專利名稱：：小反芻獸疫重組山羊痘病毒活載體疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及重組病毒疫苗領(lǐng)域，更具體地涉及小反芻獸疫重組山羊痘病毒活載體疫苗。本發(fā)明還涉及所述疫苗的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明利用我國(guó)自行培育并得到廣泛應(yīng)用的GPV弱毒株，分別構(gòu)建了表達(dá)PPRV囊膜蛋白F和H的重組山羊痘病毒，分別命名為GPV-PPRV-F(CGMCCNo.2621)和GPV-PPRV-H(CGMCCNo.2619)，并對(duì)其免疫效力進(jìn)行了初步評(píng)估。
背景技術(shù)：
：小反芻獸疫(Pestedespetitsofruminants,PPR)禾口山羊痘(Goatpox，GP)為分別由小反芻獸疫病毒(pestedespetitsofruminantsvirus,PPRV)和山羊痘病毒(Goatpoxvirus,GPV)引起的危害山羊、綿羊等小反芻動(dòng)物的兩種重大疫病，均為OIE發(fā)布A類烈性傳染病。PPR長(zhǎng)期以來一直在非洲、中東、中亞、南亞及東南亞地區(qū)危害流行，2007年傳入我國(guó)西部邊境地區(qū)，導(dǎo)致局部疫情，對(duì)我國(guó)的畜牧養(yǎng)殖業(yè)形成嚴(yán)重威脅。GP多年來在我國(guó)局部地區(qū)表現(xiàn)為地方流行性，給我國(guó)養(yǎng)羊業(yè)造成一定危害。我國(guó)山羊和綿羊的飼養(yǎng)量數(shù)以億計(jì)，PPR和GP這兩種烈性傳染病的防控意義重大。PPRV屬副粘病毒科麻疹病毒屬成員，與牛瘟病毒(Rinderpestvirus,RPV)同屬，基因組進(jìn)化與抗原性關(guān)系密切，具有共同的中和抗體表位。病毒囊膜表面的融合蛋白(F)和血凝素蛋白(H)為PPRV誘導(dǎo)中和抗體形成的主要免疫原。GPV為正痘病毒科GPTV屬成員。GPV弱毒疫苗預(yù)防GP安全有效。采用GP弱毒疫苗為載體構(gòu)建PPR—GP重組二聯(lián)活疫苗，可同時(shí)預(yù)防GP、綿羊痘和PPR，實(shí)現(xiàn)一種活毒疫苗預(yù)防多種烈性傳染病，具有極為突出的優(yōu)點(diǎn)。4山羊痘病毒基因組龐大，遺傳穩(wěn)定，其胸苷激酶(TK)基因編碼區(qū)為復(fù)制非必需區(qū)，可允許大容量的外源基因插入和表達(dá)；GPV感染宿主譜狹窄，僅局限于牛羊等反芻獸；GP弱毒疫苗生產(chǎn)成本低廉，儲(chǔ)運(yùn)無需冷凍、使用方便；尤其重要的，利用重組表達(dá)除血凝素蛋白和融合蛋白以外的蛋白為抗原，小反芻獸疫重組山羊痘病毒活載體疫苗免疫反應(yīng)可以很方便地與PPRV野毒感染相區(qū)別，不干擾血清學(xué)監(jiān)測(cè)，克服了現(xiàn)有PPR弱毒疫苗的重大缺陷，對(duì)我國(guó)廣大內(nèi)地非疫區(qū)極為重要。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供小反芻獸疫重組山羊痘病毒活載體疫苗。本發(fā)明利用我國(guó)自行培育并得到廣泛應(yīng)用的GPV弱毒株，分別構(gòu)建了表達(dá)PPRV囊膜蛋白F和H的重組山羊痘病毒，分別命名為GPV-PPRV-F和GPV-PPRV-H，分別于2008年7月31日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC，中國(guó)北京朝陽區(qū)大屯路中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，100101)，保藏登記號(hào)分別為CGMCCNo.2621和2619，并對(duì)其免疫效力進(jìn)行了初步評(píng)估。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述疫苗的制備方法。,按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，提供了本發(fā)明的小反芻獸疫重組山羊痘病毒活載體疫苗的制備方法，其包括下述步驟(1)采用適當(dāng)?shù)囊?，通過常規(guī)RT-PCR從PPRV弱毒疫苗75/1株(Nigeria/75/1)的基因組RNA分別擴(kuò)增基因PPRV血凝素蛋白H基因和PPRV融合蛋白F基因；(2)通過基因重組技術(shù)，分別構(gòu)建表達(dá)PPRV融合蛋白F的pTK-gig-PPRV-F重組載體和表達(dá)PPRV血凝素蛋白H的pTK-gig-PPRV-H重組載體；(3)將步驟(2)中的重組載體分別轉(zhuǎn)染感染了GPV病毒液的細(xì)胞，通過在熒光倒置顯微鏡下監(jiān)測(cè)綠色熒光而判斷轉(zhuǎn)染是否成功，轉(zhuǎn)染成功后，表達(dá)PPRV-F和H蛋白的重組病毒載體與GPV病毒基因組的同源基因發(fā)生了同源重組，然后利用gpt和eGFP純化篩選重組病毒克隆；和(4)鑒定已經(jīng)純化的重組山羊痘病毒DNA，分別命名為GPV-PPRV-F5禾口GPV-PPRV-H;其中步驟(3)中所用的細(xì)胞是原代山羊睪丸細(xì)胞，即LT細(xì)胞。按照本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，利用本發(fā)明獲得的重組病毒GPV-PPRV-H和GPV-PPRV-F，以及陰性對(duì)照GPV感染初代LT細(xì)胞，在熒光倒置顯微鏡下觀察到感染本發(fā)明的重組病毒的LT細(xì)胞自發(fā)產(chǎn)生綠色熒光(圖5)。進(jìn)一步以鼠抗PPRV的H蛋白和F蛋白高免血清為一抗，以紅色熒光素(TRITC)標(biāo)記的羊抗鼠IgG(Sigma)為二抗進(jìn)行免疫熒光檢領(lǐng)U，結(jié)果重組病毒GPV-PPRV-H和GPV-PPRV-F分別顯示特異的紅色免疫熒光(圖6B和6C)，而野生型GPV則表現(xiàn)為紅色熒光陰性反應(yīng)(圖6A)。本發(fā)明的重組病毒的這種特異性免疫熒光反應(yīng)為重組病毒的克隆純化、傳代生產(chǎn)過程中遺傳穩(wěn)定性觀察等提供了極大的便利。按照本發(fā)明的其它實(shí)施方案，用本發(fā)明的重組病毒免疫山羊，免疫后每天觀察注射部位的反應(yīng)和精神狀態(tài)并測(cè)量體溫。首次免疫后28天用相同劑量途徑進(jìn)行二次免疫。分別于首次免疫前及免疫后第21天和第28天，二次免疫后第7天、14天及28天采集靜脈血，分離血清，56。C30分鐘滅活，一2(TC凍存，用于血清GPV及PPRV特異中和抗體滴度的檢測(cè)。由于中和抗體反應(yīng)能夠較為客觀地反映弱毒疫苗的免疫保護(hù)效果，我們研制的重組山羊痘病毒候選疫苗株能夠誘導(dǎo)顯著的中和抗體反應(yīng)，從而能夠參照PPRV弱毒疫苗的辦法，直接采用中和抗體檢測(cè)進(jìn)行重組痘病毒免疫效力評(píng)估，確保該重組疫苗在未來疫苗生產(chǎn)質(zhì)量控制及現(xiàn)地生產(chǎn)應(yīng)用評(píng)估中具有充分的技術(shù)可行性。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供本發(fā)明的重組山羊痘病毒活載體疫苗的應(yīng)用。本發(fā)明的重組山羊痘病毒活載體疫苗可以用于同時(shí)預(yù)防或治療GP、綿羊痘和PPR，可以同時(shí)使用表達(dá)H和F蛋白的重組痘病毒進(jìn)行聯(lián)合免疫。本發(fā)明的重組山羊痘病毒活載體疫苗主要用于小反芻獸類動(dòng)物，包括牛、羊等。此外，本發(fā)明的重組山羊痘病毒活載體疫苗還可以用于制備用于預(yù)防或治療GP、綿羊痘和PPR的試劑盒。因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于預(yù)防或治療GP、綿羊痘和PPR的試劑盒，其包括本發(fā)明所述的重組山羊痘病毒活載體疫苗。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，山羊痘病毒疫苗株(CVCCAV41)是由我國(guó)分離馴化的，符合中國(guó)的痘病毒流行情況，能夠提供針對(duì)國(guó)內(nèi)流行的痘病毒更有效的免疫保護(hù)。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，本發(fā)明構(gòu)建的表達(dá)F蛋白的重組GPV和表達(dá)H蛋白的重組GPV均誘導(dǎo)顯著的中和抗體反應(yīng)，特別地，單次免疫后2周均能誘導(dǎo)顯著的中和抗體反應(yīng)；并且，表達(dá)H和F蛋白的重組痘病毒聯(lián)合免疫，能誘導(dǎo)更加顯著的、同時(shí)針對(duì)H和F抗原表面多種中和表位的中和抗體，因而提高更加全面、持續(xù)的免疫保護(hù)，這一點(diǎn)在針對(duì)存在一定程度基因變異的流行野毒株時(shí)，更有意義。本發(fā)明還有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明的免疫原基因H或F仍采用P7.5強(qiáng)啟動(dòng)子，但gpt則采用相對(duì)較弱的痘病毒晚期啟動(dòng)子pll，這樣雖然有可能增加重組病毒篩選的難度，但更加有利于目的抗原基因的表達(dá)，因而誘導(dǎo)更加顯著的中和抗體反應(yīng)，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了我們這種構(gòu)建策略在免疫效果上的優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，通過IRES序列串聯(lián)作用，pll啟動(dòng)子同時(shí)轉(zhuǎn)錄表達(dá)gpt和綠色熒光報(bào)告基因eGFP(二者都是篩選基因)，重組病毒帶有綠色熒光標(biāo)簽，使得重組病毒的克隆純化、傳代生產(chǎn)過程中遺傳穩(wěn)定性觀察、毒價(jià)滴定等變得極為方便、快捷，從而克服了GPV弱毒免疫株在LT細(xì)胞上本身病變出現(xiàn)較慢，重組病毒在TK缺失后細(xì)胞病變效應(yīng)進(jìn)一步較削弱，以及野生型病毒與重組型病毒難以分離純化的缺點(diǎn)。尤其重要的，利用重組表達(dá)除血凝素蛋白和融合蛋白以外的蛋白為抗原來檢測(cè)PPRV野毒感染動(dòng)物后產(chǎn)生的抗體，小反芻獸疫重組山羊痘病毒活載體疫苗免疫反應(yīng)可以很方便地與PPRV野毒感染相區(qū)別，不干擾血清學(xué)監(jiān)測(cè)，克服了現(xiàn)有PPR弱毒疫苗的重大缺陷，對(duì)我國(guó)廣大內(nèi)地非疫區(qū)極為重要。從下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點(diǎn)將更明顯，其中圖1.重組GPV的純化鑒定和重組GPV-PPRV-H和GPV-PPRV-F的H和F基因整合鑒定，其中，圖1A:重組GPV的純化鑒定，M.DL2000標(biāo)記；P.GPV;F.GPV-F;H.GPV-H;圖1B:重組GPV-PPRV-H和GPV-PPRV-F的H和F基因整合鑒定，M.DL2000標(biāo)記；1.GPV+F基因的鑒定引物；2.GPV-PPRV-F+F基因的鑒定引物；3.GPV+H基因的鑒定引物；4.GPV-PPRV-H+H基因的鑒定引物。圖2.表達(dá)綠色熒光蛋白重組GPV構(gòu)建的同源重組質(zhì)粒pTK-gpt-ires-egfp。2A，質(zhì)粒圖譜；2B，質(zhì)粒序列(SEQIDNo.1)，其中正常印刷體psp72骨架；單直線下劃線tk-Ltk左同源壁；波浪下劃線tk-Rtk右同源壁；陰影ires-egfp基因；方框gpt基因；陰影加虛線下劃線p7.5啟動(dòng)子；陰影加單直線下劃線pll啟動(dòng)子；雙下劃線Pstl;斜體加雙下劃線Sail;斜體加方框Xbal;斜體加單直線下劃線EcoRI。圖3.用于表達(dá)PPRVH基因重組GPV構(gòu)建的同源重組質(zhì)粒pTk-gig-PPRV-H。3A，質(zhì)粒圖譜；3B，質(zhì)粒序列(SEQIDNo.2)，其中正常印刷體psp72骨架；單直線下劃線tk-Ltk左同源壁；波浪下劃線tk-Rtk右同源壁；陰影ires-egfp基因；方框gpt基因；陰影加虛線下劃線p7.5啟動(dòng)子；陰影加單直線下劃線pll啟動(dòng)子；雙下劃線Pstl;斜體加雙下劃線Sail;斜體加方框Xbal;斜體加單直線下劃線EcoRI;黑色粗體加下劃線PPRV囊膜蛋白H基因ORF(SEQIDNo.4)。圖4.用于表達(dá)PPRVF基因重組GPV構(gòu)建的同源重組質(zhì)粒pTk-gig-PPRV-F。4A，質(zhì)粒圖譜；4B，質(zhì)粒序列(SEQIDNo.3)，其中正常印刷體psp72骨架；單直線下劃線tk-Ltk左同源壁；波浪下劃線tk-Rtk右同源壁；陰影ires-egfp基因；方框gpt基因；陰影加虛線下劃線p7.5啟動(dòng)子；陰影加單直線下劃線pll啟動(dòng)子；雙下劃線Pstl;斜體加雙下劃線Sail;斜體加方框Xbal;斜體加單直線下劃線EcoRI;黑色粗體加下劃線PPRV囊膜蛋白F基因ORF(SEQIDNo.5)。圖5.表達(dá)增強(qiáng)綠色熒光蛋白(eGFP)的重組病毒感染LT細(xì)胞在熒光倒置顯微鏡下顯示自發(fā)綠色熒光。從左至右A.感染GPV的LT細(xì)胞(陰性對(duì)照)，B.感染表達(dá)PPRVH基因及eGFP的重組GPV(GPV-PPRV-H)的LT細(xì)胞，C.感染表達(dá)PPRVF基因及eGFP的重組GPV(GPV-PPRV-F)的LT細(xì)胞。圖6.重組病毒感染LT細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)。從左至右A.感染GPV的LT細(xì)胞(陰性對(duì)照)，B.表達(dá)PPRVH基因重組GPV(GPV-PPRV-H)的LT細(xì)胞，C.表達(dá)PPRVF基因重組GPV(GPV-PPRV-F)的LT細(xì)胞。具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例來進(jìn)一步闡明本發(fā)明的小反芻獸疫重組山羊痘病毒活載體疫苗GPV-PPRV-F和GPV-PPRV-H。但是應(yīng)該理解，所述實(shí)施例只是舉例說明的目的，并不意欲限制本發(fā)明的范圍和精神。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，在不背離由后附的權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的范圍和精神的前體下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行修改和改進(jìn)。1.材料與方法病毒與細(xì)胞GPV溫度敏感弱毒疫苗株(CVCCAV41)及PPRV弱毒疫苗75/1株(Nigeria/75/1)均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)獸藥監(jiān)察所。原代山羊睪丸細(xì)胞(LT)采用1月齡公綿羊睪丸經(jīng)常規(guī)方法制備，與Vero細(xì)胞一樣均采用含5X胎牛血清(Hyclone)MEM(Invitrogen)培養(yǎng)或繼代；野生型或重組GPV及PPRV弱毒株的擴(kuò)增與滴定均采用含2%胎牛血清(Hyclone)MEM(Invitrogen)，分別在LT細(xì)胞和Vero細(xì)胞進(jìn)行?；驍U(kuò)增與質(zhì)粒構(gòu)建高保真pfb(Takara公司)擴(kuò)增質(zhì)粒pIRES2-egfp(質(zhì)粒來源Clontech)上666bp1973bp的ires-egfp序歹U。上游引物ir-f:5'-aaactg:caggcccctctccctcccccc-3'，下游引物ir-r:5'-aaactgcagttacttgtacagctcgtc-3'，均引入PstI位點(diǎn)。將PCR產(chǎn)物克隆至pBluescript-II(質(zhì)粒來源Stratagene)的EcoRV位點(diǎn)，經(jīng)序列測(cè)定準(zhǔn)確無誤后命名為pBlue-ires-egfJ3。用PstI從pBlue-ires-egfp上切下ires-egfJ3基因，插入pTK-gpt-gfp"]上的PstI位點(diǎn)，鑒定插入方向正確，命名為pTK-gpt-ires-egfp-gfy。再用SalI切下pTK-gpt-ires-egfp-gfp上的一個(gè)GFP后使其自連，構(gòu)建成pTK-gpt-ires-egfp(圖2)。用PPRV弱毒疫苗75/1株(Nigeria/75/1)接種Vero細(xì)胞上清，經(jīng)Trizol(Invitrogen)處理提取PPRV基因組RNA，采用上、下游引物PPRV-Hf:5'-GGTTTAAACGCCGCCACCATGTCCGCACAAAG-3'禾卩PPRV-Hr:5'-TGCGTTTAAACTCAGACTGGATTACATG-3'(上下游分別引入Pme頂每切位點(diǎn))，經(jīng)過常規(guī)RT—PCR擴(kuò)增約1.85kb的PPRV血凝素蛋白(H)基因(SEQIDNo.4);采用上、下游引物PPRV-Ff:5'-ATdCfiAfiGCCGCCACCATGACACGGGTCGCA-3'禾口PPRV-Fr:5'-TACTCGAGCTACAGTGATCTCACGT-3'(上、下游引物分別引入XhoI酶切位點(diǎn))，經(jīng)過常規(guī)RT—PCR擴(kuò)增約1.65kb的PPRV融合蛋白(F)基因(SEQIDNo.5)。同時(shí)，擴(kuò)增的H和F基因閱讀框架(ORP)(即分別為SEQIDNo,4禾BSEQIDNo.5)均在起始密碼ATG前引入kozak序列(GCCGCCACC)。將擴(kuò)增的F和H基因PCR產(chǎn)物分別克隆至lJpBluescript-II(Strategene)的EcoRV位點(diǎn)，分別為pB-PPRV-F禾口pB-PPRV-H，序列測(cè)定無誤后，用XhoI切下pB-PPRV-F上F基因ORF，插入到上述的pTK-gpt-ires-eg^)的SalI位點(diǎn)，鑒定正反向，命名為pTK-gig-PPRV-F(圖4);用PmeI切下pB-PPRV-H上H基因ORF，插入到SalI酶切并末端補(bǔ)平的pTK-gpt-ires-eGFP中，鑒定正反向，命名為pTK-gig-PPRV-H(圖3)。構(gòu)建重組病毒質(zhì)粒所用引物的序列總結(jié)在表l中。表l.構(gòu)建重組病毒質(zhì)粒所用的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>(F)基因病毒重組及重組病毒純化、鑒定將初代次LT細(xì)胞生長(zhǎng)于在35mm孔培養(yǎng)板板(Nunc)中，至密度約80%時(shí)，按0.05的感染復(fù)數(shù)(M.O.I.)值接種GPV病毒液100^1，感作1小時(shí)后，再采用鈣轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen)按操作說明書轉(zhuǎn)染pTK-gig-PPR-H和pTK-gig-PPR-F，12小時(shí)后用10%DMSO(PBS溶解，pH7.2)休克2.5分鐘，24小時(shí)后，在倒置熒光顯微鏡(ZEISS,型號(hào)AxioObserverDl;德國(guó))下觀察是否有綠色熒光出現(xiàn)。待90%的細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變(cytopathiceffect,CPE)并出現(xiàn)綠色熒光時(shí)，收取LT細(xì)胞及培養(yǎng)上清，反復(fù)凍融三次，超聲裂解3次，每次30秒，低速離心棄去細(xì)胞碎片，上清作IO倍連續(xù)梯度稀釋，接種初代次培養(yǎng)與35mm孔培養(yǎng)板的LT細(xì)胞，培養(yǎng)液添加霉酚酸(MPA，購(gòu)自sigma)25昭/ml，，黃嘌呤(Xanthine，購(gòu)自sigma)250|ig/ml，，次黃嘌呤(Hypoxanthine，購(gòu)自sigma)15jig/ml，，37t:培養(yǎng)10天后，收獲出現(xiàn)細(xì)胞病變高稀釋倍數(shù)細(xì)胞及上清，反復(fù)凍融三次，超聲裂解3次，每次30秒。離心棄去細(xì)胞碎片，上清作10倍連續(xù)梯度稀釋，繼續(xù)接種35mm培養(yǎng)孔內(nèi)LT細(xì)胞，每孔10(^1，感作1小時(shí)后覆蓋含1%低熔點(diǎn)瓊脂糖培養(yǎng)液，進(jìn)行常規(guī)病毒蝕斑純化克隆。通過連續(xù)多代次克隆純化，挑取表達(dá)綠色熒光并形成面積較大蝕斑的重組病毒克隆，接種LT細(xì)胞上擴(kuò)增，待細(xì)胞病變或綠色熒光陽性細(xì)胞達(dá)90%以上時(shí)，收獲接種培養(yǎng)上清液，采用SDS—蛋白酶K消化方法提取重組病毒DNA，利用分別位于TK基因同源臂兩側(cè)的特異引物，通過PCR鑒定確認(rèn)克隆病毒不含野生型GPV，已經(jīng)為純化的重組病毒。PPRV的H基因重組病毒命名為GPV-PPRV-H，F(xiàn)基因重組病毒命名為GPV-PPRV-F。免疫熒光以最后克隆獲得重組病毒按MOI0.05感染培養(yǎng)于24孔板的初代LT細(xì)胞，待細(xì)胞病變陽性或綠色免疫熒光陽性LT細(xì)胞接近50X時(shí)，棄去上清，PBST洗滌3遍。3。X多聚甲醛(購(gòu)自天津科密歐)室溫下固定20分鐘，吸去固定液，PBST洗滌3遍。選取1個(gè)野生型GPV感染細(xì)胞孔和1個(gè)未感染細(xì)胞孔為對(duì)照。分別加入用PBST(含0.1X胎牛血清白蛋白(購(gòu)自sigma))稀釋50倍的鼠抗PPRV的H蛋白和F蛋白特異單因子高免血清(本實(shí)驗(yàn)室按本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法制備)100M1，室溫下作用30分鐘后，PBST洗滌3遍。加入以PBST按200倍稀釋紅色熒光素(TRITC)標(biāo)記的羊抗鼠IgG(Sigma)100pl，室溫作用30分鐘，PBST洗滌3遍，熒光倒置顯微鏡((ZEISS，型號(hào)AxioObserverDl，德國(guó))下觀察結(jié)果。免疫試驗(yàn)免疫試驗(yàn)動(dòng)物選用12只0.52歲的山羊，隨機(jī)分為3組并編號(hào)。其中，第一組(16號(hào))接種表達(dá)H蛋白免疫原的重組山羊痘病毒，第二組(79號(hào))接種表達(dá)F蛋白免疫原的重組山羊痘病毒，第三組(10—12號(hào))為接種親本野生型GPV疫苗株。免疫接種方法如下，每只羊接種劑量為無血清MEM稀釋病毒液0.5ml，含2xl06PFU病毒量，左右腹股溝內(nèi)側(cè)皮內(nèi)途徑各一注射點(diǎn)，每點(diǎn)注射250pil。免疫后每天觀察注射部位的反應(yīng)和精神狀態(tài)并測(cè)量體溫。首次免疫后28天用相同劑量途徑進(jìn)行二次免疫。分別于首次免疫前及免疫后第21天和28天，二次免疫后7天、14天及28天采集靜脈血，分離血清，56。C30分鐘滅活，一2(TC凍存，用于血清GPV及PPRV特異中和抗體滴度的檢測(cè)。中和抗體檢測(cè)血清GPV及PPRV特異中和抗體滴度的檢測(cè)分別采用GPV疫苗株和PPRV疫苗株，按固定病毒量，血清連續(xù)梯度稀釋方法在96孔微量培養(yǎng)板(購(gòu)自Corning)進(jìn)行，具體操作術(shù)式及結(jié)果判斷，按O丄E.推薦方法進(jìn)行(WorldOrganisationforAnimalHealth.ManualofDiagnosticTestsandVaccinesforTerrestrialAnimals，2004)。2.結(jié)果利用gpt和eGFP作為篩選基因，通過連續(xù)多代次蝕斑克隆，選取表達(dá)eGFP陽性噬斑克隆病毒在LT細(xì)胞上擴(kuò)增，提取重組GPV核酸DNA，利用分別位于TK基因同源臂兩側(cè)的特異引物[1]進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定TK基<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>因，用特異擴(kuò)增pprv-H(上游引物pprv-Hf:5'-aatggcacaggaataGGC-3'，下游引物PPRV-Hr':5'-GAGCGACCCGTGTCATAG-3')和PPRV-F(上游弓l物PPRV-Ff:5'-AGCCAGAATGCGTTGTAT-3'，下游引物PPRV-Fr':5'-AAGCTGCCAGTGCTATGT-3')基因的引物鑒定目的基因的插入，用野生型GPV作為對(duì)照。結(jié)果，用TK基因特異引物鑒定，野生型GPV擴(kuò)增出740bp條帶，而重組毒未擴(kuò)增出相同條帶(圖1A),而以PPRV-H和PPRV-F特異鑒定引物分別擴(kuò)增出461bp和468bp條帶(圖1B)。結(jié)果表明分別構(gòu)建并獲得了純化的H基因和F基因重組GPV，克隆病毒中不含野生型GPV，已經(jīng)為純化的重組病毒。PPRV的H基因重組病毒命名為GPV-PPRV-H，F(xiàn)基因重組病毒命名為GPV-PPRV-F。其中鑒定目的基因插入所用的引物總結(jié)在表2中。表2.鑒定目的基因插入所用的引物引分別以GPV、GPV-PPRV-H和GPV-PPRV-F感染初代LT細(xì)胞，結(jié)果，GPV-PPRV-H和GPV-PPRV-F兩種重組病毒分別在熒光倒置顯微鏡下觀察到自發(fā)綠色熒光反應(yīng)(圖5B和5C)，而野生型GPV則為陰性(圖5A);進(jìn)一步以鼠抗PPRV的H蛋白和F蛋白高免血清為一抗，以紅色熒光素(TRITC)標(biāo)記的羊抗鼠IgG(Sigma)為二抗進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，結(jié)果重組病毒GPV-PPRV-H和GPV-PPRV-F分別顯示特異的紅色免疫熒光陽性反應(yīng)(圖6B和6C)，而野生型GPV則表現(xiàn)為紅色熒光陰性反應(yīng)(圖6A)。野生型GPV和重組病毒GPV-PPRV-H和GPV-PPRV-F分別以2xl06TCID50劑量，間隔4周兩次接種GPV中和抗體陰性山羊。結(jié)果，兩次免疫后羊均未見明顯異常臨床表現(xiàn)及體溫升高；接種部位發(fā)痘情況程度符合山羊痘弱毒疫苗安全性評(píng)估要求。免疫前后GPV及PPRV特異中和抗體均為陰性($1:10)。第一次免疫后2周，所有免疫羊GPV中和抗體全部轉(zhuǎn)陽(32128)。接種表達(dá)H蛋白重組病毒GPV-PPRV-H山羊一次免疫第2周，PPRV中和抗體滴度分別為80，80，80，40，40，10;—次免疫后第4周PPRV中和抗體轉(zhuǎn)陽率為6/6,滴度分別為80，80，80，80，40，20，20;二次免疫后第1周，PPRV中和抗體轉(zhuǎn)陽率為6/6，滴度分別為80，80，80，80，80，80，80;二次免疫后第4周PPRV中和抗體轉(zhuǎn)陽率為6/6,滴度分別為40，80，40，40，40，40，40(表l)。接種表達(dá)F蛋白重組病毒GPV-PPRV-F山羊一次免疫第2周，PPRV中和抗體轉(zhuǎn)陽率為3/3，滴度分別為40，40，40;二次免疫后第l周，滴度分別為20，80，20(表l)。野生型GPV免疫山羊所有時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)PPRV特異中和抗體均為陰性(Sl:10)(表3)。表3.重組病毒免疫后PPRV特異中和抗體檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>NT:未檢測(cè)。3.討論按OIE標(biāo)準(zhǔn)，PPRV弱毒疫苗效力檢驗(yàn)合格要求為免疫后34周中和抗體100%轉(zhuǎn)陽(>1:10)。我們構(gòu)建的表達(dá)H和F抗原蛋白重組山羊痘病毒一次免疫山羊，4周PPRV中和抗體轉(zhuǎn)陽率即可達(dá)100X(分別為6/6和3/3)。相比法國(guó)、英國(guó)兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合發(fā)表的一份研究報(bào)告[2'3]，該研究構(gòu)建的表達(dá)PPRV的F抗原重組山羊痘病毒分別以1個(gè)10000個(gè)PFU劑量免疫羊，免疫后均未檢測(cè)到明顯的PPRV抗體反應(yīng)，但對(duì)PPRV強(qiáng)毒攻擊均具有免疫保護(hù)作用，即使O.l個(gè)PFU劑量也可形成完全的免疫保護(hù)，這種保護(hù)機(jī)制可能與重組山羊痘病毒疫苗在接種后可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)有關(guān)；另外，該研究構(gòu)建的表達(dá)PPRV的H抗原重組山羊痘病毒分別以IO個(gè)PFU或更多病毒量免疫山羊，免疫后能夠檢測(cè)到PPRV抗體反應(yīng)。然而，我們研制的重組山羊痘病毒候選疫苗株在誘導(dǎo)中和抗體反應(yīng)較國(guó)外報(bào)道取得顯著改進(jìn)，即使是表達(dá)PPRV的F抗原重組山羊痘病毒一次免疫即可誘導(dǎo)顯著的中和抗體反應(yīng)，預(yù)計(jì)其具有對(duì)PPRV強(qiáng)毒攻擊的完全免疫保護(hù)作用。由于PPRV為O正規(guī)定A類烈性傳染病，強(qiáng)毒病原操作需要嚴(yán)格的生物安全實(shí)施。由于中和抗體反應(yīng)能夠較為客觀地反映弱毒疫苗的免疫保護(hù)效果，因此OIE推薦采用中和抗體檢測(cè)為PPRV弱毒疫苗保護(hù)效力評(píng)估指標(biāo)。目前我國(guó)同樣無法采用攻毒試驗(yàn)對(duì)PPRV疫苗效力進(jìn)行評(píng)估，我們研制的重組山羊痘病毒候選疫苗株能夠誘導(dǎo)顯著的中和抗體反應(yīng)，從而能夠參照PPRV弱毒疫苗的辦法，直接采用中和抗體檢測(cè)進(jìn)行重組痘病毒免疫效力評(píng)估，確保該重組疫苗在未來疫苗生產(chǎn)質(zhì)量控制及現(xiàn)地生產(chǎn)應(yīng)用評(píng)估中具有充分的技術(shù)可行性。山羊痘病毒疫苗株(CVCCAV41)是由我國(guó)分離馴化的，符合中國(guó)的痘病毒流行情況，能夠提供針對(duì)國(guó)內(nèi)流行的痘病毒更有效的免疫保護(hù)。很多情況下，副粘病毒的受體識(shí)別囊膜蛋白H、HN或G蛋白往往誘導(dǎo)更為顯著的中和抗體反應(yīng)W。因此我們?cè)跇?gòu)建表達(dá)F蛋白重組GPV的同時(shí)，構(gòu)建了表達(dá)H蛋白的重組GPV，結(jié)果證明二者均誘導(dǎo)顯著的中和抗體反應(yīng)；并且，表達(dá)H和F蛋白的重組痘病毒聯(lián)合免疫，能誘導(dǎo)更加顯著的、同時(shí)針對(duì)H和F抗原表面多種中和表位的中和抗體，因而提高更加全面、持續(xù)的免疫保護(hù)，這一點(diǎn)在針對(duì)存在一定程度基因變異的流行野毒株時(shí)，更有意義。先前，法國(guó)、英國(guó)兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合發(fā)表了表達(dá)PPRV的H和F抗原重組山羊痘病毒的研究報(bào)告[3]，篩選基因gpt均采用了痘病毒早晚期強(qiáng)啟動(dòng)15子p7.5，另外表達(dá)H和F抗原的強(qiáng)啟動(dòng)子分別為PS和p7.5;我們認(rèn)為重組病毒同時(shí)存在兩個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子，盡管使得gpt抗性基因獲得高效表達(dá)，而有利于重組病毒的純化克隆，但有可能不利于目的免疫原基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，因而影響到中和抗體的誘導(dǎo)水平。為此我們采用不同的構(gòu)建策略，即目的免疫原基因H或F仍采用P7.5強(qiáng)啟動(dòng)子，但gpt則采用相對(duì)較弱的痘病毒晚期啟動(dòng)子pll，這樣雖然有可能增加重組病毒篩選的難度，但更加有利于目的抗原基因的表達(dá)，因而誘導(dǎo)更加顯著的中和抗體反應(yīng)，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了我們這種構(gòu)建策略在免疫效果上的優(yōu)勢(shì)。GPV弱毒免疫株在LT細(xì)胞上本身病變出現(xiàn)較慢，重組病毒在TK缺失后細(xì)胞病變效應(yīng)進(jìn)一步較削弱。同時(shí)，山羊痘病毒具有較明顯的細(xì)胞結(jié)合特性，反復(fù)凍融次數(shù)及超聲仍難于分散，使得野生型病毒與重組型病毒緊密相伴，由于野生型重組病毒的復(fù)制生長(zhǎng)較重組型具有相對(duì)優(yōu)勢(shì)，給重組病毒的克隆純化帶來極大困難。因此我們通過IRES序列串聯(lián)作用，pll啟動(dòng)子同時(shí)轉(zhuǎn)錄表達(dá)gpt和綠色熒光報(bào)告基因eGFP，重組病毒帶有綠色熒光標(biāo)簽，使得重組病毒的克隆純化、傳代生產(chǎn)過程中遺傳穩(wěn)定性觀察、毒價(jià)滴定等變得極為方便、快捷。參考文獻(xiàn)程小文，胡森，王喜軍，等.表達(dá)外源綠熒光蛋白重組山羊痘病毒的構(gòu)建及純化[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2006,14(5):798-802DialloA,MinetC,BerheG，etal.Goatimmuneresponsetocapripoxvaccineexpressingthehemagglutininproteinofpestedespetitsruminants[J].AnnNYAcadSci,2002,969:88-91BerheG,MinetC,LeGoffC，etal.Developmentofadualrecombinantvaccinetoprotectsmallruminantsagainstpeste-des-petits-ruminantsvirusandcapripoxvirusinfections[J].JVirol,2003，77(2):1571-1577王喜軍，王清華，葛金英，等.表達(dá)尼帕病毒G囊膜糖蛋白重組牛痘病毒的研究[J].微生物學(xué)報(bào)，2006,46(4):644-648,10005SEQUENCELISTING〈110〉中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所<120>小反芻獸疫重組山羊痘病毒活載體疫苗<130〉IB085340〈160〉5<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>5326<212〉DNA〈213〉人工的<400〉1gaactcgaggaatcaccagagccgataacatatatagatcttagaaaagatccaacattt60ttaaacattttatc肌tattgcacgaaa肌taattgaacaaatatttttttaaaaaaaaa120tggactatggatatatacatttaattataggacctatgttttctggcaaaagtactgaat180tgataagaatagttaaaaggtaccttacttgtacagctcgtccatgccgagagtgatccc240ggcggcggtcacgaactccagcaggaccatgtgatcgcgcttctcgttggggtctttgct30017cagggc卿ctgggtgctcaggtagtggttgtcgggcagcagcacggggccgtcgccgat360gggggtgttctgctggtagtggtcggcgagctgcacgctgccgtcctcgatgUgtggcg420gatcttgaagttcaccttgatgccgttcttctgcttgtcggccatgatatagacgttgtg480gctgttgtagttgtactccagcttgtgccccaggatgttgccgtcctccttgaagtcgat540gcccttcagctcgstgcggttcaccagggtgtcgccctcgaacttcacctcggcgcgggt600cttgtagttgccgtcgtccttgaagaagatggtgcgctcctggacgtagccttcgggcat660ggcggacttgaagaagtcgtgctgcttcatgtggtcggggtagcggctgaagcactgcac720gccgtaggtcagggtggtcacgagggtgggccagggcacgggcagcttgccggtggtgca780gatgaacttcagggtcagcttgccgtaggtggcatcgccctcgccctcgccggacacgct840gaacttgtggccgtttacgtcgccgtccagctcgaccaggatgggcaccaccccggtgaa900cagctcctcgcccttgctcaccatggttgtggccatattatcatcgtgtttttcaaagga960aaaccacgtccccgtggttcggggggcctagacgtttttttaacctcgactaaacacatg1020taaagcatgtgtaccgaggccccagatcagatcccatacaatggggtaccttctgggcat1080ccttcagccccttgttgaatacgcttgaggagagccatttgactctttccacaactatcc1140aactcacaacgtggcactggggttgtgccgcctttgcaggtgtatcttatacacgtggct1200UtggccgcagaggcacctgtcgccaggtggggggUccgctgcctgcaaagggtcgcta1260cagacgt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