專利名稱：檸檬酸小檗胺鹽及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬化學(xué)領(lǐng)域，涉及檸檬酸小檗胺(Berbamine citrate)及其制備，以及 含有它們的藥物組合和它們在制備治療血液腫瘤性疾病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告2007年全世界大約2500萬人患有各種各樣的癌癥， 790萬人死于這些癌癥(約占所有死亡人數(shù)的13%)。預(yù)計(jì)全世界癌癥死亡將 繼續(xù)增加，2030年估計(jì)將有1200萬人死于癌癥。2006年，癌癥在中國奪去了 近180萬人的生命，比2005年的數(shù)字多出了約30萬。由衛(wèi)生部衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)中心 制作的《2006年中國衛(wèi)生事業(yè)發(fā)展情況統(tǒng)計(jì)公報(bào)》表明，癌癥在2006年城鄉(xiāng) 居民的死因中第一次"榮登榜首"。其中，城鎮(zhèn)及農(nóng)村居民的癌癥死亡率分別比 2005年上升了 14.76%和21.57%。也就是說，去年有83.4萬的城鎮(zhèn)居民和96 萬的農(nóng)村居民死于癌癥，這幾乎占了全年總死亡人數(shù)的四分之一，癌癥己成為 人類健康的第一殺手。然而，令人遺憾的是，目前常用的藥物并不能有效控制 和治療這些癌癥，因此研究新的更好的藥物來預(yù)防和治療這些癌癥有著十分重 要的意義。
小檗胺是一種雙芐基異喹啉類生物堿。已有一些文獻(xiàn)報(bào)道，小檗胺具有誘 導(dǎo)一些白血病細(xì)胞和其它腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。如本發(fā)明的發(fā)明人前期研究文 獻(xiàn)報(bào)道，在體外培養(yǎng)體系中，鹽酸小檗胺能誘導(dǎo)人K562、 Jurkat、 HL-60、 NB-4 白血病細(xì)胞凋亡，抑制白血病細(xì)胞生長[Xu R， et al. Leukemia Research.2006, 30:17-23; Sun JR,et al. Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2006; 86:2246-51; Zhao XY, et al. Chin Med J (Engl). 2007;120:802-6]。也有文獻(xiàn)報(bào)道，小檗胺能誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的 人肝癌細(xì)胞系SMMC7721和前列腺癌細(xì)胞PC-3凋亡[Wang GY，et al. J Zhejiang UnivSciB. 2007;8:248-55;中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2007; 24巻8期957-959頁]。也 有文獻(xiàn)報(bào)道小檗胺衍生物4乙氧丁基小檗胺
具有抑制小鼠肝癌生長[Fang BJ, et al. World J Gastroenterol 2004，10:950-953]和誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人肺癌細(xì)胞凋亡[山西師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然 科學(xué)版)2001年04期55-58頁]。但這些文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果顯示，盡管鹽酸小檗胺 或者小檗胺衍生物EBB對體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用，，但它們體內(nèi)抗腫瘤效果并不理想。
已知，化合物的水溶性是決定其生物利用度和藥效的關(guān)鍵因素之一。大多 數(shù)生物堿在植物體內(nèi)常與有機(jī)酸(檸檬酸，果酸，草酸，琥珀酸，醋酸，丙酸 等)結(jié)合成高水溶性的鹽而發(fā)揮作用，目前常用的小檗胺或小檗胺衍生物是疏 水的生物堿，不溶于水。應(yīng)用無機(jī)酸鹽酸制備的鹽酸小檗胺，水溶性也不高，
小于30mg/ml。小檗胺的疏水性和鹽酸小檗胺的低水溶性無疑會(huì)影響其抗腫瘤 效果。因此，研制新的小檗胺鹽類，以提高其水溶性和生物利用度，有可能提 高小檗胺抗腫瘤。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有以下通式結(jié)構(gòu)的新型小檗胺有機(jī)酸鹽 (Berbamine citrate),所述小檗胺有機(jī)酸鹽檸檬酸小檗胺鹽的通式結(jié)構(gòu)
(I)
其中R為一水檸檬酸(C6H507.H20)，也可以是無水檸檬酸(C6H507)。 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述檸檬酸小檗胺有機(jī)酸鹽的制備方法，通過 以下步驟實(shí)現(xiàn)
(1) 室溫下，將小檗胺加入R (—水檸檬酸或無水檸檬酸)溶液進(jìn)行成鹽 反應(yīng)，小檗胺和檸檬酸的優(yōu)選重量比例但不限于為4 20: 1。
(2) 將上述檸檬酸小檗胺鹽溶液干燥，得微黃或白色檸檬酸小檗胺鹽粉末。
反應(yīng)式
<formula>formula see original document page 5</formula>本發(fā)明所用的制備檸檬酸小檗胺鹽的方法，成功率高，簡單易行，成本低，
適合規(guī)?；a(chǎn)(實(shí)施例1-2)。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供上述檸檬酸小檗胺鹽在制備抗血液腫瘤性疾 病藥物中的應(yīng)用。涉及但不限于在制備治理白血病、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤等 藥物中的應(yīng)用。
所制備的藥物由含治療有效量的檸檬酸小檗胺鹽和藥學(xué)上可接受的輔劑 組成。
所制備的藥物還含有其他抗腫瘤藥物。所述擰檬酸小檗胺鹽的抗血液腫瘤 性疾病藥物組合，例如但不限于抗白血病藥物組合、抗多發(fā)性骨髓瘤藥物組合、 抗淋巴瘤藥物組合等。
本發(fā)明主要依據(jù)是目前常用的小檗胺是一種未成鹽的游離生物堿，不溶 于水，或者是一種用無機(jī)酸鹽酸制備的低水溶性的鹽酸小檗胺，而事實(shí)上，大 多數(shù)生物堿在植物體內(nèi)常與有機(jī)酸(檸檬酸，果酸，草酸，琥珀酸，醋酸，丙 酸等)結(jié)合成高水溶性的有機(jī)酸鹽而發(fā)揮作用。因此，本發(fā)明的發(fā)明人應(yīng)用可
食用的強(qiáng)有機(jī)酸檸檬酸設(shè)計(jì)和制備水溶性(Water-solubility)更好的小檗胺有機(jī) 酸鹽，通過體外和動(dòng)物體內(nèi)抗腫瘤活性篩選，以期獲得抗腫瘤活性更高、毒性 更低的新型小檗胺鹽，供進(jìn)一步開發(fā)成新的藥物。本發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，檸檬 酸小檗胺不僅具有很好的水溶性，而且在動(dòng)物體內(nèi)對多種血液腫瘤性疾病具有 很好的治療作用。
按上述方法制備的檸檬酸小檗胺鹽的特點(diǎn)是應(yīng)用可食用的強(qiáng)有機(jī)酸擰檬 酸取代目前常用的用無機(jī)酸鹽酸制備小檗胺鹽，獲得的檸檬酸小檗胺鹽不僅其 水溶性高，約為500mg/ml (見實(shí)施例3)，是目前常用鹽酸小檗胺(30mg/ml) 的16.6倍以上，而且用上述檸檬酸小檗胺鹽配制的溶液的pH值在4-5之間， 明顯高于鹽酸小檗胺鹽溶液(pH值在2左右)(見實(shí)施例4)。
本發(fā)明所述的小檗胺檸檬酸鹽能選擇性誘導(dǎo)多種血液腫瘤如白血病、多發(fā) 性骨髓瘤、淋巴瘤等腫瘤細(xì)胞死亡(見實(shí)施例5-10)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)口服小檗 胺擰檬酸鹽能顯著抑制動(dòng)物體內(nèi)人異種移植瘤生長，對其中的一些腫瘤，如白 血病顯示出完全清除，達(dá)到根治腫瘤效果，體內(nèi)抗腫瘤活性明顯高于鹽酸小檗 胺鹽(見實(shí)施例11)。更有意義的是，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明所述的檸檬 酸小檗胺在抗腫瘤有效劑量下對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無明顯毒性反應(yīng)(見實(shí)施例11)。
所述藥物的由本發(fā)明通式(I)化合物和任選的制劑允許的藥物賦形劑或 載體組成。
本發(fā)明的化合物可以以口服的形式給藥，例如但不限于普通片劑和腸溶片、膠囊、藥丸、粉劑、粒劑、酊劑、溶液、懸浮液和糖漿劑。它們也可以以 腸胃外的形式給藥，例如但不限于藥學(xué)領(lǐng)域的普通人熟知的靜脈內(nèi)、腹膜腔內(nèi)、 皮下和肌肉等形式。
使用本發(fā)明的化合物的劑量方案由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)各種因素 來選擇所述因素包括但不限于年齡、體重、性別和接受者的體格狀況、需要 治療的疾病的嚴(yán)重程度、給藥的途徑、接受者的代謝水平和排泄功能、采用的 劑量形式。
本發(fā)明的藥物組合可以進(jìn)一步包含另外一種或多種抗癌藥物，例如市場上 供應(yīng)的現(xiàn)有抗癌藥物。
抗癌藥物通常在聯(lián)合使用時(shí)更為有效。此外，最好以大多數(shù)藥物的最大耐 受劑量，兩次給藥之間的時(shí)間間隔最小進(jìn)行給藥。
本發(fā)明的化合物優(yōu)選在給藥之前與一種或多種藥學(xué)上可以接受的賦型劑 一起配制。賦型劑是惰性物質(zhì)，例如但不限于載體、稀釋液、調(diào)味劑、甜味劑、 潤滑劑、增溶劑、懸浮劑、粘合劑、藥品崩解劑和膠囊材料。
本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案是藥物制劑，該制劑包括本發(fā)明的化合物和 一種或多種藥學(xué)上可以接受的賦型劑，該賦型劑可以與該制劑中的其它成分相 容且對其接受者無害。本發(fā)明的藥物制劑通過將治療有效量的本發(fā)明的化合物 與一種或多種藥學(xué)上可以接受的賦型劑組合來制備。在制備本發(fā)明的組合物過 程中，所述活性成分可以與稀釋劑混合、或被封閉在載體內(nèi)，該載體可以是膠 囊、小袋、包裝紙或其它容器。該載體可以用作稀釋劑，可以是用作運(yùn)載體的 固體、半固體或液體材料；或是藥片、藥丸、粉劑、錠劑、懸浮液、乳劑、溶 液、糖漿、軟和硬的凝膠膠囊、栓劑、無菌的注射溶液和無菌的包裝粉劑。
對于口服給藥，所述活性成分可以與口服的、非毒性的藥學(xué)上可以接受的 載體組合，該載體例如但不限于乳糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、碳酸鈉、甘露 醇、山里糖醇、碳酸鈣、磷酸鈣、硫酸鈣、甲基纖維素等；任選地還可以與崩 解劑、結(jié)合劑、潤滑劑組合，該崩解劑例如但不限于玉米、淀粉、甲基纖維 素、瓊脂潤土、黃原膠、褐藻酸等；結(jié)合劑例如但不限于凝膠、天然食糖、卩-乳糖、玉米甜料、天然和合成橡膠、阿拉伯樹膠、羧甲基纖維素、聚乙二醇、 石蠟等；潤滑劑例如但不限于硬脂酸鎂、硬脂酸鈉、硬脂酸、油酸鈉、苯甲 酸鈉、乙酸鈉等。
在粉劑形式中，所述載體可以是與細(xì)碎的活性成分混合的細(xì)碎的固體。該 活性成分可以以合適的比例與具有結(jié)合屬性的載體混合，并壓成希望的形狀和 大小，從而形成片劑。所述粉劑和片劑優(yōu)選含有1%到99%重量的活性成分，該活性成分是本發(fā)明的新組合物。合適的固體載體是羧甲基纖維素鎂、低熔點(diǎn) 的蜂臘和可可油。
無菌的液體制劑包括懸浮液、乳狀液和糖漿。所述活性成分能夠溶解或懸 浮在藥學(xué)上可接受的載體中，例如無菌水、無菌有機(jī)溶劑、或無菌水和無菌有 機(jī)溶劑的混合物。
上述制劑可以以單位劑型存在，該單位劑型是含有單位劑量的物理分散單 元，適于向人體和其它哺乳動(dòng)物體給藥。單位劑型可以是膠囊或片劑，或是很 多膠囊或片劑。"單位劑量"是本發(fā)明的活性化合物的預(yù)定量，經(jīng)過計(jì)算使其與 一種或多種賦型劑組合能產(chǎn)生理想的治療效果。根據(jù)所涉及的具體治療，活性
成分的單位劑量的量可以在約0.1到約1000毫克或更多之間進(jìn)行變化或調(diào)整。
本發(fā)明所述的檸檬酸小檗胺鹽與目前常用的小檗胺和鹽酸小檗胺相比，具
有以下一些優(yōu)點(diǎn)和特性(1)具有更好的水溶性和接近人體血液生理狀態(tài)pH
值，有利于提高其生物利用度(實(shí)施例3-4); (2)制備工藝簡單易行，成本低， 適合大規(guī)模生產(chǎn)(實(shí)施例1-2); (3)因采用可食用的有機(jī)酸檸檬酸制備小檗胺 鹽，具有比無機(jī)酸鹽酸制備的鹽酸小檗胺鹽更高的安全性；(4)具有更廣和更 強(qiáng)的抗腫瘤活性，已證實(shí)敏感的血液腫瘤有白血病、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤、
等(見實(shí)施例5-ll); (5)毒付作用更低，體外細(xì)胞培養(yǎng)體系和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，
檸檬酸小檗胺在有效抗腫瘤劑量下對正常人細(xì)胞生長和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物沒有明顯毒 副作用(見實(shí)施例ll)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。應(yīng)理解，下列實(shí)施例旨在說明本發(fā)明 而不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制
實(shí)施例l: 一水檸檬酸小檗胺鹽制備
在室溫下，稱取20克小檗胺，放入玻璃燒杯中，然后加入200毫升2.5% 的一水檸檬酸(C6H507.H20)溶液，攪拌，待小檗胺完全溶解，溶液完全透明， 然后將檸檬酸小檗胺鹽溶液進(jìn)行干燥，得微黃色或白色檸檬酸小檗胺鹽結(jié)晶。
反應(yīng)式:<formula>formula see original document page 8</formula>一水檸檬酸小檗胺鹽實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示應(yīng)用這一方法制備的一水檸檬酸小檗胺鹽不僅成功率高 (100%);而且，所需試劑少，只需檸檬酸和水，操作步驟少而簡單，普通實(shí) 驗(yàn)室即可操作。
實(shí)施例2:無水檸檬酸小檗胺制備
在室溫下，稱取20克小檗胺，放入玻璃燒杯中，然后加入200毫升2.5% 的無水檸檬酸(C6H507)溶液，攪拌，待小檗胺完全溶解，溶液完全透明，然 后將小檗胺檸檬酸鹽溶液進(jìn)行干燥，得微黃色或白色小檗胺檸檬酸鹽結(jié)晶。
小檗胺 無水檸檬酸小檗胺鹽 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示應(yīng)用這一方法制備的無水檸檬酸小檗胺鹽不僅成功率高 (100%);而且，所需試劑少，只需檸檬酸和水，操作步驟少而簡單，普通實(shí)
驗(yàn)室即可操作。
實(shí)施例3:檸檬酸小檗胺鹽和鹽酸小檗胺鹽水溶性比較
在室溫下分別稱取0.1克檸檬酸小檗胺和鹽酸小檗胺，分別放入10ml試管 內(nèi)，然后慢慢加入去離子水，邊加邊搖勻，直至使加入的小檗胺鹽充分溶解， 溶液呈現(xiàn)完全透明為止。然后，測定完全溶解小檗胺鹽所需的水，計(jì)算小檗胺 鹽在水溶性中的溶解度。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示檸檬酸小檗胺鹽在水中的溶解度約為500mg/ml,而鹽酸小 檗胺在水中的溶解度約為30mg/ml。檸檬酸小檗胺鹽的水溶性是鹽酸小檗胺的 16.6倍。
實(shí)施例4:檸檬酸小檗胺鹽和鹽酸小檗胺鹽水溶性pH值比較
在室溫下分別稱取0.1克檸檬酸小檗胺和鹽酸小檗胺，分別放入10ml試管 內(nèi)，然后慢慢加入去離子水，邊加邊搖勻，直至使加入的小檗胺鹽充分溶解， 溶液呈現(xiàn)完全透明為止(2ml水)。然后，用精密pH試紙測定溶液pH值。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示檸檬酸小檗胺鹽水溶液的pH值約為4.5左右，而鹽酸小檗 胺鹽水溶液的pH值為2.0左右。與鹽酸小檗胺鹽水溶液pH值相比，檸檬酸小 檗胺鹽水溶液pH值更接近正常人血液生理pH值(7.3-7.4)。實(shí)施例5:檸檬酸小檗胺鹽抗人慢性髓系白血病細(xì)胞K562活性測定
(1) 實(shí)驗(yàn)材料
白血病細(xì)胞株人K562白血病細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。
主要試劑檸檬酸小檗胺為我們自己合成。 主要儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱，酶標(biāo)儀
(2) 實(shí)驗(yàn)方法
取生長良好的白血病細(xì)胞8000個(gè)，接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)。培養(yǎng)液 為含10%胎牛血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)液。加入不同濃度的藥物，混勻后，置二 氧化碳(5%C02)細(xì)胞培養(yǎng)箱37"C培養(yǎng)48小時(shí)。然后用MTT法測定活細(xì)胞 濃度。在本實(shí)驗(yàn)中對照組(不加藥物處理)細(xì)胞活力設(shè)為100%，并計(jì)算出藥 物作用后細(xì)胞活力(％ )和48小時(shí)白血病細(xì)胞半數(shù)生長抑制濃度(48小時(shí)IC50 值)。
(3) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明檸檬酸小檗胺能快速誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞死亡和 抑制白血病細(xì)胞生長，其48小時(shí)白血病細(xì)胞半數(shù)生長抑制濃度(48小時(shí)IC50) 約為4.0嗎/ml左右。
實(shí)施例6:檸檬酸小檗胺鹽抗人急性髓系白血病細(xì)胞NB4活性測定
(1) 實(shí)驗(yàn)材料
白血病細(xì)胞株人NB4白血病細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。
主要試劑檸檬酸小檗胺為我們自己合成。 主要儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱，酶標(biāo)儀
(2) 實(shí)驗(yàn)方法
取生長良好的白血病細(xì)胞8000個(gè)，接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)。培養(yǎng)液 為含10%胎牛血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)液。加入不同濃度的檸檬酸小檗胺，混勻 后，置二氧化碳(5%C02)細(xì)胞培養(yǎng)箱37"C培養(yǎng)48小時(shí)。然后用MTT法測 定活細(xì)胞濃度。在本實(shí)驗(yàn)中對照組(不加藥物處理)細(xì)胞活力設(shè)為100%，并 計(jì)算出藥物作用后細(xì)胞活力(％)和48小時(shí)白血病細(xì)胞半數(shù)生長抑制濃度(48 小時(shí)IC50值)。
(3) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明檸檬酸小檗胺能誘導(dǎo)人急性髓系白血病細(xì)胞系NB4細(xì)胞死 亡和抑制白血病細(xì)胞生長，其48小時(shí)白血病細(xì)胞半數(shù)生長抑制濃度(48小時(shí) IC50)分別約為4.5pg/ml。實(shí)施例7:檸檬酸小檗胺鹽抗耐藥人慢性髓系白血病細(xì)胞K562/ADR活性
測定
(1) 實(shí)驗(yàn)材料
白血病細(xì)胞株多藥耐藥人K562/ADR白血病細(xì)胞系由浙江大學(xué)腫瘤研究 所提供。
主要試劑檸檬酸小檗胺為我們自己合成。
主要儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱，酶標(biāo)儀
(2) 實(shí)驗(yàn)方法
取生長良好的白血病細(xì)胞8000個(gè)，接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)。培養(yǎng)液 為含10%胎牛血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)液。加入不同濃度的藥物，混勻后，置二 氧化碳(5%C02)細(xì)胞培養(yǎng)箱37。C培養(yǎng)48小時(shí)。然后用MTT法測定活細(xì)胞 濃度。在本實(shí)驗(yàn)中對照組(不加藥物處理)細(xì)胞活力設(shè)為100%，并計(jì)算出藥 物作用后細(xì)胞活力(％)和48小時(shí)白血病細(xì)胞半數(shù)生長抑制濃度(48小時(shí)IC50 值)。
(3) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明檸檬酸小檗胺能誘導(dǎo)耐藥人白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞死亡和 抑制白血病細(xì)胞生長，其48小時(shí)白血病細(xì)胞半數(shù)生長抑制濃度(48小時(shí)IC50) 約為8.0ixg/ml。
實(shí)施例8:檸檬酸小檗胺鹽抗人淋系白血病細(xì)胞Jurkat活性測定
(1) 實(shí)驗(yàn)材料
人白血病細(xì)胞株人淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系Jurkat購自中國科學(xué)院上海細(xì) 胞庫。
主要試劑檸檬酸小檗胺為我們自己合成。 主要儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱，酶標(biāo)儀
(2) 實(shí)驗(yàn)方法
取生長良好的白血病細(xì)胞8000個(gè)，接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)。培養(yǎng)液 為含10%胎牛血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)液。加入不同濃度的藥物，混勻后，置二 氧化碳(5%C02)細(xì)胞培養(yǎng)箱37i:培養(yǎng)48小時(shí)。然后用MTT法測定活細(xì)胞 濃度。在本實(shí)驗(yàn)中對照組(不加藥物處理)細(xì)胞活力設(shè)為100%,并計(jì)算出藥 物作用后細(xì)胞活力(％)和48小時(shí)白血病細(xì)胞半數(shù)生長抑制濃度(48小時(shí)IC50 值)。
(3) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明檸檬酸小檗胺能誘導(dǎo)人淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系Jurkat細(xì)胞死 亡和抑制白血病細(xì)胞生長，其48小時(shí)白血病細(xì)胞半數(shù)生長抑制濃度(48小時(shí) IC50)約為3.32jig/ml。
實(shí)施例9:檸檬酸小檗胺鹽抗人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞RPM18226活性測定
(1) 實(shí)驗(yàn)材料
人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株系RPM18226由浙江大學(xué) 血液病研究所提供。
主要試劑檸檬酸小檗胺為我們自己合成。
主要儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱，酶標(biāo)儀
(2) 實(shí)驗(yàn)方法
取生長良好的人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系RPM18226細(xì)胞8000個(gè)，接種到96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)。培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)液。加入不同 濃度的藥物，混勻后，置二氧化碳(5%C02)細(xì)胞培養(yǎng)箱37X:培養(yǎng)48小時(shí)。 然后用MTT法測定活細(xì)胞濃度。在本實(shí)驗(yàn)中對照組(不加藥物處理)細(xì)胞活 力設(shè)為100%，并計(jì)算出藥物作用后細(xì)胞活力(％)和48小時(shí)白血病細(xì)胞半數(shù) 生長抑制濃度(48小時(shí)IC50值)。
(3) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明檸檬酸小檗胺能誘導(dǎo)人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系RPM18226細(xì)胞 死亡，其48小時(shí)半數(shù)生長抑制濃度(48小時(shí)IC50)約為8.0|ig/ml，表明檸檬酸 小檗胺具有抗人多發(fā)性骨髓瘤活性。
實(shí)施例10檸檬酸小檗胺鹽抗人淋巴瘤瘤細(xì)胞DOHH2活性測定
(1) 實(shí)驗(yàn)材料
人淋巴瘤細(xì)胞株人淋巴瘤細(xì)胞株由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院血液科 吳東博士提供。
主要試劑檸檬酸小檗胺為我們自己合成。 主要儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱，酶標(biāo)儀
(2) 實(shí)驗(yàn)方法
取生長良好的白血病細(xì)胞8000個(gè)，接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)。培養(yǎng)液 為含10%胎牛血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)液。加入不同濃度的藥物，混勻后，置二 氧化碳(5%C02)細(xì)胞培養(yǎng)箱37。C培養(yǎng)48小時(shí)。然后用MTT法測定活細(xì)胞 濃度。在本實(shí)驗(yàn)中對照組(不加藥物處理)細(xì)胞活力設(shè)為100%，并計(jì)算出藥 物作用后細(xì)胞活力(％ )和48小時(shí)白血病細(xì)胞半數(shù)生長抑制濃度(48小時(shí)IC50值)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明檸檬酸小檗胺能誘導(dǎo)人淋巴瘤細(xì)胞死亡，其48小時(shí)半數(shù)生 長抑制濃度(48小時(shí)IC50)約為2.0pg/ml，表明檸檬酸小檗胺具有抗人淋巴瘤細(xì) 胞活性。
實(shí)施例11:檸檬酸小檗胺和鹽酸小檗胺對人白血病K562/ADR裸鼠體內(nèi) 異種移植瘤生長和動(dòng)物毒性影響比較
(1) 實(shí)驗(yàn)材料
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物裸鼠購于中國科學(xué)院上海動(dòng)物中心
試劑檸檬酸小檗胺為自己合成，鹽酸小檗胺購自成都鉅龍?zhí)烊凰帢I(yè)生命 科技有限公司。
儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱
(2) 實(shí)驗(yàn)方法
取7周齡裸鼠，在其背部皮下接種人白血病細(xì)胞K562 5xl0V每只鼠。24 小時(shí)后，隨機(jī)分3組。用藥組檸檬酸小檗胺和鹽酸小檗胺組采用口服給藥途 徑，按每公斤體重100mg劑量進(jìn)行，每天3次(灌渭)。對照組用生理鹽水 代替，連用10天。共觀察30天，期間測量裸鼠瘤重、體重以及活動(dòng)與飲食等 情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死小鼠，取腫瘤組織，測實(shí)際重量。
(3) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明檸檬酸小檗胺對人白血病裸鼠體內(nèi)異種移植瘤生長具有明 顯抑制作用，在45天實(shí)驗(yàn)周期中，6只接種腫瘤細(xì)胞裸鼠經(jīng)檸檬酸小檗胺治療， 無1只長瘤，無瘤率達(dá)100% (6/6)，而鹽酸小檗胺組，6只裸鼠中有3只出現(xiàn) 腫瘤生長，瘤體平均重量達(dá)4.67克，無瘤率50% (3/6)。對照組7只裸鼠均出 現(xiàn)明顯腫瘤生長，成瘤率100% (7/7)，瘤體平均重量達(dá)7.22克。檸檬酸小檗 胺組裸鼠平均體重為19.81克，鹽酸小檗胺組裸鼠平均體重為16.87克。這些 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，檸檬酸小檗胺在動(dòng)物體內(nèi)抗腫瘤活性明顯好于鹽酸小檗胺，而 且毒性也明顯低于鹽酸小檗胺。
權(quán)利要求
1. 一種檸檬酸小檗胺鹽，所述的檸檬酸小檗胺鹽的通式為(I)其中R為水檸檬酸或無水檸檬酸。
2. —種制備權(quán)利要求1所述的檸檬酸小檗胺鹽的制備方法，其特征在于通 過以下步驟實(shí)現(xiàn)(1) 室溫下，將小檗胺加入水檸檬酸或無水檸檬酸溶液進(jìn)行成鹽反應(yīng)， 小檗胺和檸檬酸的重量比為4 20: 1;(2) 將上述檸檬酸小檗胺鹽溶液干燥，得微黃色或白色檸檬酸小檗胺鹽粉末；反應(yīng)式<formula>formula see original document page 2</formula>
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的式(I)檸檬酸小檗胺鹽在制備治療血液腫瘤性 疾病藥物中的應(yīng)用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于在制備治療白血病的藥物中 的應(yīng)用。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于在制備治療多發(fā)性骨髓瘤的 藥物中的應(yīng)用。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于在制備治療淋巴瘤的藥物中 的應(yīng)用。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物由含治療有效量的 檸檬酸小檗胺鹽和制劑允許的藥物賦形劑或載體組成。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所制備的藥物還含有其他 抗腫瘤藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種檸檬酸小檗胺鹽，將小檗胺游離堿作為原料，在室溫條件下，應(yīng)用可食用的強(qiáng)有機(jī)酸取代目前常用的無機(jī)酸按一定比例進(jìn)行成鹽反應(yīng)，獲得檸檬酸小檗胺鹽(Berbamine citrate)。本發(fā)明提供的檸檬酸小檗胺，不僅對體外培養(yǎng)的人白血病、多發(fā)性骨髓瘤和淋巴瘤等多種血液腫瘤細(xì)胞具有明顯殺傷作用，而且對裸鼠體內(nèi)人血液腫瘤細(xì)胞生長也具有顯著的抑制作用，而相同濃度檸檬酸小檗胺對正常人細(xì)胞生長沒有明顯影響，對裸鼠沒有明顯毒副作用；并可與任選的一種或多種治療有效量的其他已知抗腫瘤藥物組成藥物組合物，達(dá)到協(xié)同增效作用。因此，本發(fā)明提供的檸檬酸小檗胺鹽可在制備治療血液腫瘤性疾病藥物中應(yīng)用。
文檔編號A61P35/00GK101429201SQ200810163438
公開日2009年5月13日 申請日期2008年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月22日
發(fā)明者瑩 古, 干小仙, 張旭照, 徐榮臻, 黃文棟 申請人:浙江大學(xué)