專利名稱：去甲異波爾定在制備治療自身免疫性疾病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及去甲異波爾定的醫(yī)藥用途。
背景技術(shù)：
自身免疫性疾病是一類臨床常見的由免疫應(yīng)答異常所致的疾病，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、 系統(tǒng)紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥、I型糖尿病、銀屑病、潰瘍性結(jié)腸炎等多種疾病。其中，類風(fēng) 濕關(guān)節(jié)炎是以周圍對(duì)稱性的多關(guān)節(jié)非化膿性炎癥為主的疾病，常常伴有關(guān)節(jié)腔滑膜炎癥，滑 膜組織增生，肉芽腫形成，軟骨及骨組織破壞，最后關(guān)節(jié)形變，功能缺失。而多發(fā)性硬化是 一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘病變?yōu)樘卣鞯淖陨砻庖呒膊?。治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物主要 有非甾體抗炎藥(雙氯滅痛，阿司匹林等)，皮質(zhì)激素和免疫抑制劑(6-巰基嘌呤等)，治療 多發(fā)性硬化的藥物主要有皮質(zhì)激素和免疫抑制劑。但這些藥物均存在明顯的不良反應(yīng)。非甾 體抗炎藥易造成胃腸道粘膜損傷而導(dǎo)致消化性潰瘍；皮質(zhì)激素類藥物雖可有效地改善癥狀， 但長(zhǎng)期應(yīng)用易引起許多副作用如液體及電解質(zhì)不平衡、腸胃、內(nèi)分泌、骨質(zhì)及代謝的損害， 且停藥后易出現(xiàn)"反跳"現(xiàn)象；免疫抑制劑選擇性差，易于誘發(fā)感染。因此，有必要研制新 型的高效、安全的治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和多發(fā)性硬化的藥物。
中藥烏藥為樟科山胡椒屬植物烏藥UwAra aggregato (Sims) Kosterm.(丄.W/jc/iw/o/ia Vill) 千燥塊根。去甲異波爾定(norisoboldine)是烏藥所含的一種異喹啉類生物堿，分子式為 CuH1904N，該化合物在原藥材中含量較高。迄今為止，除體外抗氧化作用(藥學(xué)學(xué)報(bào)2006 41(10):956-962〕夕卜，未見有關(guān)去甲異波爾定生物活性或臨床應(yīng)用方面的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了去甲異波爾定的醫(yī)藥新用途，即其可用于制備治療自身免疫性疾病藥物的 應(yīng)用。所述自身免疫性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、系統(tǒng)紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化 癥、I型糖尿病、銀屑病、潰瘍性結(jié)腸炎、Sjogren綜合征、硬皮病、多肌炎、慢性活動(dòng)性肝 炎、混合性結(jié)締組織病、原發(fā)性膽汁性肝硬變、自身免疫性溶血性貧血、橋本甲狀腺炎、 Addisons病、白斑、Graves病、重癥肌無力、強(qiáng)直性脊柱炎、變應(yīng)性骨關(guān)節(jié)炎、變應(yīng)性血管 炎、自身免疫性噬中性白細(xì)胞減少癥、特發(fā)性血小板減少性紫癜、狼瘡性腎炎、慢性萎縮性 胃炎、自身免疫性不育、子宮內(nèi)膜異位癥、pasture病、天皰瘡、盤狀狼瘡或致密沉積物等疾 病。
優(yōu)選治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，還優(yōu)選治療多發(fā)性硬化癥。
去甲異波爾定可按照文獻(xiàn)制得，可以從烏藥中提取得到，也可以化學(xué)合成得到，還可在 市場(chǎng)購(gòu)得，或用下列方法制備干燥的烏藥塊根粉末，用95%乙醇回流提取，減壓濃縮得浸 膏，加入2%鹽酸溶解，過濾。濾液經(jīng)強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂柱層析，水洗柱，氨水調(diào)pH至
8.5后，將交換樹脂轉(zhuǎn)入索氏提取器中，乙醚回流提取。揮去乙醚，得黒棕色提取物。提取物
經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜分離得到去甲異波爾定粗品，經(jīng)過多次重結(jié)晶，得到去甲異波爾定純品。


圖l是對(duì)膠原關(guān)節(jié)炎小鼠體重增長(zhǎng)的影響(與模型組比較，*/7<0.05,**;7<0.01) 圖2是對(duì)小鼠膠原關(guān)節(jié)炎臨床積分的影響(與模型組比較，*戶<0.05,**; <0.01) 圖3是對(duì)小鼠血清中抗-II型膠原抗體的影響(與模型組比較，*》<0.01) 圖4是對(duì)II型膠原誘導(dǎo)的小鼠耳廓遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響(與模型組比較，*p<0.05,**/K0.01) 圖5是對(duì)II型膠原誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響(與模型組比較，*戶<0.05，**/7<0.01)
圖6是對(duì)II型膠原關(guān)節(jié)炎小鼠關(guān)節(jié)組織學(xué)變化的影響(A:正常組；B:模型組；C:去甲異
波爾定40mg/kg組；D:地塞米松lmg/kg組)
圖7是對(duì)II型膠原關(guān)節(jié)炎小鼠關(guān)節(jié)組織學(xué)病變積分的影響(與模型組比較，*P<0.05，**p<0.01)
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
去甲異波爾定的制備干燥的烏藥塊根粉末3 kg，用95%乙醇回流提取3次，每次2h， 減壓濃縮得浸膏，加入2%鹽酸溶解，過濾。濾液經(jīng)強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂柱層析，水洗柱， 氨水調(diào)pH至8.5后，將交換樹脂轉(zhuǎn)入索氏提取器中，乙醚回流提取。揮去乙醚，得黒棕色提 取物4.8g。提取物經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜分離，氯仿-甲醇(7: 3)反復(fù)洗脫得到化合物I粗品， 經(jīng)過多次重結(jié)晶，得到棕色粉末化合物I 0.76 g。與對(duì)照品共硅膠薄層層析，Rf值一致，混和 熔點(diǎn)不下降，故鑒定化合物I為去甲異波爾定。經(jīng)HPLC檢測(cè)，化合物1的純度為98%。
實(shí)施例2
去甲異波爾定對(duì)II型膠原致小鼠關(guān)節(jié)炎的影響 1去甲異波爾定對(duì)膠原關(guān)節(jié)炎小鼠體重的影響
將雞II型膠原加入0.1 M的醋酸中，4 °C攪拌至充分溶解，使其濃度為2 mg/ml， 4 °C 過夜，在冰浴中與等體積完全弗氏佐劑(含2 mg/ml的熱滅活結(jié)核分支桿菌)混合，充分乳 化，得II型膠原乳劑。雄性ICR小鼠尾根部皮內(nèi)注射II型膠原乳劑100 pl致敏，注射當(dāng)天記 為d 0。第21天再次在相同部位注射II型膠原乳劑100 pl攻擊，將小鼠隨機(jī)分為6組(n-7 —8) : 1)正常組；2)模型組；3)去甲異波爾定(10mg/kg); 4)去甲異波爾定(20mg/kg); 5)去甲異波爾定(40mg/kg): 6)地塞米松(DEX, 1 mg/kg)。每日灌胃給藥，正常組和模型 組小鼠給予等量溶劑，連續(xù)20天。在此過程中，記錄小鼠體重變化。
結(jié)果見圖l,圖l顯示II型膠原攻擊后模型組和地塞米松組小鼠的體重明顯減輕，去甲 異波爾定(10, 20， 40 mg/kg)能夠有效緩解膠原關(guān)節(jié)炎小鼠的體重減輕。 2膠原關(guān)節(jié)炎臨床積分評(píng)價(jià)
第21天起，每隔4天觀察一次小鼠關(guān)節(jié)及足紅腫狀況， 一直觀察至第40天。小鼠足的 關(guān)節(jié)炎輕重程度采用雙盲法并依據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)0分=無變化；1分=腳趾上出現(xiàn)腫脹
和紅斑；2分=足部出現(xiàn)輕微的腫脹和紅斑；3分=腳趾上出現(xiàn)明顯的腫脹和紅斑；4分=足部 出現(xiàn)嚴(yán)重的腫脹或強(qiáng)直變形。四足的臨床積分之和作為每個(gè)小鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分，每只小鼠最高
積分為16分。
由圖2可見，去甲異波爾定(20, 40 mg/kg)和地塞米松(1 mg/kg)明顯減輕膠原關(guān)節(jié)炎小 鼠關(guān)節(jié)的腫脹和紅斑，降低關(guān)節(jié)炎臨床積分。
3血清中抗-II型膠原抗體的檢測(cè)
致敏后第36天，小鼠眼眶采血，制備血清，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)小鼠血清中抗 -II型膠原抗體的滴度。
圖3顯示，膠原關(guān)節(jié)炎小鼠血清中IgG滴度明顯高于正常小鼠。去甲異波爾定(20， 40mg/kg) 顯著降低小鼠血清中抗II型膠原IgG抗體水平。
4去甲異波爾定對(duì)II型膠原誘導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響
致敏后第40天，小鼠右耳皮內(nèi)注射0.2%11型膠原溶液(溶于0.1 M冰乙酸)20 pl，左耳注 射等量溶媒。24小時(shí)后，用螺旋測(cè)微儀檢測(cè)兩耳廓厚度，用兩耳廓厚度差作為表示遲發(fā)型超
敏反應(yīng)強(qiáng)度。
由圖4可見，去甲異波爾定(20,40mg/kg)明顯抑制II型膠原誘發(fā)的小鼠耳遲發(fā)型超敏反應(yīng)。
5去甲異波爾定對(duì)n型膠原誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖的影響
致敏后第41天，將模型組小鼠斷頭放血處死，在無菌條件下取出腹股溝處淋巴結(jié)，經(jīng)碾 磨和過濾，分散成單個(gè)淋巴細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸浮于含10。/。NCSRPMI-1640培養(yǎng)基中，調(diào)整 細(xì)胞濃度為5x106個(gè)/ml。將細(xì)胞懸液加入96孔板中，100pl/ L，分別加入II型膠原(終濃 度50嗎/ml)50pl，以及不同濃度的藥物50pl，在37 。C， 5% (302條件下培養(yǎng)68小時(shí)。每孔 加入MTT (5 mg/ml) 20 pl，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，離心(2000 rpm, 20分鐘)，吸棄 上清液，每孔加入DMSO200nl，振蕩IO分鐘。在波長(zhǎng)540nm處測(cè)量吸光度。按下式計(jì)算 淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)增殖指數(shù)=加II型膠原組OD值/空白組OD值。
由圖5可見，去甲異波爾定(20, 40 mg/kg)和地塞米松(1 mg/kg)顯著抑制II型膠原誘導(dǎo)的 淋巴細(xì)胞增殖。
6關(guān)節(jié)組織學(xué)檢査
小鼠處死后，取后足固定于4.5%甲醛溶液。在4。C條件下，10%EDTA中鈣化14天， 石蠟包埋、切片(5 pm)，蘇木精和伊紅(H&E)染色。跗關(guān)節(jié)組織病理學(xué)變化根據(jù)下列評(píng)分系統(tǒng)
進(jìn)行評(píng)價(jià)0分=正常；1分二炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；2分=滑膜增生；3分=血管翳形成；4分=
骨質(zhì)侵蝕；5分=骨質(zhì)破壞。每只小鼠關(guān)節(jié)病變的最高積分為15分。
圖6中B顯示，膠原關(guān)節(jié)炎模型組小鼠出現(xiàn)關(guān)節(jié)滑膜增生、血管翳形成、關(guān)節(jié)腔炎細(xì)胞 浸潤(rùn)、骨和軟骨侵蝕等病變。去甲異波爾定(40 mg/kg)組小鼠沒有發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)的侵蝕和降解， 炎細(xì)胞浸潤(rùn)和滑膜增生較模型組小鼠輕(圖6 C)。地塞米松(lmg/kg)亦阻止關(guān)節(jié)的破壞(圖 6 D)。各組小鼠關(guān)節(jié)病理學(xué)改變的積分見圖7。
實(shí)施例3
去甲異波爾定對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的影響
無菌條件下取豚鼠脊髓，制成50%勻漿，與等量的完全福氏佐劑充分混合，制成免疫原。 大鼠兩后足墊內(nèi)各注射免疫原乳劑O.l mL，同時(shí)尾根皮下注射百日咳疫苗(5.5 xl(^mi;1 )0.2 mL 。對(duì)照組免疫原中的豚鼠脊髓勻漿以等量生理鹽水替代，給藥組自免疫當(dāng)日開始給藥， 連續(xù)18天。免疫接種后每日稱大鼠體重，觀察病情并進(jìn)行神經(jīng)功能障礙評(píng)分。神經(jīng)功能障礙評(píng)分標(biāo) 準(zhǔn)采用5分評(píng)分法0分，無明顯異常；1分，大鼠尾部無力麻痹；2分，尾部無力+后肢 無力；3分，后肢輕度麻痹；4分，后肢嚴(yán)重麻痹伴前肢無力，被動(dòng)翻身不能復(fù)原；5分， 全身癱瘓或?yàn)l死。
EAE模型組大鼠在致敏后7 10天，陸續(xù)出現(xiàn)活動(dòng)減少，體重減輕，尾部麻痹，雙后肢 癱瘓，嚴(yán)重者四肢癱瘓，伴大小便失禁，甚至出現(xiàn)瀕死狀態(tài)。整個(gè)病程持續(xù)8 10天，發(fā)病率 100%。去甲異波爾定(10， 20 mg/kg)灌胃給藥組的發(fā)病率分別為50 %和30 %，臨床癥狀明 顯減輕(表l )。
表l去甲異波爾定對(duì)EAE大鼠臨床神經(jīng)功能障礙的影響組別劑量初期緩解期高峰期(mg/kg)(第8天)(第12天)(第18天)模型組0.9土0.33.4±0.8
去甲異波爾定100.6±0.22.2±0.7"200.5±0.2*1.5土0.7"0.4±0.2* 與模型組比較，*/7<0.05,**p<0.01。 各組大鼠于免疫接種后第12天(相當(dāng)于EAE發(fā)病高峰期)，取血制備血清，ELISA法檢測(cè) IL-2和IFN-y水平。與對(duì)照組比較，eae模型組大鼠血清IL-2和IFN-丫水平明顯升高。去甲異 表2去甲異波爾定對(duì)EAE大鼠血清IL-2和IFN-Y水平的影響 組別 劑量 (mg/kg) IL-2 (pg/ml) IFN-y (pg/ml) 對(duì)照組 模型組 去甲異波爾定 10 20 67.5±12.2 188.6±25.3 58.4士12.1** 37.8±10.9** 11.1±2.9 73.5±14.6 44.5±16.4** 20.5±9.6** 與模型組比較，**p<0.01,
權(quán)利要求
1、去甲異波爾定在制備治療自身免疫性疾病的藥物中的應(yīng)用。
2、 權(quán)利要求l的應(yīng)用，其中自身免疫性疾病是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。
3、 權(quán)利要求l的應(yīng)用，其中自身免疫性疾病是多發(fā)性硬化癥。
4、 權(quán)利要求l的應(yīng)用，其中自身免疫性疾病是系統(tǒng)紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥、I型糖尿病、 銀屑病、潰瘍性結(jié)腸炎、Sjogren綜合征、硬皮病、多肌炎、慢性活動(dòng)性肝炎、混合性結(jié)締組 織病、原發(fā)性膽汁性肝硬變、自身免疫性溶血性貧血、橋本甲狀腺炎、Addisons病、白斑、 Graves病、重癥肌無力、強(qiáng)直性脊柱炎、變應(yīng)性骨關(guān)節(jié)炎、變應(yīng)性血管炎、自身免疫性噬中 性白細(xì)胞減少癥、特發(fā)性血小板減少性紫癜、狼瘡性腎炎、慢性萎縮性胃炎、自身免疫性不 育、子宮內(nèi)膜異位癥、pasture病、天皰瘡、盤狀狼瘡或致密沉積物疾病。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及去甲異波爾定的醫(yī)藥用途。其特征是去甲異波爾定可用于制備治療自身免疫性疾病藥物的應(yīng)用。所述自身免疫性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、系統(tǒng)紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥、I型糖尿病、銀屑病、潰瘍性結(jié)腸炎、Sjogren綜合征、硬皮病、多肌炎、慢性活動(dòng)性肝炎、混合性結(jié)締組織病、原發(fā)性膽汁性肝硬變、自身免疫性溶血性貧血等疾病。
文檔編號(hào)A61K31/473GK101375850SQ20081015621
公開日2009年3月4日 申請(qǐng)日期2008年10月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月7日
發(fā)明者侴桂新, 美 劉, 夏玉鳳, 岳 戴, 王崢濤 申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)