專利名稱：糖尿病等的治療的制作方法
糖尿病等的治療本申請為申請日為2003年12月5日、申請?zhí)枮?00380105141.X (國 際申請?zhí)枮镻CT/US2003/038689)、發(fā)明名稱為"糖尿病等的治療"的發(fā)明 專利申請的分案申請。本申請要求2002年12月6日提交的美國臨時申請系列號No . 60/431351、 2003年6月6日提交的美國臨時申請系列號No . 60/476331 和2003年6月6日提交的美國臨時申請系列號No . 60/476726的優(yōu)先權(quán)，這些申請的內(nèi)容各自納入本文作參考。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及葡萄糖的調(diào)節(jié)和體內(nèi)平衡，涉及糖尿病等葡萄糖調(diào)節(jié)受損 傷相關(guān)疾病的治療或預(yù)防。發(fā)明背景糖尿病是-種由于胰島素分泌、胰島素活性或二者發(fā)生缺陷而致的以 高血糖為特征的疾病。I型糖尿病(以前稱為胰島素依賴性糖尿病 (IDDM))是-種朗格漢斯細胞作用于胰島，破壞了機體產(chǎn)生胰島素能力而 致的自身免疫性疾病。I型糖尿病占所有糖尿病例的10 % ，影響到美國 多達100萬人。II型糖尿病(以前稱為胰島素非依賴性糖尿病(NIDDM)) 是-種由于機體不能產(chǎn)生足夠的胰島素或不能適當?shù)乩靡葝u素而致的代 謝性疾病。美國所有的糖尿病人中大約90 %患II型糖尿病。I型和II型 糖尿病都是由于胰島素分泌、胰島素活性或二者發(fā)生缺陷而致的以高血 糖為特征的代謝性疾病。糖尿病的流行以警報速度增加。1976-1994年之間美國成年人中糖尿 病人群從8.9%增加至12.3%。美國目前大約有1600萬(約占人口的6% ) 人患糖尿病，每年新診斷糖尿病人80萬人。(Harris等，Diabetes Care ,21 : 518-5241 ， 1998 ; Nathan ; N Engl 2 : J Med . , 347 : 1342 -1349 ， 2002 )。糖尿病在發(fā)生前、發(fā)生期間和發(fā)生后伴有廣泛影響機體中各種器 官的病癥和供發(fā)?。焕缫暰W(wǎng)膜病變、腎病、神經(jīng)病變等，導(dǎo)致失明、腎 功能衰竭等。糖尿病可能嚴重影響生活質(zhì)量，甚至可致死亡。因此該領(lǐng)域 需要治療和預(yù)防糖尿病及其相關(guān)講發(fā)癥發(fā)生和發(fā)展的有效方法。與糖尿病，通常與II型糖尿病發(fā)生相關(guān)的幾種危險因素，具體是糖尿 病家族史、某些人種或種族、妊娠性糖尿病史、肥胖，特別是高水平的內(nèi) 臟和腹部脂肪、久坐不動的生活類型、年齡、高血壓、精神分裂癥等；以 及葡萄糖代謝的改變，包括葡萄糖耐受受損(IGT )或前驅(qū)糖尿病。因此 該領(lǐng)域需要治療和預(yù)防糖尿病相關(guān)危險因素發(fā)生和發(fā)展的有效方法。糖尿病等疾病與葡萄糖調(diào)節(jié)失控有關(guān)。糖尿病和高血糖可導(dǎo)致產(chǎn)生、 或在反應(yīng)中產(chǎn)生各種疾病和病癥，相關(guān)的疾病和病癥包括動脈粥樣硬 化、血管疾病如中風(fēng)等；肥胖癥、心血管疾病如充血性心力衰竭 (CHF )、心肌梗塞(MI )及下游影響等；或與這些疾病和病癥相關(guān)的 危險因素。因此該領(lǐng)域需要治療和預(yù)防，或最大程度減少發(fā)生糖尿病或高 血糖相關(guān)疾病危險因素的有效方法。本發(fā)明提供-種藥物治療方法回答了 這一需要，該方法與目前對于不同疾病和不同疾病的不同方面采用多種治 療方法10不同，而是給予一種能靶向有關(guān)生理過程的某家族(成員)，并 實現(xiàn)協(xié)同作用的化合物，即可獲得所需的治療效果。糖尿病的目前治療是控制血液中的葡萄糖水平(如實現(xiàn)血糖控制)， 以圖再生天然的生理性葡萄糖體內(nèi)平衡。由于生活類型的變化，如推薦控 制飲食和增加運動，因此此方法可能效果有限。這種生活類型的變化不可 能防止或戰(zhàn)勝有關(guān)生理因素的發(fā)生，有可能延緩但不能防止該病的進展。 此外，病人對此法缺乏順從性可能限制其效果。常用的治療方法包括用胰島素治療，例如通過以仔細設(shè)計的時間方 式，常常需要每天一次或甚至一天多次注射需要給予的胰島素。需要注射 胰島素的這種治療可能伴有低血糖癥和高胰島素血癥的危險。另外這類治 療是否成功常因病人缺乏順從性而失效，即不能順從推薦的治療方案而失 敗。其它基于胰島素的治療，如給予胰島素促分沁素(能刺激胰腺分沁胰 島素的化合)，也具有誘生低血糖等的類似危險。這些療法，和現(xiàn)有的療
法，如PPAR-y拮抗劑療法等伴有其它作用，例如糖尿病的和自身的一種危險因素體重增加。因此需要有效治療或預(yù)防糖尿病、高血糖癥和糖尿 病相關(guān)危險因素，如體重增加和肥胖的方法和化合物，這些方法和化合物 常?？筛倪M給藥的容易性，并不會伴有其它糖尿病相關(guān)因素，如體重增加 等的發(fā)生或危險。對于糖尿病和相關(guān)疾病，需要更接近模擬達到葡萄糖體 內(nèi)平衡的機體自身生理機制的治療方法。當然這類治療可能需要改進給藥 的容易性、提高病人的舒適度以及病人順從性。此外，糖尿病或相關(guān)疾病 的治療需要這種治療不會有加重或惡化所治疾病的作用。葡萄糖代謝，例如葡萄糖的合成、加工和利用等，是維持正常葡萄糖 平衡和體內(nèi)平衡所必須的。葡萄糖代謝或調(diào)節(jié)的破壞可導(dǎo)致葡萄糖體內(nèi)平 衡的破壞，導(dǎo)致血糖不適當?shù)母咚?即高血糖癥)或低水平(即低血糖 癥)。高血糖癥和低血糖癥長期或嚴重地影響到生活質(zhì)量，產(chǎn)生神經(jīng)和血 管損傷。因此需要調(diào)節(jié)血糖代謝和體內(nèi)平衡(達到血糖的控制)，和治療 或預(yù)防與葡萄糖代謝和體內(nèi)平衡改變或受損相關(guān)的疾病和病癥，如糖尿 病、高血糖癥等的有效方法。發(fā)明概述本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)葡萄糖代謝和實現(xiàn)葡萄糖體內(nèi)平衡的方法和化合物。 也提供使受試者降低血糖水平、降低胰島素耐受、降低糖化血紅素水平和 改善血糖控制的方法。提供治療或預(yù)防糖尿病、高血糖癥和其它血糖水平升高相關(guān)疾病的方法，例如治療10或預(yù)防糖尿病相關(guān)疾病，如成為糖尿 病危險因素，或與糖尿病同時發(fā)生或糖尿病所導(dǎo)致的疾病的方法。在各種實施方案中，所述受試者是細胞、組織或器官。在其它實施方 案中，所述受試者是動物，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選人。當受試者是細胞 時，本發(fā)明具體考慮該細胞可以是分離的細胞，原核或真核細胞。當受試 者是組織時，本發(fā)明具體考慮是巧內(nèi)源性組織和體外組織，如培養(yǎng)的組 織。在優(yōu)選的實施方案中，所述受試者是動物，具體是哺乳動物類動物， 包括大鼠、家兔、牛、羊、豬、小鼠、馬和靈長類動物。最優(yōu)選實施方案 中，所述受試者是人。
本發(fā)明提供調(diào)節(jié)葡萄糖代謝的方法。
一方面，本發(fā)明方法包括調(diào)節(jié)受試者的糖代謝，系通過穩(wěn)定受試者的HIFa調(diào)節(jié)其糖代謝。在各方面內(nèi)容 上，HIFa是HIFkx 、 HIF2a或HIF3a。在一優(yōu)選方面，穩(wěn)定HIFa包括 給予受試者有效量的抑制HIF羥化酶活性的化合物。穩(wěn)定HIFa可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已有和已知的方法來進行，可包括采 用能與HIFa相互反應(yīng)，或能修飾HIFa或與HIFa相互反應(yīng)的因子的任何 制劑，如以HIFa為底物的酶。在某些方面，本發(fā)明考慮提供結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的 HIFa變體，如穩(wěn)定的HIF突變蛋白25等，或編碼這種變體的多核苷酸。 在其它方面，本發(fā)明考慮要穩(wěn)定HIFa，包括給予能穩(wěn)定HIFa的任何制 劑。該制劑可包括多核苷酸，如反義序列；多肽；抗體；其它蛋白質(zhì)；碳 水化合物；脂肪；脂質(zhì)；和有機及無機物質(zhì)，如小分子等。在一優(yōu)選實施 方案中，本發(fā)明考慮，例如通過給予受試者能穩(wěn)定HIFa的任何制劑來穩(wěn) 定該受試者的HIFa，其中所述的制劑是能穩(wěn)定HIFa的化合物，如小分子 化合物。本發(fā)明還涉及調(diào)節(jié)受試者葡萄糖代謝的方法，該方法通過給予受試者 有效量的本發(fā)明化合物來調(diào)節(jié)該受試者的葡萄糖代謝。在一優(yōu)選方面，本 發(fā)明的化合物是能抑制HIF羥化酶活性的化合物。在最優(yōu)選的方面，本發(fā) 明的化合物是能抑制HIF脯氨酞羥化酶活性的化合物。在另-優(yōu)選方面， HIF羥化酶選自EGLN1 、 EGLN2禾Q EGLN3 。本發(fā)明還通過穩(wěn)定受試者的HIFa ，或給予受試者有效量的能調(diào)節(jié)該 受試者葡萄糖代謝過程的本發(fā)明化合物，提供調(diào)節(jié)受試者葡萄糖代謝過程 的方法。在各種實施方案中，所述葡萄糖代謝過程選自葡萄糖攝取、葡萄 糖轉(zhuǎn)運、葡萄糖儲存、葡萄糖加工、葡萄糖利用和葡萄糖合成等。在具體實施方案中，本發(fā)明的方法通過穩(wěn)定受試者的HIFa ，或通過 給予受試者有效量的能改變該受試者葡萄糖調(diào)節(jié)因子的表達的化合物，來 改變該受試者葡萄糖調(diào)節(jié)因子的表達。在一實施方案中，本發(fā)明提供的方法，通過穩(wěn)定受試者的HIFa ，或 通過給予受試者有效量的能增加該受試者葡萄糖調(diào)節(jié)因子的表達的化合 物，來增加該受試者葡萄糖調(diào)節(jié)因子的表達。在其它實施方案中，所述葡 萄糖調(diào)節(jié)因子選自PFK-P、 PFK-L 、烯醇化酶-1 、 GluT-l 、乳酸脫氫
酶、醛縮酶-1、己糖激酶-1 、 IGFBP-1和IGF。在一具體方面，葡萄糖調(diào)節(jié) 因子的增加是持續(xù)性增加。 一方面，該葡萄糖調(diào)節(jié)因子是一種糖酵解因 子。另一方面，該糖酵解因子選自PFK-P 、 PFK-L 、烯醇化酶-1 、乳 酸脫氫酶、醛縮酶-1和已糖激酶-1 。本發(fā)明提供實現(xiàn)受試者葡萄糖體內(nèi)平衡的方法。 一方面，本發(fā)明的方 法包括實現(xiàn)受試者葡萄糖體內(nèi)平衡，這是通過穩(wěn)定受試者的HIFa從而達 到該受試者的葡萄糖體內(nèi)平衡。另一方面，本發(fā)明的方法包括實現(xiàn)受試者 葡萄糖體內(nèi)平衡，這是通過給予受試者有效量的本發(fā)明化合物從而達到該 受試者的葡萄糖體內(nèi)平衡。本發(fā)明提供降低受試者血糖水平的方法。 一方面，本發(fā)明的方法包括 降低受試者的血糖水平，這是通過穩(wěn)定受試者的HIFot從而降低該受試者 的血糖體水平。另一方面，本發(fā)明的方法包括降低受試者的糖化血紅素水 平，這是通過給予受試者有效量的本發(fā)明化合物從而降低該受試者的糖化 血紅素水平。本文涉及治療或預(yù)防具有發(fā)生糖尿病或具有發(fā)生糖尿病危險受試者的 糖尿病的方法。 一實施方案中，該方法包括治療或預(yù)防具有發(fā)生糖尿病或 具有發(fā)生糖尿病危險受試者的糖尿病，這是通過穩(wěn)定該受試者的HIFa從 而預(yù)防或治療糖尿病。另一方面，本發(fā)明的方法包括治療或預(yù)防受試者的 糖尿病，這是通過給予受試者有效量的本發(fā)明化合物從而治療或預(yù)防該受 試者的糖尿病。本發(fā)明還提供治療或預(yù)防受試者的血糖水平升高相關(guān)疾病的方法。一 實施方案，該方法包括治療或預(yù)防受試者的血糖水平升高相關(guān)疾病，這是 通過穩(wěn)定該受試者的HIFa從而預(yù)防或治療血糖水平升高相關(guān)疾病。另一 方面，本發(fā)明的方法包括治療或預(yù)防受試者的血糖水平升高相關(guān)疾病，這 是通過給予受試者有效量的本發(fā)明化合物從而治療或預(yù)防該受試者的血糖 增高相關(guān)疾病。在各種實施方案中，所述疾病選自糖尿病、高血糖癥、 肥胖、糖耐受受損、高血壓、視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變、腎病、高脂血癥和 血管疾病。本發(fā)明還涉及治療或預(yù)防受試者糖尿病相關(guān)疾病的方法。 一實施方案 中，該方法包括治療或預(yù)防糖尿病相關(guān)疾病，這是通過穩(wěn)定該受試者的HIFa從而預(yù)防或治療其糖尿病相關(guān)疾病。另一方面，本發(fā)明的方法包括 治療或預(yù)防受試者的糖尿病相關(guān)疾病，這是通過給予受試者有效量的本發(fā) 明化合物從而治療或預(yù)防該受試者的糖尿病相關(guān)疾病。在各種實施方案中，所述疾病選自高血壓、肥胖、高血糖癥、葡萄糖耐受受損、高脂血癥、'腎病、神經(jīng)病變、視網(wǎng)膜病變、動脈粥樣硬化癥和血管疾病。 一實 施方案中，所述受試者是患糖尿病的受試者。另一實施方案中，所述受試 者是具有患糖尿病危險的受試者。本發(fā)明提供降低受試者血液甘油三脂水平的方法。 一方面，本發(fā)明的方法可降低受試者的血液甘油三脂水平，這是通過穩(wěn)定該受試者的HIFa 從而降低該受試者的血液甘油三脂水平。另一方面，本發(fā)明的方法可降低 受試者的血液甘油三脂水平，這是通過給予該受試者有效量的本發(fā)明化合 物從而降低該受試者的血液甘油三脂水平。本發(fā)明提供降低受試者胰島素耐受的方法。 一方面，本發(fā)明的方法可 降低受試者的胰島素耐受，這是通過穩(wěn)定該受試者的HIFa從而降低該受 試者的胰島素耐受。另一方面，本發(fā)明的方法可降低受試者的胰島素耐 受，這是通過給予該受試者有效量的本發(fā)明化合物從而降低該受試者的胰 島素耐受。本發(fā)明提供提高受試者血糖控制能力的方法。 一方面，本發(fā)明的方法 可利市受試者的血糖控制，這是通過穩(wěn)定該受試者的HIFa從而提高該受 試者的血糖控制。另一方面，本發(fā)明的方法可提高受試者的血糖控制，這 是通過給予該受試者有效量的本發(fā)明化合物從而提高該受試者的血糖控 制。還有一方面，所述受試者是患有高血糖癥的受試者。在各種實施方案中，本發(fā)明提供含有本發(fā)明化合物的配方或藥物或藥物組合物，以及制造和使用這些配方或藥物或藥物組合物的方法。 附圖簡述

圖1A和1B顯示用本發(fā)明化合物處理細胞中誘生的的醛縮酶和葡萄 糖轉(zhuǎn)運蛋白-l(GluT-l )。圖2A 、 2B和2C顯示用本發(fā)明化合物處理動物中分別參與腎、肝和 肺中葡萄糖調(diào)節(jié)的基因的表達。 圖3A和3B顯示用本發(fā)明化合物處理動物的腎和肝中分別編碼GluT-l和IGFBP-1的基因的劑量和溫度反應(yīng)。圖4顯示用本發(fā)明化合物處理的動物中血糖水平的降低。圖5A和5B顯示用本發(fā)明化合物治療后，飲食誘導(dǎo)2型糖尿病動物模型中糖耐受的提高。圖6顯示用本發(fā)明化合物治療的db/db小鼠中血紅素糖化的降低。 圖7A和7B顯示用本發(fā)明化合物治療動物的體重和心臟重量的變化。圖8顯示用本發(fā)明化合物治療動物中內(nèi)臟脂肪的減少。圖9A 、 9B和9C顯示用本發(fā)明化合物治療后，飲食誘導(dǎo)肥胖動物模型中體重增巧重和腹部脂肪墊重量均得以減少。圖10A和10B顯示用本發(fā)明化合物治療后，編碼了可誘導(dǎo)的-氧化氮合酶(iNos)和腎上腺髓質(zhì)素基因的表達。圖11顯示用本發(fā)明化合物治療動物中的血液甘油三脂水平。圖12A和12B顯示用本發(fā)明化合物處理細胞中HIF-IQ的穩(wěn)定性。發(fā)明的描述在描述本發(fā)明的組合物和方法之前，須理解本發(fā)明不限于所述的具體 方法學(xué)、程序、細胞系、試驗和試劑，因為它們是可以改變的。也應(yīng)理解 本文所用的術(shù)語目的是描述本發(fā)明的具體實施方案，不意味著限制本發(fā)明 的范圍，本發(fā)明的范圍由附屬的權(quán)利要求書所限定。必須指出，如本文和權(quán)利要求書中所用，單數(shù)形式的"一個"、"一種" 和"這個"包括復(fù)數(shù)參比物，除非文中另有說明。因此，如本文所述和本領(lǐng) 域技術(shù)人員所知，例如參比某"片段"包括多個這類片段；參比某"化合物" 指參比一個或多個化合物和其等價物。除非另有說明，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域 任何普通技術(shù)人員所共同理解的相同含義。雖然類似于或等價于本文所述 的任何方法和材料可用于實施或測試本發(fā)明，但現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法、裝 置和材料。本文所引用的所有出版物其內(nèi)容納入本文作參考，目的是描述 和公開這些出版物中報導(dǎo)的可能與本發(fā)明有關(guān)的方法學(xué)、試劑和工具。本 文中沒有任何東西構(gòu)成允許本發(fā)明有權(quán)憑借先前發(fā)明公開的內(nèi)容倒填日 期。除非另有說明，實施本發(fā)明可采用屬于本領(lǐng)域技術(shù)的化學(xué)、生物化 學(xué)、分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)和藥理學(xué)的常規(guī)方法。這些技術(shù)在文獻中有全面解釋。見例如Gennaro ， A . R主編的雷明頓藥物科 學(xué)(Remington 's Pharmaceutical sciences )， 第 18 版，1990 ， Mack Publishing co . ; Harman ， J . G ， Limird ， L . E禾卩Gilman , A . G .編，治療的 藥理學(xué)基礎(chǔ)(The Pharmacological Basis of Therapeutics )，第10版，2001 ; McGraw-Hill Co ; Colowick ， S等編，Methods in Enzymology， Academic Press ， Inc . ; Weir , D . M禾卩Blacwell , C .C編的實驗免疫學(xué)手冊 (Handbook of Experimental Immunology )， 第I-IV巻，1986 ， Blackwell Scientific Publications ; Maniatis ， T等編的分子克隆實驗手冊(Molecular cloning : A Laboratory Manual )， 第二版，I-III巻，1989 ， Cold Spring Harbor Laboratory Press ; Ansubel ， F . M等編，分子生物學(xué)技術(shù)詳細實 驗室過程(Molecular Biology Techniques : An Intensive Laboratory Course ): 1998, Academic Press; Newton ，C.R.，禾卩Graham ， A .編，生物技術(shù)系 歹lj介紹 (Introduction to Biotechniques series )， 第二版，1997 ， SpringerVerlag 。 定義術(shù)語"葡萄糖調(diào)節(jié)"或"葡萄糖代謝的調(diào)節(jié)"本文用于指細胞、組織、器 官、器官系統(tǒng)或整個生物體通過改變例如葡萄糖代謝特異性加工的增加或 減少，來維持葡萄糖的體內(nèi)平衡的過程。葡萄糖代謝或葡萄糖代謝過程包 括涉及葡萄糖合成、加工、轉(zhuǎn)運、攝取、利用或儲存的過程，和包括葡萄 糖異生和糖酵解。葡萄糖代謝和調(diào)節(jié)的具體方面包括能促進葡萄糖穿過細 胞膜及細胞保留或分泌葡萄糖的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白或酶的表達；參與葡萄糖 利用和形成的酶，如糖酵解酶和葡萄糖異生酶，的表達和/或活性的改 變；以及體內(nèi)或培養(yǎng)基，包括例如間質(zhì)中(即細胞外)和細胞內(nèi)液、血液、 尿液等中葡萄糖分布的改變。術(shù)語"葡萄糖的體內(nèi)平衡"指維持、恢復(fù)或達到正常或接近正常的血糖 水平。血糖的控制也可稱為某機體內(nèi)糖化血紅素水平的正?；?br> 術(shù)語"代謝性疾病"和"代謝性失調(diào)"可互換使用，指與葡萄糖調(diào)節(jié)或血 糖控制受損或改變相關(guān)或惡化相關(guān)的(例如胰島素耐受性)任何疾病。這 類疾病包括但不限于糖尿病、高血糖癥、肥胖等。術(shù)語"高血糖癥"本文用于一般指高于正常的血液葡萄糖水平。高血糖 癥可通過該領(lǐng)域技術(shù)人員已接受和所用的任何方法測定。目前人的正常血糖水平認為在約70-120mg/dl之間，但取決于禁食狀態(tài)而不同。餐前血糖 范圍可在約80-120mg/dl ，而餐后二小時血糖可在約I80mg/dl或更低。此 外，禁食的個體正常血糖低于約110mg/dl。血糖水平約126mg/dl或更高 者通過認為是高血糖癥，血糖高于約200mg/dl者一般視為糖尿病。術(shù)語"肥胖"指體內(nèi)脂肪過多。肥胖可通過該領(lǐng)域技術(shù)人員己接受和所 用的任何方法測定。目前己接受的肥胖衡量方法是體重指數(shù)(BMI)，為 體重的公斤數(shù)與身高的公尺數(shù)平方相比的測量值。通常20歲以上成人的 BMI在18.5-24.9之間認為正常；10 BMI在25.0-29.9之間認為過重； BMI超過30.0認為是肥胖，BMI在40或超過40認為是病態(tài)肥胖(見例 如Gallagher等(2000 ) Am J ClinNurt 72 : 694-701 )。這些BMI范圍依 據(jù)體重對疾病危險性的增加作用而定。與過重和肥胖有關(guān)的一些常見疾病 包括心血管疾病、高血壓、骨關(guān)節(jié)炎、癌癥和糖尿病。雖然BMI與機體 脂肪有關(guān)，但BMI與確切的機體脂肪之間的關(guān)系隨年齡和性別而不同。 例如具有相同BMI的女性機體巧脂肪百分率可能比男性更高。肥胖的另一種衡量方法是機體脂肪百分率.現(xiàn)有的各種間接衡量楊體 脂肪的方法包括皮膚折皺測定、水密度測定、生物電阻分析(BIA )、 雙能量X-線吸收測定、機體總鉀測定和體內(nèi)氮活化測定。水密度測定，或 水(中)靜態(tài)測定(HW)通過測定受試者在水中和空氣中重量之間的差異 來測定機體總體積。類似的，空氣置換體積描記圖(AP)通過測定將受試 者放在-空氣體積固定的室中時引起的室體積減少，來測定機體總體積。 然后用經(jīng)過驗證的預(yù)測公式計算出機體總密度和組成。BIA以小電流通過 二電極間引起的電壓下降來估計電阻或電流阻抗。機體水和電解質(zhì)組成的 -種指標，電阻的水平，可用于從開發(fā)的回歸公式估計瘦肉組織含量和機 體的水體積。假設(shè)痩肉組織的含水組分時，可用其它的回歸公式估計機體 瘦肉量和脂肪量。女性體脂的百分率通常約17-27% ，雖然高達31%認為
也可接受。男性體脂百分率-般應(yīng)為了0-20% ，雖然高達25%認為也可接受。術(shù)語"HIFa"指缺氧可誘導(dǎo)因子蛋白的a亞基。HIFa可以是人或其它哺 乳動物蛋白質(zhì)，或其片段，包括人HIF-la( Genbank登錄號 No .Q16665 ) 、 HIF-2a(Genbank登錄號No . AAB41495 )和HIF-3a (Genbank登錄號No . AAD22668 ):小鼠HIF-la(Genbank登錄號No . Q61221 ) 、 HIF-2a ( Genbank登錄號No . BAA20130和AAB41496 )和 HIF-3a( Genbank登錄號No , AAC72734 );大鼠HIF-kx (Genbank登錄號 No.CAA70701 ) 、 HIF -2a( Genbank登錄號No . CAB96612 )和 HIF-3a( Genbank登錄號No .CAB96611 );和牛HIF-la( Genbank登錄號 No.BAA78675 )。 HIFa也可以是任何非哺乳動物蛋白質(zhì)或其片段，包括 非洲爪蟾laevis的HIF-la( Genbank登錄號No . CAB96628 )、黑腹果蠅 HIF-la ( Genbank登錄號No . JC4851 )和雞HIF-la (Genbank 5登錄號 No BAA34234 ) 。 HIFa的基因序列也可用常規(guī)克隆技術(shù)獲得，例如用上 述HIFa基因序列的全部或一部分作為探針來發(fā)現(xiàn)其它物種中的HIFa基因序列。HIFa的片段包含人HIF-la的氨基酸401-603區(qū)域(Huang等，同 上)、氨基酸531 -575區(qū)域(Jiang等，J Bio Chem . 272 : 19253-260 ， 1997 )、氨基酸556-575區(qū)域(Tanimoto等，同上)、氨基酸557-571區(qū) 域(Srinivas等，Biochem Biophys Res 10 Commun . 260 : 557-561 , 1999 )、氨基酸556 -575區(qū)域(Ivan和Kaelin , Science . 292 : 464-468 , 2001 )。另外，HIFa片段包括含有至少一個LXXLAP基序的任何片段， 如見于HIFa天然序列中的L397TLLAP和L別EMLAP。此外，HIFa的片段 包括保留了 HIFa的至少一種特征性功能和結(jié)構(gòu)的任何片段。例如，用于 實施例14篩選試驗的HIF膚可含有DLDLEMLAPYIPMDDDFQL (SEQ ID No : 5 )。術(shù)語"HIF羥化酶"指能羥化HIFa蛋白質(zhì)，特別是HIFa亞基中的氨基酸殘基的任何酶。所述殘基優(yōu)選脯氨酸和域天冬酞胺殘基。術(shù)語"HIF天冬酞胺基羥化酶"指能羥化HIF蛋白中任何天冬酞胺殘基的任何酶，優(yōu)選被HIF天冬酞基羥化酶羥化的天冬酞胺殘基包括例如 HIF-loi的N803殘基或其它HIFa同工型中的同源性天冬酞胺殘。HIF天 冬酞胺基羥化酶包括抑制HIF因子20(FIH )、負責(zé)調(diào)節(jié)HIFa反式激活 的HIF天冬酞基羥化酶(Genbank登錄號NoAA127308 ; Mahon等.Gene Dev . 15 : 2675 -2686 ， 2001 ; Lando等.Science295 : 858 -861 , 2002 ;和 Lando等.Gene Dev 16 : 1446 -1471 ， 2002 。也參見Elkins等.J Bio Chem C200644200 ， 2002 )。術(shù)語"HIF脯氨酞羥化酶"和"HIF PH "指能羥化HIF蛋白中脯氨酸殘 基的任何25酶。優(yōu)選被HIFPH羥化的脯氨酸殘基包括基序LXXLAP中 的脯氨酸，如人HIF-la天然序列中L397TLLAP和L559EMLAP的脯氨酸。 HIF PH包括Taylor ( Gene 275 : 125 -132 , 2001 )所述的禾口 Aravind及 Koonin ( Genome BiolZ : REsEARCH0007 ， 2001 ) 、 Epstein等(Cell. 107 : 43 -54 ，2001 )和Bmick及McKnight ( Science 294 : 1337 -1340 , 2001 ) 所特征鑒定的Egl-Nine(EGLN)基因家族成員。HIF PH酶的例子包括人 SM-20 ( EGLN1 ) ( Genbank登錄號No . AAG33965 ; Dupuy等。Genomics 69 : 348-54 , 2000 ) , EGLN2同工型l( Genbank登錄號No . CAC42510 ; Taylor ，同上)，EGLN1 ( Genbank登錄號No—060025 )和EGLN3 (Genbank登錄號No,CAC42515 ; Taylor ，同上)；小鼠EGLN1H (Genbank登錄號No . CAC42511) 、 EGLN2 ( Genbank登錄號No . CAC42511 )和EGLN3(SM-20)( Genbank登錄號No . CAC42517 )和大 鼠SM-20 (Genbank登錄號No . AAA19321 )。此外，HIF PH可包括秀麗 隱桿線蟲(Caenorhabditis elegan ) EGL-9 (Genbank ，登錄號No , AAD56365 )和黑腹果蠅(Drosophila melanogaster ) CG1114基因產(chǎn)物 (Genbank登錄號No . AAF52050 ) 。 HIF PH也包括上述全長蛋白質(zhì)的 任何活性片段。本文所用的"樣品"可產(chǎn)生自任何來源，例如體液、分沁物、組織、細 胞或培養(yǎng)的細胞，包括但不限于唾液、血液、尿液、血清、血漿、玻璃 體液、滑膜液、腦脊液、羊水和器官組織(如活檢組織)；從細胞分離的 染色體、細胞器或其它膜；基因組DNA 、 cDNA 、 RNA 、 mRNA等； 和清除的細胞或組織，或這類細胞或組織的印染物或印制品。樣品可產(chǎn)生 自任何來源，如人體功非人哺乳動物受試者。也考慮樣品來自任何患病動
物模型。樣品可以是液體或可以固定或結(jié)合于一基質(zhì)。樣品可以是適合于 測定與代謝調(diào)節(jié)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)存在與否，或測定脂肪和葡萄糖水 平的任何物質(zhì)。獲得這類樣品的方法是該領(lǐng)域技術(shù)水平之內(nèi)的事。"受試者"如本文所用可包括分離的原核或真核細胞，或培養(yǎng)的組織。 優(yōu)選項所述受試者包括動物、特別是哺乳動物，其包括大鼠、家兔、牛、 羊、豬、馬和靈長動物，特別是人。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供治療或預(yù)防糖尿病、高血糖癥和與葡萄糖代謝和/或體內(nèi) 穩(wěn)定改變或受損相關(guān)的其它疾病的方法和化合物。也提供用于治療、預(yù)防 和延緩與糖尿病和與葡萄糖代謝和/或體內(nèi)穩(wěn)定改變或受損相關(guān)的其它疾 病的發(fā)生和/或發(fā)展的方法和化合物，因為這些方法和化合物或調(diào)節(jié)葡萄 糖代謝和實現(xiàn)葡萄糖的體內(nèi)穩(wěn)定。本發(fā)明涉及到以下發(fā)現(xiàn)，即穩(wěn)定缺氧可誘導(dǎo)因子的a亞基(HIFcO可 導(dǎo)致降低血糖水平。本發(fā)明還涉及以下發(fā)現(xiàn)，即穩(wěn)定HIFa可調(diào)節(jié)葡萄糖 代謝。此外，本發(fā)明還涉及以下發(fā)現(xiàn)，即本發(fā)明的化合物可用來降低血糖 水平、調(diào)節(jié)葡萄糖代謝和實現(xiàn)葡萄糖體內(nèi)平衡。缺氧可誘導(dǎo)因子(HIF)是一種參與多和生物途徑活動的生理因子。 HIFa在正常的氧環(huán)境下降解。在缺氧或低氧條件下，HIFa穩(wěn)定而發(fā)揮一 些下游作用。最近確定羥化fflFa亞基中的特定殘基可使HIFa定向降解， 從而防止了在正常氧環(huán)境下形成穩(wěn)定的HIF復(fù)合物，確定了這種羥化是由 于某些HIF羥化酶活化所致(見例如Ivan和Kaelin . science 292 : 464-468 , 2001 : Jaakkola等，science 292 : 468 -472 ,2001 ; Epstein等，，cell 107 : 43 -54 , 2001 ; Bmick和McKnight Sciene 294 : 1337 -1340 , 2001 )。這些 HIF羥化酶屬于2-酮戊二酸雙加氧酶家族。這些酶是氧依賴性的，在低氧 或缺氧條，件下，HIFa殘基的羥化受到抑制。已描述了可治療性穩(wěn)定 HIFa和通過抑制HIFa羥化來穩(wěn)定HIFa (見國際出版物W003 / 0 49686 ，其內(nèi)容納入本文作參考)。方法 一方面，本發(fā)明提供了通過穩(wěn)定受試者的缺氧可誘導(dǎo)因子的a亞基 (HIFa)來降低血糖水平或調(diào)節(jié)葡萄糖代謝的方法。另一方面，該方法通 過抑制受試者的HIFa羥化來降低血糖水平或調(diào)節(jié)葡萄糖代謝。在-優(yōu)選項 方面，本發(fā)明的方法包括通過抑制受試者的HIF羥化酶活性來降低血糖水 平或調(diào)節(jié)葡萄糖代謝的方法。在最優(yōu)選項方面，該方法包括通過抑制HIF 脯氨酸羥化酶的活性來降低血糖水平或調(diào)節(jié)葡萄糖代謝。穩(wěn)定HIFa可用該領(lǐng)域技術(shù)人員已有的和知道的方法之-實施，可能包 括采用能巧與HIFa相互反應(yīng)或結(jié)合或修飾HIFa的任何制劑，或能與 HIFa相互反應(yīng)的因子，包括例如，以HIFa作為底物的酶。在某些方面， 本發(fā)明提供結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的HIFa變體，如穩(wěn)定的HIF突變蛋白等，或編碼某 變體的多核苷酸(見例如美國專利No . 6,562,799禾B 6,124,131和 6,432,927)。在其它方面，本發(fā)明考慮穩(wěn)定HIFa包括給予能穩(wěn)定HIFa的 制劑。該制劑可由多核苷酸組成，如反義序列(見國際出版物WO2003 /0 45440 );多肽；抗體；其它蛋白質(zhì)；碳水化合物；脂肪；脂質(zhì)；和有機 及無機物質(zhì)，如小分子等。在一優(yōu)選項實施方案中，本發(fā)明通過給予受試 者能穩(wěn)定HIFa的制劑來穩(wěn)定HIFa，其中所述制劑是一種化合物，例如能 穩(wěn)定HIFa的小分子化合物等。在其它實施方案中，本發(fā)明的方法包括通過抑制至少一種選自2-酮戊 二酸雙加氧酶家族的酶活性來穩(wěn)定HIFa。在一優(yōu)選項實施方案中，所述 酶是HIF羥化酶，如EGLN-1 、 EGLN-2 、 EGLN-3 (見Taylor . Gene 275 : 125 -132 , 2001 ; Epstein等，Cell 107 : 43-54 ，2001 ; Bruick禾卩McKnight Sciene 294 : 1337 -1340 , 2001 )。然而特別考慮所述酶選自2 -酮戊二酸雙 加氧酶家族的酶，包括例如原膠元賴氨酰羥化酶、原膠元脯氨酰3-羥化 酶、原膠元脯氨酰4-羥化酶a(I)和a(II)、胸腺嘧啶7-羥化酶、天冬酰胺卩-羥化酶、s-N-三甲基賴氨酸羥化酶和Y-丁酸甜菜堿羥化酶等。(見例如 Majamaa等。Biochem J . 229 : 127-133 , 1985 ; Myllyharju和Kivirikko . EMBO J . 16 : 1173 -1150 ， 1997 ; Thornburg等.32 : 14023 -14033 , 1993和 Jia等.Proc Natl Acad Sci USA 91 : 7227 -7231 ， 1 994 )。在某些實施方案中，所述方法包括通過抑制HIFa的某些殘基，如脯 氨酰殘基、天冬氨酰殘基等的羥化來降低血糖水平或調(diào)節(jié)葡萄糖代謝。在
一優(yōu)選實施方案中，所述殘基是脯氨酸殘基。在具體實施方案中，所述殘基是HIF-la中的Ps64殘基或其它HIFa同工型中的同源脯氨酸，或HIF-la 中的P4Q2殘基或其它HIFa同工型中的同源脯氨酸等。在其它實施方案中， 本發(fā)明方法可包括抑制HIFa的天冬酰胺殘基，如HIF-la的N柳殘基或其 它HIFa同工型中的同源天冬酞胺殘基的羥化。 化合物一方面，本發(fā)明提供了通過給予受試者本發(fā)明的化合物來降低血糖水 平或調(diào)節(jié)葡萄糖代謝的方法。本發(fā)明的化合物可以是能抑制或調(diào)節(jié)2-酮戊 二酸雙加氧酶活性的任何化合物。2-酮戊二酸雙加氧酶包括但不限于羥化酶?？闪u化靶底物殘基的羥化酶包括例如脯氨酰、賴氨酰、天冬氨酰(天冬酰胺)羥化酶等。羥化酶有時可通過底物來描述，如HIF羥化酶、 原膠元羥化酶等；和/或通過底物中的耙殘基來描述，如脯氨酰羥化酶、 賴氨酰羥化酶等或通過二者來描述，如HIF脯氨酰羥化酶、原膠元脯氨 酰羥化酶等。代表性的2-酮戊二酸雙加氧酶包括但不限于HIF羥化酶，包 括HIF脯氨酰羥化酶，如EGLNI 、 EGLN2和EGLN3、 HIF天冬酰胺羥 化酶，如HIF抑制因子(FIH)等；原膠元羥化酶如原膠元賴氨酰羥化酶、 原膠元脯氨酰羥化酶如原膠元脯氨酰3-羥化酶、原膠元脯氨酰4-羥化酶a(1) 和a(II)等；胸腺嘧啶7-羥化酶；天冬酰胺卩-羥化酶；s-三甲基賴氨酸羥化 酶；Y-丁酸甜菜堿羥化酶等。雖然酶活性20可包括與任何2-酮戊二酸雙 加氧酶相關(guān)的活性，但特別考慮能羥化底物中的氨基酸殘基。雖然特別包 括羥化底物中的脯氨酸和/或天冬氨酸殘基，但也考慮羥化其它氨基酸。在某些實施方案中，本發(fā)明的化合物是能抑制羥化酶活性的化合物。 在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的化合物是能抑制HIF羥化酶的化合物。在不 同實施方案中，所述活性是由于HIF脯氨酰羥化酶，例如EGLN1、 EGLN2或EGLN3等所致。在其它實施方案中，所述活性是由于HIF天冬 酰胺羥化酶，例如但限于FIH所致。一方面，顯示對一種或多種2-酮戊二酸雙加氧酶有抑制活性的本發(fā)明 化合物，也可能顯示對一種或多種其它2-酮戊二酸雙加氧酶有抑制活性， 如能抑制HIF羥化酶活性的某化合物也可能抑制膠元脯氨酰羥化酶；能抑 制HIF脯氨酰羥化酶的某化合物也可能抑制HIF天冬酰胺羥化酶的活性。 一方面，本發(fā)明提供了通過給予受試者本發(fā)明的化合物來降低血糖水平或調(diào)節(jié)葡萄糖代謝的方法。本發(fā)明的化合物是能抑制HIF羥化酶活性的 小分子化合物。本發(fā)明的優(yōu)選化合物是能抑制HIF脯氨酰羥化酶活性的化 合物?？芍苯踊蜷g接抑制，可以是競爭性或非競爭性抑制等。特別提供本 發(fā)明的化合物和鑒定本發(fā)明其它化合物的方法。在正常情況下，葡萄糖是機體供應(yīng)外周組織的主要能源。腦和其它神 經(jīng)組織在正常情況下需要葡萄糖作為唯一的能源，即使在應(yīng)激狀態(tài)下，如 長期禁食時，需要大量的葡萄糖。肝臟是通過分解儲存的糖原或從前體物 質(zhì)如乳酸、丙酮酸、甘油和氨基酸合成來產(chǎn)生葡萄糖，調(diào)節(jié)血糖水平，防 止禁食時血糖水平下降的主要器官。維持葡萄糖的體內(nèi)穩(wěn)定，如葡萄糖的 內(nèi)部平衡，需要在肝臟有葡萄糖產(chǎn)生和外周葡萄糖的攝取及利用之間保持 平衡。血糖的體內(nèi)穩(wěn)定，葡萄糖內(nèi)部平衡的維持受到諸多生化因素的密切控 制和影響，包含各種生理過程。為達到葡萄糖的體內(nèi)平衡，機體從幾個水 平上調(diào)節(jié)葡萄糖，包括葡萄糖的攝取、轉(zhuǎn)運、儲存、加工、合成、利用等。因此葡萄糖的體內(nèi)平衡受諸多因素的影響，包括例如外在因素如生 理需要、食物攝入等；和內(nèi)在因素如胰島素、糖原的循環(huán)水平等。葡萄糖水平升高葡萄糖正常調(diào)節(jié)的破壞可導(dǎo)致血糖水平變化，即與正常血糖水平相比 升高或降低。例如，慢性血糖水平升高是高血糖癥、糖尿病等的特征，可 對機體的各種器官、組織和系統(tǒng)產(chǎn)生多種不良作用。糖尿病、高血糖癥或 血糖水平升高與許多疾病和病癥相關(guān)，包括動脈粥樣硬化加速、慢性心臟 病增加、心肌梗塞、中風(fēng)、微血管病變、血管損傷、導(dǎo)致手臂和腿部循環(huán) 減少的外周血管疾病、大血管拼發(fā)癥、眼科疾病如糖尿病性視網(wǎng)膜病妾、黃斑退變、白內(nèi)障等；腎病包括糖尿病性腎病、腎損傷等；神經(jīng)損傷和其 它神經(jīng)病變包括糖尿病神經(jīng)病變、外周神經(jīng)病變、自主性神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)的 損傷等、高胰島素血癥、高脂血癥、胰島素耐受、葡萄糖代謝損傷、葡萄 糖耐受損傷、皮膚和結(jié)締組織疾病、足部創(chuàng)傷和潰瘍、糖尿病酮酸中毒
可通過測定循環(huán)葡萄糖水平或測定血液/血漿葡萄糖水平來鑒定葡萄 糖調(diào)節(jié)的變化或受損，和是否存在或有發(fā)生糖尿病、高血糖癥等疾病的危 險。最常通過禁食時的血糖測定、隨機血糖測定或口服葡萄糖耐受試驗來 測定血糖水平。通過禁食時血糖試驗來測定血糖水平。在此種分析中，反映禁食狀態(tài) 時(即不吃水以外的食物或液體)血糖水平的測量數(shù)值通常保持在約70mg/dL-110mg/dL之間。如果禁食狀態(tài)時血糖水平升高超過此典型示 范，例如到126mg/dL水平或更高，可作出糖尿病診斷。在一實施方案 中，本發(fā)明提供能將禁食狀態(tài)時血糖水平保持在或達到正常禁食狀態(tài)時血 糖水平，艮卩70mg/dL-110mg/dL之間的化合物和方法。在另一實施方案 中，本發(fā)明提供能將禁食狀態(tài)時的低血糖水平(即低于正常禁食狀態(tài)時的 血糖水平)升高或恢復(fù)到70mg/dL-110mg/dL之間的化合物和方法。在另一 實施方案中，本發(fā)明提供能將禁食狀態(tài)時升高的血糖水平(即血糖水平高 于禁食狀態(tài)正常水平)降低(減少)或恢復(fù)到約126mg/dL以下，和約 70mg/dL，更優(yōu)選約120-7Omg/dL ，最優(yōu)選約U0-70mg/dL的化合物和方 法。另一種血糖水平的測定方法是隨機血糖試驗。以這種方式測定的血糖水平 通常顯示的值在低至中等100秒(mg/dL)。約180mg/dL或更高的隨機 血糖水平是高血糖癥，約180mg/dL或更高水平表明存在發(fā)生血糖調(diào)節(jié)受 損相關(guān)疾病如糖尿病的危險。因此， 一方面，本發(fā)明提供的方法和化合物 能使隨機血糖試驗測定的血糖水平維持或達到正常水平，即低至中等100 秒(mg/dL)。另一方面本發(fā)明的方法和化合物可用于使隨機血糖試驗測定 的降低到正常水平以下的血糖水平恢復(fù)達到正常水平，即低至中等100秒 (mg/dL)。還有一方面，本發(fā)明的方法和化合物可用于降低/減少高于正 常的，即高于低至中等100秒(mg/dL)的血糖水平。在各種方面，該方 法和化合物能將升高的血糖水平降低至約200-100 mg/dL水平面，更優(yōu)選 至180-100 mg/dL水平，最優(yōu)選至150-100 mg/dL水平。也可用口服葡萄糖耐受試驗來鑒定受試者是否患有或有患葡萄糖調(diào)節(jié) 損傷、高血糖癥、糖尿病的危險。在此試驗中，讓個體喝-杯糖水液禁食 過夜，幾小時后測定血糖水平。具有正常葡萄糖耐受/調(diào)節(jié)的人，如無糖 尿病等者，在喝下糖水后測定的血糖水平升高然后迅速下降。喝糖水后二小時讀取的正常血糖水平低于約140 mg/dL，在0時和2小時之間讀取的所 有值都低于200 mg/dL。如果在口服葡萄糖耐受試驗中測定的血糖水平在 約140-199 mg/dL范圍內(nèi)， 一般診斷為葡萄糖耐受受損。如果測定的血糖 水平約為20Omg/dL或更高， 一般診斷為糖尿病。本發(fā)明的方法和化合物 可用于在口服葡萄糖耐受試驗后保持、恢復(fù)或達到正常血糖水平。 葡萄糖調(diào)節(jié)因子的表達一實施方案中，本發(fā)明提供能提高產(chǎn)物參與細胞葡萄糖攝取和利用的 基因的表達的化合物和方法。這種基因包括但不限于葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白， 如葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GluT) -1和GluT-3;葡萄糖酵解酶如醛縮酶-A、烯醇 化酶-1、己糖激酶-1、已酮激酶-2、果糖磷酸激酶-L和果糖磷酸激酶-P。 葡萄糖轉(zhuǎn)運子及其利用的治療性上調(diào)將有效降低胰島素的耐受、降低血糖 水平，從而在代謝疾病病人，如2型糖尿病、高血糖癥、葡萄糖控制受 損、葡萄糖耐受受損等的病人中產(chǎn)生有利的作用。一方面，本發(fā)明提供治療或預(yù)防高血糖癥的化合物和方法。這種化合 物和方法適合治療或預(yù)防高血糖癥相關(guān)疾病，如由于葡萄糖釋放增加、葡 萄糖利用減少和/或葡萄糖攝取受損所致的血糖水平升高。這些疾病還與 胰島素耐受、葡萄糖耐受受損、2型糖尿病和/或肥胖相關(guān)。一方面，本發(fā)明的方法提供了活化能調(diào)節(jié)葡萄糖和葡萄糖代謝(包括 全身加工和利用)水平和活性的基因表達文庫的工具。該方法能補償機體 調(diào)節(jié)這種加工天然機制的缺陷(例如不能產(chǎn)生胰島素可對其反應(yīng))。本發(fā) 明提供的方法可治療與葡萄糖控制受損相關(guān)的代謝性疾病或病癥。這些疾 病包括但不限于葡萄糖耐受受損(IGT)或前糖尿病、糖尿病、高血糖癥 等。本發(fā)明特別考慮選擇性設(shè)計被特定器官攝入時可被激活的前藥化合 物。例如，由于肝臟能產(chǎn)生參與脂肪體內(nèi)平衡的許多蛋白質(zhì)，本發(fā)明考慮 在本發(fā)明的方法中選擇性地靶向肝臟。選擇性上調(diào)肝臟中的一些基因，如 醛縮酶基因，可采用能被肝特異性酶從無活性轉(zhuǎn)變成活性的化合物來實 現(xiàn)。例如，對某活性化合物起作用的羧酸可相應(yīng)的醇代替。肝中的醇脫氫 酶(ADH)活性可將這類化合物轉(zhuǎn)變成活性形式。因為其它器官缺少ADH
活性，該化合物只能在肝內(nèi)被選擇性激活。類似的，可使本發(fā)明方法中所 用的化合物靶向其它器官，如脂肪組織、腎、骨骼肌、心臟等。 胰島素胰島素是調(diào)節(jié)機體大多數(shù)細胞代謝平衡，刺激葡萄糖攝取的關(guān)鍵性激 素。當存在胰島素時，大多數(shù)細胞采用葡萄糖作為它們的代謝燃料，脂肪 細胞利用葡萄糖合成脂肪，肝細胞將葡萄糖轉(zhuǎn)變成糖原和脂肪。血胰島素 升高隨后立即血糖升高，幾種與葡萄糖攝取相關(guān)的活動刺激了胰島素分 泌。血糖水平隨后降低時，胰島素釋放迅速減少，葡萄糖進入神經(jīng)系統(tǒng)以 外的細胞受到抑制。不供應(yīng)葡萄糖時細胞利用糖原和脂肪作為代謝燃料。 肝臟和脂肪細胞開始分解儲存的糖原和脂肪。結(jié)果肝臟向血液提供葡萄糖 而不是從血液攝取葡萄糖，肝臟和脂肪組織都向血液提供脂肪酸。因此， 胰島素水平低時降低了胰島素敏感組織的葡萄糖攝取，促進了肝臟中的葡 糖異生和糖原分解(糖元破壞)，減少了糖原合成，并促進了儲存糖原和 脂肪的代謝。機體不能產(chǎn)生胰島素，或?qū)σ葝u素?zé)o反應(yīng)，例如對胰島素敏感性降 低，即胰島素耐受等可導(dǎo)致各種疾病，包括糖尿病和高血糖癥。葡萄糖轉(zhuǎn)運受損原因與胰島素耐受有關(guān)。本發(fā)明的方法可降低胰島素 耐受以恢復(fù)受損的葡萄糖轉(zhuǎn)運或提高葡萄糖轉(zhuǎn)運。本發(fā)明提供降低或減少胰島素耐受的方法。在某些方面，通過穩(wěn)定HIF(x來降低胰島素耐受。在 其它方面，提供了通過抑制HIFPH活性而降低胰島素耐受的方法。胰島素敏感性提高與胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-l(IGFBP-l)的高血漿 水平正相關(guān)。IGFBP-1血漿水平也與青少年的體重指數(shù)負相關(guān)(Travers 等，J Clin Endocrinol Metab . 83 : 1935 -1939 ， 1998 )。此外，低IGFBP-1 水平與2型糖尿病心血管危險增加相關(guān)(Gibson等.J Clin Endocrinol Metab 81 : 860-563 ，1996 )。因此，在恢復(fù)或維持胰島素敏感性，即治療 胰島素耐受中，需要提高IGFBP-1的水平。此外，影響果糖磷酸-l-激酶(PFK)的基因缺陷可導(dǎo)致胰島素耐受和2 型糖尿病。因為PFK是糖酵解級聯(lián)反應(yīng)中的速度限制性酶，糖酵解級聯(lián)反 應(yīng)中此酶活性的降低通常與胰島素耐受和2型糖尿病明顯相關(guān)。因此，提
高PFK和其它糖酵解因子，如醛縮酶、烯醇化酶、己糖激酶等的水平是恢 復(fù)或維持胰島素敏感性，如降低胰島素耐受所需要的。本發(fā)明的化合物顯示能提高IGFBP-1、 PFK和其它糖酵解酶的表達(見 實施例4 )。因此，在一實施方案中，本發(fā)明提供協(xié)同表達某些基因(其 產(chǎn)物如IGFBP-1、 PFK等，參與葡萄糖加工和利用)的方法和化合物。在 另一實施方案中，本發(fā)明通過協(xié)同表達式這類基因，提供能提高胰島素敏 感性，如降低胰島素耐受等的方法和化合物。 一方面，該方法包括例如穩(wěn) 定受試者的HIFa。本發(fā)明還通過給予受試者本發(fā)明的化合物，如能抑制 HIF羥化酶活性的制劑，來提供增加胰島素敏感性的方法。糖化血紅素糖尿病控制和供發(fā)癥試驗(DCCT)的結(jié)果證明血糖控制的改進減少了 供發(fā)癥，包括非增殖性和增殖性視網(wǎng)膜病變(降低47%)、微白蛋白血癥 (降低39%)、臨床腎病(降低54% )和神經(jīng)病變(降低60。/。)(DCCT 研究小組，NEnglJMed 329 :977 -986， 1993 )。此外，英國糖尿病預(yù)后 研究(UKPDs)證明血糖控制與微血管供發(fā)癥減少相關(guān)，嚴格的血壓控制 顯著減少了大血管和小血管講發(fā)癥(UKPDS小組，Lancet 352 : 837 -853 , 1998 )。糖化血紅素(也稱為糖血紅蛋白、糖基化血紅素、HbAlc或HbAl)可 通過使各種糖分子(最常用葡萄糖)結(jié)合血紅素分子而形成，其形成的速 率與血糖濃度成正比。糖化血紅素水平的測定提供了前2-3個月的平均血 糖濃度的精確指數(shù)。臨床上糖化血紅素水平提供了對糖尿病病人血糖控制 的評估手段。正常(非糖尿病)的糖化血紅素水平范圍是4-6%。在糖尿病 個體的研究中，DCCT發(fā)現(xiàn)與具有較高水平HbAlc的糖尿病個體相比，將 HbAlc水平降低或維持到7.2%可導(dǎo)致視網(wǎng)膜病變減少76%、神經(jīng)病變減 少60%、腎病減少50%、心血管疾病減少35%。本發(fā)明提供降低糖化血紅素水平的化合物和方法。 一實施方案中，采 用本發(fā)明方法和化合物來維持、恢復(fù)或使糖化血紅素水平達到約4 -6%。 在另-實施方案中，本發(fā)明的方法和化合物可降低糖化血紅素水平低于約9 %，更優(yōu)選低于約8%，最優(yōu)選低于約7%。糖尿病和肥胖 肥胖是一種危險因素，有時是糖尿病的一種惡性副作用。肥胖的特征 是脂肪積蓄過量，具體是內(nèi)臟或中樞脂肪水平過高。因此治療或預(yù)防肥胖 可最大程度減少發(fā)生糖尿病的危險，事實上對糖尿病病人或診斷有糖尿病 風(fēng)險的個體常開出減輕體重的處方。本發(fā)明的化合物在體內(nèi)研究中己顯示能防止或減慢體重的增加(見實 施例9和10)。因此， 一方面，本發(fā)明提供了通過減少或預(yù)防肥胖來治療或預(yù)防糖尿病的方法。 一方面，該方法包括例如穩(wěn)定受試者的HIFa。本 發(fā)明還提供了通過給予受試者本發(fā)巧明的化合物，如能抑制HIF羥化酶活 性的制劑，來治療或預(yù)防該受試者肥胖的方法。如上所述，糖尿病與多種 疾病和病癥相關(guān)。例如。心血管疾病(CVD)是2型糖尿病病人死亡的主 要原因。2型糖尿病病人比非糖尿病病人死于CVD高2-6倍。這些病人顯 著數(shù)量死于慢性心臟病(CHD)。高脂血癥在2型糖尿病病人中常見并引 起CHD。 2型糖尿病病人的常見脂質(zhì)分布為，與非糖尿病個體相比甘油三 脂較高而HDL膽固醇較低。類似的甘油三脂和HDL膽固醇異常見于肥胖 (特別是具有內(nèi)臟脂肪增加的個體)、高血壓和胰島素耐受(如代謝綜合 征)的非糖尿病個體。甘油三脂水平升高已表明是心血管疾病的-種危險因 素。升高的甘油三脂是代謝綜合征的-種重要成分。 糖尿病和高血壓高血壓，或血壓升高是糖尿病的-種危險因素。此外，高血壓及其相 關(guān)疾病的作用可伴隨產(chǎn)生糖尿病或?qū)е绿悄虿?。因此，治療或預(yù)防高血壓 可盡量減少糖尿病或發(fā)生糖尿病的危險，強調(diào)糖尿病這方面的治療方法應(yīng) 是有價值的。本發(fā)明提供這樣-種方法。具體說，本發(fā)明的方法和化合物可用于治 療糖尿病相關(guān)的高血壓。例如，本發(fā)明的化合物可提高血壓調(diào)節(jié)因子如腎 上腺髓質(zhì)激素和一氧化氮合成酶的表達(見料施例12 )。因此， 一方面， 本發(fā)明通過降低或預(yù)防高血壓，提供治療或預(yù)防糖尿病的方法。 一方面， 該方法包括例如穩(wěn)定受試者的HIFct。本發(fā)明還提供了通過給予受試者本 發(fā)明的化合物，如能抑制HIF羥化酶活性的制劑，來治療或預(yù)防該受試者 高血壓的方法。協(xié)同治療方法
糖尿病與多種有害的同時發(fā)生或發(fā)展、重疊的和/或相繼發(fā)生的疾病 相關(guān)。例如，高血壓、血管和循環(huán)損傷、肥胖可導(dǎo)致糖尿病發(fā)生發(fā)展危險 性的增加。因此，可同時降低這類危險因素和癥狀的治療方法是有價值 的。
本發(fā)明提供這類方法。具本說，本發(fā)明的方法和化合物可用于實現(xiàn)多 種效應(yīng)。例如如上所述，肥胖是糖尿病發(fā)生的一種危險因素。此外，肥胖 可因糖尿病，例如由于特殊的治療方法而發(fā)生。具體說，胰島素介導(dǎo)了脂 質(zhì)攝入脂肪組織，加重了肥胖，進而加重了胰島素耐受。本發(fā)明因此一方 面提供治療或預(yù)防肥胖和以協(xié)同方式提高胰島素敏感性，來治療或預(yù)防糖 尿病的方法。
本發(fā)明的化合物能降低血糖水平(見實施例6)、減少內(nèi)臟和腹部脂肪(見實施例9 )、提高糖化酶的表達從而提高胰島素敏感性(見實施例4) 和提高血壓調(diào)節(jié)因子的表達(見實施例12)，因而能調(diào)節(jié)機體的血管張力， 維持正常血壓水平或?qū)寡軓埩Φ淖兓?，如高血壓的作用等。因此一?面，本發(fā)明提供治療或預(yù)防糖尿病的方法，該方法包括穩(wěn)定受試者的 HIFct。來降低血糖水平面和減少內(nèi)臟脂肪。另一方法還包括提高胰島素敏 感性來治療或預(yù)防受試者的糖尿病。另一方法還包括提高血壓調(diào)節(jié)因子的 表達來治療或預(yù)防受試者的糖尿病。 代謝性疾病本發(fā)明提供能調(diào)節(jié)代謝活動的化合物，和利用該化合物治療代謝失調(diào)相關(guān)疾病或病癥的方法。這類疾病包括但不限于糖尿病、高血糖癥和肥 胖。
一方面，本發(fā)明提供利用所述化合物預(yù)防或治療糖尿病的方法，該方法包括給予需要的病人治療有效量的該化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，單 獨給予或與藥學(xué)上可接受的賦形劑一起給予。
一實施方案中，根據(jù)預(yù)測的情況，如葡萄糖體內(nèi)平衡受損、葡萄糖耐受受損、高血糖癥、糖尿病或肥 胖等情況給予該化合物。
另一方面，本發(fā)明提供利用該化合物治療高血糖癥的方法，該方法包 括給予需要的病人治療有效量的該化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，單獨給 予或與藥學(xué)上可接受的賦形劑一起給予。 一實施方案中，給予診斷為伴有 發(fā)生高血糖癥相關(guān)疾病如糖尿病的病人該化合物?？膳c各種其它治療方法聯(lián)合給予該化合物。 一實施方案中，該化合物 與外源性胰島素如合成的人胰島素聯(lián)用。葡萄糖調(diào)節(jié)本發(fā)明的方法和化合物能提高烯醇化酶的表達。這些結(jié)果表明本發(fā)明 的方法和化合物可用于調(diào)節(jié)參與糖酵解的基因的表達。也提供了通過提高 糖羚化調(diào)節(jié)葡萄糖代謝的方法和化合物。本發(fā)明提供提高GluT-l表達的方法和化合物。 一方面，本發(fā)明的方法 能調(diào)節(jié)參與葡萄糖攝取的因子的表達。本發(fā)明的方法和化合物提供了增加 葡萄糖轉(zhuǎn)運入細胞的治療方法。治療性上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運因子將有效降低胰 島素耐受，提高胰島素敏感性，降低血糖水平，從而對高血糖癥或糖尿病 病人產(chǎn)生有利作用。本發(fā)明的方法和化合物能提高腎、肝和肺中的葡萄糖調(diào)節(jié)因子，包括 磷酸果糖激酶-P、磷酸果糖激酶-L、醛縮酶-1、 GluT-l、乳酸脫氫酶、烯 醇化酶-l和已糖激酶-1的表達。 一實施方案中，本發(fā)明的方法可協(xié)同調(diào)節(jié) 其產(chǎn)物參與葡萄糖攝取和利用的基因的表達，從而可調(diào)節(jié)葡萄糖代謝。治 療性上調(diào)葡萄糖的轉(zhuǎn)運和利用將降低胰島素耐受，提高胰島素敏感性，降 低血糖水平，從而提供了治療高血糖癥或糖尿病的方法。利用本發(fā)明的方法和化合物可提高腎和肝中編碼胰島素樣生長因子結(jié) 合蛋白-l(IGFBP-l)基因的表達。IGFBP-1血漿高水平與胰島素敏感性提高 正相關(guān)。因此本發(fā)明的方法和化合物可用于提高胰島素敏感性和增加葡萄 糖轉(zhuǎn)運，從而調(diào)節(jié)葡萄糖代謝。治療性提高胰島素敏感性和葡萄糖轉(zhuǎn)運將 降低血糖水平，從而提供了治療高血糖癥或糖尿病的方法。本發(fā)明提供的方法和化合物能提高細胞的葡萄糖攝取。本發(fā)明的方法 和化合物在胰島素存在下可提高葡萄糖攝取，表明本發(fā)明的方法和化合物 可提高細胞的胰島素敏感性，導(dǎo)致葡萄糖攝取的增加和葡萄糖調(diào)節(jié)的改 變。治療性提高胰島素敏感性和葡萄糖攝取可用于治療患胰島素敏感性降 低或胰耐受的全體，從而提供了治療高血糖癥或糖尿病的方法。
本發(fā)明的方法和化合物也可用于提高胰島素激發(fā)的葡萄糖攝入組織。 本發(fā)明的方法和化合物可用于提高組織的葡萄糖攝入，提高其對胰島素的 敏感性。葡萄糖攝入增加對血糖水平升高的個體，如高血糖癥或糖尿病個 體，或?qū)崿F(xiàn)或維持葡萄糖體內(nèi)平衡有缺陷的個體，提供了降低其血糖水平 的方法。因此，本發(fā)明的方法和化合物可通過提高胰敏感性、提高葡萄糖 攝入和降低血糖水平來治療高血糖癥和糖尿病。用本發(fā)明的化合物治療動物顯示血糖水平呈劑量依賴性降低。通過改 變該化合物的劑量可將血糖水平保持在所需水平。因此一方面，本發(fā)明的 方法和化合物可用于調(diào)節(jié)血糖水平。另一方面，本發(fā)明的方法和化合物可 用于降低血糖水平。因此本發(fā)明的方法和化合物可用于治療性降低血糖水 平。通過降低血糖水平，本發(fā)明提供了治療高血糖癥和糖尿病的方法。給 予本發(fā)明的化合物改進了飲食誘導(dǎo)肥胖和葡萄糖耐受受損動物模型中的葡 萄糖從循環(huán)中的廓清。提高葡萄糖廓清降低了血糖水平。因此一方面，本 發(fā)明的方法通過提高葡萄糖廓清或降低血糖水平可用于調(diào)節(jié)葡萄糖耐受受 損個體的葡萄糖代謝。治療性提高葡萄糖廓清和降低血糖水平可用于治療 病人，包括糖尿病病人或有發(fā)生糖尿病危險的病人。糖尿病的治療本發(fā)明的方法和化合物能降低糖尿病動物模型的血糖水平。此外，本 發(fā)明的方法和化合物能恢復(fù)和實現(xiàn)糖尿病和葡萄糖耐受受損動物模型的葡 萄糖體內(nèi)平衡。糖化血紅素水平反映了糖尿病病人或高血糖癥個體中的血糖控制和葡萄糖體內(nèi)平衡的維持。降低糖化血紅素水平表明本發(fā)明的方法 和化合物可用于改變個體的葡萄糖調(diào)節(jié)，從而恢復(fù)、達到或維持葡萄糖體 內(nèi)平衡。因此，本發(fā)明的方法和化合物通過調(diào)節(jié)葡萄糖代謝，和恢復(fù)、達 到或維持葡萄糖體內(nèi)平衡，可用于治療高血糖癥和糖尿病。用本發(fā)明的化合物和方法治療動物降低了糖尿病動物模型中糖化血紅 素的積累。糖化血紅素水平反應(yīng)了糖尿病患者或高血糖癥患者對血糖水平 的控制和葡萄糖體內(nèi)平衡的維持。糖化血紅素的水平降低說明本發(fā)明的化 合物和方法可用于改變個體的葡萄糖調(diào)節(jié)，從而恢復(fù)、實現(xiàn)或維持葡萄糖 體內(nèi)平衡。因此，本發(fā)明的化合物可方法可通過調(diào)節(jié)葡萄糖代謝并恢復(fù)、 實現(xiàn)或維持葡萄糖體內(nèi)平衡來治療高血糖癥和肥胖。
用本發(fā)明化合物治療的動物顯示其體重增加呈劑量依賴性延緩。特別 地，用該化合物治療的動物觀察到內(nèi)臟脂肪墊呈劑量依賴性減少。因此， 本發(fā)明的方法和化合物可用于減少脂肪儲存和減少內(nèi)臟脂肪。肥胖，特別 是伴有內(nèi)臟、腹部或中樞脂肪過量的肥胖，與高血糖癥和糖尿病相關(guān)。具 體說，伴有胰島素敏感性降低、胰島素耐受提高等的肥胖將導(dǎo)致高血糖癥 和發(fā)生糖尿病。 一方面，本發(fā)明的方法和化合物通過減少內(nèi)臟的脂肪可減 少發(fā)生高血糖癥或糖尿病的危險。另一方面，本發(fā)明的方法和化合物通過 減少肥胖可降低發(fā)生高血糖癥或糖尿病的危險。藥物制劑和給藥途徑如該領(lǐng)域所熟知，本發(fā)明的組合物可直接輸送或放在含賦形劑的藥物 組合物中輸送。本發(fā)明的治療方法可包括給予患有代謝性疾病，具體是葡 萄糖調(diào)節(jié)相關(guān)疾病，如糖尿病、高血糖癥等，或有患這類疾病危險的受試 者，治療有效量的本發(fā)明化合物。在一優(yōu)選實施方案中，所述受試者是哺 乳動物，在最優(yōu)選的實施方案中，所述受試者是人?；衔锘蛩幬锏挠行Я?，如劑量，不難用常規(guī)實驗確定，可通過有效 有和常規(guī)的途徑和適當?shù)闹苿┙o藥。該領(lǐng)域己有各種制劑和藥物輸送系統(tǒng)(見Gonnaro主編，2000，雷明頓藥物科學(xué)(Remington's Pharmaceutical Sciences )，同上和Hardman ， Limbird與Gilman編的治療的藥理學(xué)基礎(chǔ) (The Pharmacological Basis of Therapetics),同上)。合適的給藥途徑可包括，例如口服、直腸、局部、鼻內(nèi)、肺內(nèi)、眼 內(nèi)、腸道內(nèi)和腸胃道外給藥。主要的腸胃道外給藥途徑包括靜脈內(nèi)、肌肉 內(nèi)和皮下給藥。第二種給藥途徑包括腹膜內(nèi)、動脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、心內(nèi)、腦 池內(nèi)、皮內(nèi)、病灶內(nèi)、眼內(nèi)、胸膜內(nèi)、氣管內(nèi)、尿道內(nèi)和心室內(nèi)給藥。應(yīng) 優(yōu)選要治療的指征與藥物的物理、化學(xué)和生物學(xué)性能，表明制劑類型和所 用的給藥途徑，以及是否局部或全身輸送。本發(fā)明化合物的藥物劑量形式可提供的有一次性釋放、控釋、緩釋或 靶向藥物輸送系統(tǒng)。常用的劑量形式包括例如，溶液、懸浮液、(小)乳 液、軟膏、凝膠和貼片、脂質(zhì)體、片劑、糖衣丸、軟或硬膠囊、錠劑、卵 狀小體(ovule)、植入物、無定形或結(jié)晶粉末、氣溶膠和凍干制劑。取決 于使用的給藥途徑，可能需要特殊裝置來施加或給予藥物，例如，注射器
和針頭、吸入器、泵、注射筆、施加器或?qū)Ｓ闷?。藥物劑量形式常包含?物、賦形劑和容器/密封系統(tǒng)。可在本發(fā)明的化合物中加入一種或多種稱 為無活性成分的賦形劑，以改善或有利于制造、穩(wěn)定性、藥物的給藥和安 全性，可提供一種實現(xiàn)藥物所需釋放方式的工具。因此，加入該藥物中的 賦形劑的類型取決于多種因素，例如藥物的理化性能、給藥途徑和制造方 法。藥學(xué)上可接受的賦形劑該領(lǐng)域己具有，包括各種藥典中所列出的那些(見USP、 JP、 EP禾卩BP、 FDAweb頁(www.fda.gov)，惰性成分指南 (Inactive Ingredient Guide) 1996 ， 和藥物添加劑手冊(Handbook ofPharmaceutical Additives),Ash 編；Synapse Information Resources Inc.2002)?？捎迷擃I(lǐng)域熟知的任何方法制備本發(fā)明化合物的藥物劑量形式，如常 規(guī)的混合法、過篩、溶解、融化、制粒、糖衣丸制備、制片、懸浮、擠 壓、噴霧干燥、研磨、乳化、(納米/微米)包裹、陷夾或凍干加工。如 上所述本發(fā)明的組合物可包含一種或多種生理上可接受的無活性成分，以 有利于將活性分子加工到具有藥物用途的制品中。適當?shù)闹苿┤Q于所需的給藥途徑。對于靜脈注射，例如，該組合物 可配制成水溶液，如果需要，可采用生理相容性緩沖劑，包括例如，磷 酸、組氨酸或檸檬酸來調(diào)節(jié)制劑的pH ，和采用張力調(diào)節(jié)劑如氯化鈉或葡 萄糖。對于經(jīng)粘膜或鼻內(nèi)給藥，優(yōu)選半固體、液體制劑或貼片，可含滲透 增強劑，這類滲透增強劑是該領(lǐng)域通常知道的。對于口服給藥，可將該化 合物配制成液體或固體劑量形式，和一次性釋放或控釋/緩釋制劑。適合 受試者口服的劑量形式包括片劑、丸藥、糖丸、硬和軟殼膠囊、液體、凝 膠、糖漿、糖水、懸浮液和乳液。該化合物也可配制在直腸組合物中，如 錠劑或保留灌腸劑中，如含有常規(guī)錠劑基質(zhì)如可可油或其它甘油基質(zhì)的灌 腸劑中?？刹捎觅x形劑，包括填充劑、崩解劑、粘合劑(干的或濕的)、溶解 延緩劑、潤滑劑、促滑劑、防粘劑、陽離子交換樹脂、增濕劑、抗氧化 劑、防腐劑、著色劑和芳香劑。這些賦形劑可來源于合成的或天然的。這 類賦形劑的例子包括纖維素衍生物、檸檬酸、磷酸二鈣、明膠、碳酸鎂、 月桂酸硫酸鎂/鈉、甘露醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、硅酸鹽、二氧
化硅、苯甲酸鈉、山梨醇、淀粉、硬脂酸及其鹽、糖(即葡萄糖、蔗糖、 乳糖等)、滑石粉、西黃耆膠粘漿、植物油(加氫的)和蠟。乙醇和水可 作為制粒輔助劑。在某些情況下，可能需要用掩蔽氣味的膜、抗胃酸膜、 或釋放延巧緩膜來包裹片劑。常常聯(lián)用天然和合成的聚合物與著色劑、 糖、有機溶劑和水來包裹片劑，產(chǎn)生糖丸。當包裹藥片、藥粉、懸浮液或 溶液優(yōu)選用膠囊時，可以相容的硬或軟殼膠囊來輸送。在一實施方案中，可局部，例如通過皮膚貼片、半固體開液體制劑， 如凝膠、(小)浮劑、軟膏、溶液、(納米/微米)懸浮液、或泡沫制劑 給予本發(fā)明的化合物?？刹捎美纾瑵B透促進劑；適當選擇和組合親脂 性、親水性和兩性賦形劑，包括水、有機溶劑、蠟、油、合成的和天然的聚合物、表面活性劑、促乳化劑，通過調(diào)節(jié)pH 、采用促混合劑，來調(diào)節(jié)藥物對皮膚和其下組織的滲透。可采用其它技術(shù)，如離子電滲療法，來調(diào) 節(jié)本發(fā)明化合物對皮膚的滲透。優(yōu)選透皮或局部給藥，例如在需要最低限 度全身接觸的情況下局部輸送藥物。對于吸入給藥或鼻內(nèi)給藥，本發(fā)明的化合物可以溶液、懸液、乳液或 加壓包裝的半固體氣溶膠形式或采用螺旋槳推進的噴霧器，如甲烷和乙 烷、二氧化碳或任何其它合適的氣體產(chǎn)生的鹵化碳常規(guī)輸送。對于局部施 加氣溶膠，可采用丁烷、異丁烷和戊烷類碳氫化合物。就加壓氣溶膠而 言，可通過提供-輸送確定量氣溶膠的閥門來確定適當?shù)膭┝繂挝弧？膳?制用于吸入器或吹入器中的膠囊和明膠栓。這些膠囊或栓通常含有化合物 的混合粉末和適合的粉末基質(zhì)，如乳糖和淀粉。通常以單位劑量形式，如在安瓿、注射器、注射筆或多劑量容器(常 含有防腐劑)中，提供配制的用于胃腸道外注射的除菌組合物。此組合物 可采取懸液、溶液或油性或水性乳液形式，可含有配制試劑，如緩沖劑、 強化劑、粘性增強劑、表面活性劑、懸而未決浮和分散劑、抗氧化劑、生 物相容性聚合物、螯合劑和防腐劑。取決于注射部位，到家載體可含水、 合成的油或植物油和/或有機促溶劑。某些情況下，如凍干產(chǎn)品或濃縮產(chǎn) 品時，可在給藥之前重建或稀釋胃腸道外給藥制劑。可提供本發(fā)明化合物 控釋或緩釋的儲存制劑，可包含納米/微米級顆?；蚣{米/微米級或非微 化晶體的可注射懸浮液。聚合物，除該領(lǐng)域熟知的那些外，如聚(乳酸)
聚(羥乙酸)，或其共聚物或用作控釋/緩釋基質(zhì)?？梢灾踩胛锖托枰?割的泵形式提供其它儲存輸送系統(tǒng)。本領(lǐng)域熟知適合靜脈注射本發(fā)明分子的載體，其包括能形成離子化化 合物的含堿如氫氧化鈉的和作為增強劑的蔗糖或氯化鈉的堿性溶液，例 如，含磷酸或組氨酸的緩沖液?？杉尤牍踩軇缇垡叶?。這些水系統(tǒng) 能有效溶解本發(fā)明的化合物，對全身給藥只產(chǎn)生低毒性。溶液系統(tǒng)的各組 分比例可相當不同而不破壞其溶解性和毒性特征。另外，諸組分的身分可 以改變。例如，可采用低毒的表面活性劑，如聚山15梨醋或波洛沙姆， 可加入聚乙二醇或其它共溶劑、生物相容性聚合物如聚乙烯吡咯垸酮，其 它糖和聚醇來代替葡萄糖。對于目前治療方法所用的組合物，起初可用本領(lǐng)域熟知的各種技術(shù)估 計治療有效劑量。動物研究所用的最初劑量可根據(jù)細胞培養(yǎng)試驗確定的有 效濃度而定。適合人用的劑量范圍可用動物研究和細胞培養(yǎng)所獲得的數(shù)據(jù) 確定。本發(fā)明的化合物或藥物的治療有效量或劑量，指該化合物或藥物可導(dǎo) 致受試者的癥狀緩解或生存延長的量或劑量。這類分子的毒性和治療效果 可通過在細胞培養(yǎng)或?qū)嶒瀯游镏羞M行標準的藥學(xué)程序來確定，例如，通過測定LD50 (導(dǎo)致50%群體死亡的劑量)和ED50 (50 %群體治療有效的 劑量)來確定。毒性和療效的劑量比值是治療指數(shù)，可用LD50/ED50比值 表示。優(yōu)選顯示高治療指數(shù)的制劑。有效量或治療有效量是所述化合物或藥物組合物能誘導(dǎo)研究者、獸 醫(yī)、醫(yī)生或其它臨床人員所認為的組織、系統(tǒng)、動物或人產(chǎn)生生物學(xué)或醫(yī) 反應(yīng)的量，例如能調(diào)節(jié)葡萄糖代謝、降低升高的或增加的血糖水平、治療 或預(yù)防葡萄糖代謝改變相關(guān)疾病如糖尿病的量。優(yōu)選項的劑量應(yīng)落在包括ED50并有極小或沒有毒性的循環(huán)濃度范圍 內(nèi)。劑量可在此范圍內(nèi)根據(jù)所用的劑量形式和/或給藥途徑而變化。應(yīng)按 照本領(lǐng)域己知方法根據(jù)受試者狀況的特征選擇精確的制劑、給藥途徑、劑 量和劑量間隔?？蓚€別調(diào)整劑量和間隔以提供能充分獲得所需效果，如調(diào)節(jié)葡萄糖代 謝、降低血糖水平等的血漿水平的活性成分，即盡量減少有效濃度
(MEC)。各化合物的MEC不同但可從例如體外資料和動物實驗估計。 需要獲得MEC的劑量取決于個體的特征和給藥途徑。就局部給藥或選擇 性攝入而言，藥物的有效局部濃度可能與血漿濃度無關(guān)。可根據(jù)多種因素，包括待治療受試者的性別、年齡和體重、疾病的嚴 重程度、給藥方式和醫(yī)生的判斷確定給予的制劑或組合物的量。如果需要，本發(fā)明的組合物可以裝在含一個或多個單位劑量形式(含 有活性成分)的填裝或分散裝置中。例如，這種填裝或裝置可包括金屬或 塑料泊，如起泡填裝物或玻璃和橡皮塞如小瓶中。該填裝或分散裝置可裝 有給藥說明書。也可制備用相容性藥學(xué)載體配制的含本發(fā)明化合物的組合 物，裝其放在適當?shù)娜萜髦?，貼上治療某種標明疾病的標簽。化合物及其篩選方法本發(fā)明的化合物是能抑制羥化酶活性的化合物，具體說，其中的羥化 酶活性是2-酮戊二酸雙加氧酶活性。更優(yōu)選羥化酶活性是HIF羥化酶的活 性。最優(yōu)選羥化酶活性是HIF脯氨酞羥化酶的活性。本發(fā)明的方法是依靠穩(wěn)定HIFa以實現(xiàn)受試者的特殊效果的方法。通 過給予受試者能穩(wěn)定HIFa以實現(xiàn)受試者的特殊效果的化合物來完成本發(fā) 明的方法。最優(yōu)選通過給予本發(fā)明的化合物來實施該方法。本發(fā)明的化合物示范性地用于本發(fā)明與穩(wěn)定HIFa有關(guān)的方法中。具 體說，本發(fā)明提供能抑制羥化酶活性和/或HIFa羥化、穩(wěn)定HIFcx等的化 合物，和篩選及鑒定其它化合物的方法。本發(fā)明的化合物包括能抑制羥化 酶活性的化合物，其中優(yōu)選的羥化活性是2-酮戊二酸雙加氧酶的活性。更 優(yōu)選羥化酶活性是HIF羥化酶的活性。HIF羥化酶可羥化HIF蛋白，優(yōu) 選HIFa亞基中的任何氨基酸，包括例如，脯氨酸或25天冬氨酸殘基等。 在-特別優(yōu)選的實施方案中，所述羥化酶活性是HIF脯氨酰羥化酶和/或 HIF天冬酰胺羥化酶的活性。本領(lǐng)域知道2 —酮戊二酸雙加氧酶的抑制劑。例如，己鑒定到前膠原 脯氨酰4-羥化酶的幾種小分子抑制齊U(見Majamaa等，Eur J Biochem 138 : 239 -245 , 1954 ; Majamaa等，Biochem J 229 : 127 -133 , 1985 ; Kivirikko和 Myllyharju , Matrix Biol 16 : 357 -368 ， 30 1998 ; Bickel等，Hepatology 28 : 404 -411 , 1998 ; Friedman等，Proc Natl Acad Sci USA 97 : 4736-4741 ，2000 ; Franklin等，Biochem J 353 : 333 -338 , 2001 ;所有文獻的內(nèi)容都 納入本文作參考)。也己鑒定到HIF羥化酶的小分子抑制劑(見國際公開 號WO 02/07498l，WO 03/049686和WO 03/080566,所有文獻的內(nèi)容納入本 文作參考)。本發(fā)明特別考慮采用能用本領(lǐng)域已知方法鑒定的這些和其它 的化合物。2-酮戊二酸雙加氧酶家族中的所有酶對于它們的羥化酶活性都需要 氧、Fe2+、 2-酮戊二酸和抗壞血酸(見Majamaa等，Biochem J 229 : 127 -133 , 1985 : Myllyharju和Kivirikko EMBO J 16 : 1173-1180， 1997; Thomburg等，32 : 14023 -14033 ， 1993 ;和Jia等，Pro Natl Acad Sci USA 91 : 7227-7231 )。因此，本發(fā)明的化合物包括但不限于鐵螯合 劑、2-酮戊二酸模擬物和修飾的氨基酸如脯氨酸或天冬氨酸同類物。在具體的實施方案中，本發(fā)明提供使用2-酮戊二酸的結(jié)構(gòu)模擬物。這 種化合物可競爭性抑制靶子2-酮戊二酸雙加氧酶與2-酮戊二酸的反應(yīng)，并 非競爭性其與鐵的反應(yīng)(Majamaa等1954 ，同上；Majamaa等，1985 ， 同上)。特別考慮采用例如Majamaa等，同上；Kiviri硅。和Myllyharju ， Matrix Biol 16 : 357 -368 , 1995 ; Bickd等，Hepatology 28 : 404-411 ， 1998 ; Friedman等，Proc Natl Acad Sci USA 97 : 4736 -4741 ， 2000 ; Franklin , Biochem Soc Trans 19 : 8 12 -815 , 1991 : Franklin等，Biochem J 353 : 333 -338,2001和國際公開號WO 03/049686中所述的化合物，以上所有文獻 的內(nèi)容納入本文作參考。示范性的化合物包括菲咯啉，其包括但不限于美國專利5，916，898和 6,200,974;國際出版物WO 99/21860中所述的那些；雜環(huán)羰基甘氨酸，包 括但不限于美國專利5，719，164和5,726,305中所述取代的喹啉-2-酞胺及 其酯；美國專利6,093,730中所述取代的異喹啉-3-酰胺及其酯；歐洲專利 EPO650961和美國專利5,658,933中所述的3-甲氧基吡啶羰基甘油及其酯； 美國專利5,620,995和6,020,350中所述的3-羥基吡啶羰基甘油及其酯；美 國專利5,607,954、 5,610,172和5,620,996中所述的5-亞磺酞氨基羰基吡啶 '羧酸鹽及其酯。這些專利中列出的所有化合物，特別是權(quán)利要求化合物中 和工作實施例中列出的那些化合物都納入本申請書中作參考。
因此，本發(fā)明的優(yōu)選化合物包括，例如雜環(huán)酰胺。特別優(yōu)選的雜環(huán)酰 胺包括，例如異喹啉、喹啉、吡啶、噌啉、咔啉等。此外，優(yōu)選化合物的 結(jié)構(gòu)類型包括蒽醌、氮雜芴、氮雜菲咯啉、苯并咪唑啉、苯并呋喃、苯并 吡喃、苯并噻吩、兒茶酚、二氫色原酮、(X-二酮、呋喃、N-羥基酰胺、N-羥基脲、咪唑、吲唑、吲哚、異噻二唑、異噻唑、異噁二唑、異噁唑、a-酮酸、a-酮酰胺、a-酮酯、a-酮亞胺、噁二唑、草酰酰胺、噁唑、噁唑 啉、嘌呤、吡喃、吡嗪、吡唑、吡唑啉、噠嗪、吡啶、喹唑啉、菲咯啉、 四唑、噻二唑、噻唑、噻唑啉、噻吩和三唑。以下用于本發(fā)明實施例中的示范性化合物表明了本文所述本發(fā)明的方 法[(7-氯-3-羥基-喹啉基-2-羰基)氨基)]-乙酸(化合物八)，[(1-氯-4-羥基-異喹啉基-3-羰基)氨基]-乙酸(化合物B)， [(4-羥基-7-苯氧基-異喹啉基-3-羰基)氨基]-乙酸(化合物C )，4-氧-l，4-二氫-[l,10]菲咯啉基-3-羧酸(化合 物D),[(l-氯-4-羥基-7-甲氧基-異喹啉基-3-羰基)氨基]-乙酸(化合物E)， [(3-羥基-6-異丙氧基-喹啉基-2-羰基)氨基]-乙酸(化合物F), [(3-羥基-卩比啶基-2-羰基)-氨基]-乙酸(化合物G)，和[(7-節(jié)氧基-l-氯-4-羥基-異喹啉基-3-羰基) 氨基]-乙酸甲酯(化合物H)?？刹捎酶鞣N試驗和篩選技術(shù)，包括下述的那些，來鑒定本發(fā)明的化合 物，即能制羥化酶活性的化合物。這些化合物適合用于本發(fā)明方法中。適 合用于本發(fā)明方法中的其它化合物，即能穩(wěn)定HIFa的化合物可由該領(lǐng)域 技術(shù)人員用己有的試驗和篩選方法作鑒定。試驗通常可提供與反應(yīng)底物的消耗，或與反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)生有關(guān)的可檢 測信號。檢測例如可包括熒光團、放射性同位素、酶偶聯(lián)物和本領(lǐng)域熟 知的其它可檢測標記。結(jié)果可以是定量或定性的。標記物可有利于反應(yīng)產(chǎn) 物的分離，如生物素或組氨酸尾可通過沉淀或親和層析使反應(yīng)產(chǎn)物從其它 反應(yīng)成分中純化出來。本領(lǐng)域標準化了測定羥化酶活性的試驗。這類試驗?zāi)苤苯踊蜷g接測定 羥化酶的活性。例如，某試驗?zāi)軠y定酶底物，如靶蛋白、合成肽模擬物、 或其片段中存在的羥化殘基，如脯氨酸、天冬氨酸等(見Palmerini等，J Chromatogr 339 : 285 -292 ， 1985 )。還原某化合物中存在的羥化脯氨酸或 天冬氨酸表明該化合物能抑制羥化酶活性?；蛘咚鲈囼?zāi)軠y定羥化反應(yīng)
的其它產(chǎn)物，如2-酮戊二酸形成的琥珀酸(見Cunliffe等，BiochemJ240: 617-619 ) 。 Kaule和G麗ler (Anal Biochem 184 : 291 -297 ， 1990 )描述 了一種測定2-酮戊二酸產(chǎn)生琥珀酸的示范性方法。上述這些方法可用于鑒定能調(diào)節(jié)HIF羥化酶活性的化合物。實施例 14中描述了示范性方法(見上)。靶蛋白可包括HIFa或其片段，如 HIF(556-575);例如實施例14中所述試驗用的典型底物為 DLDLEMLAPYIPMDDDFQL(SEQ ID NO:5 )。所述酶包括，例如獲自任何 來源的HIF脯氨酰羥化酶(見GenBank登錄號No . AAG33965等)、HIF 天冬氨酰羥化酶(見GenBank登錄號No.AAL27308等)。所述酶可存在 于細胞粗制裂解液中，或是部分純化形式。例如，在Ivan等(Science 292: 464 -468 , 2001和Proc Natl Acad Sci USA 99 : 13459 -13464 ， 2002 )和 Hirsila等(J Bio Chem 278 : 30772 -30780 , 30 2003 )中描述了直接或間接 測定HIF羥化酶活性的方法；國際公開號WO 03/049686中描述了其它方 法。測定和比較缺少和存在所述化合物時的酶活性，將鑒定到能抑制 HIFot羥化的化合物。HIFa穩(wěn)定性和/或HIF激活的試驗可包括直接測定樣品中的HIFa (見實施例14,同上)、通過測定與vonHippelLindau蛋白質(zhì)相關(guān)的HIFa 減少(見國際公開號WO 00/69908)、或HIF應(yīng)答性靶基因或報導(dǎo)構(gòu)建物的 活化(見美國專利No.5,942，434)來間接測定HIFa。測定和比較缺少和存在 所述化合物時HIF和/或HIF-應(yīng)答性靶蛋白質(zhì)的水平，將鑒定到能穩(wěn)定 HIFa和/或活化HIFa的化合物。可采用基于2-氧化[l-"C]戊二酸羥化-偶聯(lián)脫羧基試驗，鑒定能調(diào)節(jié) HIF特異性脯氨酰羥化酶活性的化合物(見Hirsila等，J Bio Chem 278 : 30772-30780,2003 )。該反應(yīng)25"C在1.0 ml的反應(yīng)體積中進行，其中含 10-100微升洗滌劑如Triton-X-lOO、獲自表達內(nèi)源性HIF脯氨酰羥化酶或 重組HIF脯氨酰羥化酶的裂解細胞提取液、0.05pM DLDLEMLAPYIPMDDDFQL ( SEQ ID NO : 5 ) 、 0.005, FeS04 0.16jxM 2-氧化[1-4(:]戊二酸、2pM抗壞血酸、60pg過氧化氫酶、O.l(iM 二硫蘇糖 醇和50pM Tris-鹽酸緩沖液，調(diào)pH到7.8。 37°C進行反應(yīng)20分鐘。該反
應(yīng)產(chǎn)生的"C02被捕捉在懸褂于反應(yīng)混合物上方大氣中浸泡堿液的濾紙 上，并在液閃計數(shù)器中計數(shù)。通過閱讀本文內(nèi)容本領(lǐng)域普通技術(shù)人員不難實施本發(fā)明的這些和其它 實施方案。實施例參見以下目的純粹是說明本發(fā)明的實施例將能進-步了解木發(fā)明。提 供這些實施例只是為了說明本發(fā)明的權(quán)利要求。本發(fā)明不限于目的是說明 本發(fā)明-個方面的示范性實施例所述的范圍。功能上相等的任何方法都在 本發(fā)明的范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得按照以上描述并參考附圖可對本發(fā) 明作出本文所述以外的各種修改，這類修改都屬于本發(fā)明權(quán)利要求的范 圍。實施例l:實驗材料通常，用于本發(fā)明方法用的脯氨酰羥化酶抑制劑化合物是采用本領(lǐng)域 技術(shù)人員已知的標準化學(xué)方法合成的。用高效液本色譜分析化合物的純 度，室溫避光保存。在制備不同用途的制劑時，采用PULVERISETTE 7 行星式超微磨(FritshGMBH, Germany )以750rpm使化合物懸浮超粉化 20分鐘以形成均勻大小的顆粒。在使用前立即制備經(jīng)口管飼的超微粉化合物的懸浮液。給藥時將化合 物懸浮在含0.5X羧甲基纖維素(CMC; Spectrum Chemical Gardena CA), 0.1 %聚山梨酯80 (Mallinckrodt Baker,Inc., Phillipsburg NJ)的水溶液中，用磁 攪拌器或旋轉(zhuǎn)搖動持續(xù)攪拌。計算懸液的濃度達到給定體積和所需劑量水 平。另外的方法中，秤重化合物并置于適當大小的明膠膠囊中用于口服， 對照動物接受同樣大小的空膠囊；或?qū)⒒衔镫S意溶于代替水的lOOmM 的組氨酸(Mailinckrodt Baker)溶液中。對于注射給藥，先將化合物與等摩爾量的氫氧化鈉混合于10%的葡萄 糖(Spectmm)或25mM組氨酸加等滲氯化鈉(Mailinckrodt Baker)的水溶 液中。實施例2 :葡萄糖調(diào)節(jié)因子的體外表達增加本發(fā)明化合物對參與葡萄糖調(diào)節(jié)和代tf的蛋白質(zhì)和基因的表達的作用 如下。將人293A細胞(腺病毒轉(zhuǎn)化的胎腎上皮細胞)鋪滿接種在裝有含5% FBS和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基的35mm養(yǎng)皿中，37°C， 10。/。C02條件下培養(yǎng)l天。將培養(yǎng)基換成Opti-Meml ，繼18-24小時。在 培養(yǎng)基中另入載體對照或化合物B ，再培養(yǎng)24、 48或72小時。將平板置 于冰上棄去培養(yǎng)上清液，加入裂解緩沖液-l(LB-l: 10mM Tris pH7.4, lmM EDTA,150mM氯化鈉，0.5%IGEPAL)。刮下收集細胞裂解物，將其在冰 上培育15分鐘，然后4。C離心3000xg5分鐘分級。收集代表胞質(zhì)組分的上 清液，用SDS-聚丙酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)在還原條件下分離胞質(zhì)蛋 白，每泳道加入等到量的蛋白質(zhì)。在150V下進行SDS-PAGE 2小時，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，在 4°C 400mA 1.5小時。用T-TBS洗一次，加入用封閉緩沖液稀釋到工作濃 度的抗醛縮酶抗體。4°C輕搖培育過夜。用T-TBS洗膜4次，然后與用封 閉緩沖液稀釋的偶聯(lián)第二抗體室溫培育l小時。用T-TBA洗膜4次，然后 用X-光膠片和ECL SUPERSIGNAL WEST FEMTO或PICO化學(xué)發(fā)光底物 (Pierce Chemical Co. Rockford IL)按照制造商說明書顯影和觀察。如圖1A所示，用化合物B處理24、 48和72小時的細胞中醛縮酶的 表達隨時間而增加，但用載體對照處理的細胞中醛縮酶表達不見增加?；?合物B處理培養(yǎng)物未顯示p-微管蛋白表達增加，表明醛縮酶的增加是特異 性的，與蛋白質(zhì)表達的總體增加無關(guān)。這些結(jié)果表明本發(fā)明的化合物和方法可用于調(diào)節(jié)參與糖酵解基因的表 達，并提示用本發(fā)明化合物治療可通過增強糖酵解而提高葡萄糖的利用率 和代謝。實施例3 :葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GluT)-l的體外表達增加 在100mm培養(yǎng)皿中，37°C， 10% C02條件下在含10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)人SSC-25 (鱗狀上皮細胞癌)或大鼠H9c2 (心室心 肌細胞)至鋪滿。用PBS洗細胞2次，與載體對照、化合物D(10和25)或化合物C(5 、 10和20pM )培育16小時。將平板置于冰上， 棄去培養(yǎng)上清液，加入裂解緩沖液-l(LB-l : 10mMTrispH7.4，lmMEDTA， 150mM氯化鈉，0.5。/。IGEPAL )。刮下收集細胞裂解物，冰上培育15分 鐘，然后4°C離心3000xg5分鐘。收集代表胞質(zhì)組分的上清液，用SDS-
聚丙酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE )在還原條件下分離胞質(zhì)蛋白，每泳道加 入等到量的蛋白質(zhì)。在150V下進行SDS-PAGE2小時，然后4°C 400mA 1.5小時或過夜， 將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用T-TBS洗一次，加入用封閉緩沖液稀釋到 工作濃度的抗-GluT-l抗體(Alpha Diagnostics )。 4°C輕搖培育過夜后， 用T-TBS洗膜4次，然后與用封閉緩沖液稀釋的偶聯(lián)第二抗體室溫培育1 小時。用T-TBA洗膜4次，然后用X-光膠片和ECLSUPERSIGNALWEST FEMTO或PICO化學(xué)發(fā)光底物(PierceVhemicalCo.RockfordIL )按照制 造商說明書顯影和觀察。圖IB所示資料表明化合物D和化合物C分別提高了 SSC-25和H9c2 細胞的介導(dǎo)葡萄糖攝入的主要可誘導(dǎo)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白，GluT-1蛋白的水 平。本發(fā)明的化合物和方法能夠提高細胞的GluT-1表達提供了研究化合物 對葡萄糖體外攝取作用的工具。這些結(jié)果顯示本發(fā)明的化合物和方法可用 于提高參與葡萄糖攝入的蛋白質(zhì)的表達，因而為高血糖癥、糖尿病或葡萄 糖體內(nèi)平衡調(diào)節(jié)有缺陷的其它疾病病人，提供了增強葡萄糖攝入和降低血 糖水平的治療方法。實施例4 :葡萄糖調(diào)節(jié)因子的體外表達增加為了確定基因隨時間推移的誘導(dǎo)方式，從Simonsen.Inc獲得雄性Swiss Webster小鼠(30-32克)24只并用口飼管口服4ml/kg體積的0.5%羧甲 基纖維素(CMC : Sigma-Aldrich , St. Louis Mo) ( Omg / kg /天)或1.25 % 化合物B(25mg/ml0.5。/。CMC)(10Omg/kg)治療。在最后一次服藥后4 、 8 、 16 、 24 、 48和72小時，用異氟垸麻醉。然后處死小鼠，分離得到 腎、肝、腦、肺和心臟的組織樣品，儲存于-2(TC的RNALATER溶液液 (Ambion)中。為了研究本發(fā)明化合物的劑量反應(yīng)，將12只雄性Swiss Webster小鼠 (30-32克，獲自Simonsen,Inc.,GilroyCA )每天一次用口飼管口服4ml/kg 體積的0.5%羧甲基纖維素(CMC : Sigma-Aldrich ， St丄ouis MO)、化合物D (25mg/ml，用0.5 % CMC配)、或化合物B (7.5和25mg/ml ，用0.5 % CMC 配)(分別30和lOOmg/kg/天)治療4天。在最后一次服藥后4小時，麻
醉并處死小鼠，分離得到約150mg的肝和每只腎，并儲存在-2(TC的 RNALATER溶液液(Ambion )中。用以下方法分離上述實驗所得組織的RNA :各器官制成50mg的 小方塊，加入875微升RLT緩沖液(RNEARY試劑盒Qiagen Inc.， Valencia CA)，用旋轉(zhuǎn)式POLYTRON勻漿器(Kinematica， Inc., Cincinnati OH)勻 漿化切片20秒。微離心勻漿液3分鐘沉降不溶性物質(zhì)，將上清液轉(zhuǎn)移到一 新試管中，用RNEASY試劑盒(Qiagen)按制造商說明書分離得到RNA 。 該RNA洗脫在80微升水中，用RIBOGREEN試劑(Molecular Probes, Eugene OR )定量。然后用DNA — FREE試劑盒(Ambion Inc., Austin TX) 按制造商說明書除去RNA中的基因組DNA 。測定260和280吸光值確 定RNA的純度和濃度。或者將組織樣品切成小方塊在TRIZOL試劑(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad CA)中用旋轉(zhuǎn)式POLYTRON勻漿器(Kinematica) 勻漿化。勻漿液置室溫另入0.2體積的氯仿強烈攪拌樣品。室溫培育混合 物幾分鐘，然后4。C 12,000g離心15分鐘。收集水相加入0.5體積的異丙 醇。室溫混合樣品IO分鐘，4°C 12，000g離心10分鐘。棄去上清，沉淀用 75% EtOH洗滌，4°C 7 ， 5,000g離心5分鐘。用DNA-FREE試劑盒 (Ambion Inc., Austin TX)按制造商說明書除去RNA中的基因組DNA 。 測定260和280吸光值確定RNA的純度和濃度。用0.3M乙酸鈉(pH5.2 )、 50ng/ml糖原和2.5體積的乙醇，-20°C沉 淀RNA—小時。離心樣品用80%冷乙醇洗滌沉淀，干燥，重懸于水中。 用T7-dT )24第 一 鏈引物(Affymetrix, Inc., Santa Vlara CA )和 SUPERSCRIPT CHOICE系統(tǒng)(Invitrogen)按照制造商說明書合成雙鏈 cDNA 。用等到體積25:14:1的酚氯仿異戊醇和PHASE LOCK GEL 插入物(brinkman， Inc., Westbury NY)抽提最終的cDNA。收集水相用0.5體 積的7.5M乙酸銨和2.5體積的乙醇沉淀cDNA?；蛘?，用GENECHIP樣 品清除模塊(Affymetrix )接制造商說明書純化cDNA 。用BIOARRAY HIGHY正LD RNA轉(zhuǎn)錄標記試劑盒(Enzo Diagnostics, Inc., Farmingdale NY )按制造商說明書在體外翻譯反應(yīng)中從cDNA合成生 物素標記的cRNA。用GENECfflP樣品清除模塊(Affymetrix)接制造商
說明書純化最后標記的產(chǎn)物并片段化。在lx雜交緩沖液(lOOmM MES ，lM[Na+] ,20mM EDTA ,0.01 % Tween 20)中加入5嗎探針，100嗎/ml鯡魚精子DNA ， 500ng/ml乙?；疊SA ， 0.03nM對照寡B2 (Affymetrix)和lx GENECHIP真核雜交對照物 (Affymetrix)，制備雜交混合物。將此雜交混合物依次在99°C和45°C培 育5分鐘，然后離心5分鐘。將鼠基因組U74AV2陣列(MG-U74AV2; Affymetrix)置于室溫，然后與lx雜交液45'C搖動預(yù)雜交10分鐘。該緩沖用80微升雜交混合物置換，以60rpm45。C將該陣列與計量 平衡液雜交16小時。雜交后用6xSSPE,0.1 %Tween20洗滌陣列一次，然 后洗滌并用R-藻紅蛋白偶聯(lián)的鏈霉親和素(Molecular Probes, Eugene OR)、 生物素化羊抗鏈霉親和素抗體(Vector Laboratories, Burlingame CA)禾口 GENECHIP Fluidics Station 400儀器(Affymetrix)按照制造商的micro—lvl 程序(Affymetrix)染色。用GENEARRAY掃描儀(Affymetrix)和微陣列 組軟件(Affymetrix)分析此陣列。鼠基因組U74AV2陣列(MG-U74AV2 ; Affymetrix )提供了 Mouse UniGene Database build 74 (生物技術(shù)信息國家中心(National center for Biotechnology Information, Bethesda MD ))中的所有序列(約6000個)， 該序列己經(jīng)功能性特征分析并有約6000個未注釋的表達序列標簽(EST) 簇。如圖2A 、 2B和2C所示，編碼參與葡萄糖調(diào)節(jié)酶的基因的表達，在 用化合物B處理后以協(xié)同方式增加。圖2A 、 2B和2C提供的轉(zhuǎn)錄模式 包括血小板類型的磷酸果糖激酶(PFK)-P(A)、肝臟類型的PFK-L(B)、烯 醇化酶-l(C)、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GluT)-l (D)、乳酸脫氫酶-l(E)、醛縮酶-l(F) 和已糖激酶-l(G)。在時間曲線中，大多數(shù)mRNA水平在給予化合物后早 期達到峰值，24-48小時后回到對照水平。另外，不同器官之間編碼糖酵 解酶的基因表達相類似，但腎(圖2A)肝(圖2B)和肺(圖2C)在特定 mRNA相對表達水平的增加和增加的時間上表現(xiàn)不同。這些不同部分與向 各組織提供重要能源，特別在應(yīng)激時提供能源的糖酵解活動程度不同相關(guān)。 這些結(jié)果表明本發(fā)明的化合物可特異性誘導(dǎo)糖酵解作用，這些作用可因組 織而不同。
如圖3A所示，低劑量(30mg/ml)或高劑量(100mg/ml )化合物處 理可導(dǎo)致腎中GluT-l編碼基因表達的劑量依賴性改變。此例中GluT-l表 達的增加提供了通過促進細胞攝取葡萄糖來調(diào)節(jié)血糖水平的機制。如圖3B 所示，用化合物B處理導(dǎo)致腎和肝中IGFBP-1表達的幾乎相同的瞬時誘 導(dǎo)，但一種組織與另一種組織相比表達水平在量上有所不同。IGFBP-I促 進了胰島素樣生長因子的轉(zhuǎn)運，提高了 IGFBP-1的循環(huán)水平，以及提高了 胰島素敏感性和葡萄糖的利用效果，這與例如持久的訓(xùn)練有關(guān)(見Marietta 等，Metabolism 52 : 821-826 ， 2003 )。因此，本發(fā)明的化合物可特異性誘 導(dǎo)血糖攝取的直接介導(dǎo)劑，并間接作用于血糖和葡萄糖調(diào)節(jié)的體液調(diào)節(jié)劑。實施例5 :葡萄糖的攝取增加胰島素耐受使機體對胰島素反應(yīng)的能力降低。胰島素耐受或胰島素敏 感性降低，常與高血糖癥、糖尿病和高胰島素血癥相關(guān)連。胰島素耐受降 低或胰島素敏感性增加可通過以下測定給予本發(fā)明化合物后葡萄糖的攝入 來測定。為了測定本發(fā)明化合物對體內(nèi)葡萄糖攝入的影響，給DIO (飲食誘導(dǎo) 的肥胖)大鼠(Charles River)詞喂高脂肪食物4周以誘導(dǎo)肥胖和胰島素耐 受。或者，可采用ZDF大鼠或2型糖尿病的任何其它遺傳動物模型。將 動物分成治療和對照組。治療動物接受所述化合物10天而其余接受高脂食 物。10天后在全麻下給禁食動物作頸靜頸動脈和股動脈插管。用一種定量 測定胰島素耐受的參比方法，即高胰島素血-正常血糖維持程序進行胰島素 連續(xù)灌注和10%葡萄糖灌注，速度足以將血漿葡萄糖水平維持在基礎(chǔ)濃度。 收取血樣品監(jiān)測血糖水平并適當調(diào)節(jié)葡萄糖灌注速度。在正常血糖穩(wěn)態(tài)條件下，機體所有組織的葡萄糖灌注速度等于葡萄糖 攝入速度，因此是組織胰島素敏感性的一種衡量指標。在此維持程序之前 和穩(wěn)態(tài)時灌注的[3-3司葡萄糖可估計基礎(chǔ)的和胰島素激發(fā)的全身葡萄糖流 通量。 一旦達到穩(wěn)態(tài)葡萄糖水平(約60-75分鐘)，加入作為藥團的2-脫氧 -0-[1-14(:]葡萄糖來估計各組織中胰島素激發(fā)的葡萄糖攝取。在藥團注射后 1 、 3 、 5 、 10 、 20 、 30和45分鐘，測定血樣的葡萄糖和示蹤物的濃 度。120分鐘安樂死后收集組織樣品測定葡萄糖的具體組織攝取。這些方法 對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯然易見的。
用本發(fā)明化合物治療的動物，其組織如肌肉和肝臟，通過對胰島素敏 感性的提高和對胰島素耐受的降低而提高了葡萄糖的攝取。給予本發(fā)明的 化合物后葡萄糖攝取的增加，表明本發(fā)明的化合物可用于胰島素耐受的病 人，可胰島素敏感性降低或受損的病人來治療性降低其胰島素耐受和提高 其胰島素敏感性。因此，本發(fā)明的方法和化合物對高血糖癥、糖尿病病人 或其它葡萄糖體內(nèi)平衡調(diào)節(jié)缺陷病人，可提高其體內(nèi)葡萄糖攝取和降低其 血糖水平。實施例6 :血糖水平的劑量依賴性降低如下研究了給予化合物對血糖水平的作用。給予從Simonsen， Inc.獲 得的50只雄性Spraque Dawley大鼠(6-7周齡)0.5 % CMC (Sigma-Aldrich)或20 、 60 、 100 、 200mg/kg體重的化合物B ，通過口 飼管口服每天一次，連續(xù)14天。監(jiān)測動物的體重變化和看得見的毒性和死 亡信號。第15天，讓動物禁食過夜但可自由飲水，用異氟烷麻醉動物，打 開腹腔，收集下腔靜脈血液。將約lml的一份樣品收集到含EDTA的試管 中作血液學(xué)分析，將約lml的第二份樣品收集到不抗凝的試管中作血清化 學(xué)分析。血樣分析由IDEXX ( West Sacramento ， CA)進行。如圖4所示，兩次分開的實驗表明，用本發(fā)明化合物治療的動物顯示 了血糖水平的劑量依賴性降低?；衔飫┝颗c血糖水平之間的關(guān)系提示， 采用本發(fā)明方法和化合物以適當劑量可將血糖維持在理想水平。因此，本 發(fā)明的方法和化合物可用于調(diào)節(jié)，具體說降低血糖水平。因此，本發(fā)明的 方法和化合物可用于治療性降低受試者的血糖水平，例如降低患有葡萄糖 調(diào)節(jié)疾病如高血糖癥或糖尿病受試者的血糖水平。實施例7 :飲食誘導(dǎo)的2型糖尿病動物模型的葡萄糖耐受增強采用喂養(yǎng)高脂飲食產(chǎn)生嚴重肥胖、高血糖癥和高胰島素血癥的 C57BL/6J小鼠作為飲食誘導(dǎo)肥胖、2型糖尿病和葡萄糖耐的模型。將獲自 Jackson Laboratory (Bar Harbor ME)的40只雄性C57BL/6J小鼠分成以下實驗組組l :載體對照動物，飼喂標準的小鼠口糧(n=10);組2 :飼 喂標準的小鼠口糧并口飼管給予75mg/kg/天的化合物E(r^10):組3 :載 體對照。動物飼喂高脂小鼠口糧(研究飲食45%脂肪)(n=10);組4 :動 物詞喂高脂小鼠口糧和口飼管給予75mg/kg/天的化合物E (n=10)。飼養(yǎng)方
案持續(xù)進行14天，每天測定體重和食品消耗。在腹腔內(nèi)葡萄糖耐受試驗(IPGTT)前動物禁食4小時，采用kg體重2克葡萄糖負荷量。給予葡 萄糖后0、 15、 30 、 60和90分鐘取血樣作血糖水平測定。如圖5A所示，服用標準食糧與給予的(RxChow)化合物或不用(VeChow)化合物的小鼠，與服食高脂飲食用化合物(RxHF)治療的小 鼠，葡萄糖清除速率幾乎相同和基本上相同。然而，高脂飲食不用化合物(VeHF)的小鼠葡萄糖清除速率比其它組小鼠低。計算各動物IPGTT曲線(AUC)下葡萄糖區(qū)域的差異，比較標準食糧加化合物(RxChow)和不用 化合物(VeChow)治療的動物與高脂飲食不用(VeHF)的動物差異有統(tǒng)計 學(xué)意義(t檢驗，PO.OOl)。此外，當比較高脂飲食不用化合物(VeHF)的 動物與高脂飲食用化合物(RxHF)治療的動物的葡萄糖AUC ，發(fā)現(xiàn)血糖 水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t檢驗，P<0.05)。(見圖5B)。然而如圖5B所示， 標準飲食(RxChow )或高脂飲食(RxHF)治療小鼠與標準飲食不用化合 物(VeChow)小鼠之間的葡萄糖AUC無統(tǒng)計學(xué)差異。這些數(shù)據(jù)表明，在飲食誘導(dǎo)的肥胖和葡萄糖耐受受損動物模型中，用 本發(fā)明化合物治療的動物血中葡萄糖清除改善、血糖水平降低、葡萄糖機 耐受正?；推咸烟求w內(nèi)平衡得到恢復(fù)。這些結(jié)果提示受治療動物的葡萄 糖利用和調(diào)節(jié)得到改善。本發(fā)明化合物恢復(fù)了飲食誘導(dǎo)的葡萄糖利用和調(diào) 節(jié)(如葡萄糖耐受受損)受損動物模型的正常葡萄糖耐受，表明本發(fā)明的 方法和化合物可用于治療性恢復(fù)葡萄糖耐受受損病人的葡萄糖體內(nèi)平衡。給予本發(fā)明化合物后葡萄糖利用和調(diào)節(jié)的改善和葡萄糖體內(nèi)平衡的恢 復(fù)，也可用口服葡萄糖耐受試驗(OGTT)測定。進行上述實施例7中所 述的類似實驗來測定給予的化合物對血糖水平的作用。將40只C57BL/6J 小鼠分成以下實驗組組l :載體對照動物，飼喂標準的小鼠口糧(11=10); 組2 :載體對照動物，飼喂高脂小鼠口糧(研究飲食45%脂肪)(n=10); 組3 :動物詞喂高脂小鼠口糧并口飼管給予75mg/kg/天的化合物E (n=10):組4 :動物飼喂高脂小鼠口糧和口飼管給予75mg/kg/天的化合物 A(n=10)。飼養(yǎng)方案持續(xù)進行28天，每周測定體重。在OGTT前動物禁 食過夜，采用kg體重1克葡萄糖負荷量。給予葡萄糖后0、 30 、 60 、 90 、 120和180分鐘取血樣葡萄糖水平測定。 實施例8 :血紅素的糖化降低各種糖(最常見葡萄糖)通過結(jié)合于血紅素分子而形成糖化血紅素， 其形成的速度與務(wù)葡萄糖濃度成正比。測定糖化血紅素水平提供了前2-3 個月平均血糖濃度的精確指數(shù)。臨床上糖化血紅素水平可估計糖尿病病人 或高血糖癥病人的血糖控制情況。如下用糖尿病小鼠模型研究了給予化合物對糖化血紅素水平的作用。 使20只雄巧性db / db小鼠(Harlan)接受含載體(100pM組氨酸)或化 合物A(0.5mg/ml)的飲用水8周。研究開始前和治療后4和8周，收集 尾靜脈血樣品，用HbAlcNow試劑盒(Metrika Inc.， Sunnyvale CA )測定 HbAlc水平。對照組8周時HbAlc水平y(tǒng)離基線顯著上升(PO.05)。如圖6所示， HbAlc從0周時的7.5%升高到8周時的10X?；衔镏委熃M的HbAlc不 隨時間而升高，8周20時顯著低于非治療組。用本發(fā)明化合物治療的動物 8周時的HbAlc水平約為7.5 %。這些數(shù)據(jù)顯示，在2型糖尿病動物模型中本發(fā)明化合物治療減少了糖 化血紅素的累積。HbAlc反映了糖尿病病人的整體血糖控制?；衔锝档?此模型HbAlc表明本發(fā)明的化合物可用于治療性改善糖尿病或高血糖癥病 人的血糖控制。實施例9 :體重的增加和降低脂肪儲存減少如下研究了本發(fā)明化合物對動物體重損失和脂肪儲存的作用。通過口 飼管口服給予40只獲自Simonsen， Inc.的雄性Spmque Dawley大鼠(6-7 周齡)給予0.5% CMC( Sigma陽Aldrich )或20 、 60 、 100 、 200mg/kg體 重的化合物B ，每天一次，連續(xù)14天。監(jiān)測動物的體重變化和看得見的 毒性和死亡信號。第15天，讓動物禁食過夜但可自由飲水，用異氟烷麻醉 動物。將約lml的一份全血樣品收集到含EDTA的試管中作血液學(xué)分析， 將約lml的第二份樣品收集到不抗凝的試管中作血清化學(xué)分析。血樣分析 由IDEXX( West Sacramento, CA)進行。收集血樣后，切取隔膜處死動物。 記錄各動物的顯微鏡觀察結(jié)果，并收集肝、腎、心臟、脾、肺、胃、小腸 和大腸作組織學(xué)評估。
如圖7A所示，用本發(fā)明化合物治療的動物體重增加呈劑量依賴性減 少。動物檢查表明，生長沒有總體上延緩，因為治療動物的大多數(shù)器官絕 對重量與對照的未治療動物各器官重量相比，沒有顯著性差異。例如，化 合物治療動物的心臟重量與對照相比，無統(tǒng)計學(xué)顯著差異(圖7B)。然而 治療動物的器官相對重量比未治療對照有顯著增加。例如表示為機體總重 分數(shù)的心臟相對重量，與對照相比，用100mg/kg化合物治療的動物顯著 增加(p二0.036，單向圖氏差異分析(one-way AM3VA/Tukey's test))。由于器官的絕對重量，如心臟的重量沒有顯著減少，故受治療動物的 總體生長過程沒有延緩。另外，由于相對于機體總重的器官重量顯著增加， 故存在著其它組織的選擇性損失。如圖8所示當用化合物治療時，顯示內(nèi) 臟脂肪呈劑量依賴性減少。上圖的箭頭顯示用低劑量化合物治療動物中存 在的內(nèi)臟脂肪墊，而下圖顯示用高劑巧量化合物治療的動物完全缺少脂肪 墊。這些結(jié)果表明，本發(fā)明的方法和化合物可用于調(diào)節(jié)體重、誘導(dǎo)體重的 損失或減少，而不會伴有肌肉的損失，并能減少內(nèi)臟脂肪。綜合在一起， 這些結(jié)果表明，本發(fā)明的方法和化合物可用于有效控制體重增加，特別是 減少內(nèi)臟脂肪。這些方法和化合物對治療或預(yù)防肥胖具有優(yōu)越性，因此可 用于治療或預(yù)防肥胖相關(guān)糖尿病。實施例IO :飲食誘導(dǎo)肥胖動物模型的體重增加降低 飼喂高脂食物發(fā)生嚴重肥胖、高血糖癥和高胰島素血癥的C57BL/6J小鼠是飲食誘導(dǎo)肥胖、2型糖尿病和葡萄糖耐受受損的一種模型。將購自 Jackson Laboratory (Bar Harbor ME)的40只雄性C57BL/6J小鼠分成以下實驗組組l :載體對照動物，詞喂標準的小鼠口糧(n=10);組2 :載體對照動物，飼喂高脂小鼠口糧(研究飲食45%脂肪)(n=10);組3 :動 物詞喂高脂小鼠口糧并口飼管給予75mg/kg/天的化合物E (n=10):組4 : 動物詞喂高脂小鼠口糧和口飼管給予75mg/kg/天的化合物A(n^10)。此詞 養(yǎng)方案持續(xù)進行28天，每周測定體重。處死動物收集它們的器官和脂肪墊 并秤重。如圖9A所示，飼喂高脂飲食(組2)的動物體重顯著高于飼喂標準口 糧(組l)的動物(P<0.05)。然而，飼喂高脂飲食但用化合物E或化合物 A治療的動物(分別為組3和組4)顯示體重增加明顯為少(P<0.05)。 事實上，盡管高脂飲食，用化合物治療動物的體重與飼喂正常飲食動物(組 3和組4與組l比較)的基本上相同。類似地，如圖9B所示，飼喂高脂 食物的動物(組2)腹部脂肪墊比飼喂標準口糧的動物(組l)和飼喂高脂 食物并用本發(fā)明化合物治療的動物(組3和組4)顯著增加。如圖9B所示，飼喂高脂食物并用化合物治療的動物的脂肪墊重量與正常飲食動物的 基本相同。研究28天后也測定了動物各器官的重量。如圖9C所示，腎、肝心臟 的重量在實驗組之間無差異。這些結(jié)果表明，觀察到的體重差異歸因于脂 肪儲存的減少，而不是生長速度的減少。這些數(shù)據(jù)顯示，用本發(fā)明的化合 物治療動物，消除了與高脂飲食相關(guān)的體重增加。本發(fā)明化合物這種防止 體重增加的作用，表明本發(fā)明化合物可用于在甚至不良的飲食攝取入時治 療性減少體重增加。此外，本發(fā)明的方法和化合物可用于對體重增加的改 變，提示這類化合物可能用于治療性調(diào)節(jié)肥胖病人的體重減輕。實施例ll :肥胖小鼠體重減輕按以下方法研究了給予本發(fā)明化合物對體重減輕的作用。從Jackson Laboratory, (Bar Harbor ME)獲得C57BL/6J小鼠。飼喂高脂食物發(fā)生嚴重 肥胖、高血糖癥和高胰島素血癥的C57BL/6J小鼠是飲食誘導(dǎo)肥胖、2型糖 尿病和葡萄糖耐受受損的一種模型。給小鼠飼喂高脂食物8周后變成肥胖。 將肥胖小鼠分成二實驗組組l動物為對照的肥胖小鼠，組2動物為用本 發(fā)明化合物治療的肥胖小鼠。另一組年齡相配的非肥胖小鼠也包含在本研 究中。每天用本發(fā)明化合物或用載體對照治療動物。21天內(nèi)每周二次測定 小鼠體重。第21天秤重小鼠并處死。分離腹部脂肪墊、肝、腎和心臟并秤 重作分析。給予化合物后體重減輕表明本發(fā)明的化合物可用于治療性減少肥胖病 人的體重。實施例12 :參與血壓調(diào)節(jié)基因的表達增加高血壓是糖尿病和糖尿病相關(guān)疾病和病癥的危險因素。如下研究了本 發(fā)明化合物對調(diào)節(jié)血壓的作用。發(fā)用化合物B或化合物D治療動物，如 實施例4所述制備RNA樣品。用以下方法測定iNOSmRNA水平。用lpM 隨機六聚引物、l嗎總RNA和OMNISCRIPT逆轉(zhuǎn)錄酶(Qiagen)按制造 商說明書進行cDNA合成。用水5倍稀釋得到的cDNA至100pL最終體 積。用FASTSTARTDNAMASTER SYBR GREEN I試劑盒(Roche)和基 因特異性引物，用LIGHTCYCLER系統(tǒng)(Roche)，按照制造商說明書， 以定量PCR進行基因表達相對水平的分析。樣品加熱至90 °C 6分鐘，然 后總共42輪循環(huán)95°C 15秒，6(TC5秒，和72°C 10秒?？烧T導(dǎo)的一氧化 氮合酶(iNOS) —特異性引物如下m-iNOS-F2 CCCAGGAGGAGAGAGATCCGATT (SEQ ID NO:l) m-iNOS-R2 AGGTCCCTGGCTAGTGCTTCAGA (SEQ ID NO:2)測定了 18S核糖體RNA基因表達的相對水平作為對照。用 QUANTITECT SYBR GREEN PCR試劑盒(Qiagen)和基因特異性引物，， 用LGHTCYCLER系統(tǒng)(Roche),按照制造商說明書，進行定量PCR 。 樣品加熱至9(TC 15分鐘，然后總共42輪循環(huán)95。C15秒，60。C20秒， 和72°C 10秒。核糖體RNA-特異性引物如下185-mt-2B TAGGCACGGCGACTACCATCGA (SEQ ID NO:3)185陽rat-2B CGGCGGCTTTGGTGACTCTAGAT (SEQ ID NO:4)每次PCR運行包括包括標準曲線形和水空白對照。此外，在完成每次 PCR運行后跑解鏈杯以估計擴增的特異性。將樣品的iNOS基因表達相對 于18S核糖體的RNA表達水平作標準化。如圖IOA所示，編碼iNOS基因的表達在用本發(fā)明化合物處理8小 時后升高，此后回落到對照水平。另外，iNOS的誘導(dǎo)是劑量依賴的，用本 發(fā)明二種化合物(化合物B和D )都可獲得。這二種化合物是二種不同 的藥效基團， 一種是菲咯琳衍生物， 一種是雜環(huán)酰胺，可用于本發(fā)明方法 中。這些結(jié)果表明，用本發(fā)明化合物治療可提高iN0S (—種參與血管舒張 調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì))的表達。因此，本發(fā)明的方法和化合物可用于誘導(dǎo)血管舒 張和降低血壓。為了測定腎上腺髓質(zhì)素mRNA的表達，如以上實施例4所述制備樣 品并雜交分析。如圖10B所示，用本發(fā)明化合物B治療動物的各種組織 中腎上腺髓質(zhì)素(代表參與血管舒張蛋白質(zhì)的編碼基因)增加。在用化合 物B治療后的時間中，心臟、腎和肺中的腎上腺髓質(zhì)激素mRNA水平顯 示表達快速上升，然后在16-24小時內(nèi)回落到對照水平。綜合在一起，這些結(jié)果表明，本發(fā)明的方法和化合物可用于提供了通 過舒張機制激活參與調(diào)節(jié)血壓基因表達的工具。這類基因包括但不限于 可誘導(dǎo)的一氧化氮合酶和緊上腺髓質(zhì)素。治療性上調(diào)血管舒張因子提供了 降低血壓的有效方法，從而向代謝失調(diào)疾病如糖尿病病人提供了益處。通 過降低血壓，本發(fā)明的方法和化合物可用于為治療或預(yù)防糖尿病、高血糖 癥和其它糖尿病相關(guān)代謝疾病等提供了方法。實施例13 :血清甘油三脂降低用糖尿病小鼠模型如下研究了給予化合物對甘油三脂水平的作用該研究采用在leptin受體中含純合型功能喪失突變的20只雄性db/db小鼠 (Harlan, Indianapolis, Indiana )。與正常小鼠相比，db/db小鼠的甘油三脂 水平通常高1.5-2倍(Nishina等，Metabolism 43 : 549-553， 1994)。隨年齡 增力H db/db小鼠的甘油三脂水平進行性增加(Tuman禾Q Doisy . Diabetologia 13 : 7-11 , 1977)。小鼠接受含載體(lOOpM組氨酸)或化合物 A(0.5mg/ml ，用lOO^M組氨酸配)的飲水8周。研究末，動物禁食過夜， 在全麻下從尾靜脈插管中取血樣品置于血清分離試管中。將血樣品送到 Quality Clinical Labs ( Mountain View, CA)作分析。如圖11所示，實驗?zāi)φ盏膁b/db小鼠甘油三脂的水平大約為 120mg/dL 。然而，用本發(fā)明化合物治療的動物甘油三脂水平約為 85mg/dL ，顯著低于對照。甘油三脂水平升高與心血管疾病危險升高相關(guān)， 升高的甘油三脂是代謝綜合征的一種成分。因為本發(fā)明的方法和化合物可 有效降低或維持通常的甘油三脂升高相關(guān)疾病，如糖尿病、綜合癥X 、大 血管疾病或其它脂質(zhì)代謝障礙血癥中的甘油三脂水平，故本發(fā)明的方法可 用于治療具有或有患這類疾病危險的個體。實施例14 :化合物和HIFa穩(wěn)定的鑒定可采用基于2-氧化[1-14C]戊二酸羥化-偶聯(lián)脫梭基試驗，鑒定能調(diào)節(jié) HIF特異性脯氨酞輕化酶活性的化合物(見Hirsila等，J Biochem 278 : 30772-30750 ， 2003)。該反應(yīng)25°C在1.0ml的反應(yīng)體積中進行，其中含 10-100微升洗滌劑如Triton-X-100 、獲自表達內(nèi)源性HIF脯氨酞經(jīng)化酶 或重組HIF脯氨酞輕化酶的裂解細胞提取液、0.05pM DLDLEMLAPYIPMDDDFQL (SEQ ID NO:5)、 0.005pM FeS04 0.16pM 2-氧 化[l-"C]戊二酸、2pM抗壞血酸、60嗎過氧化氫酶、O.l(iM 二硫蘇糖 醇和50 pM Tris-鹽酸緩沖液，調(diào)pH至ij 7.8。 37°C進行酶反應(yīng)20分鐘。 該反應(yīng)產(chǎn)生的14C02被捕捉在懸褂于反應(yīng)混合物上方大氣中浸泡堿液的濾 紙上，并在液閃計數(shù)器中計數(shù)。如下檢測了用本發(fā)明的方法和化合物對HIFoc的穩(wěn)定。將衍生自腺病 毒轉(zhuǎn)化的胎腎上皮(239A)、宮頸上皮腺癌(Hda)、肝細胞癌(H印3B)、 鱗狀上皮癌(SSC-25)的人細胞和肺成纖維細胞(HLF)(見美國典型培養(yǎng)物 保存中心，Manassas VA禾H Qbiogene， Carlsbad CA)分別接種在100mm培 養(yǎng)皿中，在37。C 、 20% 02 、 10%CO2下培養(yǎng)，培養(yǎng)基為HeLa細胞為 Dulbeeco改進的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)， 2%胎牛血清(FBS ); HLF細 胞為DMEM ， 10 % FBS; 293細胞為DMEM ， 5%FBS; Hep3B細胞為極 限必需培養(yǎng)基(MEM ), Earle，s BSS (Mediatech In . Herndon VA)， 2mM L-谷 氨酞胺，O.lmM非必須氨基酸，lmM丙酮酸鈉，10%FBS。當細胞層達到 鋪滿時，用OPTI誦MEM培養(yǎng)基(Invitrogen Life Technologies , Carlsbad CA) 替換原培養(yǎng)基，在37^C 、 20% 02 、 10% C02下培養(yǎng)細胞層約24小時。 然后在當前培養(yǎng)基中加入本發(fā)明化合物(化合物B 、 F 、 G和H之一) 或DMSO(0.5-1.0。/。)，繼續(xù)培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)后取出培養(yǎng)基，離心并保存待分析。用冷磷酸緩沖鹽水(PBS) 洗滌細胞二次，然后用1.0ml的10mM Tris (pH7.4) , lmM EDTA， 150mM NaCl，0.5。/。IGEPAL (Sigma-Aldrich， St丄ouis MO)和蛋白酶抑制劑混合物 (Roche Molecular Biochemicals )冰上裂解細胞15分鐘。4°C 3 ，OOOxg離 心細胞裂解物5分鐘，收集胞質(zhì)組分(上清液)。重懸細胞核用lOOpl 20mM HEPES (pH7.2) , 400mM NaCl ， lmM EDTA ，lmM 二硫蘇糖醇和蛋白酶混合 物(Roche Molecular Biochemicals)裂解，4°C 13000xg離心5分鐘，收集 核蛋白組分(上清液)。根據(jù)蛋白質(zhì)濃度標準化核組分，加到4-12% TG凝膠上，在還原條件 下分級。在500mA下1.5小時，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Invitrogen Corp., Carlsbad CA)上。用T-TBS， 2%牛奶室溫封閉該膜1小時，與用T-TBS , 2 %牛奶1:250稀釋的小鼠抗HIF-la抗體(BD Biosciences, Bedford MA) 培育過夜。用SUPERSIGNALWEST化學(xué)發(fā)光底物(Pierce , Rockford IL) 顯色印跡。如圖12A所示，本發(fā)明的代表性化合物(化合物D)以劑量依 賴方式穩(wěn)定了各種類型細胞中的HIFoc，使細胞中積累了 HIFou或者，用核抽提試劑盒制備核組分，并用TRANSAMHIF-1 ELISA試 劑盒子(Active Motif)按照制造商說明書分析HIF-la。如圖12B所示， Hep3B細胞當用本發(fā)明化合物處理時，顯示了劑量依賴性穩(wěn)定HIFa。圖 12B也顯示上皮細胞(293A)和肝細胞癌(Hep3B)用本發(fā)明各種化合物 (化合物B 、 F 、 G和H )處理后，與載體處理的對照細胞相比，顯示 了HIFa的穩(wěn)定和積累。除了本文所示和描述的以外，本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得可根據(jù)上述描寫對 本發(fā)明作各種修改。這些修改都落在本發(fā)明權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本文引用的所有參考文獻的內(nèi)容納入本文作參考。
<110>法布羅根股份有限公司(FibroGen, Inc.)V-京策爾一普卡爾(Guenzler-Pukall, Volkmar) S. J.克勞斯(Klaus, St印hen J.) L蘭斯特姆帕羅博克(Langsetmo Parobok, Ingrid) T.W.西利(Seeley, Todd W.)<120>糖尿病等的治療<130> FP0602.1 PCT<150> 60/431,351 <151〉 2002-12-06<150> 60/476,331 <151〉 2003-06-06<150> 60/476,726 <151> 2003-06-06<150> 未知 <151> 2003-12-04<160〉 5<170〉 Patentln version 3.2<210> 1 <211〉 23 〈212〉 DNA<213> 小家鼠(Mus musculus) <400> 1cccagg鄉(xiāng)a gagagatccg att<210> 2 <211> 23 <212〉 DNA<213> 小家鼠(Mus musculus) <400> 2aggtccctgg ctagtgcttc aga
<210> 3 <211> 22 <212〉 DNA<213> 黑鼠(Rattus rattus〉 <400> 3taggcacggc gactaccatc ga 22<210> 4 <211> 23 <212> DNA<213〉 黑鼠(Rattus rattus) <400> 4cggcggcttt ggtgactcta gat 23<210> 5 <211〉 19 <212> PRT<213> 智人(Homo sapiens) <400〉 5Asp Leu Asp Leu Glu Met Leu Ala Pro Tyr lie Pro Met Asp Asp Asp 15 10 15Phe Gin Leu
權(quán)利要求
1. 穩(wěn)定HIFα的制劑用于制造用于具有患糖尿病危險的個體治療或預(yù)防糖尿病的藥物的用途，其特征在于所述制劑是雜環(huán)羰基甘氨酸。
2. 如權(quán)利要求1所述的用途，其中所述雜環(huán)羰基甘氨酸是抑制HIF羥 化酶活性的化合物。
3. 如權(quán)利要求2所述的用途，其中所述化合物抑制HIF脯氨酰羥化酶 活性。
4. 穩(wěn)定HIFa的制劑用于制造治療或預(yù)防患有與血糖水平升高相關(guān)疾 病的個體中的藥物的用途，其特征在于所述制劑是雜環(huán)羰基甘氨酸。
5. 如權(quán)利要求4所述的用途，其中所述疾病選自高血糖癥，肥胖，高 血壓，高血脂癥，腎病，視網(wǎng)膜病變，葡萄糖耐受受損，動脈粥樣硬化和 血管疾病。
6. 如權(quán)利要求4所述的用途，其中所述雜環(huán)羰基甘氨酸是抑制HIF羥 化酶活性的化合物。
7. 如權(quán)利要求6所述的用途，其中所述化合物抑制HIF脯氨酰羥化酶 活性。
8. 穩(wěn)定HIFa的制劑用于制造的藥物的用途，所述藥物用于a. 調(diào)節(jié)葡萄糖代謝或葡萄糖代謝過程；b. 實現(xiàn)葡萄糖體內(nèi)平衡；c. 降低血糖水平；d. 降低糖化血紅素水平；e. 提高葡萄糖調(diào)節(jié)因子的表達；f. 改變糖酵解因子表達；g. 降低胰島素耐受；或h. 提高血糖水平控制； 其特征在于所述制劑是雜環(huán)羰基甘氨酸。
9. 如權(quán)利要求8所述的用途，其中所述葡萄糖代謝過程選自葡萄糖攝 取，葡萄糖轉(zhuǎn)運，葡萄糖儲存，葡萄糖加工和葡萄糖利用。
10. 如權(quán)利要求8所述的用途，其中所述葡萄糖調(diào)節(jié)因子選自磷酸果糖 激酶-P，磷酸果糖激酶-L，烯醇化酶，葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-1，乳酸脫氫酶、醛 縮酶-1、己糖激酶-1、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-l和胰島素祥生長因子。
11. 如權(quán)利要求8所述的用途，其中所述糖酵解因子選自磷酸果糖激酶 -P，磷酸果糖激酶-L，烯醇化酶-1，乳酸脫氫酶、醛縮酶-1、己糖激酶-1。
12.如權(quán)利要求8所述的用途，其中所述雜環(huán)羰基甘氨酸是抑制HIF羥 化酶活性的化合物。
13.如權(quán)利要求12所述的用途，其中所述化合物抑制HIF脯氨酰羥化酶活性。
全文摘要
本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)葡萄糖代謝、實現(xiàn)葡萄糖體內(nèi)平衡和降低血糖水平的方法和化合物。也提供了治療或預(yù)防糖尿病、高血糖癥和與葡萄糖代謝改變或受損相關(guān)的疾病和病癥的方法和化合物。
文檔編號A61K31/70GK101396559SQ20081017613
公開日2009年4月1日 申請日期2003年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月6日
發(fā)明者I·蘭斯特姆帕羅博克, S·J·克勞斯, T·W·西利, V·京策爾-普卡爾 申請人:法布羅根股份有限公司