專利名稱：：二聚桔霉素類化合物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用桔青霉HGYl-5(Penicilliumcitri皿mHGY1-5)(保藏編號是CCTCCM208170，保藏日期2008年10月27日)生產(chǎn)二聚桔霉素類化合物的方法；本發(fā)明還涉及該類化合物在制備細胞增殖抑制劑、細胞凋亡誘導(dǎo)劑或抗腫瘤劑中的用途。
背景技術(shù)：
：桔霉素是由桔青霉(Penicilliumcitrin咖)或一些曲霉(Aspergillussp.)生產(chǎn)的一種活性聚酮化合物，其二聚體目前報道了5個，但是這種5個六元環(huán)相互稠合形成的新穎的桔霉素二聚體未見報道。本發(fā)明人研究得知，桔青霉HGYl-5(Penicilliumcitri皿mHGY1-5)(保藏編號是CCTCCM208170)液體發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)超聲破碎后的粗提物有很好的細胞增殖抑制和細胞凋亡誘導(dǎo)活性，遂對其活性成分進行了研究。研究發(fā)現(xiàn)所示二聚桔霉素類化合物具有抗腫瘤活性，目前尚未見該化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)及細胞增殖抑制和細胞凋亡誘導(dǎo)活性的報道，因此市場上也尚未見有與此有關(guān)的藥物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明旨在提供兩種結(jié)構(gòu)獨特的具有抑制腫瘤細胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡作用，具有抗腫瘤活性的新化合物。其結(jié)構(gòu)式分別是R其結(jié)構(gòu)特征是式I和式II是由5個六元環(huán)相互稠合形成的新穎的桔霉素二聚體，其中R_R3為氫、氨基、羥基、烷氧基、酰氧基或酰氨基。本發(fā)明優(yōu)選的式I和式II化合物其中R、&為羥基、R2為甲氧基、R3為氫。本發(fā)明的式I和式II化合物可通過微生物發(fā)酵培養(yǎng)來獲取含有二聚桔霉素類化合物的發(fā)酵物，然后從發(fā)酵物中采用硅膠柱層析、S印hadexLH20凝膠柱層析制備HPLC等方法分離純化得到。本發(fā)明的下述實施例中列舉了利用桔青霉HGYl-5(PeniciIliumcitri皿mHGY1-5)(保藏編號是CCTCCM208170)制備本發(fā)明式I和式II化合物的實例。具體實施例方式在如下的實施例中所指的化合物I和II的化學(xué)結(jié)構(gòu)(結(jié)構(gòu)式中的阿拉伯?dāng)?shù)字是化學(xué)結(jié)構(gòu)中碳原子的標(biāo)位)分別是<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>化合物I化合物II實施例1化合物I和II的發(fā)酵生產(chǎn)及分離精制1發(fā)酵生產(chǎn)生產(chǎn)菌的發(fā)酵培養(yǎng)按培養(yǎng)微生物的常規(guī)方法，取桔青霉HGYl-5(Penicilliumcitri皿mHGYl-5)(保藏編號是CCTCCM208170)適量，接種到PDA固體斜面培養(yǎng)基上，在28攝氏度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天。取斜面培養(yǎng)4天的桔青霉HGYl-5(Penicilliumcitrinum)適量，接種到裝有200mL培養(yǎng)液[培養(yǎng)基組成(克/升)麥芽糖20.0，甘露醇20.0，味精10.0，KH2P040.5，MgS040.3，酵母膏3.0，pH自然]的500mL錐型瓶中，在28t:、160轉(zhuǎn)/分鐘條件下?lián)u床培養(yǎng)15天，獲得菌絲體和發(fā)酵液。2浸膏的獲得用棉布將菌絲體和發(fā)酵液分離。將發(fā)酵液等體積乙酸乙酯萃取三次，再用正丁醇萃取三次，將正丁醇萃取液減壓濃縮，得粗浸膏，共100.0克。3化合物的分離精制浸膏(100.0克)用氯仿-甲醇混合溶劑溶解后，加300克200-300目硅膠(青島海洋化工集團公司產(chǎn)品)拌樣，減壓除去溶劑后，用硅膠柱層析，以石油醚、石油醚_丙酮，氯仿，氯仿-甲醇為溶劑進行梯度洗脫，分為12個流份。？1-7(12.08，氯仿-甲醇20:1洗脫物)，先后以氯仿-甲醇(1:1)為溶劑進行LH20柱層析，再經(jīng)加壓硅膠柱層析以石油醚丙酮(5:5)為溶劑，最后經(jīng)半制備反相高效液相色譜(甲醇水=80:20)得化合物I(100mg)和化合物II(80mg)?；衔颕淡黃色無定形固體，是一對不可分離的非對應(yīng)異構(gòu)體[IOS異構(gòu)體(1)和IOR異構(gòu)體(2)]的混合物，[a]25D-34.3°(c0.53，MeOH)，分子式C25H3006，HR-ESI-MSm/z:425.1954[M-H]—，計算值425.1964.UV入隨nm(loge)inMeOH:211(4.65)，221(4.66)，294(3.69)。IRvmaxcm—1(KBr):3485，3419，3333，2970，2929，2891，1640，1611，1590，1510，1472，1387，1334，1270，1178，1135，1088，1038，1012,950,837.'H和"C-NMR數(shù)據(jù)見表1,表1化合物I的^和13CNMR數(shù)據(jù)(600和150MHz,inDMS0_d6)aNo.3CSH(JinHz)'H-'HCOSYbHMBCT<5HC/iHz)'H-'HCOSYbHMBCCa)本表信號歸屬基于DEPT、HMQC及HMBC圖譜解析結(jié)果。碳信號的多重度利用DEPT方法確定并分別用s(單重峰)、d(二重峰)、t(三重峰)和q(四重峰)表示。b)此欄中的數(shù)字和代號分別代表在^」HCOSY譜中與相應(yīng)行中的^給出偶合相關(guān)信號的^核。c)此欄中的數(shù)字和代號分別代表在HMBC譜中與相應(yīng)行中的^給出偶合相關(guān)信號的"C核。化合物II淡黃色無定形固體，是一對不可分離的非對應(yīng)異構(gòu)體[IOS異構(gòu)體(1)和IOR異構(gòu)體(2)]的混合物，[a]25D-104.4°(c0.59，MeOH)，分子式C25H3。06，HR-ESI-MSm/z:425.1980[M-H]—，計算值425.1964.UV入隨nm(loge)inMeOH:221(4.69)，295(4.04)。IRvmaxcm—1(KBr):3335，2970，2929，2876，2826，1638，1610，1586，1495，1380，1344，1261，1128，1073，1044，959，905，840.力和13C_NMR數(shù)據(jù)見表2。表2化合物II的^和13CNMR數(shù)據(jù)(600和150MHz，inDMS0_d6)a268.83.89m(6.4，7.8)36.02.67m(6.8)4139.5116.46154.46-OH8.64s103.58145.19113.11094.35.56s1120.21.29d(6.4)1219.11.14d(6.8)1311.82.07s1454.73.45s2,78.54.07m(6.4)3，36.92.88m(6.8)4，138,15，117.56，156.16，-OH9.61s7，99.56.50s8，145,99，109，110，65.75.73sir21.61,35d闊12，19.71.23d(6.8)13，11.02.06s3,112,12233',ir2',12'3,112,124,10,11,124,5,9,11,125,6,72,4,8，9，142,32,3,44,5,61010',11',12'■',4'，5',9',11'12，5',6',6,7,8，2',4',8',9,3'2',3>,4'4',5',6'233',ir2',12'10,11,122，4,5,9,11,125,6,72'4'8，9,142,3,44,5,610io',ir,12'2'，4',5'，9',11'，12'5',6',7'6,7，8,2',4'，8',9,4',5',6'4.05m2.71m(6.8)8.53s5.52s174d.8)1d.8)2.07s3.51s4.08m(6.4)2.88m(6.4)9.61s6.47s5.69s1.32d(6.4)1.23d(6.8)2.06s39092Km出s一6165[OOSO]a)本表信號歸屬基于DEPT、HMQC及HMBC圖譜解析結(jié)果。碳信號的多重度利用DEPT方法確定并分別用s(單重峰)、d(二重峰)、t(三重峰)和q(四重峰)表示。b)此欄中的數(shù)字和代號分別代表在力」HCOSY譜中與相應(yīng)行中的^給出偶合相關(guān)信號的^核。c)此欄中的數(shù)字和代號分別代表在HMBC譜中與相應(yīng)行中的^給出偶合相關(guān)信號的"C核。實施例2體外抗腫瘤活性的測試細胞增殖抑制活性測試及細胞凋亡誘導(dǎo)活性測試1實驗樣品及實驗方法被測樣品溶液的配制測試樣品為上述實施例1中分離精制的化合物I和II純品。精密稱取適量樣品，用甲醇配制成所需濃度的溶液，供測活性。細胞系及細胞的繼代培養(yǎng)采用人肺癌A549細胞、人肝癌BEL-7402細胞、人白血病HL60細胞及人白血病M0LT-4細胞等癌細胞系。各種細胞均用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37t:于通入5X二氧化碳的培養(yǎng)箱中繼代培養(yǎng)。細胞增殖抑制活性測試方法麗絲胺羅丹明B(SRB)法取對數(shù)生長期的人肺癌A549細胞、人肝癌BEL-7402細胞，用新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)基配制成密度為每毫升2X105個細胞的細胞懸液，按每孔200微升接種于96孔板中，每孔加入2微升不同濃度的樣品或空白溶液，37t:下培養(yǎng)24小時。取藥物作用下培養(yǎng)后的細胞，首先在光學(xué)顯微鏡下觀察藥物處理引起的形態(tài)學(xué)變化，判斷<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>有無細胞周期抑制，細胞凋亡或細胞壞死的形態(tài)學(xué)特征，繼而在4°C、3000轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，吸去上清。每孔細胞中加入20%三氯醋酸50微升，置于4t:固定1小時，用水沖洗5次并空氣干燥。每孔加入0.4%SRB的醋酸溶液50微升并在室溫靜置30分鐘。用1%醋酸水清洗4次，除去未結(jié)合的游離SRB染料。每孔加入150微升Tris緩沖液(10mmol/L，pH10.5)溶解蛋白結(jié)合染料并利用MD公司產(chǎn)SPECTRAMAXPlus型酶標(biāo)儀測定每孔在520nm處的光密度(OD)值。在同一塊96孔板中樣品的每個濃度均設(shè)置三孔，另設(shè)三孔空白對照和無細胞調(diào)零孔(如果藥物有顏色要做相應(yīng)藥物濃度無細胞調(diào)零)。各孔OD值先做相應(yīng)無細胞調(diào)零，再取三孔平均OD值按IR%=(0D站對照-0D樣品)/0D空自對照X100X式計算每個濃度下的細胞增殖抑制率(IR%)。四氮唑鹽(MTT)法取對數(shù)生長期的人白血病HL60細胞和人白血病MPLT-4細胞，將細胞密度調(diào)至每毫升2X105個細胞，按每孔200微升接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，于37°C通入5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時。每孔加樣品液或空白液各2微升，培養(yǎng)24小時后，每孔加MTT液(MTT的每毫升5毫克生理鹽水溶液)10微升，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，37°C、2000轉(zhuǎn)/分鐘離心8分鐘，吸去上清。每孔加入匿SO各100微升，在微量振蕩器上振蕩15分鐘，至結(jié)晶完全溶解后，利用MD公司產(chǎn)SPECTRAMAXPlus型酶標(biāo)儀測定每孔在570nm處的吸光值(OD值)。在同一塊96孔板中樣品的每個濃度均設(shè)置三孔，另設(shè)三孔空白對照和無細胞調(diào)零孔(如果藥物有顏色要做相應(yīng)藥物濃度無細胞調(diào)零)。各孔OD值先做相應(yīng)無細胞調(diào)零，再取三孔平均OD值按IR%=(OD空自對照-OD樣。。。)/OD空自對照X100X式計算每個濃度下的細胞增殖抑制率(IR%)。細胞凋亡誘導(dǎo)活性測試方法取對數(shù)生長期的人白血病HL60細胞，用新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)基配制成密度為每毫升2X105個細胞的細胞懸液，按每孔0.5毫升接種于24孔板中，每孔加入5微升終濃度為10M的樣品溶液，37t:下培養(yǎng)20小時取藥物作用下培養(yǎng)后的細胞，首先在光學(xué)顯微鏡下觀察藥物處理引起的形態(tài)學(xué)變化，判斷有無細胞周期抑制，細胞凋亡或細胞壞死的形態(tài)學(xué)特征，必要時進行拍照。繼而將細胞分別從24孔板轉(zhuǎn)移至1.5毫升E卯endorf離心管中(貼壁細胞提前用胰蛋白酶消化約一分鐘)，4°CT3000轉(zhuǎn)/分離心3分鐘，吸去上清液，加0.5毫升磷酸緩沖溶液(PBS)震蕩洗滌一次，相同條件下離心收集細胞，加150微升碘化丙啶(PI)水溶液(在100毫升水中含5毫克PIUOO毫克檸檬酸納和200毫克NP-40)，4°C下染色30分鐘后，加入150微升PBS稀釋，用流式細胞儀分析測定細胞中DNA的含量分布。細胞在細胞周期各時相中的分布利用計算機軟件進行分析計算。2.實驗結(jié)果細胞增殖抑制活性測試結(jié)果在SRB法或MTT法測試中，不同濃度的化合物I和II對人肺癌A549細胞、人肝癌BEL-7402細胞、人白血病HL60細胞和人白血病M0LT-4細胞的增殖抑制結(jié)果分別見表3和表4。表3不同濃度的化合物I對癌細胞增殖的抑制率(％)細胞株-化合物IlxlO^Mlxl0-5MIxl0-6MlxlO-7MIxl0-8MA549BEL-7402HL60MOLT-495.6%92.4%94.4%81.3%94.6%91.4%95.0%84.6%1.4%O.50/030.7%17.4%I.6%0.6%II.6%14.6%0%5.2%4.0%4.2%表4不同濃度的化合物II對癌細胞增殖的抑制率(％細胞株-化合物nIxl0-4Mlxl(T5MIxl0-6M1x10-7Mlxl(T8MA549BEL-7402HL60MOLT-492.7%92.4%95.1%813%0.8%91.4%95.4%84.6%0.7%0.5%91.7%17.4%1.2%0.6%30.7%14.6%05.2%21.7%4.2%細胞凋亡誘導(dǎo)活性領(lǐng)B式結(jié)果在流式細胞術(shù)測試中，濃度為10iiM的化合物I和II對人白血病HL60細胞的凋亡誘導(dǎo)活性結(jié)果見，圖1為化合物I和II的凋亡誘導(dǎo)活性。3結(jié)論化合物I和II具有明顯的腫瘤細胞增殖抑制作用和誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，可作為細胞增殖抑制劑、細胞凋亡誘導(dǎo)劑或抗腫瘤劑用于抗腫瘤的研究。QHL&O231.008___File:HL60231.008%Gated%TotalMeanPeakCh100.00100.00304.8529.5629.56101.76102338Channels(FL2-A)化合物I8Channels(FL2-A)_HL60232.,__File:HL60232.009%Gated%TotalMeanPeakCh~100.00100.00~~371.98102312.2712.27121.0540Apoptosis化合物II圖1化合物I和II的凋亡誘導(dǎo)活性3結(jié)論化合物I和II具有明顯的腫瘤細胞增殖抑制作用和誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，可作為細胞增殖抑制劑、細胞凋亡誘導(dǎo)劑或抗腫瘤劑用于抗腫瘤的研究。J9qEnM權(quán)利要求式I化合物式I其中R、R1為羥基、R2為甲氧基、R3為氫。F2008101724325C0000011.tif2.式II化合物R式II其中R、&為羥基、R2為甲氧基、R3為氫。3.權(quán)利要求1所述式I化合物或權(quán)利要求2所述式II化合物的制備方法，其特征是發(fā)酵培養(yǎng)桔青霉HGYl-5(PeniciIliumcitri皿m)，獲取含有上述式I和/或式II化合物的發(fā)酵物，然后從發(fā)酵物中分離純化出式I和/或II化合物。4.權(quán)利要求3所述的制備方法，其中將所述發(fā)酵物經(jīng)硅膠柱層析，以石油醚、石油醚-丙酮，氯仿，氯仿-甲醇為溶劑進行梯度洗脫，氯仿-甲醇20:l洗脫部分，再經(jīng)S印hadexLH20凝膠柱層析及制備HPLC分離純化得式I和/或II化合物。5.權(quán)利要求1或2所述的式I或式II化合物在制備細胞增殖抑制劑中的用途。6.權(quán)利要求1或2所述的式I或式II化合物在制備細胞凋亡誘導(dǎo)劑中的用途。7.權(quán)利要求1或2所述的式I或式II化合物在制備抗腫瘤藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及兩種二聚桔霉素類化合物的制備方法和用途。本發(fā)明用采自火山口樣品中的桔青霉HGY1-5(PenicilliumcitrinumHGY1-5)生產(chǎn)出結(jié)構(gòu)新穎的二聚桔霉素類化合物。經(jīng)實驗證實，該類化合物可作為細胞增殖抑制劑、細胞凋亡誘導(dǎo)劑或抗腫瘤劑。文檔編號A61K31/352GK101735236SQ20081017243公開日2010年6月16日申請日期2008年11月10日優(yōu)先權(quán)日2008年11月10日發(fā)明者朱天驕,杜林,顧謙群申請人:中國海洋大學(xué)