專利名稱：用于治療和診斷卵巢癌的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及卵巢癌療法。更具體地說，本發(fā)明涉及包括卵巢癌蛋白質(zhì)的至少一部分的多肽類并涉及編碼這類多肽的多核苷酸以及特異性識別這類多肽的抗體和免疫系統(tǒng)細胞。可以將這類多肽、多核苷酸、抗體和細胞用于治療卵巢癌的疫苗和藥物組合物中。
背景技術(shù)：
卵巢癌在美國和全世界范圍內(nèi)是危害婦女健康的一個顯著問題。盡管在檢測和治療這種癌癥方面已經(jīng)取得了發(fā)展，但是目前尚未獲得用于預(yù)防或治療的疫苗或其它普遍成功的方法?？刂七@種疾病目前依賴于將早期診斷與攻擊性治療結(jié)合起來的方法，所述的攻擊性治療包括諸如外科手術(shù)、放療、化療和激素療法這樣各種療法中的一種或多種。通常以包括分析特異性腫瘤標(biāo)記在內(nèi)的各種預(yù)后參數(shù)為基礎(chǔ)來選擇針對特定癌癥的治療過程。然而，使用確定的標(biāo)記通常產(chǎn)生難以解釋的結(jié)果且在許多癌癥患者中觀察到持續(xù)發(fā)生高死亡率。
免疫療法具有基本上改善癌癥治療和存活率的潛能。這類療法可以包括對卵巢癌抗原產(chǎn)生或增強免疫反應(yīng)的過程。然而，迄今為止，了解到的卵巢癌抗原相對較少且尚未證實對抗原產(chǎn)生的免疫反應(yīng)對治療有利。
因此，本領(lǐng)域中存在對鑒定卵巢腫瘤抗原和在卵巢癌療法中使用這類抗原的改進方法的需求。本發(fā)明滿足了這些需求并進一步提供了其它相關(guān)的優(yōu)點。
和方法。在一個方面中，本發(fā)明提供了包括卵巢癌蛋白質(zhì)的免疫原性部分或在一種或多種取代、缺失、添加和/或插入方面有差異的其變化形式的多肽類，使得該變化形式與卵巢癌蛋白質(zhì)特異性抗血清反應(yīng)的能力基本上不會被削弱。在某些實施方案中，所述的卵巢癌蛋白質(zhì)包括由選自SEQID NOs1-81、313-331、359、366、379、385-387或391組成的組的多核苷酸序列和這類多核苷酸的互補物編碼的序列。
本發(fā)明進一步提供了編碼如上所述的多肽或其部分的多核苷酸、包括這類多核苷酸的表達載體和用這類表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細胞。
在其它方面中，本發(fā)明提供了藥物組合物和疫苗。藥物組合物可以包括生理上可接受的載體或賦形劑以及下列物質(zhì)中的一種或多種(i)一種包括卵巢癌蛋白質(zhì)的免疫原性部分或在一種或多種取代、缺失、添加和/或插入方面有差異的其變化形式的多肽，使得該變化形式與卵巢癌蛋白質(zhì)特異性抗血清反應(yīng)的能力基本上不會被削弱，其中所述的卵巢癌蛋白質(zhì)包括以SEQ ID NOs1-81、313-331、359、366、379、385-387或391中任意一種描述的序列；(ii)一種編碼這類多肽的多核苷酸；(iii)一種與這類多肽特異性結(jié)合的抗體；(iv)一種表達這類多肽的抗原呈遞細胞；和/或(v)一種與這類多肽發(fā)生特異性反應(yīng)的T細胞。疫苗可以包括非特異性免疫反應(yīng)增強劑和下列物質(zhì)中的一種或多種(i)一種包括卵巢癌蛋白質(zhì)的免疫原性部分或在一種或多種取代、缺失、添加和/或插入方面有差異的其變化形式的多肽，使得該變化形式與卵巢癌蛋白質(zhì)特異性抗血清反應(yīng)的能力基本上不會被削弱，其中所述的卵巢癌蛋白質(zhì)包括內(nèi)多核苷酸編碼的氨基酸序列，所述的多核苷酸包括以SEQID NOs1-81、313-331、359、366、379、385-387或391中任意一種描述的序列；(ii)一種編碼這類多肽的多核苷酸；(iii)一種被特異性結(jié)合這類多肽的抗體所特異性結(jié)合的抗獨特型抗體；(iv)一種表達這類多肽的抗原呈遞細胞；和/或(v)一種與這類多肽發(fā)生特異性反應(yīng)的T細胞。
在其它方面中，本發(fā)明進一步提供了包括如上所述的至少一種多肽的融合蛋白以及編碼這類融合蛋白的多核苷酸。
在相關(guān)的方面中，本發(fā)明提供了包括融合蛋白或編碼融合蛋白的多核苷酸以及生理上可接受的載體的藥物組合物。
在其它方面中，本發(fā)明進一步提供了包括融合蛋白或編碼融合蛋白的多核苷酸以及非特異性免疫反應(yīng)增強劑的疫苗。
在其它方面中，本發(fā)明提供了用于抑制患者體內(nèi)癌癥發(fā)生的方法，該方法包括給患者施用如上所述的藥物組合物或疫苗的步驟。
在其它方面中，本發(fā)明進一步提供了用于刺激和/或擴充T細胞的方法，該方法包括使T細胞與下列物質(zhì)接觸的步驟(a)一種多肽，它包括至少一種卵巢癌蛋白質(zhì)的免疫原性部分或在一種或多種取代、缺失、添加和/或插入方面有差異的其變化形式，使得該變化形式與卵巢癌蛋白質(zhì)特異性抗血清反應(yīng)的能力基本上不會被削弱，其中卵巢癌蛋白質(zhì)包括由多核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述的多核苷酸序列包括以SEQ IDNOs1-387或391中任意一種描述的序列；(b)一種編碼這類多肽的多核苷酸；和/或(c)一種在足以刺激和/或擴充T細胞的條件和時間下表達這類多肽的抗原呈遞細胞。這類多肽、多核苷酸和/或抗原呈遞細胞可以存在于藥物組合物或疫苗內(nèi)以便用于刺激和/或擴充哺乳動物體內(nèi)的T細胞。
在其它方面中，本發(fā)明提供了用于抑制患者體內(nèi)卵巢癌發(fā)生的方法，該方法包括給患者施用如上所述制備的T細胞的步驟。
在其它方面中，本發(fā)明提供了用于抑制患者體內(nèi)卵巢癌發(fā)生的方法，該方法包括下列步驟(a)用下列物質(zhì)中的一種或多種培養(yǎng)分離自患者的CD4+和/或CD8+T細胞(i)一種多肽，它包括至少一種卵巢癌蛋白質(zhì)的免疫原性部分或在一種或多種取代、缺失、添加和/或插入方面有差異的其變化形式，使得該變化形式與卵巢癌蛋白質(zhì)特異性抗血清反應(yīng)的能力基本上不會被削弱，其中卵巢癌蛋白質(zhì)包括由多核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述的多核苷酸包括以SEQ ID NOs1-387或391中任意一種描述的序列；(ii)一種編碼這類多肽的多核苷酸；或(iii)一種表達這類多肽的抗原呈遞細胞；從而使T細胞增殖；和(b)給患者施用有效量的增殖的T細胞并由此抑制患者體內(nèi)卵巢癌的發(fā)生?？梢栽趯颊呓o藥前克隆增殖的細胞。
在其它方面中，本發(fā)明還提供了用于鑒定分泌的腫瘤抗原的方法。這類方法包括下列步驟(a)將腫瘤細胞植入免疫缺陷型哺乳動物體內(nèi)；(b)在足以使腫瘤抗原分泌入血清的一定時間后從免疫缺陷型哺乳動物體內(nèi)獲得血清；(c)給免疫活性哺乳動物免疫接種該血清；(d)從免疫活性哺乳動物體內(nèi)獲得抗血清；和(e)用該抗血清篩選腫瘤表達文庫且由此鑒定分泌的腫瘤抗原。一種用于鑒定分泌的卵巢癌抗原的優(yōu)選方法包括下列步驟(a)將卵巢癌細胞植入SCID小鼠體內(nèi)；(b)在足以使卵巢癌抗原分泌入血清的一定時間后從SCID小鼠體內(nèi)獲得血清；(c)給免疫活性免疫小鼠接種該血清；(d)從免疫活性小鼠體內(nèi)獲得抗血清；和(e)用該抗血清篩選卵巢癌表達文庫且由此鑒定分泌的卵巢癌抗原。
本發(fā)明的這些和其它方面在參照下面的具體描述和所附的附圖時將變得顯而易見。將本文所公開的所有參考文獻的全部內(nèi)容引入本文作為參考，就如同將它們分別引入作為參考一樣。
附圖簡述
附

圖1A-1S(SEQ ID NOs1-71)描述了編碼有代表性的分泌的卵巢癌抗原的多核苷酸的部分序列。
附圖2A-2C描述了附圖1克隆中的三種的全插入序列。附圖2A表示命名為07E的序列(11731；SEQ ID NO72)；附圖2B表示命名為09E的序列(11785；SEQ ID NO73)且附圖2C表示命名為08E的序列(13695；SEQ ID NO74)。
附圖3提供了對命名為08E的卵巢癌序列的顯微排列表達分析結(jié)果。
附圖4提供了編碼卵巢癌序列的多核苷酸部分序列(命名為3g；SEQID NO75)，其中所述的卵巢癌序列是一種位于人T-細胞白血病I型病毒癌蛋白質(zhì)TAX與骨粘連蛋白之間的剪接融合體。
附圖5提供了命名為3f(SEQ ID NO76)的卵巢癌多核苷酸。
附圖6提供了命名為6b(SEQ ID NO77)的卵巢癌多核苷酸。
附圖7A和7B提供了命名為8e(SEQ ID NO78)和8h(SEQ ID NO79)的卵巢癌多核苷酸。
附圖8提供了命名為12c(SEQ ID NO80)的卵巢癌多核苷酸。
附圖9提供了命名為12h(SEQ ID NO81)的卵巢癌多核苷酸。
附圖10描述了對命名為3f的卵巢癌序列的顯微排列表達分析結(jié)果。
附圖11描述了對命名為6b的卵巢癌序列的顯微排列表達分析結(jié)果。
附圖12描述了對命名為8e的卵巢癌序列的顯微排列表達分析結(jié)果。
附圖13描述了對命名為12c的卵巢癌序列的顯微排列表達分析結(jié)果。
附圖14描述了對命名為12h的卵巢癌序列的顯微排列表達分析結(jié)果。
附圖15A-15EEE描述了編碼有代表性的分泌的卵巢癌抗原的附加的多核苷酸的部分序列(SEQ ID NOs82-310)。
附圖16是說明全長序列內(nèi)各種部分08E序列的位置的示意圖。
發(fā)明詳述
如上所述，本發(fā)明一般涉及用于治療諸如卵巢癌這樣的癌癥的組合物和方法。本文所述的組合物可以包括免疫原性多肽類、編碼這類多肽的多核苷酸、諸如與多肽結(jié)合的抗體這樣的結(jié)合劑、抗原呈遞細胞(APCs)和/或免疫系統(tǒng)細胞(例如T細胞)。
本發(fā)明的多肽類一般包括至少一種卵巢癌蛋白質(zhì)的免疫原性部分或其變化形式。已經(jīng)使用免疫測定技術(shù)鑒定了某些卵巢癌蛋白質(zhì)且在本文中將其稱作卵巢癌抗原。“卵巢癌抗原”是一種以比正常卵巢細胞水平至少高兩倍水平的卵巢腫瘤細胞(優(yōu)選人體細胞)表達的蛋白質(zhì)。某些卵巢癌抗原以可檢測到的方式(在一種諸如ELISA或蛋白質(zhì)印跡這樣的免疫測定中)與針對來自植入了人卵巢腫瘤的免疫缺陷型動物的血清而產(chǎn)生的抗血清發(fā)生反應(yīng)。這類卵巢癌抗原從卵巢腫瘤中排出或分泌入免疫缺陷型動物的血清。因此，本文所提供的某些卵巢癌抗原是分泌抗原。本發(fā)明主題的某些核酸序列一般包括編碼全部或部分這類多肽的DNA或RNA序列或與這類序列互補。
本發(fā)明進一步提供了使用評價卵巢腫瘤內(nèi)表達改變的技術(shù)所鑒定的卵巢癌序列。這類序列可以是多核苷酸或蛋白質(zhì)序列。正如使用本文提供的有代表性的測定法所測定的，一般在卵巢腫瘤中表達卵巢癌序列的水平至少高于正常卵巢組織內(nèi)的表達水平兩倍、且優(yōu)選至少高5倍。本文提供了某些卵巢癌多核苷酸的部分序列。還將由包括這類多核苷酸序列(或其互補物)的基因編碼的蛋白質(zhì)看作是卵巢癌蛋白質(zhì)。
抗體一般是如本文描述的能夠結(jié)合至少部分卵巢癌多肽的免疫系統(tǒng)蛋白質(zhì)或其抗原結(jié)合片段。可以在本文提供的組合物中使用的T細胞一般是對這類多肽具有特異性的T細胞(例如CD4+和/或CD8+)。本文所述的某些方法進一步使用了表達如本文所提供的卵巢癌多肽的抗原呈遞細胞(諸如樹突細胞或巨噬細胞)。
卵巢癌多核苷酸
本發(fā)明包括編碼如本文所述的卵巢癌蛋白質(zhì)或其部分或其其它變化形式的任意多核苷酸。優(yōu)選的多核苷酸包括至少15個連續(xù)的核苷酸、優(yōu)選至少30個連續(xù)的核苷酸且更優(yōu)選至少45個連續(xù)的核苷酸，它們可編碼卵巢癌蛋白質(zhì)的一部分。更優(yōu)選地，一種多核苷酸編碼諸如卵巢癌抗原這樣的卵巢癌蛋白質(zhì)的免疫原性部分。本發(fā)明還包括與任意這類序列互補的多核苷酸。多核苷酸可以是單鏈(編碼或反義的)或雙鏈的且可以是DNA(基因組、cDNA或合成的)或RNA分子。附加的編碼或非編碼序列可以(但并不需要)存在于本發(fā)明的多核苷酸內(nèi)且多核苷酸可以(但并不需要)與其它分子和/或支持物連接。
多核苷酸可以包括天然序列(即編碼卵巢癌蛋白質(zhì)或其部分的內(nèi)源性序列)或可以包括這類序列的變化形式。多核苷酸變化形式可以含有一種或多種取代、缺失、添加和/或插入，使得所編碼的多肽的免疫原性相對于天然卵巢癌蛋白質(zhì)來說不會被削弱。一般可以如本文所述評價對所編碼的多肽的免疫原性的作用。變化形式優(yōu)選表現(xiàn)出與編碼天然卵巢癌蛋白質(zhì)或其部分的多核苷酸序列至少約70％的同一性、更優(yōu)選至少約80％的同一性且最優(yōu)選至少約90％的同一性。
兩種多核苷酸或多肽序列的同一性百分比可以通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的諸如Megalign這樣的應(yīng)用默認(rèn)參數(shù)的計算機算法對序列進行比較而方便地測定。兩種序列之間的比較一般通過比較用于鑒定和比較序列相似性的局部區(qū)域的比較窗口內(nèi)的序列來進行。本文所用的“比較窗口”指的是至少約20個相鄰位置、通常30-約75或40-約50個相鄰位置的區(qū)段，其中可以在使兩種序列進行最佳排列后對序列與相鄰位置的相同數(shù)量的參考序列進行比較。例如，可以使用應(yīng)用默認(rèn)參數(shù)的生物信息學(xué)軟件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)Lasergene組中的Megalign程序?qū)τ糜诒容^的序列進行最佳排列。優(yōu)選通過對至少20個位置比較窗口內(nèi)的兩種最佳排列的序列進行比較來測定序列同一性的百分比，其中窗口內(nèi)的多核苷酸或多肽序列的部分可以包括相對于參考序列(不含添加或缺失)來說為20％或20％以下、通常為5-15％或10-12％的添加或缺失(即缺口)。同一性百分比可以通過如下方法來計算測定相同核酸堿基或氨基酸殘基在兩種序列中出現(xiàn)的位置的數(shù)目得到配對位置的數(shù)目，將配對位置的數(shù)目除以參考序列中位置的總數(shù)(即窗口大小)并將結(jié)果乘以100得到序列同一性百分比。
此外或另一方面，變化形式可以基本上與天然基因或其部分或其互補物同源。這類多核苷酸變化形式能夠在中等嚴(yán)格條件下與天然出現(xiàn)的編碼天然卵巢癌蛋白質(zhì)的DNA序列(或互補序列)雜交。合適的中等嚴(yán)格條件包括在5％X SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)的溶液中預(yù)洗滌；在50℃-65℃下、5X SSC條件下雜交過夜；隨后在65℃下用含有0.1％SDS的2X、0.5X和0.2X SSC洗滌共兩次、每次20分鐘。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解存在編碼本文所述的多肽的許多核苷酸序列作為遺傳密碼簡并的結(jié)果。這些多核苷酸中的某些與任意天然基因中的核苷酸序列具有最低限度的同源性。盡管如此，但是本發(fā)明特別關(guān)注因密碼子選擇上的差異而改變的多核苷酸。此外，包括本文所提供的多核苷酸序列的基因的等位基因?qū)儆诒景l(fā)明的范圍。等位基因是作為一種或多種諸如核苷酸缺失、添加和/或取代這樣的突變結(jié)果而改變的內(nèi)源性基因。所得的mRNA和蛋白質(zhì)可以(但并不需要)具有改變的結(jié)構(gòu)或功能?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)(諸如雜交、擴增和/或數(shù)據(jù)庫序列比較)來鑒定等位基因。
使用任意不同的技術(shù)可以制備多核苷酸。例如，正如下面更詳細地描述的，在給免疫活性小鼠注射來自植入了晚期傳代卵巢腫瘤的SCID小鼠血清后，可以通過用針對這類小鼠血清產(chǎn)生的抗血清篩選晚期傳代卵巢腫瘤表達文庫來鑒定卵巢癌多核苷酸。還可以使用用于評價不同基因表達的任意不同技術(shù)來鑒定卵巢癌多核苷酸。另一方面，可以從由卵巢腫瘤細胞制備的cDNA來擴增多核苷酸。通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)可以擴增這類多核苷酸。就這一手段而言，可以以本文提供的序列為基礎(chǔ)設(shè)計序列特異性引物且可以商購或合成序列特異性引物。
可以使用眾所周知的技術(shù)將擴增的部分用于從合適的文庫(例如卵巢癌cDNA文庫)中分離全長基因。在這類技術(shù)中，使用一種或多種適合于擴增的多核苷酸探針或引物來選擇文庫(cDNA或基因組文庫)。優(yōu)選將文庫進行大小選擇以便包括較大的分子。還可以優(yōu)先選擇用于鑒定基因5’和上游區(qū)的隨機引物文庫。優(yōu)先選擇基因組文庫以便用于獲得內(nèi)含子和延伸的5’序列。
就雜交技術(shù)而言，可以使用眾所周知的技術(shù)標(biāo)記部分序列(例如通過切口平移或用32P末端標(biāo)記)。然后通過將含有變性細菌菌落(或含有噬菌體斑的菌苔)的濾膜與標(biāo)記的探針雜交來篩選細菌或噬菌體文庫(參見Sambrook等人，《分子克隆》(Molecular Cloning)“實驗室手冊”(A Laboratory Manual)，美國冷泉港實驗室(Cold Spring HarborLaboratories)，紐約冷泉港，1989)。選擇雜交菌落或噬菌斑并使其擴大且分離DNA用于進一步的分析?？梢苑治鯿DNA克隆以便例如通過使用來自部分序列的引物和來自載體的引物進行PCR來測定添加序列的數(shù)量?？梢陨上拗泼笀D譜和部分序列以便鑒定一種或多種重疊的克隆。然后使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以測定完全的序列，這一過程可以包括產(chǎn)生一系列缺失克隆。接著將所得的重疊序列裝配成單一的鄰接序列。通過使用眾所周知的技術(shù)連接合適的片段可以產(chǎn)生全長cDNA分子。
另一方面，存在大量用于從部分cDNA序列中獲得全長編碼序列的擴增技術(shù)。在這類技術(shù)中，擴增一般通過PCR來進行。可以將任意不同的商購試劑盒用于進行擴增步驟。例如，可以使用本領(lǐng)域中眾所周知的軟件來設(shè)計引物。優(yōu)選引物具有22-30個核苷酸的長度、具有至少50％的GC含量并在約68℃-72℃的溫度下與靶序列一起退火?？梢匀缟纤鰷y序擴增的區(qū)域并將重疊的序列裝配成鄰接序列。
一種這類擴增技術(shù)是反向聚合酶鏈反應(yīng)(參見Triglia等人，《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)168186，1988)，該技術(shù)使用限制酶來產(chǎn)生公知基因區(qū)域內(nèi)的片段。然后通過分子內(nèi)連接使該片段成環(huán)形并用作使用來源于公知區(qū)域的分歧引物進行PCR的模板。在一種可選擇的手段中，可以通過使用針對接頭序列的引物和對已知區(qū)域具有特異性的引物進行擴增來恢復(fù)與部分序列鄰接的序列。一般使用相同的接頭序列和對已知區(qū)域具有特異性的引物對擴增的序列進行第二輪擴增。關(guān)于應(yīng)用兩種啟動從已知序列向反向延伸的引物的這一過程的變化形式描述在WO96/38591中。另外的技術(shù)包括俘獲PCR(Lagerstrom等人，《實用PCR方法》(PCR Methods Applic.)1111-19，1991)和步行PCR(Parker等人，《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)193055-60，1991)。還可以使用應(yīng)用擴增的其它方法以便獲得全長cDNA序列。
在某些情況中，能夠通過對諸如商購自GenBank的表達序列標(biāo)記(EST)數(shù)據(jù)庫中提供的序列進行分析而獲得全長cDNA序列。一般使用眾所周知的程序可以對重疊ESTs進行檢索(例如NCBI BLAST檢索)且可以將這類ESTs用于產(chǎn)生連續(xù)的全長序列。
在附圖1A-1S(SEQ ID NOS1-71)和附圖15A-15EEE(SEQ ID NOs82-310)中提供了編碼卵巢癌抗原部分的cDNA分子的某些核酸序列。附圖1A-1S中提供的序列看起來是新的。就附圖15A-15EEE中的序列而言，數(shù)據(jù)庫檢索顯示了基本上具有同一性的配對序列。通過使用用于鑒定分泌的腫瘤抗原的技術(shù)對卵巢腫瘤cDNA表達文庫進行血清學(xué)篩選來分離這些多核苷酸。簡單地說，由載體λ-篩選(Novagen)中SCID-衍生的人卵巢腫瘤(OV9334)制備晚期傳代卵巢腫瘤表達文庫。通過給免疫活性小鼠注射來自植入了一種晚期傳代卵巢腫瘤的SCID小鼠的血清而獲得篩選用血清。這項技術(shù)使得鑒定編碼分泌腫瘤抗原的免疫原性部分的cDNA分子成為可能。
本發(fā)明特別包括本文所述的多核苷酸、以及包括這類序列的全長多核苷酸、這類全長多核苷酸的其它部分和與這類全長分子的全部或部分互補的序列。還可以將這項技術(shù)用于鑒定分泌自其它類型腫瘤的抗原，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。
附圖4-9(SEQ ID NOs75-81)以及SEQ ID NOs313-384中提供了編碼卵巢癌蛋白質(zhì)部分的cDNA分子的其它核酸序列。通過篩選用于與腫瘤相關(guān)的表達(即正如使用本文提供的有代表性的檢測試驗所測定的，在卵巢腫瘤中比在正常卵巢組織中至少大5倍的表達)的cDNAs的顯微排列來鑒定這些序列。使用Synteni顯微排列(Palo Alto，CA)、按照制造商的說明(且主要如Schena等在《美國國家科學(xué)院院報》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)9310614-10619，1996和Heller等在《美國國家科學(xué)院院報》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)942150-2155，1997中所述)來進行這類篩選。SEQ ID NOs311和391提供了摻入這些核酸序列中的某些的全長序列。
可以將任意不同的眾所周知的技術(shù)用于評價與腫瘤相關(guān)的cDNA的表達。例如，可以使用應(yīng)用標(biāo)記的多核苷酸探針的雜交技術(shù)。另一方面或此外，可以使用諸如實時PCR的擴增技術(shù)(參見Gibson等人，《基因組研究》(Genome Research)6995-1001，1996；Heid等人，《基因組研究》(Genome Research)6986-994，1996)。實時PCR是一種評價擴增過程中PCR產(chǎn)物累積水平的技術(shù)。這項技術(shù)使得在多個樣品中定量評價mRNA的水平成為可能。簡單地說，從腫瘤和正常組織中提取mRNA并使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備cDNA。例如，可以使用Perkin Elmer/Applied Biosystems(Foster City，CA)7700 Prism儀器進行實時PCR。例如，可以使用由Perkin Elmer/Applied Biosystems(Foster City，CA)提供的引物表達程序為所關(guān)注的基因設(shè)計配對引物和熒光探針。開始可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員測定引物和探針的最佳濃度且對照(例如β-肌動蛋白)引物和探針例如可以商購自Perkin Elmer/Applied Biosystems(Foster City，CA)。為了對樣品中特異性RNA的量進行定量，在使用含有所關(guān)注基因的質(zhì)粒的同時生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。可以使用實時PCR中測定的Ct值生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，它們與檢測試驗中所用的起始cDNA濃度相關(guān)。10-106所關(guān)注基因的拷貝范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)稀釋度一般是足夠的。此外，生成對照序列的標(biāo)準(zhǔn)曲線。這要求對組織樣品中的起始RNA含量與用于比較目的的對照組量進行標(biāo)準(zhǔn)化。
一般可以通過包括例如通過固相亞磷酰胺化學(xué)合成法在內(nèi)的本領(lǐng)域中已知的任意方法來制備多核苷酸的變化形式。還可以使用諸如寡核苷酸定向位點特異性誘變(參見Adelman等人，《DNA》2183，1983)這樣的標(biāo)準(zhǔn)誘變技術(shù)在多核苷酸序列中引入修飾。另一方面，可以通過體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄編碼卵巢癌抗原或其部分的DNA序列來生成RNA分子，條件是用合適的RNA聚合酶啟動子(諸如T7或SP6)將所述DNA引入載體。如本文所述，可以將某些部分用于制備編碼的多肽。此外或另一方面，可以給患者施用某一部分，使得在體內(nèi)生成編碼的多肽。
還可以將與編碼序列互補的序列的一部分(即反義多核苷酸)用作探針或調(diào)制基因表達。也可以將可轉(zhuǎn)錄成反義RNA的cDNA構(gòu)建體引入細胞或組織以便有利于產(chǎn)生反義RNA?？梢匀绫疚乃鍪褂梅戳x多核苷酸以便抑制卵巢癌蛋白質(zhì)的表達?？梢詫⒎戳x技術(shù)用于通過形成三股螺旋而控制基因表達，這一過程危及到雙螺旋為結(jié)合聚合酶、轉(zhuǎn)錄因子或調(diào)節(jié)分子而充分打開的能力(參見Gee等人，在Huber和Carr的《分子和免疫手段》(Molecular and Immunologic Approaches)，F(xiàn)utura PublishingCo.(Mt.Kisco，NY；1994)中所述)。另一方面，可以將反義分子設(shè)計成與基因的控制區(qū)(例如啟動子、增強子或轉(zhuǎn)錄起始位點)雜交并阻斷該基因的轉(zhuǎn)錄或通過抑制轉(zhuǎn)錄物與核糖體的結(jié)合而阻斷翻譯。
可以將任意多核苷酸進一步進行修飾以便增加體內(nèi)的穩(wěn)定性?？赡艿男揎棸ǖ幌抻谠?’和/或3’末端添加側(cè)翼序列；在主鏈中使用硫代磷酸酯或2’O-甲基硫代磷酸酯而不是磷酸二酯酶鍵；和/或包括諸如肌苷、queosine和wybutosine這樣的非傳統(tǒng)堿基以及乙?；?、甲基、硫代和其它修飾形式的腺嘌呤、胞苷、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和鳥苷。
可以使用確立的重組DNA技術(shù)使本文所述的核苷酸序列與各種其它核苷酸序列連接。例如，可以將多核苷酸克隆入包括質(zhì)粒、噬菌粒、λ噬菌體衍生物和粘粒在內(nèi)的任意不同克隆載體。特別關(guān)注的載體包括表達載體、復(fù)制載體、探針生成載體和測序載體。一般來說，載體將含有在至少一種生物體中有功能的復(fù)制起點、便利的限制性核酸內(nèi)切酶位點和一種或多種選擇性標(biāo)記。其它元件將取決于所需的用途且這對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。
在某些實施方案中，可以配制多核苷酸以便使它們進入哺乳動物細胞并在其中進行表達。這類制劑特別可用于如下所述的治療目的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解存在許多在靶細胞中表達多核苷酸的方法且可以使用任意合適的方法。例如，可以將多核苷酸引入病毒載體，諸如但不限于腺病毒、與腺相關(guān)的病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或牛痘或其它痘病毒(例如鳥類痘病毒)。用于將DNA摻入這類載體的技術(shù)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是眾所周知的。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以另外轉(zhuǎn)移或摻入用于選擇性標(biāo)記的基因(以便有助于鑒定或選擇轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞)和/或靶向部分，諸如編碼特異性靶細胞上受體的配體的基因以便使所述載體變?yōu)榘刑禺愋暂d體。還可以使用抗體、通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來完成定向。
用于治療目的的其它制劑包括膠體分散系統(tǒng)，諸如大分子復(fù)合物、微膠囊、微球體、珠和包括水包油乳液、膠粒、混合膠粒和脂質(zhì)體在內(nèi)的以脂類為基礎(chǔ)的系統(tǒng)。優(yōu)選用作體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)運載體的膠體系統(tǒng)是脂質(zhì)體(即人工膜囊泡)。這類系統(tǒng)的制備方法和應(yīng)用在本領(lǐng)域中是眾所周知的。
卵巢癌多肽類
在本發(fā)明的上下文中，多肽類可以包括如本文所述的至少一種卵巢癌蛋白質(zhì)的免疫原性部分或其變化形式。如上所述，某些卵巢癌蛋白質(zhì)是由卵巢腫瘤細胞表達的卵巢癌抗原且它們在免疫測定(諸如ELISA)中以可檢測到的方式與針對來自植入了卵巢腫瘤的免疫缺陷型動物的血清而產(chǎn)生的抗血清發(fā)生反應(yīng)。其它的卵巢癌蛋白質(zhì)由本文所述的卵巢癌多核苷酸編碼。本文所述的多肽類可以具有任意長度?？赡艽嬖趤碓从谔烊坏鞍踪|(zhì)和/或異源序列的另外的序列且這類序列可以(但并不需要)進一步具有免疫原性或抗原特性。
本文所用的“免疫原性部分”是一種被B-細胞和/或T-細胞表面抗原受體所識別(即特異性結(jié)合)的抗原的一部分。這類免疫原性部分一般包括至少5個卵巢癌蛋白質(zhì)或其變化形式的氨基酸殘基、更優(yōu)選至少10個氨基酸殘基且更優(yōu)選至少20個氨基酸殘基。優(yōu)選的免疫原性部分由如本文所述分離的cDNA分子編碼。使用眾所周知的技術(shù)一般可以鑒定另外的免疫原性部分，這類技術(shù)概括在Paul的《基礎(chǔ)免疫學(xué)》(FundamentalImmunology)第3版243-247(Raven Press，1993)及其中的參考文獻中。這類技術(shù)包括篩選能夠與卵巢癌蛋白質(zhì)特異性抗體、抗血清和/或T-細胞系或克隆反應(yīng)的多肽類。如本文所述，如果抗血清和抗體與卵巢癌蛋白質(zhì)特異性結(jié)合(即它們在ELISA或其它免疫測定中與卵巢癌蛋白質(zhì)反應(yīng)且不與不相關(guān)的蛋白質(zhì)以可檢測到的方式反應(yīng))，那么它們是“卵巢癌蛋白質(zhì)特異性的”。如本文所述且使用眾所周知的技術(shù)可以制備這類抗血清、抗體和T細胞。天然卵巢癌蛋白質(zhì)的免疫原性部分是一種以基本上不低于全長多肽反應(yīng)性的水平與這類抗血清、抗體和/或T-細胞反應(yīng)的部分(例如在ELISA和/或T-細胞反應(yīng)性檢測試驗中)。這類免疫原性部分可以在這類檢測試驗中以類似于或高于全長蛋白質(zhì)反應(yīng)性的水平發(fā)生反應(yīng)。一般可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法來進行這類篩選，諸如那些描述在Harlow和Lane的《抗體》(Antibodies)“實驗室手冊”(A Laboratory Manual)，美國冷泉港實驗室(Cold Spring HarborLaboratory)，1988中的方法。例如，可以將多肽固定在固體支持物上并與患者的血清接觸以使抗體在血清內(nèi)與固定化多肽結(jié)合。然后將未結(jié)合的血清除去并使用例如125I-標(biāo)記的蛋白質(zhì)A來檢測結(jié)合的抗體。
如上所述，一種組合物可以包括天然卵巢癌蛋白質(zhì)的變化形式。本文所用的多肽“變化形式”是一種在一種或多種取代、缺失、添加和/或插入方面不同于天然卵巢癌蛋白質(zhì)的多肽，使得該多肽的免疫原性基本上不會被削弱。換句話說，相對于天然卵巢癌蛋白質(zhì)來說，變化形式與卵巢癌蛋白質(zhì)特異性抗血清反應(yīng)的能力可以得到增強或不會改變；或可以使這種能力比天然卵巢癌蛋白質(zhì)降低50％以下且優(yōu)選降低20％以下。一般可以通過修飾上述多肽序列之一并評價所修飾的多肽與本文所述的卵巢癌蛋白質(zhì)特異性抗體或抗血清的反應(yīng)性來鑒定這類變化形式。優(yōu)選的變化形式包括諸如N-末端前導(dǎo)序列或跨膜結(jié)構(gòu)域這樣的一種或多種部分已經(jīng)被除去的那些變化形式。其它優(yōu)選的變化形式包括已經(jīng)將小部分(例如1-30個氨基酸、優(yōu)選5-15個氨基酸)從成熟蛋白質(zhì)的N-和/或C-末端除去的變化形式。
多肽變化形式優(yōu)選顯示出與天然多肽具有至少約70％、更優(yōu)選至少約90％且最優(yōu)選至少約95％的同一性。優(yōu)選一種變化形式含有保守置換。“保守置換”是一種氨基酸取代另一種具有相似特性的氨基酸的情況，使得肽化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以預(yù)測基本上未改變的多肽的二級結(jié)構(gòu)和親水性。氨基酸取代一般可以以其殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩親性為基礎(chǔ)來進行。例如，帶負(fù)電荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；且?guī)в芯哂邢嗨朴H水值的不帶電荷的極性頭基團的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；以及絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸?？梢源肀Ｊ匦愿淖兊钠渌M的氨基酸包括(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；和(5)phe、tyr、trp、his。另外或另一方面，一種變化形式可以含有非保守性改變。例如，還(或另外)可以通過缺失或添加對多肽的免疫原性、二級結(jié)構(gòu)和親水性具有最低影響的氨基酸來修飾變化形式。
如上所述，多肽類可以包括共同翻譯或翻譯后指導(dǎo)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)的N-末端上的信號(或前導(dǎo))序列。還可以使該多肽與一種接頭或易于合成、純化或鑒定該多肽(例如聚-His)或促進該多肽與固體支持物結(jié)合的其它序列結(jié)合。例如，可以使多肽與免疫球蛋白Fc區(qū)接合。
可以使用任意不同的眾所周知的技術(shù)來制備多肽類。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意不同的表達載體可以方便地由DNA序列制備由如本文所述的DNA序列編碼的重組多肽類?？梢栽谝呀?jīng)用含有編碼重組多肽的DNA分子的表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的合適的宿主細胞內(nèi)進行表達。合適的宿主細胞包括原核細胞、酵母和高等真核細胞。優(yōu)選所用的宿主細胞是大腸桿菌、酵母或諸如COS或CHO這樣的哺乳動物細胞系?？梢允紫仁褂蒙藤彽臑V膜濃縮來自將重組蛋白質(zhì)或多肽分泌入培養(yǎng)基的合適的宿主/載體系統(tǒng)的上清液。在濃縮后，可以將濃縮物施用于諸如親和性基質(zhì)或離子交換樹脂這樣的合適的純化基質(zhì)。最后，可以使用一個或多個反向HPLC步驟來進一步純化重組多肽。
還可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)、通過合成方式來生產(chǎn)具有少于約100個氨基酸且一般少于約50個氨基酸的部分和其它變化形式。例如，可以使用任意商購的固相技術(shù)、諸如Merrifield固相合成法來合成這類多肽，其中將氨基酸依次添加到不斷伸長的氨基酸鏈上。參見Merrifield的《美國化學(xué)協(xié)會雜志》(J.Am.Chem.Soc.)852149-2146，1963。自動化合成多肽類的設(shè)備商購自諸如AppliedBioSystems，Inc.(Foster City，CA)這樣的供應(yīng)商且可以按照制造商的說明操作它。
在某些具體的實施方案中，多肽可以是包括本文所述的多個多肽或包括一種如本文所述的多肽和一種諸如卵巢癌蛋白質(zhì)或這類蛋白質(zhì)的變化形式這樣的已知腫瘤抗原的融合蛋白。例如，融合配偶體可以輔助產(chǎn)生T輔助細胞表位(一種免疫融合配偶體)、優(yōu)選由人識別的T輔助細胞表位或可以輔助以高于天然重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)量表達蛋白質(zhì)(表達增強子)。某些優(yōu)選的融合配偶體既是免疫的又是表達增強的融合配偶體?？梢詫ζ渌诤吓渑俭w進行選擇以便增加蛋白質(zhì)的溶解性或能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)靶向至所需的胞內(nèi)區(qū)室。另外的融合配偶體包括有利于純化蛋白質(zhì)的親和性標(biāo)記。
一般可以使用包括化學(xué)結(jié)合在內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備融合蛋白。優(yōu)選將融合蛋白表達為重組蛋白質(zhì)，使得在表達系統(tǒng)中相對于非融合蛋白來說它們產(chǎn)生的量增加。簡單地說，可以將編碼多肽成分的DNA序列單獨裝配并連入合適的表達載體。使用或不用肽接頭將編碼一種多肽成分的DNA序列的3’末端與編碼第二種多肽成分的DNA序列的5’末端連接以便序列的讀框處于同相中。這使得翻譯成保留兩種成分多肽生物活性的單一融合蛋白成為可能。
可以使用肽接頭使第一種和第二種多肽成分相隔的距離足以確保使各多肽折疊成其二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)。使用本領(lǐng)域眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將這類肽接頭序列摻入融合蛋白?？梢砸韵铝幸蛩貫榛A(chǔ)選擇合適的肽接頭(1)其采取柔性擴展構(gòu)象的能力；(2)其不具有采取能與第一種和第二種多肽上功能表位發(fā)生相互作用的二級結(jié)構(gòu)的能力；和(3)可能與多肽功能表位發(fā)生相互作用的疏水性或帶電荷殘基的缺乏。優(yōu)選的肽接頭序列含有Gly、Asn和Ser殘基?？梢詫⒅T如Thr和Ala這樣的其它接近中性的氨基酸用于肽接頭序列?？梢杂杏玫赜米鹘宇^的氨基酸序列包括那些概括在Maratea等人，《基因》(Gene)4039-46，1985、Murphy等人，《美國國家科學(xué)院院報》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)838258-8262，1986、美國專利號4,935,233和美國專利號4,751,180中的序列。接頭序列一般可以具有1-約50個氨基酸的長度。當(dāng)?shù)谝环N和第二種多肽具有可用于分離功能結(jié)構(gòu)域并防止空間干擾的非必需N-末端氨基酸區(qū)時，并不需要接頭序列。
將連接的DNA序列可操作地與合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)元件連接。導(dǎo)致表達DNA的調(diào)節(jié)元件僅位于編碼第一種多肽的DNA序列的5’端。類似地，終止翻譯所需的終止密碼子和轉(zhuǎn)錄終止信號僅位于編碼第二種多肽的DNA序列的3’端。
還提供了包括本發(fā)明多肽和不相關(guān)的免疫原性蛋白質(zhì)的融合蛋白。優(yōu)選所述的免疫原性蛋白質(zhì)能夠引起回憶反應(yīng)。這類蛋白質(zhì)的實例包括破傷風(fēng)蛋白質(zhì)、結(jié)核蛋白質(zhì)和肝炎蛋白質(zhì)(例如，參見Stoute等人，《新英格蘭藥物雜志》33686-91，1997)。
在優(yōu)選的實施方案中，免疫融合配偶體來源于蛋白質(zhì)D、即一種革蘭氏陰性菌流感嗜血桿菌B的表面蛋白(WO 91/18926)。優(yōu)選蛋白質(zhì)D衍生物包括約三分之一的蛋白質(zhì)(例如N-末端的前100-110個氨基酸)且可以使蛋白質(zhì)D衍生物脂化。在某些優(yōu)選的實施方案中，在N-末端上包含脂蛋白D融合配偶體的前109個殘基以便形成具有附加的外源T-細胞表位的多肽并提高大腸桿菌內(nèi)的表達水平(由此起表達增強子的作用)。脂尾確保以最佳方式將抗原呈遞給抗原呈遞細胞。其它融合配偶體包括來自流感病毒NS1(血凝素)的非結(jié)構(gòu)蛋白。一般來說，使用N-末端的81個氨基酸，不過，可以使用包括T-輔助細胞表位的不同片段。
在另一個實施方案中，免疫融合配偶體是稱作LYTA的蛋白質(zhì)或其部分(優(yōu)選C-末端部分)。LYTA來源于肺炎鏈球菌，它可合成稱作酰胺酶LYTA的N-乙?；?L-丙氨酸酰胺酶(由LytA基因編碼；《基因》(Gene)43265-292，1986)。LYTA是一種特異性降解肽聚糖主鏈中的某些鍵的自溶素。LYTA蛋白質(zhì)的C-末端結(jié)構(gòu)域是導(dǎo)致與膽堿或與某些諸如DEAE這樣的膽堿類似物親和的原因。已經(jīng)利用這種特性開發(fā)了用于表達融合蛋白的C-LYTA表達質(zhì)粒。已經(jīng)描述了在氨基末端含有C-LYTA片段的雜交蛋白質(zhì)的純化(參見《生物技術(shù)》(Biotechnology)10795-798，1992)。在一個優(yōu)選的實施方案中，可以將LYTA的重復(fù)部分摻入融合蛋白。在178位殘基開始的C-末端區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)了重復(fù)部分。特別優(yōu)選的重復(fù)部分含有188-305位殘基。
一般來說，分離了如本文所述的多肽類(包括融合蛋白)和多核苷酸。“分離”的多肽或多核苷酸是一種來源于其原始環(huán)境中的部分。例如，如果天然存在的蛋白質(zhì)分離自天然系統(tǒng)中某些或全部共存的物質(zhì)，那么它是分離的。優(yōu)選這類多肽至少具有約90％的純度、更優(yōu)選至少具有約95％的純度且最優(yōu)選至少具有約99％的純度。例如，如果將多核苷酸克隆入不屬于天然環(huán)境中的一部分的載體，那么將其看作是分離的。
結(jié)合劑
本發(fā)明進一步提供了諸如抗體及其抗原結(jié)合片段這樣的活性劑，它們特異性結(jié)合卵巢癌蛋白質(zhì)。一般認(rèn)為如果本文所用的抗體或其抗原結(jié)合片段在可檢測的水平上(例如在ELISA中)與卵巢癌蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)且在相似條件下不與不相關(guān)的蛋白質(zhì)以可檢測的方式發(fā)生反應(yīng)，那么它與卵巢癌蛋白質(zhì)“特異性結(jié)合”。本文所用的“結(jié)合”指的是兩種獨立分子之間的非共價結(jié)合而形成“復(fù)合物”。例如，可以通過測定形成所述復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)來評價結(jié)合能力。結(jié)合常數(shù)是復(fù)合物的濃度除以產(chǎn)物成分的濃度時獲得的數(shù)值。在本發(fā)明的上下文中，當(dāng)形成復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)超過約103L/mol時，一般認(rèn)為兩種化合物“結(jié)合”。可以使用本領(lǐng)域眾所周知的方法測定結(jié)合常數(shù)。
使用本文提供的有代表性的檢測試驗，結(jié)合劑可能還能夠區(qū)分患有和不患有諸如卵巢癌這樣的癌癥的患者。換句話說，與卵巢癌抗原結(jié)合的抗體或其它結(jié)合劑會產(chǎn)生一種指示至少約20％癌癥患者中癌癥存在的信號并產(chǎn)生一種指示至少約90％未患癌癥個體中這種疾病不存在的陰性信號。為了測定結(jié)合劑是否能夠滿足這種需求，如本文所述對來自患有和不患癌癥患者(如使用標(biāo)準(zhǔn)臨床試驗測定的)的生物樣品(例如血液、血清、白細胞轉(zhuǎn)移、尿和/或腫瘤活檢組織)檢測可結(jié)合結(jié)合劑的多肽類的存在。顯然應(yīng)檢測患有和不患該病的具有統(tǒng)計學(xué)顯著性數(shù)量的樣品。各結(jié)合劑應(yīng)滿足上述標(biāo)準(zhǔn)；然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到可以以組合方式使用結(jié)合劑以便改善敏感性。
滿足上述要求的任意活性劑可以是一種結(jié)合劑。例如，結(jié)合劑可以是包有或不包有肽成分的核糖體、RNA分子或多肽。在一個優(yōu)選的實施方案中，結(jié)合劑是抗體或其抗原結(jié)合片段?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意不同技術(shù)制備抗體。例如，參見Harlow和Lane的《抗體》(Antibodies)“實驗室手冊”(A Laboratory Manual)，美國冷泉港實驗室(Cold Spring Harbor Laboratory)，1988。一般來說，通過包括如本文所述生產(chǎn)單克隆抗體在內(nèi)的細胞培養(yǎng)技術(shù)或通過將抗體基因轉(zhuǎn)染入合適的細菌或哺乳動物細胞宿主可以生產(chǎn)抗體，從而產(chǎn)生重組抗體。在一種技術(shù)中，開始將包括多肽的免疫原注入任意不同的哺乳動物(例如小鼠、大鼠、家兔、綿羊或山羊)。在該步驟中，本發(fā)明的多肽類可以用作不加修飾的免疫原。另一方面，特別就相對較短的多肽類而言，如果使所述多肽與諸如牛血清白蛋白或匙孔
血藍蛋白這樣的載體蛋白連接，那么可以引起優(yōu)良的免疫反應(yīng)。優(yōu)選按照包括一次或多次加強免疫的預(yù)定方案將免疫原注入動物宿主并定期對動物取血。然后，例如可以通過使用與合適的固體支持物偶聯(lián)的多肽的親和色譜法從這類抗血清中純化對所述多肽具有特異性的多克隆抗體。
例如，可以使用Kohler和Milstein在《歐洲免疫學(xué)雜志》(Eur.J.Immunol.)6511-519，1976中所述的技術(shù)及其改進技術(shù)來制備對所關(guān)注的抗原多肽具有特異性的單克隆抗體。簡單地說，這些方法包括制備能夠產(chǎn)生具有所需特異性(即與所關(guān)注多肽的反應(yīng)性)的抗體的無限增殖細胞系的步驟。例如，可以由獲自如上所述免疫接種動物的脾細胞產(chǎn)生這類細胞系。然后，例如通過與骨髓瘤細胞融合配偶體、優(yōu)選一種與免疫接種動物同基因的配偶體融合使所述的脾細胞無限增殖化?？梢允褂酶鞣N融合技術(shù)。例如，可以使脾細胞和骨髓瘤細胞與非離子型去污劑混合幾分鐘且然后以低密度將它們平板接種在維持雜交細胞而不是骨髓瘤細胞生長的選擇性培養(yǎng)基上。優(yōu)選的選擇技術(shù)使用HAT(次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷)選擇。在足夠的時間、通常約為1-2周后，觀察到雜交體集落。選擇單一集落并檢測其培養(yǎng)物上清液對所述多肽的結(jié)合活性。優(yōu)選具有高反應(yīng)性和特異性的雜交瘤。
單克隆抗體可以分離自生長雜交瘤集落的上清液。此外，可以將各種技術(shù)用于提高產(chǎn)量，諸如將雜交瘤細胞系注入諸如小鼠這樣的合適脊椎動物宿主的腹膜腔的技術(shù)。然后從腹水液或血液中收集單克隆抗體?？梢酝ㄟ^諸如色譜法、凝膠過濾法、沉淀法和提取法這樣的常規(guī)技術(shù)從所述抗體中除去污染物。可以將本發(fā)明的多肽類用于例如親和色譜步驟中的純化過程。
在某些實施方案中，可以優(yōu)選使用抗體的抗原結(jié)合片段。這類片段包括可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備的Fab片段。簡單地說，可以通過蛋白質(zhì)A珠柱上的親和色譜法從家兔血清中純化免疫球蛋白(Harlow和Lane的《抗體》(Antibodies)“實驗室手冊”(A Laboratory Manual)，美國冷泉港實驗室(Cold Spring Harbor Laboratory)，1988)并通過木瓜蛋白酶將其消化而產(chǎn)生Fab和Fc片段?？梢酝ㄟ^蛋白質(zhì)A珠柱上的親和色譜法分離Fab和Fc片段。
可以將本發(fā)明的單克隆抗體與一種或多種治療劑偶聯(lián)。在這方面合適的治療劑包括放射性核素、分化誘導(dǎo)物、藥物、毒素及其衍生物。優(yōu)選的放射性核素包括90Y、123I、125I、131I、186Re、188Re、211At和212Bi。優(yōu)選的藥物包括氨甲蝶呤、嘧啶和嘌呤類似物。優(yōu)選的分化誘導(dǎo)物包括佛波酯和丁酸。優(yōu)選的毒素包括蓖麻毒蛋白、相思豆毒素、白喉毒素、霍亂毒素、gelonin、假單胞菌外毒素、志賀菌屬毒素和美洲商陸抗病毒蛋白。
可以以直接或間接(例如通過連接基團)的方式使治療劑與合適的單克隆抗體偶聯(lián)(例如通過共價結(jié)合的方式)。治療劑與抗體之間的直接反應(yīng)在它們各自具有能夠彼此發(fā)生反應(yīng)的取代基時是可能的。例如，在一種物質(zhì)上的諸如氨基或巰基這樣的親核基可能能夠與諸如酐或?；u這樣的含羰基的基團或與另一種物質(zhì)上的含良好的離去基團(例如鹵化物)的烷基發(fā)生反應(yīng)。
另一方面，可能需要通過連接基團偶聯(lián)治療劑和抗體。連接基團可以起治療劑與抗體之間的間隔基的作用以便避免干擾結(jié)合能力。連接基團還可以用于增加治療劑或抗體上的取代基的化學(xué)反應(yīng)性且由此提高偶聯(lián)功效。化學(xué)反應(yīng)性的提高還可有助于治療劑、或治療劑上的官能基的應(yīng)用，否則是不可能的。
可以將各種雙功能或多功能試劑即相同和不同功能試劑(諸如在Pierce Chemical Co.，Rockford，IL目錄中所述的那些試劑)用作連接基團，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。例如，通過氨基、羧基、巰基或氧化的碳水化合物殘基可以進行偶聯(lián)。存在大量描述這類方法的參考文獻，例如Rodwell等人的美國專利號4,671,958。
盡管治療劑在不含本發(fā)明的免疫綴合物的抗體部分時更為有效，但是可能需要使用在攝入細胞過程中或攝入細胞時可裂解的連接基團。已經(jīng)描述了大量不同的可裂解的連接基團。在胞內(nèi)從這些連接基團中釋放治療劑的機理包括通過下列方式進行裂解還原二硫鍵(例如Spitler的美國專利號4,489,710)；照射遇光不穩(wěn)定的鍵(例如Senter等人的美國專利號4,625,014)；水解衍生的氨基酸側(cè)鏈(例如Kohn等人的美國專利號4,638,045)；血清互補物介導(dǎo)的水解(例如Rodwell等人的美國專利號4,671,958)；和酸催化的水解(例如Blattler等人的美國專利號4,569,789)。
可能需要將一種以上的治療劑與抗體偶聯(lián)。在一個實施方案中，將多個治療劑分子與一個抗體分子偶聯(lián)。在另一個實施方案中，可以將一種類型以上的治療劑與一種抗體偶聯(lián)。無論特定的實施方案如何，可以按照不同方式制備與一種以上治療劑形成的免疫綴合物。例如，可以將一種以上的治療劑直接與一種抗體分子偶聯(lián)或可以使用為附著提供多個位點的接頭。另一方面，可以使用一種載體。
載體可以以多種方式，包括直接或通過連接基團共價結(jié)合帶有治療劑。合適的載體包括諸如白蛋白這樣的蛋白質(zhì)(例如Kato等人的美國專利號4,507,234)、肽類和諸如氨基葡聚糖這樣的多糖類(例如Shih等人的美國專利號4,699,784)。載體還可以通過非共價鍵或通過諸如包裹在脂質(zhì)體囊泡內(nèi)而帶有治療劑(例如美國專利號4,429,008和4,873,088)。對放射性核素具有特異性的載體包括放射性鹵化的小分子和螯合化合物。例如，美國專利號4,735,792中公開了有代表性的放射性鹵化小分子及其合成方法?？梢杂砂ê土蛟幼鳛榻Y(jié)合金屬或金屬氧化物(放射性核素)用供體原子的那些螯合化合物制成放射性核素螯合物。例如，Davison等人的美國專利號4,673,562中公開了有代表性的螯合化合物及其合成方法。
可以使用抗體和免疫綴合物的不同給藥途徑。一般來說，給藥可以是靜脈內(nèi)給藥、肌內(nèi)給藥、皮下給藥或在切除腫瘤的部位給藥。顯然抗體/免疫綴合物的準(zhǔn)確劑量將取決于所用的抗體、腫瘤上抗原的密度和抗體的清除率而改變。
本文還提供了模擬卵巢癌蛋白質(zhì)免疫原性部分的抗獨特型抗體。使用眾所周知的技術(shù)，可以針對特異性結(jié)合卵巢癌蛋白質(zhì)的免疫原性部分的抗體或其抗原結(jié)合片段產(chǎn)生這類抗體。模擬卵巢癌蛋白質(zhì)的免疫原性部分的抗獨特型抗體是結(jié)合如本文所述可特異性結(jié)合卵巢癌蛋白質(zhì)的免疫原性部分的抗體或其抗原結(jié)合片段的那些抗體。
T細胞
免疫治療組合物還或另一方面可以包括對卵巢癌蛋白質(zhì)具有特異性的T細胞。一般可以使用標(biāo)準(zhǔn)程序在體外或體內(nèi)制備這類細胞。例如，使用商購自CellPro Inc.，Bothell WA的諸如CEPRATETM系統(tǒng)這樣的商購細胞分離系統(tǒng)可以使T細胞存在于骨髓(或分離自)骨髓、外周血液或骨髓部分或諸如患者這樣的哺乳動物外周血液中(另外參見美國專利號5,240,856；美國專利號5,215,926；WO89/06280；WO 91/16116和WO92/07243)。另一方面，T細胞可以來源于相關(guān)的或不相關(guān)的人、非人動物、細胞系或培養(yǎng)物。
可以用卵巢癌多肽、編碼卵巢癌多肽的多核苷酸和/或表達這類多肽的抗原呈遞細胞(APC)來刺激T細胞。這種刺激過程在足以使對所述多肽具有特異性的T細胞生成的條件和時間下進行。優(yōu)選卵巢癌多肽或多核苷酸存在于諸如微球體這樣的轉(zhuǎn)運載體內(nèi)以便促進特異性T細胞生成。
如果T細胞殺死包被有卵巢癌多肽或表達編碼這類的基因的靶細胞，那么將T細胞看作對卵巢癌多肽具有特異性。使用任意不同的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以評價T細胞特異性。例如，在鉻釋放測定或增殖測定中，裂解和/或增殖比陰性對照增加2倍以上的刺激指數(shù)表明了T細胞的特異性。例如，可以如Chen等人在《癌癥研究》(Cancer Res.)541065-1070，1994中所述進行這類測定。另一方面，通過各種已知的技術(shù)可以完成對T細胞增殖的檢測。例如，通過測定DNA合成的增加率(例如通過用含氚胸苷脈沖標(biāo)記T細胞培養(yǎng)物并測定摻入DNA的含氚胸苷的量)可以檢測T細胞的增殖情況。正如使用標(biāo)準(zhǔn)細胞因子檢測試驗所測定的，與卵巢癌多肽(200ng/ml-100μg/ml、優(yōu)選100ng/ml-25μg/ml)接觸3-7天應(yīng)導(dǎo)致T細胞增殖至少增加2倍和/或如上所述接觸2-3小時應(yīng)導(dǎo)致T細胞激活，其中細胞因子的釋放水平(例如TNF或IFN-γ)提高2倍表示T細胞激活(參見Coligan等人《最新免疫學(xué)方案》(CurrentProtocols in Immunology)第1卷，Wiley Interscience(Greene1998))。為響應(yīng)卵巢癌多肽、多核苷酸或表達卵巢癌多肽的APC已經(jīng)被激活的T細胞可以是CD4+和/或CD8+。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以使卵巢癌多肽特異性T細胞擴充。在優(yōu)選的實施方案中，T細胞來源于患者或相關(guān)或不相關(guān)的供體且在刺激和擴充后給患者施用它們。
為了治療目的，可以使為響應(yīng)卵巢癌多肽、多核苷酸或APC而增殖的CD4+或CD8+T細胞在體外或體內(nèi)的數(shù)量擴充。按照不同方式可以完成這類T細胞在體外的增殖。例如，可以通過添加或不添加諸如白細胞介素-2這樣的T細胞生長因子和/或合成卵巢癌多肽的細胞刺激物使T細胞重新與卵巢癌多肽接觸。另一方面，通過克隆可以使在有卵巢癌多肽存在的情況下增殖的一種或多種T細胞的數(shù)量擴充。用于克隆細胞的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的且包括有限稀釋。例如，在擴充后，可以如Chang等人在《腫瘤學(xué)與血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)綜述》(Crit.Rev.Oncol.Hematol.)22213，1996中所述將所述細胞給藥回患者體內(nèi)。
藥物組合物和疫苗
在某些方面中，可以將如本文所述的多肽類、多核苷酸、結(jié)合劑和/或免疫系統(tǒng)細胞混入藥物組合物或疫苗。藥物組合物包括一種或多種這類化合物或細胞和生理上可接受的載體。疫苗可以包括一種或多種這類化合物或細胞和非特異性免疫反應(yīng)增強劑。非特異性免疫反應(yīng)增強劑可以是增強對外源抗原的免疫反應(yīng)的任意物質(zhì)。非特異性免疫反應(yīng)增強劑的實例包括佐劑、可生物降解的微球體(例如polylactic galactide)和脂質(zhì)體(化合物混入其中；例如，參見Fullerton的美國專利號2,235,877)。例如，疫苗制品一般描述在M.F.Powell和M.J.Newman編輯的“疫苗設(shè)計(亞單位和佐劑法)”(Vaccine Design(the subunit andadjuvant approach))、Plenum Press(NY，1995)中。本發(fā)明范圍內(nèi)的藥物組合物和疫苗還可以含有具生物活性的或無活性的其它化合物。例如，可以將存在的其它腫瘤抗原的一種或多種免疫原性部分混入融合多肽或作為混入所述組合物或疫苗中的獨立化合物。
藥物組合物或疫苗可以含有編碼如上所述的一種或多種多肽類的DNA，使得所述多肽在原位生成。如上所述，所述DNA可以存在于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的包括核酸表達系統(tǒng)、細菌和病毒表達系統(tǒng)在內(nèi)的任意不同轉(zhuǎn)運系統(tǒng)中。合適的核酸表達系統(tǒng)含有在患者體內(nèi)表達所必需的DNA序列(諸如合適的啟動子和終止信號)。細菌轉(zhuǎn)運系統(tǒng)涉及給予表達在其細胞表面上多肽的免疫原性部分的細菌(諸如卡介苗)。在一個優(yōu)選的實施方案中，可以使用可包括應(yīng)用非致病性(缺陷型)復(fù)制活性病毒的病毒表達系統(tǒng)(例如牛痘或其它痘病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒)引入所述DNA。例如，合適的系統(tǒng)公開在下列文獻中Fisher-Hoch等人的PNAS86317-321，1989；Flexner等人的《紐約科學(xué)院年鑒》(Ann.N.Y.Acad.Sci.)56986-103，1989；Flexner等人的《疫苗》(Vaccine)817-21，1990；美國專利號4,603,112、4,769,330和5,017,487；WO 89/01973；美國專利號4,777,127；GB2,200,651；EP O,345,242；WO 91/02805；Berkner的《生物技術(shù)》(Biotechniques)6616-627，1988；Rosenfeld等人的《科學(xué)》(Science)252431-434，1991；Kolls等人的PNAS 91215-219，1994；Kass-Eisler等人的PNAS 9011498-11502，1993；Guzman等人的《循環(huán)》(Circulation)882838-2848，1993；和Guzman等人的《循環(huán)研究》(Cir.Res.)731202-1207，1993。用于將DNA混入這類表達系統(tǒng)的技術(shù)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是眾所周知的。例如，正如Ulmer等人在《科學(xué)》(Science)2591745-1749，1993中描述和由Cohen在《科學(xué)》(Science)2591691-1692，1993中綜述的，所述DNA還可以是“裸的”。通過將所述DNA包被在有效轉(zhuǎn)運入細胞的可生物降解的珠上可以提高裸DNA的攝取。
盡管可以將本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意合適的載體用于本發(fā)明的藥物組合物中，但是載體的類型將取決于給藥方式?？梢詾楹线m的給藥方式來配制本發(fā)明的組合物，例如，所述的給藥方式包括局部給藥、口服給藥、鼻部給藥、靜脈內(nèi)給藥、顱內(nèi)給藥、腹膜內(nèi)給藥、皮下給藥或肌內(nèi)給藥。就諸如皮下注射這樣的非腸道給藥而言，所述的載體優(yōu)選包括水、鹽水、醇、脂肪、蠟或緩沖液。就口服給藥而言，可以使用任意上述載體或固體載體諸如甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖和碳酸鎂。還可以將可生物降解的微球體(例如聚乳酸聚乙醇酸酯)用作本發(fā)明藥物組合物的載體。例如，適宜的可生物降解的微球體公開在美國專利號4,897,268和5,075,109中。
這類組合物還可以包括緩沖液(例如中性緩沖鹽水或磷酸鹽緩沖鹽水)、碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露糖醇、蛋白質(zhì)、多肽類或諸如甘氨酸這樣的氨基酸、抗氧化劑、諸如EDTA或谷胱甘肽這樣的螯合劑、佐劑(例如氫氧化鋁)和/或防腐劑。另一方面，可以將本發(fā)明的組合物配制成凍干物。還可以使用眾所周知的技術(shù)將化合物包裹在脂質(zhì)體內(nèi)。
可以將任意不同的非特異性免疫反應(yīng)增強劑用于本發(fā)明的疫苗中。例如，可以包括佐劑。大多數(shù)佐劑含有用于防止抗原快速分解代謝的諸如氫氧化鋁或礦物油這樣的物質(zhì)和諸如脂質(zhì)A，即Bortadella pertussis或結(jié)核分枝桿菌衍生的蛋白質(zhì)這樣的免疫反應(yīng)刺激物。例如，合適的佐劑是商購的弗氏不完全佐劑和弗氏完全佐劑(Difco Laboratories，Detroit，MI)、Merck Adjuvant 65(Merck and Company，Inc.，Rahway，NJ)、明礬、可生物降解的微球體、單磷?；|(zhì)A和quil A。還可以將諸如GM-CSF或白細胞介素-2、白細胞介素-7或白細胞介素-12這樣的細胞因子用作佐劑。
在本文所提供的疫苗中，優(yōu)選將佐劑組合物設(shè)計成主要誘發(fā)Th1類型的免疫反應(yīng)。高水平的Th1-型細胞因子(例如IFN-γ、IL-2和IL-12)傾向于促進誘發(fā)對給予的抗原的細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。相反，高水平的Th2-型細胞因子(例如IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和TNF-β)傾向于促進誘發(fā)體液免疫反應(yīng)。在施用如本文所提供的疫苗后，患者維持包括Th1-和Th2-型反應(yīng)在內(nèi)的免疫反應(yīng)。在一個反應(yīng)主要為Th1-型反應(yīng)的優(yōu)選的實施方案中，Th1-型細胞因子的水平增加至高于Th2-型細胞因子水平的程度。使用標(biāo)準(zhǔn)檢測試驗可以方便地評價這些細胞因子的水平。就對細胞因子家族的綜述而言，參見Mosmann和Coffman的《免疫學(xué)回顧年鑒》(Ann.Rev.Immunol.)7145-173，1989。
例如，用于主要引起Th1-型反應(yīng)的優(yōu)選的佐劑包括單磷酰基脂質(zhì)A、優(yōu)選3-脫氧-?；瘑瘟柞；|(zhì)A(3D-MPL)與鋁鹽的組合物。MPL佐劑商購自Ribi ImmunoChem Research Inc.(Hamilton，MT；參見美國專利號4,436,727、4,877,611、4,866,034和4,912,094)。另外優(yōu)選的是AS-2(SmithKline Beecham)。含CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸是未甲基化的)也可誘發(fā)主要為Th1的反應(yīng)。這類寡核苷酸是眾所周知的且例如描述在WO 96/02555中。另一種優(yōu)選的佐劑是皂苷、優(yōu)選QS21，可以單獨或與其它佐劑一起使用它們。例如，增強的系統(tǒng)包括單磷?；|(zhì)A和皂苷衍生物的組合物、諸如WO 94/00153中所述的QS21和3D-MPL的組合物或如WO 96/33739中所述用膽固醇驟冷QS21的低反應(yīng)原性組合物。其它優(yōu)選的制劑包括水包油型乳液和生育酚。在水包油型乳液中包括QS21、3D-MPL和生育酚的特別有效的佐劑配方描述在WO 95/17210中?？梢允褂卯a(chǎn)生抗原、免疫反應(yīng)增強劑和合適的載體或賦形劑的組合物的眾所周知的方法制備本文所提供的任意疫苗。
可以將本文所述的組合物作為緩釋制劑(即，諸如在給藥后達到緩慢釋放化合物目的的膠囊或海綿狀物這樣的制劑)的一部分進行給藥。一般可以使用眾所周知的技術(shù)來制備這類制劑且例如可以通過口服、直腸或皮下植入或通過在所需靶位點植入的方式給予它們。緩釋制劑可以含有分散在載體基質(zhì)中和/或包含在控速膜圍繞的儲存器內(nèi)的多肽、多核苷酸或抗體。在這類制劑中使用的載體是生物相容性的且也可以是可生物降解的；優(yōu)選該制劑具有以相對恒定的水平釋放活性成分的能力。在緩釋制劑中含有的活性化合物的量取決于植入部位、釋放速率和預(yù)計的釋放期限以及所治療或預(yù)防疾病的性質(zhì)。
可以在藥物組合物和疫苗中使用任意不同的轉(zhuǎn)運載體以便有利于產(chǎn)生以腫瘤細胞為靶的抗原特異性免疫反應(yīng)。轉(zhuǎn)運載體包括諸如樹突細胞、巨噬細胞、B細胞、單核細胞這樣的抗原呈遞細胞(APCs)和可以改造成有效APCs的其它細胞。可以但不必對這類細胞進行遺傳修飾以便增加呈遞抗原的能力、改善對T細胞反應(yīng)的激活和/或維持T細胞反應(yīng)、本身具有抗腫瘤作用和/或與受體(即配對的HLA單元型)免疫相容。APCs一般可以分離自任意不同的生物液體和器官(包括腫瘤和腫瘤外圍組織)且可以是自體、同種異體、同源或異源細胞。
本發(fā)明的某些優(yōu)選的實施方案使用樹突細胞或其祖代細胞作為抗原呈遞細胞。樹突細胞是高度有效的APCs(Banchereau和Steinman《自然》(Nature)392245-251，1998)且已經(jīng)證實它們可有效地作為引起預(yù)防或治療性抗腫瘤免疫性的生理佐劑(參見Timmerman和Levy《藥物回顧年鑒》《Ann.Rev.Med.》50507-529，1999)。一般來說，正如使用標(biāo)準(zhǔn)檢測試驗所測定的，可以以樹突細胞的典型形狀(在原位為星狀，具有在體外可見的顯著的胞質(zhì)突(樹突))為基礎(chǔ)和以缺乏B細胞(CD19和CD20)、T細胞(CD3)、單核細胞(CD14)和天然殺傷細胞(CD56)的分化標(biāo)記為基礎(chǔ)來鑒定它。當(dāng)然，可以將樹突細胞進行改造以便表達通常不見于體內(nèi)或來自體內(nèi)的樹突細胞上的特異性細胞表面受體或配體且這類修飾的樹突細胞是本發(fā)明所關(guān)注的。作為樹突細胞的替代物，可以在疫苗中使用分泌型小泡的承載抗原的樹突細胞(稱作外來體)(參見Zitvogel等人《天然藥物》(Nature Med.)4594-600，1998)。
樹突細胞和祖代細胞可以獲自外周血液、骨髓、腫瘤浸潤細胞、腫瘤外圍組織浸潤細胞、淋巴結(jié)、脾、皮膚、臍帶血或任意其它合適的組織或液體。例如，通過向采集自外周血液的單核細胞培養(yǎng)物中添加諸如GM-CSF、IL-4、IL-13和/或TNFα這樣的細胞因子的組合物可以使樹突細胞從體內(nèi)分化。另一方面，通過向培養(yǎng)基中添加GM-CSF、IL-13、TNFα、CD40配體、LPS、flt3配體和/或誘導(dǎo)樹突細胞成熟和增殖的其它化合物的組合物可以使采集自外周血液、臍帶血或骨髓的CD34陽性細胞分化成樹突細胞。
將樹突細胞方便地分類成“未成熟”和“成熟”的細胞，這要求存在一種用于區(qū)分兩種充分表征的表型的簡便方式。然而，這種命名法不應(yīng)排除所有可能的分化中間階段。未成熟樹突細胞的特征在于APC具有高度攝取抗原并進行加工的能力，這一能力與高度表達Fcγ受體、甘露糖受體和DEC-205標(biāo)記相關(guān)。成熟表型的特征一般在于對這些標(biāo)記的表達程度較低、而對導(dǎo)致T細胞激活的諸如I和II型MHC、粘附分子(例如CD54和CD11)和共刺激分子(例如CD40、CD80和CD86)這樣的細胞表面分子的表達程度較高。
一般可以用編碼卵巢癌抗原(或其部分或其其它變化形式)的多核苷酸轉(zhuǎn)染APCs，使得在細胞表面上表達抗原或其免疫原性部分。這類轉(zhuǎn)染過程可以在體內(nèi)發(fā)生且然后可以將包括這類轉(zhuǎn)染細胞的組合物或疫苗用于如本文所述的治療目的。另一方面，可以給患者施用靶向樹突細胞或其它抗原呈遞細胞的基因轉(zhuǎn)運載體，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)染在體內(nèi)發(fā)生。例如，一般可以使用諸如WO 97/24447中所述的方法或由Mahvi等人在《免疫學(xué)與細胞生物學(xué)》(Immunology and Cell Biology)75456-460，1997中所述的基因槍手段這樣的本領(lǐng)域中已知的任意方法在體內(nèi)和從體內(nèi)轉(zhuǎn)染樹突細胞。通過用多肽、DNA(裸或在質(zhì)粒載體內(nèi))或RNA、或用表達抗原的重組細菌或病毒(例如牛痘、禽痘、腺病毒或慢病毒屬載體)培養(yǎng)樹突細胞或祖代細胞可以對樹突細胞進行抗原承載。在承載前，可以使所述多肽與提供T細胞輔助作用的免疫配偶體(例如載體分子)共價綴合。另一方面，可以單獨或在有所述多肽存在的情況下用非綴合的免疫配偶體對樹突細胞進行脈沖。
癌癥療法
在本發(fā)明的其它方面中，可以將本文所述的組合物用于諸如卵巢癌這樣的癌癥的免疫療法。在這類方法中，一般給患者施用藥物組合物和疫苗。本文所用的“患者”指的是任意溫血動物、優(yōu)選人。患者可以患有癌癥也可以不患癌癥。因此，可以將上述藥物組合物和疫苗用于預(yù)防癌癥的發(fā)生或治療患有癌癥的患者。在某些優(yōu)選的實施方案中，患者患有卵巢癌?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中一般可接受的標(biāo)準(zhǔn)來診斷這類癌癥、包括存在的惡性腫瘤。可以在外科手術(shù)摘除原發(fā)性腫瘤和/或諸如給予放療或常規(guī)的化療藥這樣的治療之前或之后給予藥物組合物和疫苗。
在某些實施方案中，免疫療法可以是主動免疫療法，其中治療依賴于體內(nèi)刺激內(nèi)源性宿主免疫系統(tǒng)以便通過給予改進免疫反應(yīng)的活性劑(諸如腫瘤疫苗、細菌佐劑和/或細胞因子)對腫瘤產(chǎn)生反應(yīng)。
在其它實施方案中，免疫療法可以是被動免疫療法，其中治療過程包括用可直接或間接介導(dǎo)抗腫瘤作用且不必依賴于完整宿主免疫系統(tǒng)的確立的腫瘤免疫反應(yīng)性(諸如效應(yīng)細胞或抗體)轉(zhuǎn)運活性劑的步驟。效應(yīng)細胞的實例包括表達本文所提供的多肽的T淋巴細胞(諸如CD8+細胞毒性T淋巴細胞和CD4+T-輔助腫瘤浸潤淋巴細胞)、殺傷細胞(諸如天然殺傷細胞和淋巴因子激活的殺傷細胞)、B細胞和抗原呈遞細胞(諸如樹突細胞和巨噬細胞)?？梢詫Ρ疚乃龆嚯木哂刑禺愋缘腡細胞受體和抗體受體克隆、表達并轉(zhuǎn)染入用于過繼免疫療法的其它載體或效應(yīng)細胞中。還可以將本文所提供的多肽類用于生成用于被動免疫療法的抗體或抗獨特型抗體(如上文所述和美國專利號4,918,164中所述)。
一般可以通過如本文所述在體外生長而獲得用于過繼免疫療法的足量的效應(yīng)細胞。通過保留體內(nèi)的抗原識別作用而使單一抗原特異性效應(yīng)細胞擴充至幾十億總數(shù)的培養(yǎng)條件在本領(lǐng)域中是眾所周知的。這類體外培養(yǎng)條件一般經(jīng)常在有細胞因子(諸如IL-2)和非分裂性飼養(yǎng)細胞存在的情況下應(yīng)用使用抗原的間歇刺激。如上所述，可以將本文所提供的免疫反應(yīng)性多肽類用于使抗原特異性T細胞培養(yǎng)物快速擴充以便生成足夠數(shù)量的用于免疫療法細胞。特別地，可以用免疫反應(yīng)性多肽類將諸如樹突細胞、巨噬細胞或B細胞這樣的抗原呈遞細胞進行脈沖或使用本領(lǐng)域中眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用一種或多種多核苷酸轉(zhuǎn)染它們。例如，可以用帶有適合于增加重組病毒或其它表達系統(tǒng)中的表達的啟動子的多核苷酸轉(zhuǎn)染抗原呈遞細胞。用于療法的所培養(yǎng)的效應(yīng)細胞必須能夠生長并廣泛分布且在體內(nèi)長期存活。研究已經(jīng)證實通過用補充了IL-2的抗原反復(fù)刺激可以誘導(dǎo)所培養(yǎng)的效應(yīng)細胞在體內(nèi)生長并以基本數(shù)量長期存活(例如，參見Cheever等人，《免疫回顧》(Immunological Reviews)157；177，1997)。
另一方面，可以將表達本文所述的多肽的載體引入取自患者的干細胞并在體外以克隆方式增殖而用于自體移植回同一患者。
給藥途徑和頻率以及劑量將根據(jù)個體與個體的差異而改變且可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)方便地確定。一般來說，可以通過注射(例如皮內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下)、經(jīng)鼻內(nèi)(例如通過吸入)、口服或在切除腫瘤的部位給予所述的藥物組合物和疫苗。優(yōu)選可以在52周的期限內(nèi)給予1-10次劑量。優(yōu)選以1個月的間隔給予6次劑量且可以在此后定期給予加強接種。替代方案可能適合于個別的患者。當(dāng)如上所述給藥時，合適的劑量是能夠促進抗腫瘤免疫反應(yīng)的化合物的量且至少高于基礎(chǔ)(即未治療的)水平10-50％?？梢酝ㄟ^測定患者體內(nèi)的抗腫瘤抗體或通過能夠殺傷體外患者腫瘤細胞的溶細胞效應(yīng)細胞的疫苗依賴性產(chǎn)生來監(jiān)測這類反應(yīng)。這類疫苗也應(yīng)能夠產(chǎn)生免疫反應(yīng)，這種免疫反應(yīng)導(dǎo)致接種疫苗的患者比未接種疫苗的患者的臨床結(jié)果改善(例如更快的緩解、完全或部分或較長的不帶病的存活)。一般來說，就包括一種或多種多肽類的藥物組合物和疫苗而言，存在于劑量中的各多肽的量在約100μg-5mg/kg宿主的范圍。合適的劑量大小將根據(jù)患者的身材而改變，不過一般在約0.1mL-約5mL的范圍。
一般來說，適宜的劑量和治療方案提供了足以達到治療和/或預(yù)防有益效果量的活性化合物?？梢酝ㄟ^確定治療患者與未治療患者相比較改善的臨床結(jié)果(例如更快的緩解、完全或部分或較長的不帶病的存活)來監(jiān)測這類反應(yīng)。預(yù)先存在的對卵巢癌抗原的免疫反應(yīng)的增加通常與改善的臨床結(jié)果相關(guān)。一般可以使用標(biāo)準(zhǔn)增殖、細胞毒性或細胞因子檢測試驗來評價這類免疫反應(yīng)，所述的檢測試驗使用治療前和治療后獲自患者的樣品來進行。
用于鑒定分泌的卵巢癌抗原的篩選
本發(fā)明提供了用于鑒定分泌的腫瘤抗原的方法。在這類方法中，將腫瘤植入諸如SCID小鼠這樣的免疫缺陷型動物并維持足以使腫瘤抗原分泌入血清的時間。一般來說，可以將腫瘤經(jīng)皮下植入免疫缺陷型動物或植入免疫缺陷型動物的生殖腺脂墊內(nèi)并維持1-9個月、優(yōu)選1-4個月。一般可以如WO 97/18300中所述進行植入。然后使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)且如本文所述將含有分泌抗原的血清用于制備免疫活性小鼠體內(nèi)的抗血清。簡單地說，可以將50-100μL血清(收集自三組免疫缺陷型小鼠，各組帶有不同SCID-衍生的人卵巢腫瘤)按1:1(vol:vol)與諸如RIBI-MPL或MPL+TDM(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)這樣合適的佐劑混合并按每月一次的間隔經(jīng)腹膜內(nèi)注入同源免疫活性動物、總計5個月。通過在第三次、第四次和第五次免疫接種后取血可以從以這類方式免疫接種的動物體內(nèi)獲得抗血清。一般將所得的抗血清預(yù)先清除大腸桿菌和噬菌體抗原并用于(一般在諸如1:200這樣的稀釋后使用)血清學(xué)表達篩選。
文庫一般是一種含有來自植入SCID小鼠類型的一種或多種腫瘤的cDNAs的表達文庫?？梢杂弥T如λ-篩選(Novagen)這樣的任意合適的載體制備這種表達文庫?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)鑒定編碼與抗血清反應(yīng)的多肽的cDNAs并對其進行測序?？梢赃M一步表征這類cDNA分子以便評價在腫瘤和正常組織中的表達情況并評價患者體內(nèi)抗原的分泌情況。
本文所提供的方法具有超過發(fā)現(xiàn)腫瘤抗原的其它方法的優(yōu)點。特別地，由這類方法鑒定的所有抗原應(yīng)通過腫瘤細胞的壞死而分泌或釋放。這類抗原可以在腫瘤細胞表面呈遞一定的時間，這一時間足以在免疫接種后通過免疫系統(tǒng)起到靶向和殺傷作用。
用于檢測癌癥的方法
一般來說，可以以獲自患者的生物樣品(諸如血液、血清、尿和/或腫瘤活檢組織)中存在的一種或多種卵巢癌蛋白質(zhì)和/或編碼這類蛋白質(zhì)的多核苷酸為基礎(chǔ)檢測患者體內(nèi)的癌癥。換句話說，可以將這類蛋白質(zhì)用作標(biāo)記以便指示存在或不存在諸如卵巢癌這樣的癌癥。此外，可以將這類蛋白質(zhì)用于檢測其它癌癥。一般本文提供的結(jié)合劑可檢測與生物樣品中活性劑結(jié)合的蛋白質(zhì)的水平?？梢詫⒍嗪塑账嵋锖吞结樣糜跈z測編碼腫瘤蛋白質(zhì)的mRNA的水平，它也可指示存在或不存在癌癥。一般來說，與卵巢癌相關(guān)的序列應(yīng)以在腫瘤組織中比在正常組織中至少高3倍的水平存在。
就使用結(jié)合劑檢測樣品中的多肽標(biāo)記而言，存在各種本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的測定方式。例如，參見Harlow和Lane的《抗體》(Antibodies)“實驗室手冊”(A Laboratory Manual)，美國冷泉港實驗室(Cold SpringHarbor Laboratory)，1988。一般來說，可以通過下列步驟確定患者體內(nèi)存在或不存在癌癥(a)使獲自患者的生物樣品與結(jié)合劑接觸；(b)在該樣品中檢測與結(jié)合劑結(jié)合的多肽的水平；和(c)比較多肽水平與預(yù)定的截斷值。
在一個優(yōu)選的實施方案中，測定包括使用固定在固體支持物上的結(jié)合劑以便結(jié)合多肽并從樣品剩余部分中除去多肽的步驟。然后可以使用含有報道基團并特異性結(jié)合到結(jié)合劑/多肽復(fù)合物上的檢測試劑檢測結(jié)合的多肽。例如，這類檢測試劑可以包括特異性結(jié)合多肽的結(jié)合劑或抗體或特異性結(jié)合該結(jié)合劑的其它活性劑諸如抗免疫球蛋白、蛋白質(zhì)G、蛋白質(zhì)A或凝集素。另一方面，可以使用競爭測定，其中用報道基團標(biāo)記多肽并在用樣品培養(yǎng)結(jié)合劑后使之與固定化結(jié)合劑結(jié)合。樣品中成分抑制標(biāo)記的多肽與結(jié)合劑結(jié)合的程度表示含有固定化結(jié)合劑的樣品的反應(yīng)性。用于這類檢測試驗中的合適的多肽類包括如上所述的全長卵巢癌蛋白質(zhì)及其結(jié)合劑結(jié)合的部分。
固體支持物可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的腫瘤蛋白質(zhì)可以與之結(jié)合的任意物質(zhì)。例如，固體支持物可以是微量滴定平板或硝化纖維素或其它合適的膜中的檢測孔。另一方面，所述的支持物可以是諸如玻璃、玻璃纖維、膠乳這樣的珠或盤或諸如聚苯乙烯或聚氯乙烯這樣的塑料物質(zhì)。所述的支持物還可以是諸如那些公開在例如美國專利號5,359,681中的磁粉或纖維光學(xué)傳感器?？梢允褂贸浞置枋鲈趯＠涂茖W(xué)文獻中的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種技術(shù)將結(jié)合劑固定在固體支持物上。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“固定化”指的是諸如吸附這樣的非共價結(jié)合和共價結(jié)合(可以是活性劑與支持物上官能基之間的直接連接或可以是通過交聯(lián)劑的連接)。優(yōu)選通過吸附到微量滴定平板中的孔或膜上的固定化。在這樣的情況下，通過使結(jié)合劑在一種合適的緩沖液中與固體支持物接觸合適的時間來實現(xiàn)吸附。時間隨溫度而改變，但一般在約1小時至約1天。一般來說，接觸塑料微量滴定平板(諸如聚苯乙烯或聚氯乙烯)孔與約10ng-約10μg且優(yōu)選約100ng-約1μg量的結(jié)合劑接觸足以固定適當(dāng)量的結(jié)合劑。
一般可以通過首先使支持物和將與該支持物和結(jié)合劑上諸如羥基或氨基這樣的官能基反應(yīng)的雙功能試劑反應(yīng)來實現(xiàn)結(jié)合劑與固體支持物的共價結(jié)合。例如，可以使用苯并喹啉或通過用結(jié)合配偶體上的胺和活性氫縮合支持物上的醛基使結(jié)合劑與帶有合適的聚合物涂層的支持物共價結(jié)合(例如，參見Pierce的《免疫技術(shù)目錄與手冊》(ImmunotechnologyCatalog and Handbook)，1991的A12-A13)。
在某些實施方案中，測定是雙抗體夾層測定。本測定通過首先使已經(jīng)固定在通常為微量滴定平板的孔的固體支持物上的抗體與樣品接觸來進行，使得樣品中的多肽能夠與固定化抗體結(jié)合。然后從固定化多肽-抗體復(fù)合物中除去未結(jié)合的樣品并加入含有報道基團的檢測試劑(優(yōu)選能夠與多肽上的不同位點結(jié)合的第二種抗體)。接著使用適合于特異性報道基團的方法測定保持與固體支持物結(jié)合的檢測試劑的量。
更具體地說，一旦如上所述將抗體固定在支持物上，則支持物上的剩余蛋白質(zhì)已合位點一般被阻斷。任何合適的阻斷劑對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的，諸如牛血清白蛋白或Tween 20TM(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。然后用樣品培養(yǎng)固定化抗體并使所述多肽與該抗體結(jié)合。在培養(yǎng)前可以將該樣品用諸如磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)這樣合適的稀釋劑稀釋。一般來說，合適的接觸時間(即培養(yǎng)時間)是足以檢測多肽在獲自患卵巢癌個體的樣品中的存在的多肽的時間期限。優(yōu)選的接觸時間足以實現(xiàn)在結(jié)合與未結(jié)合多肽之間達到至少約95％的平衡的結(jié)合水平。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到通過檢測一定時間期限內(nèi)發(fā)生的結(jié)合水平可以方便地測定達到平衡所必需的時間。在室溫下，培養(yǎng)約30分鐘的時間一般是足夠的。
然后通過用諸如含有0.1％Tween 20TM的PBS這樣合適的緩沖液洗滌固體支持物而除去未結(jié)合的樣品。接著將含有報道基團的第二種抗體加入到固體支持物中。優(yōu)選的報道基團包括如上所述的那些基團。
然后用固定化抗體-多肽復(fù)合物將檢測試劑培養(yǎng)足以檢測結(jié)合多肽的時間期限。一般可以通過檢測在一定時間期限內(nèi)發(fā)生的結(jié)合水平來測定合適的時間期限。接著將未結(jié)合的檢測試劑除去并使用報道基團檢測結(jié)合的檢測試劑。用于檢測報道基團的方法取決于報道基團的性質(zhì)。就放射性基團而言，一般合適的是閃爍計數(shù)法或放射自顯影法?？梢詫⒐庾V法用于檢測染料、發(fā)光基團和熒光基團。可以使用抗生物素蛋白檢測生物素、使其與不同的報道基團(通常是放射性或熒光基團或酶)偶聯(lián)。一般可以通過添加底物(一般持續(xù)特定的時間期限)、隨后對反應(yīng)產(chǎn)物進行光譜或其它分析來檢測酶報道基團。
為了確定存在或不存在諸如卵巢癌這樣的癌癥，一般將由保持與固體支持物結(jié)合的報道基團檢測的信號與符合預(yù)定截斷值的信號進行比較。在一個優(yōu)選的實施方案中，用于檢測癌癥的截斷值是用來自未患癌癥患者的樣品培養(yǎng)固定化抗體時獲得的信號平均值。一般來說，將產(chǎn)生三種預(yù)定截斷值以上的標(biāo)準(zhǔn)偏差的信號的樣品看作是癌癥的陽性信號。在可替代的優(yōu)選的實施方案中，使用Receiver Operator Curve、按照Sackett等人在《臨床流行病學(xué)》(Clinical Epidemiology)“臨床醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)科學(xué)”(A Basic Science for Clinical Medicine)，LittleBrown and Co.，1985，p.106-7中所述的方法來測定所述的截斷值。簡單地說，在本實施方案中，可以根據(jù)符合診斷試驗結(jié)果的各種可能的截斷值的真實陽性率(即敏感性)和假陽性率(100％-特異性)的配對圖來測定截斷值。圖上最接近左上角的截斷值(即包圍最大面積的值)是最準(zhǔn)確的截斷值且可以將產(chǎn)生高于通過本方法測定的截斷值的信號的樣品看作是陽性的。另一方面，截斷值可以沿圖向左移動而將假陽性率減小到最低限度或向右移動以便將假陰性率減小到最低限度。一般來說，將產(chǎn)生高于通過本方法測定的截斷值的信號的樣品看作是癌癥陽性的。
在一個所涉及的實施方案中，測定可以以一種流通或帶狀試驗形式進行，其中將結(jié)合劑固定在諸如硝化纖維素這樣的膜上。在流通試驗中，當(dāng)樣品通過膜時，樣品中的多肽與固定化結(jié)合劑結(jié)合。接著當(dāng)含有第二種結(jié)合劑的溶液流過膜時，第二種標(biāo)記的結(jié)合劑與結(jié)合劑-多肽復(fù)合物結(jié)合。接著如上所述檢測結(jié)合的第二種結(jié)合劑。在帶狀試驗形式中，將與結(jié)合劑結(jié)合的膜的一端浸入含有樣品的溶液。樣品沿膜遷移過含有第二種結(jié)合劑的區(qū)并到達固定化結(jié)合劑的區(qū)域。第二種結(jié)合劑集中在固定化抗體區(qū)域表示存在癌癥。一般來說，第二種結(jié)合劑集中在該部位產(chǎn)生一種可以目測讀取的圖形諸如線條。沒有這類圖形表示陰性結(jié)果。一般來說，當(dāng)生物樣品含有足以在上述形式的雙抗體夾層測定中產(chǎn)生陽性信號的多肽量時，對固定在膜上的結(jié)合劑的量進行選擇以便產(chǎn)生可目測辨別的圖形。用于這類測定的優(yōu)選的結(jié)合劑是抗體及其抗原結(jié)合片段。優(yōu)選固定在膜上的抗體的量在約25ng-約1μg且更優(yōu)選在約50ng-約500ng的范圍。一般可以使用極小量的生物樣品來進行這類試驗。
當(dāng)然，存在適用于本發(fā)明腫瘤蛋白質(zhì)或結(jié)合劑的大量其它的測定方案。上述描述僅是典型的。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然可以方便地修改上述方案以便使用卵巢癌多肽檢測與生物樣品中的這類多肽結(jié)合的抗體。對這類卵巢癌蛋白質(zhì)特異性抗體的檢測可能與存在癌癥相關(guān)。
還可以或另一方面以存在的與生物樣品中的卵巢癌蛋白質(zhì)發(fā)生特異性反應(yīng)的T細胞為基礎(chǔ)檢測癌癥。在某些方法中，用卵巢癌蛋白質(zhì)、編碼這類多肽的多核苷酸和/或表達至少一種這類多肽的免疫原性部分的APC培養(yǎng)包括分離自患者的CD4+和/或CD8+T細胞的生物樣品并檢測存在或不存在T細胞的特異性激活。合適的生物樣品包括但不限于分離的T細胞。例如，可以通過常規(guī)技術(shù)從患者體內(nèi)分離T細胞(諸如通過對外周血液淋巴細胞進行Ficoll/Hypaque密度梯度離心)。在37℃下，可以在體外用卵巢癌蛋白質(zhì)(例如5-25μg/ml)將T細胞培養(yǎng)2-9天(一般為4天)。需要在沒有卵巢癌蛋白質(zhì)存在的情況下培養(yǎng)T細胞樣品的另一等分試樣用作對照。就CD4+T細胞而言，優(yōu)選通過評價T細胞的增殖來檢測激活情況。就CD8+T細胞而言，優(yōu)選通過評價溶細胞活性來檢測激活情況。增殖水平至少高于未患病患者2倍和/或溶細胞活性水平至少高于未患病患者20％表示患者體內(nèi)存在癌癥。
如上所述，還可以或另一方面以編碼生物樣品中的卵巢癌蛋白質(zhì)的mRNA水平為基礎(chǔ)檢測癌癥。例如，可以將至少兩種寡核苷酸引物用于以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)為基礎(chǔ)的測定以便擴增來源于生物樣品的卵巢癌蛋白質(zhì)cDNA的一部分，其中至少一種寡核苷酸引物對編碼卵巢癌蛋白質(zhì)的多核苷酸具有特異性(即與之雜交)。然后使用諸如凝膠電泳這樣的本領(lǐng)域中眾所周知的技術(shù)分離并檢測擴增的cDNA。類似地，可以將與編碼卵巢癌蛋白質(zhì)的多核苷酸特異性雜交的寡核苷酸探針用于雜交測定以便檢測生物樣品中存在的編碼腫瘤蛋白質(zhì)的多核苷酸。
為了在測定條件下進行雜交，寡核苷酸引物和探針應(yīng)包括與編碼至少10個核苷酸、且優(yōu)選至少20個核苷酸長度的卵巢癌蛋白質(zhì)的多核苷酸的一部分具有至少約60％、優(yōu)選至少約75％且更優(yōu)選至少約90％同一性的寡核苷酸序列。優(yōu)選寡核苷酸引物和/或探針如上所述的，在中等嚴(yán)格條件下與編碼本文所述的多肽的多核苷酸雜交。可有用地用于本文所述診斷方法的寡核苷酸引物和/或探針優(yōu)選至少具有10-40個核苷酸的長度。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述的寡核苷酸引物包括具有本文所提供序列的至少10個連續(xù)的核苷酸、更優(yōu)選至少15個連續(xù)的核苷酸的DNA分子。用于以PCR為基礎(chǔ)的測定和雜交測定的技術(shù)在本領(lǐng)域中是眾所周知的(例如，參見Mullis等人在美國冷泉港實驗室(Cold Spring Harbor)的《數(shù)量生物學(xué)專題論叢》(Symp.Quant.Biol.)51263，1987；Erlich編輯《PCR技術(shù)》(PCR Technology)，Stockton Press，NY，1989中所述)。
一種優(yōu)選的測定使用RT-PCR，其中將PCR與反轉(zhuǎn)錄聯(lián)用。一般來說，RNA提取自諸如活檢組織這樣的生物樣品且將其反轉(zhuǎn)錄以便產(chǎn)生cDNA分子。使用至少一種特異性引物的PCR擴增生成cDNA分子，例如，可以使用凝膠電泳將其分離并觀察?？梢詫θ∽栽囼灮颊吆蛠碜晕椿及┌Y的個體的生物樣品進行擴增?？梢詫缍葹閮蓚€數(shù)量級的cDNA的幾種稀釋液進行擴增反應(yīng)。一般將在試驗患者樣品的幾種稀釋液中的表達比非癌癥樣品的相同稀釋液中的表達提高2倍或2倍以上的情況看作陽性。
在另一個實施方案中，可以將編碼這類蛋白質(zhì)的卵巢癌蛋白質(zhì)和多核苷酸用作監(jiān)測癌癥的進展的標(biāo)記。在本實施方案中，可以在一段時間內(nèi)進行如上所述用于癌癥診斷的測定并評價反應(yīng)性多肽水平上的改變。例如，可以將本測定每24-72小時進行一次、持續(xù)6個月至1年的期限且此后根據(jù)需要進行。一般來說，癌癥在那些由結(jié)合劑所檢測的多肽水平在增加一段時間內(nèi)的患者中有發(fā)展。相反，當(dāng)反應(yīng)性多肽水平隨時間保持恒定或減少時，癌癥沒有發(fā)展。
可以直接對腫瘤進行某些體內(nèi)診斷測定。一種這樣的測定包括使腫瘤細胞與結(jié)合劑接觸的步驟。然后可以通過報道基團直接或間接檢測所結(jié)合的結(jié)合劑。還可以將這類結(jié)合劑用于組織學(xué)應(yīng)用。另一方面，可以在這類應(yīng)用中使用多核苷酸探針。
如上所述，為了改善敏感性，可以在給定的樣品中檢測多個卵巢癌蛋白質(zhì)標(biāo)記。顯然可以在單一測定中合并使用對本文提供的不同蛋白質(zhì)具有特異性的結(jié)合劑。此外，可以同時使用多個引物或探針?？梢砸猿Ｒ?guī)實驗為基礎(chǔ)選擇腫瘤蛋白質(zhì)標(biāo)記以便確定產(chǎn)生最佳敏感性的組合。此外或另一方面，可以將用于本文提供的腫瘤蛋白質(zhì)的測定與用于其它已知腫瘤抗原的測定相結(jié)合。
診斷試劑盒
本發(fā)明進一步提供了用于上述任意診斷方法的試劑盒。這類試劑盒一般包括進行診斷測定所必需的兩種或多種成分。成分可以是化合物、試劑、容器和/或器械。例如，試劑盒內(nèi)的一種容器中可以含有與卵巢癌蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的單克隆抗體或其片段?？梢匀缟纤鰧⑦@類抗體或片段附著到固體物質(zhì)上。一種或多種另外的容器中可以裝有諸如試劑或緩沖液這樣的用于測定的成分。這類試劑盒還可以或另一方面含有如上所述的檢測試劑，該檢測試劑含有適合于直接或間接檢測抗體結(jié)合情況的報道基團。
另一方面，可以將試劑盒設(shè)計成可檢測編碼生物樣品中卵巢癌蛋白質(zhì)的mRNA的水平。這類試劑盒一般包括至少一種如上所述的寡核苷酸探針或引物，它們與編碼卵巢癌蛋白質(zhì)的多核苷酸雜交。例如，可以在PCR或雜交測定中使用這類寡核苷酸。可以存在于這類試劑盒中的附加成分包括第二種寡核苷酸和/或診斷試劑或容器以有利于檢測編碼卵巢癌蛋白質(zhì)的多核苷酸。
提供下列實施例是為了說明而非限定的目的。
實施例
實施例1
有代表性卵巢癌蛋白質(zhì)cDNAs的鑒定
本實施例解釋了編碼卵巢癌蛋白質(zhì)的cDNA分子的鑒定。
將抗-SCID小鼠血清(對來自攜帶晚期傳代卵巢癌的SCID小鼠的血清產(chǎn)生的)預(yù)清除大腸桿菌和噬菌體抗原并以1:200的稀釋度用于血清學(xué)表達篩選中。使用定向RH寡脫氧胸苷引導(dǎo)的cDNA文庫構(gòu)建試劑盒和λScreen載體(Novagen)由SCID-衍生的人卵巢腫瘤(0V9334)制成所篩選的文庫。使用噬菌體λ篩選。篩選了約400,000pfu的擴增的OV9334文庫。
分離196個陽性克隆。附圖1A-1S和SEQ ID NOs1-71中提供了某些看起來是新的序列。三種完全的插入序列如附圖2A-2C中所示(SEQ IDNOs72-74)。附圖15A-15EEE中提供了具有已知序列的其它克隆(SEQ IDNOs82-310)。數(shù)據(jù)庫檢索鑒定了下列基本上與附圖15A-15EEE中提供的序列相同的序列。
使用顯微排列技術(shù)進一步表征這些克隆以便測定不同腫瘤和正常組織內(nèi)mRNA的表達水平。使用Synteni(Palo Alto，CA)顯微排列、按照制造商的說明進行了這類分析。將PCR擴增產(chǎn)物排列在載物片上，其中各產(chǎn)物在排列中具有唯一的位置。mRNA提取自所檢測的組織樣品、將其反轉(zhuǎn)錄并產(chǎn)生熒光標(biāo)記的cDNA探針。用標(biāo)記的cDNA探針探測顯微排列并掃描載物片以便測定熒光強度。使用Synteni氏提供的GEMtools軟件分析數(shù)據(jù)。一種克隆(13695、也稱作08E)的結(jié)果如附圖3中所示。
實施例2
使用顯微排列技術(shù)鑒定卵巢癌cDNAs
本實施例解釋了通過PCR扣除和顯微排列分析來鑒定卵巢癌多核苷酸。使用Synteni(Palo Alto，CA)顯微排列、按照制造商的說明(且基本上如Schena等人在《美國國家科學(xué)院院報》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)9310614-10619，1996和Heller等人在《美國國家科學(xué)院院報》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)942150-2155，1997中所述)來分析cDNAs顯微排列的卵巢癌腫瘤特異性表達。
使用包括四種卵巢腫瘤(它們中的三種是轉(zhuǎn)移瘤)的cDNA的試驗者和cDNA型五種正常組織(腎上腺、肺、胰腺、脾和腦)的驅(qū)動者來進行PCR扣除。對從這種扣除中回收的cDNA片段進行DNA顯微排列分析，其中將所述片段進行PCR擴增、粘附到嵌片上并與來源于人卵巢腫瘤和不同正常人組織的mRNAs的熒光標(biāo)記探針雜交。在這種分析中，掃描載物片并測定熒光強度且使用Synteni的GEMtools軟件分析數(shù)據(jù)。一般來說，將在腫瘤細胞中顯示出表達至少增加5倍(相對于正常細胞而言)的序列看作卵巢腫瘤抗原。分析熒光結(jié)果并通過DNA測序和數(shù)據(jù)庫檢索以便確定所述序列的新穎性而進一步表征卵巢腫瘤中顯示出表達增加的克隆。
使用這類測定法鑒定了屬于人T-細胞白血病I型病毒癌蛋白質(zhì)TAX(參見Jin等人，《細胞》(Cell)9381-91，1998)與稱作骨粘連蛋白的胞外基質(zhì)蛋白之間的剪接融合體的卵巢腫瘤抗原。剪接點序列存在于融合點上。附圖4和SEQ ID NO75中提供了這種克隆的序列。還從這類測定法中獨立地鑒定了未剪接和未改變的骨粘連蛋白。
將由本方法鑒定的其它克隆在本文中稱作3f、6b、8e、8h、12c和12h。這些克隆的序列如附圖5-9和SEQ ID NOs76-81中所示。如上所述進行顯微排列分析并如附圖10-14中所示。通過篩選卵巢腫瘤(SCID-衍生的)cDNA文庫而獲得包括克隆3f、6b、8e和12h的全長序列。這種2996個堿基對的序列(命名為0772P)如SEQ ID NO311中所示且編碼的914個氨基酸的蛋白質(zhì)序列如SEQ ID NO312中所示。PSORT分析表明1a型跨膜蛋白位于漿膜上。
除上述序列中的某些外，這種篩選鑒定了下列序列
這種篩選進一步鑒定了本文稱作21013、21003和21008的克隆0772P的多種形式。PSORT分析表明21003(SEQ ID NO386；翻譯成SEQ ID NO389)和21008(SEQ ID NO387；翻譯成SEQ ID NO390)代表0772P的1a型跨膜蛋白形式。21013(SEQ ID NO385；翻譯成SEQ ID NO388)看起來是該蛋白質(zhì)的截短形式且通過PSORT分析將其推斷為分泌性蛋白。
另外的序列分析產(chǎn)生了08E的全長克隆(2627bp，與諾慎分析觀察到的信息大小一致；SEQ ID NO391)。如下獲得了這種核苷酸序列發(fā)現(xiàn)原始08E序列(OrigO8Econs)與來自EST克隆(IMAGE#1987589)的序列有33個核苷酸重疊。這種克隆在原始08E序列的上游提供了1042個另外的核苷酸。對唯一EST和08E序列(ESTxO8EPCR)使用引物、通過對由卵巢原發(fā)性腫瘤文庫產(chǎn)生的多個PCR片段進行測序證實了EST與08E之間的連接鍵。當(dāng)錨式PCR從卵巢腫瘤文庫中產(chǎn)生全部終止于推定起始甲硫氨酸上游的幾種克隆(錨式PCRcons)、而沒有產(chǎn)生任何另外的序列信息時，進一步證實了全長情形。附圖16表示說明全長08E序列中各部分序列位置的示意圖。
可以由全長08E序列翻譯兩種蛋白質(zhì)序列。就“a”(SEQ ID NO393)而言，它開始于推定的起始甲硫氨酸。第二種形式“b”(SEQ ID NO392)包括核苷酸序列5’端的27個另外的上游殘基。
盡管本文已經(jīng)為解釋目的描述了本發(fā)明的具體實施方案，但是顯然可以根據(jù)以上描述對其進行各種修改而不脫離本發(fā)明的實質(zhì)和范圍。因此，除所附的權(quán)利要求外，它們并不用來限定本發(fā)明。
序列表概括
SEQ ID NOs1-71是附圖1A-1S中所示的卵巢癌抗原多核苷酸。
SEQ ID NOs72-74是附圖2A-2C中所示的卵巢癌抗原多核苷酸。
SEQ ID NO75是卵巢癌多核苷酸3g(附圖4)。
SEQ ID NO76是卵巢癌多核苷酸3f(附圖5)。
SEQ ID NO77是卵巢癌多核苷酸6b(附圖6)。
SEQ ID NO78是卵巢癌多核苷酸8e(附圖7A)。
SEQ ID NO79是卵巢癌多核苷酸8h(附圖7B)。
SEQ ID NO80是卵巢癌多核苷酸12e(附圖8)。
SEQ ID NO81是卵巢癌多核苷酸12h(附圖9)。
SEQ ID NOs82-310是15A-15EEE中所示的卵巢癌抗原多核苷酸。
SEQ ID NO311是卵巢癌多核苷酸0772P的全長序列。
SEQ ID NO312是0772P氨基酸序列。
SEQ ID NOs313-384是卵巢癌抗原多核苷酸。
SEQ ID NOs385-390代表0772P形式的序列。
SEQ ID NO391是卵巢癌多核苷酸08E的全長序列。
SEQ ID NOs392-393是由08E編碼的蛋白質(zhì)序列。
序列表
<110>Corixa Corporation
<120>用于治療和診斷卵巢癌的組合物和方法
<130>210121.462PC
<140>PCT
<141>1999-12-17
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<213>人
<400>39權(quán)利要求
1.藥物組合物，用于治療表達由SEQ ID NO391編碼的多肽的癌癥，包括生理學(xué)可接受的載體與以下物質(zhì)的組合
(a)包含由SEQ ID NO391編碼的氨基酸序列的、特異性結(jié)合卵巢癌蛋白的抗體或其抗原結(jié)合片段；
(b)包含由SEQ ID NO391編碼的氨基酸序列的多肽，或與所述多肽具有至少90％同一性的序列；和/或
(c)編碼根據(jù)(b)的多肽的多核苷酸。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中將所述的抗體或抗原結(jié)合片段綴合到毒素。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的藥物組合物，其中所述毒素選自蓖麻毒蛋白、相思豆毒素、白喉毒素、霍亂毒素、gelonin毒素、假單胞菌外毒素、志賀菌屬毒素和美洲商陸抗病毒蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其中將所述抗體或抗原結(jié)合片段綴合到放射性核素。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的藥物組合物，其中所述放射性核素選自90Y、123I、125I、131I、186Re、188Re、211At和212Bi。
6.疫苗組合物，用于治療表達由SEQ ID NO391編碼的多肽的癌癥，包括非特異性免疫反應(yīng)增強劑與下列物質(zhì)的組合
(a)包含由SEQ ID NO391編碼的氨基酸序列的多肽，或與所述多肽具有至少90％同一性的序列；
(b)編碼根據(jù)(b)的多肽的多核苷酸；或
(c)表達(a)的多肽的抗原呈遞細胞。
7.包含由SEQ ID NO391編碼的氨基酸序列的并特異性結(jié)合卵巢癌蛋白的抗體或其抗原結(jié)合片段制備用于治療表達由SEQ ID NO391編碼的多肽的癌癥的藥物的用途。
8.抗獨特型抗體或其抗原結(jié)合片段制備用于治療表達由SEQ IDNO391編碼的多肽的癌癥的藥物的用途，其中所述抗獨特性抗體或其抗原結(jié)合片段特異性地結(jié)合與卵巢癌蛋白特異性結(jié)合的抗體，所述卵巢癌蛋白包含由SEQ ID NO391描述的多核苷酸序列或其互補序列編碼的氨基酸序列。
9.分離的多肽和生理學(xué)可接受的載體制備用于治療表達由SEQ IDNO391編碼的多肽的癌癥的藥物的用途，所述多肽包括至少一種卵巢癌蛋白質(zhì)的免疫原性部分或在一種或多種取代、缺失、添加和/或插入方面有差異的其變化形式，使得該變化形式與抗原特異性抗血清反應(yīng)的能力基本上不會被削弱，其中卵巢癌蛋白包括由SEQ ID NO391描述的多核苷酸序列或所述多核苷酸的互補序列編碼的氨基酸序列。
10.分離的多核苷酸或所述多核苷酸的變化形式制備用于治療表達由SEQ ID NO391編碼的多肽的癌癥的藥物的用途，其中所述多核苷酸編碼由SEQ ID NO391編碼的多肽，所述多核苷酸的變化形式在一種或多種取代、缺失、添加和/或插入方面有差異，使得被所述多核苷酸編碼的多肽的免疫原性沒有被削弱。
11.包含分離的多肽和非特異性免疫增強劑的疫苗制備用于治療表達由SEQ ID NO391編碼的多肽的癌癥的藥物的用途，所述多肽包括至少一種卵巢癌蛋白質(zhì)的免疫原性部分或在一種或多種取代、缺失、添加和/或插入方面有差異的其變化形式，使得該變化形式與抗原特異性抗血清反應(yīng)的能力基本上不會被削弱，其中所述卵巢癌蛋白包括由SEQ ID NO391描述的多核苷酸序列或所述多核苷酸的互補序列編碼的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于治療和診斷諸如卵巢癌這樣的癌癥的組合物和方法。組合物可以包括一種或多種卵巢癌蛋白質(zhì)、其免疫原性部分、編碼這類部分的多核苷酸或?qū)@類蛋白質(zhì)具有特異性的抗體或免疫系統(tǒng)細胞。例如，可以將這類組合物用于預(yù)防和治療諸如卵巢癌這樣的疾病。本發(fā)明進一步提供了用于鑒定選自卵巢癌和/或其它腫瘤的腫瘤抗原的方法。可以進一步將本文提供的多肽類和多核苷酸用于診斷和監(jiān)測卵巢癌。
文檔編號A61K39/395GK101816788SQ20081018370
公開日2010年9月1日 申請日期1999年12月17日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月17日
發(fā)明者J·L·米特查姆, G·E·金, P·A·阿爾蓋特, T·N·弗魯達奇斯 申請人:科里克薩有限公司