專(zhuān)利名稱(chēng)：：長(zhǎng)春氟寧衍生物及其制備方法和其在制備靶向治療實(shí)體瘤、肝癌或肺癌的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種新型的具有靶向抗癌作用的長(zhǎng)春氟寧衍生物及其合成方法，特別是在長(zhǎng)春氟寧G環(huán)的C-4位上直接或間接連上氨基酸、多肽或氨基葡萄糖，從而提高它的靶向作用。
背景技術(shù)：
：長(zhǎng)春氟寧是法國(guó)PierreFabre公司開(kāi)發(fā)(商品名Javlor)，2004年在歐洲用于治療膀胱癌和非小細(xì)胞肺癌進(jìn)行三期臨床階段；其用于治療乳腺癌和卵巢癌則處于二期臨床試驗(yàn)。長(zhǎng)春氟寧(vinflimine)是繼長(zhǎng)春瑞濱之后又一種新型的半合成長(zhǎng)春堿類(lèi)生物堿抗腫瘤藥，它與長(zhǎng)春瑞濱的區(qū)別在于在C-19'位上由兩個(gè)氟原子取代兩個(gè)氫原子，在15'和20'位的碳碳雙鍵被還原成單鍵。國(guó)外研究資料表明，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)顯示出對(duì)P338白血病、B16惡性黑素瘤及對(duì)人體肺部和胸部腫瘤的抗腫瘤活性。而作為抗癌藥物，長(zhǎng)春氟寧也具有抗癌藥物的缺點(diǎn)一副作用大，如骨髓抑制、白細(xì)胞減少等。因此開(kāi)發(fā)具有低副作用的抗癌藥物或?qū)﹂L(zhǎng)春氟寧進(jìn)行結(jié)構(gòu)的修飾具有非常重要的意義。在美法侖、雌莫司汀、卡莫司汀這些抗癌藥物中引入氨基酸或糖等進(jìn)行修飾，在提高其靶向性上己經(jīng)取得了一定成果，而長(zhǎng)春堿類(lèi)藥物非活性位點(diǎn)的修飾還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就在于提供一種長(zhǎng)春氟寧衍生物，通過(guò)對(duì)其C-4位進(jìn)行修飾以提高藥物的耙向性。本發(fā)明提供的長(zhǎng)春氟寧衍生物，是在長(zhǎng)春氟寧G環(huán)的C-4位上直接或間接連上氨基酸、多肽或帶氨基的糖環(huán)。所述的氨基酸可以為天冬氮酸或谷氨酸等氨基酸，其結(jié)構(gòu)如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>本發(fā)明還提供了上述長(zhǎng)春氟寧衍生物的制備方法，其制備方法如下:(1)長(zhǎng)春氟寧在堿性條件下水解，將G環(huán)的C-4位水解為-OH;(2)將(1)所得的產(chǎn)物與天冬氨酸或谷氨酸在極性溶劑中反應(yīng)，合成長(zhǎng)春氟寧衍生物。上述方法中所述歩驟(1)中堿性條件尤指pH值為8-11，pH過(guò)高容易引起反應(yīng)產(chǎn)率下降，副反應(yīng)增多。上方法中，所述歩驟(1)中的溶劑可以為甲醇、乙醇、乙腈或它們的混合物；所述步驟(2)中的可以溶劑氯仿-甲醇、氯仿-乙醇、二甲基亞砜、水或它們的混合物，步驟(2)中的反應(yīng)溫度為相應(yīng)溶劑的回流溫度。上述方法中，反應(yīng)中原料長(zhǎng)春氟寧和天冬氨酸或谷氨酸的摩爾比為l:1-6，優(yōu)選l:3-5，在l:3-5比例中使長(zhǎng)春氟寧能夠完全參與反應(yīng)，提高長(zhǎng)春氟寧的利用率，降低反應(yīng)成本。所述的長(zhǎng)春氟寧衍生物，長(zhǎng)春氟寧G環(huán)的C-4位上可以是間接連接的L-精氨酸或帶氨基的糖環(huán)，其結(jié)構(gòu)如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>還提供了上述長(zhǎng)春氟寧衍生物的制備方法，其制備方法如下(1)以長(zhǎng)春氟寧在堿性條件下水解，將G環(huán)的C-4位水解為-OH;(2)將(1)所得的產(chǎn)物與琥珀酰COA合成酶在極性溶劑中反應(yīng)；(3)將(2)所得的產(chǎn)物與L-精氨酸或帶氨基的糖環(huán)在極性溶劑下反應(yīng)，得到長(zhǎng)春氟寧衍生物。上述方法中，所述步驟(1)中堿性條件尤指pH值為8-11。上述方法中，步驟(1)和(2)中的溶劑可以為甲醇、乙醇、乙腈、氯仿、吡啶或它們的混合物；步驟(3)中的可以溶劑為氯仿-甲醇、氯仿-乙醇、二甲基亞砜、水或它們的混合，步驟(2)和(3)中反應(yīng)溫度為各溶劑的回流溫度。上述方法中，反應(yīng)中原料長(zhǎng)春氟寧和L-精氨酸或帶氨基的糖環(huán)的摩爾比為l:1-6，優(yōu)選l:3-5。本發(fā)明以氨基酸、多肽或帶氨基的糖環(huán)接入長(zhǎng)春氟寧G環(huán)的C一4位上對(duì)長(zhǎng)春氟寧進(jìn)行修飾，可以提高藥物靶向性。這主要是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞在某個(gè)發(fā)育階段合成蛋白質(zhì)的速度較高，要求氨基酸與糖等在癌細(xì)胞內(nèi)快速濃集，將藥效團(tuán)即長(zhǎng)春氟寧連接在氨基酸上，提髙向癌組織中分布的選擇性。作為藥物載體的前體藥物能夠特異地積累于癌細(xì)胞，并能在癌細(xì)胞中特異釋放出原藥。通過(guò)在具有腫瘤的小鼠中注射等量的帶氨基酸、糖環(huán)等的長(zhǎng)春氟寧與長(zhǎng)春氟寧后，采用HPLC法測(cè)定了癌組織中藥物的濃度，計(jì)算出平均每克腫瘤細(xì)胞組織中長(zhǎng)春氟寧的含量，通過(guò)對(duì)比得出帶藥物載體的前體藥物的靶向性作用。采用FITC標(biāo)記的以氨基酸，多肽或帶氨基的糖環(huán)為載體的長(zhǎng)春氟寧在體內(nèi)組織的含量，確定長(zhǎng)春氟寧精氨酸酯具有良好的肝臟靶向效率。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，以助于理解本發(fā)明的內(nèi)容。實(shí)施例1取長(zhǎng)舂氟寧5.0g(0.00612mol)，加入甲醇150ml溶液中，接著加入碳酸鈉1.95g(0.01836mol)，pH值約為10，置水浴上加熱8(TC，回流5個(gè)小時(shí)后，用氯仿萃取3次后合并，旋轉(zhuǎn)蒸干。得17-羥基長(zhǎng)春氟寧3.29g。將17-羥基長(zhǎng)春氟寧加入到氯仿-甲醇(體積比為l:3)混合液100ml中，置水浴上加熱至溶解。在回流攪拌的條件下，緩緩加入含2.66g(0.02mol)天冬氨酸水溶液lOml，繼續(xù)回流2小時(shí)至溶液透明澄清。用氯仿萃取3次后合并，旋轉(zhuǎn)蒸干，得到最后產(chǎn)物約2.8g。實(shí)施例2取長(zhǎng)春氟寧5.0g(0.00612mol)，加入甲醇150ml溶液中，接著加入碳酸鈉L95g(0.01836mol)，pH值約為10，置水浴上加熱80。C，回流5個(gè)小時(shí)后，用氯仿萃取3次后合并，旋轉(zhuǎn)蒸干。得17-羥基長(zhǎng)春氟寧3.25g。將17-羥基長(zhǎng)春氟寧溶解在氯仿-甲醇(1:3)混合液100ml中，并緩慢滴加到在含有琥珀酰C0A合成酶2g的吡啶溶液中，磁力攪拌，加完后，在回流5個(gè)小時(shí)，過(guò)濾，得到產(chǎn)物3.15g。將前面所得的產(chǎn)物溶解在甲醇溶液中，加幾滴二氯亞砜，然后緩慢加入L-精氨酸4.355g(0.025mol)，磁力攪拌并回流，用氯仿萃取3次后合并，旋轉(zhuǎn)蒸干，得到最后產(chǎn)物3.13g。實(shí)施例3取長(zhǎng)春氟寧5.Og(O.00612mol)，加入甲醇150ml溶液中，接著加入碳酸鈉1.65g(0.0155mol)，pH值約為9，置水浴上加熱8(TC，回流5個(gè)小時(shí)后，用氯仿萃取3次后合并，旋轉(zhuǎn)蒸干。得17-羥基長(zhǎng)春氟寧3.29g。將17-羥基長(zhǎng)春氟寧溶解在氯仿-甲醇(1:3)混合液100ml中，并緩慢滴加到在含有琥珀酰COA合成酶2g的吡啶溶液中，磁力攪拌，加完后，在回流5個(gè)小時(shí)，過(guò)濾，得到產(chǎn)物3.09g。將前面所得的產(chǎn)物溶解在甲醇溶液中，加幾滴二氯亞砜，然后緩慢加入氨基葡萄糖1.8g(O.Olmol)，磁力攪拌并回流，用氯仿萃取3次后合并，旋轉(zhuǎn)蒸干，得到最后產(chǎn)物2.lg。實(shí)施例4取長(zhǎng)春氟寧5.0g(0.00612mol)，加入甲醇150ml溶液中，接著加入碳酸鈉1.95g(0.01836mol)，pH值約為10，置水浴上加熱80。C，回流5個(gè)小時(shí)后，用氯仿萃取3次后合并，旋轉(zhuǎn)蒸干。得17-羥基長(zhǎng)春氟寧3.29g。將17-羥基長(zhǎng)春氟寧加入到氯仿-甲醇(h3)混合液100ml中，置水浴上加熱至溶解。在回流攪拌的條件下，緩緩加入谷氨酸水溶液2.7g(0,0184mol)，繼續(xù)回流2小時(shí)至溶液透明澄清。用氯仿萃取3次后合并，旋轉(zhuǎn)蒸干，得到最后產(chǎn)物約2.6g。實(shí)施例5取長(zhǎng)春氟寧3.0g(0.00367mol)，加入甲醇100ml溶液中，接著加入氫氧化鈉0.6g(0.015mol)，pH值約為9，置水浴上加熱8(TC，回流7個(gè)小時(shí)后，用氯仿萃取3次后合并，旋轉(zhuǎn)蒸干。得17-羥基長(zhǎng)春氟寧1.76g。將17-羥基長(zhǎng)春氟寧加入到氯仿-甲醇(1:3)混合液100ml中，置水浴上加熱至溶解。在回流攪拌的條件下，緩緩加入半胱氨酰甘氨酰纈氨酸水溶液7.7g(0.022mol)，繼續(xù)回流2小時(shí)至溶液透明澄清。用氯仿萃取3次后合并，旋轉(zhuǎn)蒸干，得到最后產(chǎn)物約1.83g。實(shí)施例6取長(zhǎng)春氟寧3.0g(Q.00367mol)，加入乙腈100ml溶液中，接著加入氫氧化鉀0.616g(0.011mol)，pH值約為8，置水浴上加熱85°C，回流3個(gè)小時(shí)后，用氯仿萃取3次后合并，旋轉(zhuǎn)蒸干。得17-羥基長(zhǎng)春氟寧1.43g。將17-羥基長(zhǎng)春氟寧加入到氯仿-乙醇(體積比為l:2)混合液100ml中，置水浴上加熱至溶解。在回流攪拌的條件下，緩緩加入含0.72g(0.0054mol)天冬氨酸水溶液5ml，繼續(xù)回流3小時(shí)至溶液透明澄清。用氯仿萃取3次后合并，旋轉(zhuǎn)蒸干，得到最后產(chǎn)物約1.08g。實(shí)施例7取長(zhǎng)春氟寧5.0g(0.00612mol)，加入甲醇150ml溶液中，接著加入碳酸鈉L95g(0.01836mol)，pH值約為10，置水浴上加熱8(TC，回流5個(gè)小時(shí)后，用氯仿萃取3次后合并，旋轉(zhuǎn)蒸干。得17-羥基長(zhǎng)春氟寧3.21g。將17-羥基長(zhǎng)春氟寧溶解在氯仿-甲醇(1:3)混合液100ml中，并緩慢滴加到在含有琥珀酰COA合成酶2g的吡啶溶液中，磁力攪拌，加完后，在回流5個(gè)小時(shí)，過(guò)濾，得到產(chǎn)物3.15g。將前面所得的產(chǎn)物溶解在甲醇溶液中，加幾滴二氯亞砜，然后緩慢加入L-精氨酸2.14g(0.0123mol)，磁力攪拌并回流，用氯仿萃取3次后合并，旋轉(zhuǎn)蒸干，得到最后產(chǎn)物2.42g。實(shí)驗(yàn)例8、1、熒光標(biāo)記長(zhǎng)春氟寧精氨酸酯、長(zhǎng)春氟寧谷氨酸酯、長(zhǎng)春氟寧-多肽、長(zhǎng)春氟寧-氨基葡萄糖在體內(nèi)分布研究精密稱(chēng)取長(zhǎng)春氟寧精氨酸酯、長(zhǎng)春氟寧谷氨酸酯、長(zhǎng)春氟寧-多肽、長(zhǎng)春氟寧-氨基葡萄糖300mg溶于水溶液10ml中，再用NaOH調(diào)節(jié)pH值到6.9、加入21mgFITC(異硫氰熒光素)，混合均勻后室溫下反應(yīng)24小時(shí)，透析。將透析后的樣品冷凍干燥。測(cè)定熒光素含量為6.56%(w/w)。取小鼠64只，雄性，重量在25-30g之間，隨機(jī)取16只為一組，一共4組，按注射劑量40mg/kg計(jì)算，尾靜脈分別注射FITC-長(zhǎng)春氟寧精氨酸酯，F(xiàn)ITC-長(zhǎng)春氟寧谷氨酸酯，F(xiàn)ITC-長(zhǎng)春氟寧-多肽，F(xiàn)工TC-長(zhǎng)春氟寧-帶氨基的糖環(huán)藥物。分別在15min、30min、60min、120min處死小鼠，取心、肝、脾、肺、腎，稱(chēng)重，并制備成組織勻漿，沉淀蛋白后，用熒光分光光度計(jì)測(cè)定含量，計(jì)算出每只小鼠每種組織中長(zhǎng)春氟寧-精氨酸等的量占總注射量的百分?jǐn)?shù)。結(jié)果見(jiàn)表l。表l長(zhǎng)春氟寧衍生物在體內(nèi)的分布<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>結(jié)果證明，精氨酸是一種具有良好肝靶向性的藥物載體，形成的長(zhǎng)春氟寧精氨酸酯能夠聚集在肝臟中。2、長(zhǎng)春氟寧氨基酸酯、長(zhǎng)春氟寧一多肽或長(zhǎng)春氟寧一帶氨基的糖環(huán)前體藥物在小鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞中分布研究取小鼠100只，雄性，重量在25-30g之間，分成5組，每組20只。再在20只中隨機(jī)取5只為一組，一共4組，按注射劑量28mg/kg計(jì)算，尾靜脈分別注射長(zhǎng)春氟寧，長(zhǎng)春氟寧精氨酸酯，長(zhǎng)春氟寧谷氨酸酯，長(zhǎng)春氟寧-多肽，長(zhǎng)春氟寧-帶氨基的糖環(huán)藥物。分別15min，30min，60min，120min處死小鼠，取出腫瘤細(xì)胞，搗碎，加入甲醇和10%三氯乙酸沉淀蛋白，漩渦振搖5分鐘，離心(14000轉(zhuǎn)、分，15分鐘)，高效液相色譜測(cè)定上清液游離藥物濃度，計(jì)算出平均每克腫瘤細(xì)胞組織中，長(zhǎng)春氟寧的含量(ug)，結(jié)論如表2。表2長(zhǎng)春氟寧氨基酸酯、長(zhǎng)春氟寧一多肽或長(zhǎng)春氟寧一帶氨基的<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>從上面的數(shù)據(jù)可以看出，當(dāng)長(zhǎng)春氟寧與氨基酸、多肽或糖形成前體藥物以后，在腫瘤細(xì)胞中水解，并且水解后的原藥一長(zhǎng)春氟寧的濃度比直接注射長(zhǎng)春氟寧后的濃度高，因此可以證明形成的前體藥物具有明顯的靶向作用。權(quán)利要求1、一種具有靶向抗癌作用的長(zhǎng)春氟寧衍生物，其特征是在長(zhǎng)春氟寧G環(huán)的C-4位上直接或間接連上氨基酸、多肽或帶氨基的糖環(huán)。2、如權(quán)利要求1所述的長(zhǎng)春氟寧衍生物，其特征在于所述的氨基酸為天冬氨酸或谷氨酸，其結(jié)構(gòu)如下R=C0CH2CH(NH2)C00H或C0CHCHCH(NH)C00H3、如權(quán)利要求1所述的長(zhǎng)春氟寧衍生物，其特征在于長(zhǎng)春氟寧G環(huán)的C-4位上是間接連接的L-精氨酸或帶氨基的糖環(huán)，其結(jié)構(gòu)如下:4、一種權(quán)利要求2所述長(zhǎng)春氟寧衍生物的制備方法，其制備方法如下(1)長(zhǎng)舂氟寧在堿性條件下水解，將G環(huán)的C-4位水解為-0H;(2)將(1)所得的產(chǎn)物與天冬氨酸或谷氨酸在極性溶劑中反應(yīng)，合成長(zhǎng)春氟寧衍生物。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述步驟(1)中堿性條件是指pH值為8-11。6、根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的制備方法，其特征在于所述步驟(1)中的溶劑為甲醇、乙醇、乙腈或它們的混合物；所述步驟(2)中的溶劑氯仿-甲醇、氯仿-乙醇、二甲基亞砜、水或它們的混合物，步驟(2)中的反應(yīng)溫度為相應(yīng)溶劑的回流溫度。7、根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的制備方法，其特征在于反應(yīng)中原料長(zhǎng)春氟寧和天冬氨酸或谷氨酸的摩爾比為1:1-6。8、根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的制備方法，其特征在于反應(yīng)中原料長(zhǎng)春氟寧和天冬氨酸或谷氨酸的摩爾比為1:3-5。9、一種權(quán)利要求3所述的長(zhǎng)春氟寧衍生物的制備方法，其制備方法如下(1)長(zhǎng)春氟寧在堿性條件下水解，將G環(huán)的C-4位水解為-0H;(2)將(1)所得的產(chǎn)物與琥珀酰COA合成酶在極性溶劑中反應(yīng)；(3)將(2)所得的產(chǎn)物與L-精氨酸或帶氨基的糖環(huán)在極性溶劑下反應(yīng)，得到長(zhǎng)春氟寧衍生物。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于所述步驟(l)中堿性條件是指PH值為8-11。11、根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的制備方法，其特征在于步驟(1)和(2)中的溶劑為甲醇、乙醇、乙腈、氯仿、吡啶或它們的混合物；步驟(3)中的溶劑為氯仿-甲醇、氯仿-乙醇、二甲基亞砜、水或它們的混合，步驟(2)和(3)中反應(yīng)溫度為各溶劑的回流溫度。12、根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的制備方法，其特征在于反應(yīng)中原料長(zhǎng)春氟寧和L-精氨酸或帶氨基的糖環(huán)的摩爾比為1:1-6。13、根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于反應(yīng)中原料長(zhǎng)春氟寧和L-精氨酸或帶氨基的糖環(huán)的摩爾比為1:3-5。14、一種權(quán)利要求2所述的長(zhǎng)春氟寧衍生物在制備靶向治療實(shí)體瘤、肝癌或肺癌的藥物中的應(yīng)用。15、一種權(quán)利要求3所述的長(zhǎng)春氟寧衍生物在制備靶向治療實(shí)體瘤、肝癌或肺癌的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種具有靶向抗癌作用的長(zhǎng)春氟寧衍生物，是在長(zhǎng)春氟寧G環(huán)的C-4位上直接或間接連上氨基酸、多肽或帶氨基的糖環(huán)。這種長(zhǎng)春氟寧衍生物具有良好的靶向作用。文檔編號(hào)A61K31/475GK101386625SQ20081017523公開(kāi)日2009年3月18日申請(qǐng)日期2008年11月4日優(yōu)先權(quán)日2008年11月4日發(fā)明者伍曾利,敏劉,劉全勝申請(qǐng)人:劉全勝