗口 大小是7個氨基酸殘基(下圖)。
圖2顯示黃病毒科3個屬中，每個屬3種代表病毒的衣殼蛋白的序列 對比。具有顯著疏水特性的序列區(qū)段(依照Kyte和Doolittle算法采用窗口大 小為5確定的)用下劃線表示。在這種情況下，各自最靠羧基末端排列的區(qū) 段代表隨后的包膜蛋白的信號序列。在該區(qū)段，不應(yīng)有任何缺失。其它的(內(nèi) 部的)疏水區(qū)段代表用于減毒缺失的優(yōu)選區(qū)域。
實(shí)施例
實(shí)施例1: TBE病毒衣殼缺失突變體作為活疫苗的應(yīng)用 就TBE病毒而言，其致病性和免疫原性可在成年小鼠模型中得到檢測。 在衣殼蛋白區(qū)域有16個氨基酸缺失的TBE病毒突變體(CD28-43)可用作活 疫苗。該突變體和以下實(shí)施例中討論的其它突變體總結(jié)于表l中。突變體 CD28-43的基因表達(dá)與野生型病毒相當(dāng)，且能在HBK-21細(xì)胞中如所希 望的那樣頻繁傳代。該突變體可通過將相應(yīng)突變導(dǎo)入到TBE病毒的感染性 cDNA克隆中來制備?？蓪碜栽撏蛔凅wcDNA克隆的RNA在體外進(jìn)行轉(zhuǎn) 錄，然后將該RNA通過電穿孔導(dǎo)入到BHK-21細(xì)胞中。3天后，收獲細(xì)胞 培養(yǎng)上清，然后將該病毒在幼鼠腦中傳代二次以獲得高滴度的病毒懸液。 將后者用于檢測該突變體是否適合在成年小鼠模型中用作活疫苗。為此目 的，將10只5周齡的小鼠每只皮下接種10,000pfu的突變體或有毒力的野 生型病毒，4周期間觀察存活率。從表2中可以明顯發(fā)現(xiàn)，接種有毒力的野 生型病毒的10只小鼠中9只出現(xiàn)典型的腦炎臨床癥狀而死亡。相反，接種 衣殼缺失突變體的小鼠沒有一只死亡。將突變體的接種劑量增加100倍時， 10只小鼠中仍沒有一只染病。這一結(jié)果表明衣殼缺失突變體是非致病的。 對接種突變體的所有小鼠的血清樣品進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，所有小鼠都形成了針對TBE病毒的特異性免疫應(yīng)答。為檢測該免疫應(yīng)答是否能保護(hù)小鼠抗御野: 生型病毒的感染，用較高劑量的野生型病毒進(jìn)行接種。結(jié)果所有小鼠在受 到攻擊后都活了下來，都沒有出現(xiàn)任何疾病的體征。該結(jié)果表明這種衣殼 缺失突變體已經(jīng)引發(fā)了保護(hù)性免疫，可以用作抗野生型病毒的疫苗。
實(shí)施例2:能進(jìn)行傳代的突變體的回復(fù)，這種突變體具有延伸至氨基末 端20個氨基酸區(qū)域的缺失。
在感染性cDNA克隆的輔助下，將缺失導(dǎo)入到TBE病毒衣殼蛋白中， 該缺失是自氨基酸16延伸至氨基酸25(突變體CD16-25;參照表1)。突變 體CD16-25在細(xì)胞培養(yǎng)基中如所期望的那樣頻繁傳代。該結(jié)果表示，與本 領(lǐng)域以往的情形不同，延伸至20個氨基末端氨基酸的區(qū)域(包括氨基酸16 在內(nèi))，缺失不破壞黃病毒的復(fù)制。
實(shí)施例3:有毒力的衣殼缺失突變體
衣殼缺失突變體CD28和CD28-31分別攜帶長度為1和4個氨基酸的 缺失(表l)。在這些突變體中，缺失的氨基酸不是內(nèi)部疏水結(jié)構(gòu)域的一部分 (圖1)。給成年小鼠接種這種突變體顯示，它們具有相當(dāng)于野生型病毒的毒 力表型，分別殺死80%和100%的小鼠(表2)。這一結(jié)果表示在衣殼蛋白非 疏水區(qū)缺失不超過4個氨基酸對制備減毒疫苗而言是不適合的。
實(shí)施例4:減毒的衣殼缺失突變體
衣殼缺失突變體CD28-35， CD28-39和在實(shí)施例1中描述的突變體 CD28-34攜帶長度為8， 12和16個氨基酸的缺失(表1)。這些缺失除去了內(nèi) 部疏水結(jié)構(gòu)域中的多個部分(圖1)。用這些突變體接種成年小鼠顯示它們具 有減毒表型，即沒有殺死小鼠，或在CD28-35的情況中僅殺死10%的小鼠 (表2)。這一結(jié)果顯示除去部分內(nèi)部疏水結(jié)構(gòu)域可導(dǎo)致減毒。減毒的程度還 取決于缺失范圍的大小，擴(kuò)大缺失范圍可增強(qiáng)減毒作用。用上述減毒突變 體免疫的所有小鼠能夠完全抗御有毒力的野生型病毒感染。這一結(jié)果證實(shí) 了實(shí)施例1所得的結(jié)果，即衣殼缺失突變體能用作活疫苗。
實(shí)施例5:額外突變的鑒定
衣殼缺失突變體CD28-48, CD28-54和CD28-89攜帶長度為21， 27和 62個氨基酸的缺失(表1)。這些缺失完全去除了內(nèi)部疏水結(jié)構(gòu)域，或者在最 大缺失的情況下，除去了衣殼蛋白的所有內(nèi)部疏水區(qū)段(圖1)。這些突變體 顯示基因表達(dá)未受到干擾，但不能在BHK-21細(xì)胞中傳代。用這些突變體轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，3天后收獲培養(yǎng)上清液，并對10只幼鼠(1日齡)每只進(jìn) 行顱內(nèi)接種。這構(gòu)成了已知TBE病毒擴(kuò)增系統(tǒng)中最敏感的一個擴(kuò)增系統(tǒng)。5 到IO天后，在CD28-48突變體情況下所有的幼鼠，以及CD28-54情況下的 10只幼鼠中的7只死亡并伴有明顯的腦炎臨床癥狀。用突變體CD28-89接 種的小鼠沒有一只死亡。在所有死亡小鼠的大腦中都可以通過PCR檢測到 TBE病毒，而在存活的小鼠體內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)該病毒。來自死亡小鼠大腦中的 病毒能夠在BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)基中如所期望的那樣頻繁傳代。這一結(jié)果提 示在通過去除疏水結(jié)構(gòu)域而在細(xì)胞培養(yǎng)基中喪失了其傳代能力的突變體 中，可選擇出又能在細(xì)胞培養(yǎng)基中傳代的回復(fù)體。
為了確定這些變化的基因基礎(chǔ)，對一系列這樣的回復(fù)體中編碼衣殼蛋 白的基因組區(qū)段進(jìn)行測序。結(jié)果顯示，在每種情況下，除了最初導(dǎo)入的缺 失外在蛋白C中還存在另外的突變。這些突變?yōu)辄c(diǎn)突變或序列的重復(fù)。這 些額外的突變在表3中概括。所有這些突變的一個共同的特點(diǎn)是它們增強(qiáng) 了衣殼蛋白的疏水性。結(jié)果顯示，增強(qiáng)衣殼蛋白疏水性的突變能回復(fù)內(nèi)部 疏水序列缺失所導(dǎo)致的結(jié)果，即能回復(fù)黃病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中的傳代能力。 實(shí)施例6:用作活疫苗的伴有額外突變的衣殼缺失突變體 在感染性克隆的輔助下，制備兩種突變體，所述每種突變體包含內(nèi)部 疏水結(jié)構(gòu)域的長度為21個氨基酸的缺失，同時還伴有衣殼蛋白中的一種突 變(選自表3所列的突變)。與沒有額外突變的相應(yīng)缺失突變體(CD28-43)不 同，這兩種突變體，CD28-43/L70和CD28-43/Du8，能按預(yù)期頻繁傳代(表: 1)。該結(jié)果證實(shí)了實(shí)施例5所得的結(jié)果。成年小鼠接種這些突變體顯示，這 兩種突變體都無致病性，且都能引發(fā)保護(hù)性的免疫應(yīng)答(表2)。該結(jié)果表明 具有缺失和額外突變的突變體根據(jù)上述觀點(diǎn)適合用作活疫苗。
表1
TBE病毒的衣殼缺失突變體
名稱 CD28 CD28-31 CD28-35
缺失a
Q28 Q28-V31 Q28-N35
額外突變
基因表達(dá) + + +
傳代能力e
+ + +
15CD28-39Q28-L39++
CD28-43Q28-M43++
CD28-46Q28-L46++
CD28-48Q28-H48+—
CD28-54Q28-A54+—
CD28-89Q28-L89+—
CD16-25R16-K25++
CD28-48/L70Q28-H48Q70誦> L++
CD28-48/Du8Q28-H48I78-L85Dupld++
a表示第一個和最后一個缺失的氨基酸。數(shù)字是指氨基酸的位置，從衣 殼蛋白氨基末端計(jì)數(shù)。
b通過用TBE特異性抗血清對BHK-21細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色來檢測。 + =與野生型病毒相比的免疫熒光染色強(qiáng)度；-=沒有染色。
c通過向BHK-21細(xì)胞中多次轉(zhuǎn)移細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行的檢測+表 示能被傳代；-表示不能被傳代。
d 78-85位的8個氨基酸的重復(fù)。
表2
對成年小鼠的免疫
接種物接種量a存活b得到保護(hù)性免疫
野生型104pfb1/10n.a.
CD28104pfu0/10n.a.
CD28-31104pfu2/10n.a.
CD28-35104pfti9/109/10
CD28-39104pfu10/1010/10
CD28-43104pfti10/1010/10
CD28-43104pfu10/1010/10
CD28-48/L70104pfu10/1010/10
CD28隱48/Du8104pfU10/1010/10a表示皮下應(yīng)用的接種物的量，以每只小鼠接種的空斑形成單位(Pfb)表示。
b表示存活的小鼠數(shù)/總的小鼠數(shù)。
c被免疫的小鼠數(shù)/總的小鼠數(shù)。通過檢測血清中TBE特異性抗體來確 定免疫作用。通過隨后用有毒力的野生型病毒進(jìn)行的感染證實(shí)，免疫接種 完全可以抗雄卩疾病，起到保護(hù)作用。n.a.表示不適用。
表3
在衣殼缺失突變體中的補(bǔ)償性突變
RNAa蛋白b
A299- > UD56- > I
C302畫〉UP57國> L
G328- > UV66- 〉 F
A341畫〉UQ70畫〉L
C347畫〉UT72-> I
A368畫〉UK79畫> I
C374- 〉 UT81畫〉M
A401-〉UQ90- > L
364-387Duplc178畫L85Dupl
307-363DuplL59曙K77Dupl
a表示TBE病毒基因組中核苷酸的位置(GenBank編號U27495)。
b蛋白C中的氨基酸的位置。
e所示區(qū)段的重復(fù)。序列表
<110> 英特賽爾股份公司(Intercell AG )
<120> 減毒的活疫苗
<130> R39186
<140〉 PCT/AT02/00046 <141> 2002-02-11
<150〉 A 272/2001 AT <151〉 2001-02-21
<160> 9
<170〉 Patentln version 3. 1
<210〉 1 <211〉 115 <212> PRT
<213> 蜱傳月畝炎病毒(Tick-borne encephalitis virus) <400> 1
Val Lys Lys Ala lie Leu Lys Gly Lys Gly Gly Gly Pro Pro Arg Arg 15 10 15
Val Ser Lys Glu Thr Ala Thr Lys Thr Arg Gin Pro Arg Val Gin Met 20 25 30
Pro Asn Gly Leu Val Leu Met Arg Met Met Gly lie Leu Trp His Ala 35 40 45
Val Ala Gly Thr Ala Arg Asn Pro Val Leu Lys Ala Phe Trp Asn Ser 50 55 60
Val Pro Leu Lys Gin Ala Thr Ala Ala Leu Arg Lys lie Lys Arg Thr 65 70 75 80
Val Ser Ala Leu Met Val Gly Leu Gin Lys Arg Gly Lys Arg Arg Ser 85 90 95
Ala Thr Asp Trp Met Ser Trp Leu Leu Val lie Thr Leu Leu Gly Met 100 105 110
Thr Leu Ala 115
<210> 2<211〉 124 <212〉 PRT
<213> 西尼羅病毒(West Nile virus) <400> 2
Ser Lys Lys Pro Gly Gly Pro Gly Lys Asn Arg Ala Val Asn Met Leu 15 10 15
Lys Arg Gly Met Pro Arg Gly Leu Ser Leu lie Gly Leu Lys Arg Ala 20 25 30
Met Leu Ser Leu lie Asp Gly Lys Gly Pro lie Arg Phe Val Leu Ala 35 40 45
Leu Leu Ala Phe Phe Arg Phe Thr Ala lie Ala Pro Thr Arg Ala Val 50 55 60
Leu Asp Arg Trp Arg Gly Val Asn Lys Gin Thr Ala Met Lys His Leu 65 70 75 80
Leu Ser Phe Lys Lys Glu Leu Gly Thr Leu Thr Ser Ala lie Asn Arg 85 90 95
Arg Ser Thr Lys Gin Lys Lys Arg Gly Gly Thr Ala Gly Phe Thr lie 100 105 110
Leu Leu Gly Leu lie Ala Cys Ala Leu Leu Ser Lys 115 120
<210〉 <211> <212〉 <213>
3
113 PRT
登革病毒
<400> 3
Asn Asp Gin Arg Lys Lys Ala Arg Asn Thr Pro Phe Asn Met Leu I>ys 15 10 15
Arg Glu Arg Asn Arg Val Ser Thr Val Gin Gin Leu Thr Lys Arg Phe 20 25 30
Ser Leu Gly Met Leu Gin Gly Arg Gly Pro Leu Lys Leu Phe Met Ala 35 40 45
Leu Val Ala Phe Leu Arg Phe Leu Thr lie Pro Pro Thr Ala Gly lie
1950
55
60
Leu Lys Arg Trp Gly Thr lie Lys Lys Ser Lys Ala lie Asn Val Leu
65
70
75 80
Arg Gly Phe Arg Lys Glu lie Gly Arg Met Leu Asn lie Leu Asn Arg 85 90 95
Arg Arg Arg Thr Ala Gly Met lie lie Met Leu lie Pro Thr Val Met 100 105 110
Ala
<210> 4
<211> 99
<212> PRT
<213> 典型豬發(fā)熱病毒(klassisches Schweinef ieber-Virus )
<400> 4
Ser Asp Asp Gly Ala Ser Gly 1 5
Ser l>ys Asp Lys Lys Pro Asp Arg Met 10 15
Asn Lys Gly Lys Leu Lys lie Ala Pro Arg Glu His Glu Lys Asp Ser
20
25 30
Lys Thr Lys Pro Pro Asp Ala Thr He Val Val Glu Gly Val Lys Tyi
35
40 45
Gin lie Lys Lys Lys Gly Lys Val Lys Gly Lys Asn Thr Gin Asp Gly
50 55
60
Ixu Tyr His Asn Lys Asn Lys Pro Pro Glu Ser Arg Lys Lys Leu Glu
65 70
75
80
Lys Ala Leu Leu Ala Trp Ala Val lie Thr lie Leu Leu Tyr Gin Pro
85 90
95
Val Ala Ala
<210> 5
<211> 102
<212> PRT
<213> 牛病毒性腹瑪病毒(Bovines virales Diarrhoe Virus)
20<400> 5
Ser Asp Thr 1
Lys Glu Glu Gly Ala Thr Lys Lys Lys Thr Gin Lys Pro 5 10 15
Asp Arg Leu Glu Arg Gly Lys Met Lys lie Val Pro Lys Glu Ser Glu 20 25 30
Lys Asp Ser Lys Thr Lys Pro Pro Asp Ala Thr lie Val Val Glu Gly
35
40 45
Val Lys Tyr Gin Val Arg Lys Lys Gly Lys Thr Lys Ser Lys Asn Thr
50
55 60
Gin Asp Gly Leu Tyr His Asn Lys Asn Lys Pro Gin Glu Ser Arg Lys
65
70 75 80
Lys Leu Glu Lys Ala Leu Leu Ala Trp Ala lie lie Ala lie Val Leu 85 90 95
Phe Gin Val Thr Met Gly 100
<210> <211> <212> <213〉
6
100 PRT
邊界病病毒
<400> 6
Ser Asp Asp Asn Lys Asn Glu Lys Thr Asn Glu Lys Lys Pro Asp Arg
1
10 15
Val Lys Arg Gly Ala Met Lys lie Thr Pro Lys Glu Ser Glu Lys Asp 20 25 30
Ser Lys Ser Lys Pro Pro Asp Ala Thr lie Val Val Asp Gly Val Lys
35
40 45
Tyr Gin Val Lys Lys Lys Gly Lys Val Lys Ser Lys Asn Thr Gin Asp
50
55 60
Gly Leu Tyr His Asn Lys Asn Lys Pro Pro Glu Ser Arg Lys Lys Leu 65 70 75 80Glu Lys Ala Leu Leu Ala Trp Ala Val Leu Ala Val Leu Met Trp Gin 85 90 95
Pro Val Lys Pro 100
<210> <211〉 <212〉 <213>
<400>
190 PRT
丙型肝炎病毒1
Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gin Lys Lys Asn Lys Arg Asn Thr Asn Arg 15 10 15
Arg Pro Gin Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gin lie Val Gly Gly 20 25 30
Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr 35 40 45
Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gin Pro Arg Gly Arg Arg Gin Pro lie 50 55 60
Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gin Pro Gly Tyr 65 70 75 80
Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Cys Gly Trp Ala Gly Trp Leu 85 90 95
Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg 100 105 110
Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val lie Asp Thr Leu Thr Cys Gly 115 120 125
Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr lie Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly 130 135 140
Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly 145 150 155 160
Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser lie Phe 165 170 175Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala 180 185 190
<210> 8 <211> 190 <212> PRT
<213> 丙型肝炎病毒2 <400〉 8
Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gin Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg 15 10 15
Arg Pro Gin Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gin lie Val Gly Gly 20 25 30
Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr 35 40 45
Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gin Pro Arg Gly Arg Arg Gin Pro lie 50 55 60
Pro Lys Asp Arg Arg Ser Thr Gly Lys Ser Trp Gly Lys Pro Gly Tyr 65 70 75 80
Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Ala Gly Trp Leu 85 90 95
Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Asn Asp Pro Arg 100 105 110
His Arg Ser Arg Asn Val Gly Lys Val lie Asp Thr Leu Thr Cys Gly 115 120 125
Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr lie Pro Val Val Gly Ala Pro Leu Gly 130135 140
Gly Val Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly 145 150 155 160
Val Asn Phe Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser lie Phe 165 170 175
Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys lie Thr Thr Pro Val Ser Ala 180 185 190
23<210〉 9 <211〉 189 <212〉 PRT<213〉 丙型肝炎病毒3 <400> 9Ser Thr Leu Pro Lys Pro Gin Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr lie Arg1 51015Arg Pro Gin Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gin Leu Val Gly Gly 20 25 30Val Tyr Val Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr 35 40 45Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gin Pro Arg Gly Arg Arg Gin Pro lie 50 55 60Pro Lys Ala Arg Arg Ser Glu Gly Arg Ser Trp Ala Gin Pro Gly Tyr657075 80Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Cys Gly Trp Ala Gly Trp Leu 85 90 95Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Asn Asp Pro Arg 100 105 110Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val lie Asp Thr Leu Thr Cys Gly 115 120 125Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr lie Pro Leu Val Gly Ala Pro Val Gly 130 135 140Gly Val Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Ala Leu Glu Asp Gly145150155 160lie Asn Phe Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser lie Phe 165 170 175Leu Leu Ala Leu Phe Ser Cys Leu lie His Pro Ala Ala 180 18權(quán)利要求
1.一種包含黃病毒突變體的減毒的黃病毒活疫苗，其特征在于所述黃病毒突變體在衣殼蛋白中有至少4個以上連續(xù)的氨基酸的缺失，其中，羧基末端疏水區(qū)不受該缺失的影響。
2. 依照權(quán)利要求l的活疫苗，其特征在于所述缺失涉及衣殼蛋白的內(nèi)部 疏水結(jié)構(gòu)域。
3. 依照權(quán)利要求1或2的活疫苗，其特征在于衣殼蛋白中缺失了5到70個， 優(yōu)選6到25個，更優(yōu)選7到20個連續(xù)的氨基酸。
4. 依照權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的活疫苗，其特征在于所述缺失大于20個連 續(xù)的氨基酸，且衣殼蛋白額外還包含一個或多個進(jìn)一步的突變，通過所述突 變衣殼蛋白的疏水性得到增強(qiáng)，所述進(jìn)一步的突變優(yōu)選選自*可增強(qiáng)衣殼蛋白疏水性的點(diǎn)突變，或*具有顯著疏水特征的氨基酸片段的插入，尤其是衣殼蛋白疏水區(qū)的 重復(fù)。
5. 依照權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的活疫苗，其特征在于所述黃病毒選自黃熱 病毒(YFV),日本腦炎病毒(JEV),登革病毒(DV)的四種血清型，蜱傳腦炎病 毒(TBE病毒)，西尼羅病毒(WNV)，墨累山谷腦炎病毒(MVEV),圣路易腦炎 病毒(SLEV)，玻瓦散病毒(PV)，典型豬發(fā)熱病毒(CPFV),牛病毒性腹瀉病毒 (BDV),邊界病病毒(BDV),丙型肝炎病毒(HCV)或庚型肝炎病毒(HGV)。
6. 依照權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)的活疫苗，特征在于其包含1(^-10"個，優(yōu) 選102 - 106個，更優(yōu)選103 - 105個黃病毒感染單位。
7. 依照權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)的活疫苗，特征在于其進(jìn)一步包含抗生素， 防腐劑，穩(wěn)定劑，緩沖物質(zhì)或它們的混合物。
8. 依照權(quán)利要求7的活疫苗，特征在于其包含新霉素，卡那霉素，硫柳 汞，人白蛋白，乳糖-山梨糖醇，山梨糖醇-明膠，polygeline, MgCl2， MgS04， 氨基酸，多糖，緩沖鹽或它們的混合物。
9. 依照權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)的活疫苗，特征在于其是由非轉(zhuǎn)化的宿主細(xì) 胞制備。 ；
10. —種黃病毒疫苗，特征在于其包含編碼權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)定義的 缺失的衣殼蛋白的核酸。
11. 依照權(quán)利要求10的黃病毒疫苗，特征在于其包含氨基糖甙類抗生素，尤其是新霉素或卡那霉素，脂質(zhì)體，微球體或它們的混合物。
12. —種制備權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)的活疫苗的方法，其特征在于以下步驟*提供黃病毒或黃病毒核酸，其中黃病毒或黃病毒核酸在衣殼蛋白中具有權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)定義的至少4個以上連續(xù)氨基酸的缺失， *在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中擴(kuò)增黃病毒或黃病毒核酸， *回收由宿主細(xì)胞擴(kuò)增的病毒顆粒，以及 *將病毒顆粒制備成活疫苗。
13. 依照權(quán)利要求12的方法，其特征在于所述宿主細(xì)胞選自雞胚細(xì)胞， 原代雞胚細(xì)胞，人二倍體細(xì)胞系，非洲綠猴腎細(xì)胞系細(xì)胞，原代倉鼠腎細(xì)胞， 原代犬腎細(xì)胞或恒河猴二倍體胎J L肺細(xì)胞。
14. 黃病毒核酸在制備預(yù)防黃病毒感染的疫苗中的應(yīng)用，所述黃病毒核 酸在衣殼蛋白中具有權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)定義的至少4個以上連續(xù)核酸的缺 失。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種包含黃病毒突變體的減毒黃病毒活疫苗，其特征在于該黃病毒突變體包含缺失至少4個以上連續(xù)氨基酸的衣殼蛋白，而疏水的羧基末端區(qū)不受所述缺失的影響。
文檔編號A61K39/12GK101670101SQ200810149940
公開日2010年3月17日 申請日期2002年2月11日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月21日
發(fā)明者克里斯琴·曼德爾, 弗朗茲·X·海因茨 申請人:英特塞爾股份公司