專利名稱：：一種牛黃降壓丸的質(zhì)量控制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及中成藥的質(zhì)量控制方法，更具體地說，是一種采用高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜來控制牛黃降壓丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的測定方法。
背景技術(shù)：
：牛黃降壓丸收載于《中國藥典》2005年版一部，由羚羊角、珍珠、水牛角濃縮粉、黨參、決明子、甘松、薄荷、郁金、黃芪、人工牛黃、冰片、川芎、白芍、黃芩苷提取物等14味中藥組成。具有清心化痰、鎮(zhèn)靜降壓的功效。用于肝火旺盛、痰熱壅盛所致的頭暈?zāi)垦！㈩^痛失眠、煩躁不安；高血壓病見上述證候者。牛黃降壓丸是全國知名企業(yè)天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司達(dá)仁堂制藥廠生產(chǎn)的百姓放心藥品牌。已應(yīng)用臨床多年，是治療頭暈?zāi)垦?、頭痛失眠、高血壓效果較佳的臨床首選藥物，其療效不容置疑?，F(xiàn)代臨床研究進(jìn)一步證實(shí)，牛黃降壓丸對心腦腎有很好的保護(hù)作用，對于高血壓合并心電圖ST-T段改變者有改善作用，能擴(kuò)張冠狀動脈，增加冠狀動脈血流量，降低心肌耗氧量，擴(kuò)張外周血管，調(diào)整心肌血管的順應(yīng)性。對腎性高血壓有明顯降壓作用，其特點(diǎn)是具有雙向調(diào)節(jié)作用，使血壓下降但不會使之低于正常?；颊咂毡榉从撑｜S降壓丸對眩暈頭痛，急躁易怒，視物昏花等癥狀，緩解迅速。盡管牛黃降壓丸具有見效快，療效顯著等特點(diǎn)，但由于中藥具有成分復(fù)雜多變、活性成分多、藥效成分和毒性成分不甚明確等特點(diǎn)，再加上缺乏更加科學(xué)全面的質(zhì)量評價體系，嚴(yán)重地制約其在國際市場的競爭力。中國藥典僅針對牛黃降壓丸規(guī)定了冰片、人工牛黃、川芎、黃芪的薄層色譜鑒別方法和白芍、黃芩提取物的高效液相色譜含量測定。顯然，對于牛黃降壓丸這樣一個由14味動植物藥組成的復(fù)方，其質(zhì)量控制的鑒定方法過于簡單，相對于目前中藥產(chǎn)品質(zhì)量控制的要求有較大的差距。目前，中國藥典規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測，不能準(zhǔn)確全面反映產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量，也無法用于生產(chǎn)過程中、以及產(chǎn)品質(zhì)量的有效控制。因而必須重視質(zhì)量控制與療效評價標(biāo)準(zhǔn)的研究相結(jié)合，這樣才能使我國的中藥走出國門，邁向世界。目前，以指紋圖譜作為質(zhì)量控制方法已成為業(yè)界人士的共識。國際上多采用指紋圖譜對植物藥進(jìn)行質(zhì)量控制。中藥質(zhì)量控制正從簡單的單個成分含量測定轉(zhuǎn)向以先進(jìn)技術(shù)為手段，對多組分、多指標(biāo)進(jìn)行含量控制。采用中藥指紋圖譜方式，一方面可以通過指紋圖譜的特征性，有效的鑒別樣品的真?zhèn)魏彤a(chǎn)地；另一方面通過對主要指紋圖譜特征峰的面積或比例的控制，能有效控制產(chǎn)品的質(zhì)量，確保產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定一致，從而保證產(chǎn)品安全有效。中藥指紋圖譜是指某些中藥材或中藥制劑經(jīng)適當(dāng)處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標(biāo)示其化學(xué)特征的色譜圖。中藥指紋圖譜是一種綜合的，可量化的鑒定手段，它是建立在中藥化學(xué)成分系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上，主要用于評價中藥材以及中藥制劑成品質(zhì)量的真實(shí)性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性。由于中藥及其制劑均為多組分復(fù)雜體系，尤其是復(fù)方中藥成分復(fù)雜，其中所含的任意成分含量的高低都不能代表其整體的療效。如果只用其中一、兩種成分來說明其內(nèi)在質(zhì)量，具有一定的片面性，更無法判斷無藥效的指標(biāo)成分。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是建立一種牛黃降壓丸的質(zhì)量控制方法，特別是采用指紋圖譜技術(shù)對牛黃降壓丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行控制的方法。包括l)采用HPLC法建立牛黃降壓丸的指紋圖譜控制方法2)按照1)建立的方法采集IO批牛黃降壓丸的指紋圖譜，建立牛黃降壓丸的對照指紋圖譜；3)按照1)建立的方法測定待檢測牛黃降壓丸樣品的指紋圖譜；4)計(jì)算待檢測牛黃降壓丸樣品的指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度，相似度大于0.9以上的即為合格產(chǎn)品。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案—種牛黃降壓丸的質(zhì)量控制方法，其特征在于該方法包括以川芎、白芍和決明子有效成分指紋圖譜為檢測手段的測定方法，其步驟如下(1)色譜條件色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；采用梯度洗脫，流動相A為乙腈，B為O.1%磷酸;檢測波長為210400nm，優(yōu)選230nmnm;柱溫35。C;流速1.0mL/min，進(jìn)樣量10iiL;(2)參照物溶液的制備取黃芩苷對照品適量，置10mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，搖勻，即得；(3)供試品溶液的制備稱取牛黃降壓丸3g，剪碎，加硅藻土2g，研勻，置圓底燒瓶中，加入50%乙醇40mL，回流提取2h，濾過，濾液減壓濃縮，殘?jiān)眉状既芙庵?0mL量瓶中，并加至刻度，搖勻，經(jīng)0.45iim微孔濾膜濾過，即得；(4)以黃芩苷為參照峰的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的制定精密吸取參照物溶液和供試品溶液，分別注入高效液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，依據(jù)所測得的圖譜，制定標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。(5)將牛黃降壓丸待測產(chǎn)品指紋圖譜與制定的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行比較，計(jì)算相似度，識別兩者所具有的共同吸收峰的數(shù)量，以確定產(chǎn)品是否合格。其中待測牛黃降壓丸樣品指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜比對，其相似度應(yīng)為0.901.00。本發(fā)明所述牛黃降壓丸制得的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，各共有峰以5號峰黃芩苷為參照峰，計(jì)算相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果如下所示相對保留時間1(0.1390.140)，2(0.5000.502)，3(0.5270.529)，4(0.6140.616)，5(1.000)，6(1.3011.307)，7(1.3991.346)，8(1.5721.574)，9(1.8891.900)，10(1.9201.932);相對峰面積1(0.0360.091)，2(0.0230.047)，3(0.0910.134)，4(0.0280.038)，5(1.000)，6(0.0780.124)，7(0.0400.144)，8(0.2010.335)，9(0.1600.259)，10(0.0220.041)。其中以25min處黃吝苷的色譜峰為自身參照峰，3號峰芍藥苷在13min出峰；4號峰阿魏酸在17min出峰；5號峰黃芩苷在25min出峰；10號峰大黃素在51min出峰。單峰面積超過總峰面積10%的是S峰，其單峰面積占總峰面積為40%以上。本發(fā)明優(yōu)選的采用高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜測定的方法包括(1)色譜條件由于本實(shí)驗(yàn)樣品成分復(fù)雜，采用等度洗脫時各組份峰分離不理想，不能有效檢測樣品中各成分峰，故采用梯度洗脫的方式，先后嘗試了甲醇_水、甲醇_磷酸、甲醇_醋酸、乙腈_水和乙腈_磷酸等不同流動相系統(tǒng)，并且嘗試了多種不同梯度條件，最后確定梯度洗脫方式。經(jīng)比較，乙腈和O.1%磷酸水溶液一起組成流動相進(jìn)行梯度洗脫分離效果較好，能較好地使樣品中各色譜峰分離且出峰最多。因此最終確定用乙腈和0.1%磷酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫。(2)關(guān)于檢測波長的選擇取供試品溶液，在210400nm波長范圍進(jìn)行全梯度掃描，并對各波長下的色譜圖進(jìn)行分析比較。結(jié)果表明，在230nm下，各峰分離良好，特征峰明顯且峰型較好，因此選定230nm為指紋圖譜測定波長，結(jié)果見附圖4。最終確定的色譜柱SuntikC18(4.6X250mm，5iim)色譜柱；檢測波長230nm;柱溫35。C。流速1.OmL/min;流動相A:乙腈，B:0.1%磷酸；洗脫方式梯度洗脫(見表2);進(jìn)樣量10PL。(3)參照物溶液的制備方法取黃芩苷對照品適量，置10mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，搖勻，即得。(4)供試品溶液的制備本實(shí)驗(yàn)對供試品溶液的制備、色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化選擇。試驗(yàn)對樣品用甲醇、水、50%乙醇、95%乙醇分別進(jìn)行了超聲和回流提取方法比較。對不同提取溶劑、提取方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較，擬定采用50X乙醇回流2h提取方式作為供試品的制備方法，所得指紋圖譜出峰數(shù)較多。因此，優(yōu)選的條件為稱取牛黃降壓丸3g，剪碎，加硅藻土2g，研勻，置圓底燒瓶中，加入50%乙醇40mL，回流提取2h，濾過，濾液減壓濃縮，殘?jiān)眉状既芙庵?0mL量瓶中，并加至刻度，搖勻，經(jīng)0.45iim微孔濾膜濾過，即得。本發(fā)明優(yōu)選的以黃芩苷為參照峰的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的制定它是以上述方法作為待測定牛黃降壓丸樣品中川芎、白芍和決明子中一種或幾種成分指紋圖譜的測試手段(祥見圖3)。將待測定牛黃降壓丸樣品指紋圖譜與上述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜對比，計(jì)算相似度，應(yīng)為0.901.00。本發(fā)明建立的牛黃降壓丸質(zhì)量控制方法與現(xiàn)有技術(shù)相比所具有的積極效果在于(1)本發(fā)明采用高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜，以川芎、白芍和決明子的有效成分特征為主的指紋圖譜來全面控制牛黃降壓丸的質(zhì)量，更加完善了成品的質(zhì)量控制。(2)本發(fā)明所涉及的牛黃降壓丸，由于各藥材之間所含的化學(xué)成分復(fù)雜，對指紋圖譜的制定造成干擾，導(dǎo)致各部分指紋圖譜特征不穩(wěn)定，所以必須嚴(yán)格控制流動相的色譜條件，才能得到良好的指紋圖譜。也就是說，本發(fā)明涉及制劑的指紋圖譜不是將川芎、白芍和決明子藥材或制劑的指紋圖譜簡單疊加就能得到的，由于處方中14味藥材所含成分相互之間的干擾影響，導(dǎo)致本發(fā)明涉及制劑中川芎、白芍和決明子部分的指紋圖譜特征峰發(fā)生改變，而只有采用本發(fā)明經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)加以確定的條件，才能得到理想的指紋圖譜。(3)以牛黃降壓丸主要有效成分川芎、白芍和決明子為指標(biāo)建立起來的高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜，代表了牛黃降壓丸的藥理活性，不僅能有效地表征牛黃降壓丸的內(nèi)在質(zhì)量，更適合于生產(chǎn)過程中產(chǎn)品質(zhì)量的有效控制。(4)通過實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明質(zhì)量控制方法對牛黃降壓丸成品的質(zhì)量控制更為有效，方法精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性均較高。能有效控制產(chǎn)品的質(zhì)量，確保產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定一致，從而保證產(chǎn)品的安全有效。圖1為牛黃降壓丸的HPLC-DAD三維圖譜。圖2為10批牛黃降壓丸的HPLC指紋圖譜(疊加顯示)。圖3為牛黃降壓丸的HPLC對照指紋圖譜。具體實(shí)施例方式為了更充分的解釋本發(fā)明的實(shí)施，提供下述測定方法的實(shí)施實(shí)例。這些實(shí)施實(shí)例僅僅是解釋、而不是限制本發(fā)明的范圍。下面通過典型的實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。實(shí)施例1牛黃降壓丸標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜建立色譜條件Waters2695高效液相色譜儀(Waters996型PDA檢測器，EmpowerWaters工作站)；(1)色譜條件色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；采用梯度洗脫，流動相A為乙腈，B為0.1%磷酸；檢測波長為230nmnm;柱溫35t:;流速1.0mL/min，進(jìn)樣量lOiiL;(2)參照物溶液的制備取黃芩苷對照品適量，置lOmL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，搖勻，即得；(3)供試品溶液的制備稱取牛黃降壓丸3g，剪碎，加硅藻土2g，研勻，置圓底燒瓶中，加入50%乙醇40mL，回流提取2h，濾過，濾液減壓濃縮，殘?jiān)眉状既芙庵?0mL量瓶中，并加至刻度，搖勻，經(jīng)0.45m微孔濾膜濾過，即得；(4)以黃芩苷為參照峰的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的制定精密吸取參照物溶液和供試品溶液，分別注入高效液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，依據(jù)所測得的圖譜，制定標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。(5)將牛黃降壓丸待測產(chǎn)品指紋圖譜與制定的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行比較，計(jì)算相似度，識別兩者所具有的共同吸收峰的數(shù)量，以確定產(chǎn)品是否合格。2、方法學(xué)考察1)精密度實(shí)驗(yàn)在上述優(yōu)化后的色譜條件下，分析供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄指紋圖譜，以25min出峰的黃芩苷保留時間和色譜峰面積為參照，計(jì)算出各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果見附表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各色譜峰的相對保留時間及峰面積的比值基本沒有明顯變化，各色譜峰的相對保留時間和單峰面積大于或等于5%的色譜峰的比值基本一致(RSD在3.0%以下)，符合指紋圖譜的要求。2)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)在上述優(yōu)化后的色譜條件下，分析供試品溶液，分別在0，3，6，12，24h時間間隔下檢測指紋圖譜，以黃芩苷的保留時間和色譜峰面積為參照，計(jì)算出各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果見附表4。結(jié)果表明，各色譜峰的相對保留時間及峰面積的比值基本沒有明顯變化，各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均不大于2.98%，符合指紋圖譜的要求(不大于3%)。樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。3)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取批號為Nl的樣品，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液5份，檢測指紋峰。以黃芩苷的保留時間和色譜峰面積為參照，計(jì)算出各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果見附表5。結(jié)果表明，各色譜峰的相對保留時間及峰面積的比值基本沒有明顯變化，各共有峰的相對保留時間和單峰面積占總峰面積大于或等于5%的色譜峰面積比值基本一致(RSD在3.0%以下)，符合指紋圖譜要求。3、牛黃降壓丸指紋圖譜的建立本研究收集了不同批次川芎樣品10批，由天津達(dá)仁堂提供。來源及產(chǎn)地見表1。取上述10批牛黃降壓丸藥材(依次批號為Nl至N10號)，按上述方法制備供試品溶液。采用HPLC法對川芎藥材進(jìn)行分析，記錄各色譜圖。上述實(shí)驗(yàn)條件下測定所有樣品的HPLC色譜圖，見圖2。對IO批樣品進(jìn)行測定，經(jīng)比較樣品的色譜圖和計(jì)算相對保留時間，其中有IO個峰確定為共有指紋峰。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其中大黃素在51min出峰(10號峰)，黃吝苷在25min出峰(5號峰)，芍藥苷在13min出峰(3號峰)，阿魏酸在17min出峰(4號峰)。以25min處黃吝苷的色譜峰為自身參照峰(見圖3)。以25min處的黃芩苷色譜峰為內(nèi)參照峰，計(jì)算各共有指紋峰保留時間、峰面積的相對比值，計(jì)算結(jié)果見表6、表7。按照《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求》要求，對單峰面積超過總峰面積10%以上的峰進(jìn)行面積標(biāo)定，超過總峰面積10%的是S峰。制定了牛黃降壓丸的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜技術(shù)參數(shù)，相對保留時間1(0.1390.140)，2(0.5000.502)，3(0.5270.529)，4(0.6140.616)，5(1.000)，6(1.3011.307)，7(1.3991.346)，8(1.5721.574)，9(1.8891.900)，10(1.9201.932)，相對峰面積1(0.0360.091)，2(0.0230.047)，3(0.0910.134)，4(0.0280.038)，5(1.000)，6(0.0780.124)，7(0.0400.144)，8(0.2010.335)，9(0.1600.259)，10(0.0220.041);其中5(S)號峰的單峰面積占總峰面積為40%以上。4、相似度評價用《中藥色譜圖的指紋圖譜評價系統(tǒng)》軟件(2004A)進(jìn)行色譜峰的匹配，計(jì)算10批牛黃降壓丸的相似度，結(jié)果見表8。表1牛黃降壓丸樣品收集<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2流動相條件時間(min)A(乙腈)B(0.1%磷酸)010901025752525753040604040604570305070305510006010006510907010908_表3精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果_<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>權(quán)利要求一種牛黃降壓丸的質(zhì)量控制方法，其特征在于該方法包括以川芎、白芍和決明子為有效成分的指紋圖譜測定，其步驟如下(1)色譜條件色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；采用梯度洗脫，流動相A為乙腈，B為0.1％磷酸；檢測波長為210～400nm；柱溫35℃；流速1.0mL/min，進(jìn)樣量10μL；(2)參照物溶液的制備取黃芩苷對照品適量，置容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，搖勻，即得；(3)供試品溶液的制備稱取牛黃降壓丸3g，剪碎，加硅藻土2g，研勻，置圓底燒瓶中，加入50％乙醇40mL，回流提取2h，濾過，濾液減壓濃縮，殘?jiān)眉状既芙庵?0mL量瓶中，并加至刻度，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，即得；(4)以黃芩苷為參照峰的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的制定精密吸取參照物溶液和供試品溶液，分別注入高效液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，依據(jù)所測得的圖譜，制定標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜；(5)將牛黃降壓丸待測產(chǎn)品指紋圖譜與制定的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行比較，計(jì)算相似度，識別兩者所具有的共同吸收峰的數(shù)量，以確定產(chǎn)品是否合格。2.如權(quán)利要求1所述牛黃降壓丸的質(zhì)量控制方法，其中待測牛黃降壓丸樣品指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜比對，其相似度應(yīng)為0.901.00。3.如權(quán)利要求1所述牛黃降壓丸的質(zhì)量控制方法，其中的檢測波長為230nm.。4.如權(quán)利要求1所述牛黃降壓丸的質(zhì)量控制方法，其特征在于該方法所得標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，以5號峰黃吝苷為參照峰，各共有峰有10個，其中單峰面積超過5%的吸收峰有5個；計(jì)算相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果如下所示相對保留時間1(0.1390.140)，2(0.5000.502)，3(0.5270.529)，4(0.6140.616)，5(1.000)，6(1.3011.307)，7(1.3991.346)，8(1.5721.574)，9(1.8891.900)，10(1.9201.932);相對峰面積:1(0.0360.091)，2(0.0230.047)，3(0.0910.134)，4(0.0280.038)，5(1.000)，6(0.0780.124)，7(0.0400.144)，8(0.2010.335)，9(0.1600.259)，10(0.0220.041)。5.如權(quán)利要求4所述牛黃降壓丸的質(zhì)量控制方法，其中以25min處黃芩苷的色譜峰為自身參照峰，3號峰芍藥苷在13min出峰；4號峰阿魏酸在17min出峰；5號峰黃芩苷在25min出峰；10號峰大黃素在51min出峰。6.如權(quán)利要求4所述牛黃降壓丸的質(zhì)量控制方法，其中單峰面積超過總峰面積10%的是S峰，其單峰面積占總峰面積為40%以上。全文摘要本發(fā)明涉及牛黃降壓丸HPLC指紋圖譜的質(zhì)量控制方法，包括以川芎、白芍和決明子有效成分指紋圖譜為測試手段建立的質(zhì)量控制方法，其中的色譜條件色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；采用梯度洗脫，流動相A為乙腈，B為0.1％磷酸；檢測波長為230nm；柱溫35℃；流速1.0mL/min，進(jìn)樣量10μL；采用本發(fā)明的測定方法，能有效的控制牛黃降壓丸的內(nèi)在質(zhì)量，該方法具有精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性高的特點(diǎn)，確保產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定一致，從而保證產(chǎn)品的安全有效。文檔編號A61P9/12GK101716308SQ200810152289公開日2010年6月2日申請日期2008年10月10日優(yōu)先權(quán)日2008年10月10日發(fā)明者劉彤,孫寶珍,張鐵軍,王文燕,趙強(qiáng),金兆祥申請人:天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司達(dá)仁堂制藥廠