專利名稱：：順鉑聯(lián)合phTERT-HRP/IAA在治療宮頸癌細(xì)胞藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體涉及順鉑在增強(qiáng)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因(hTERT)啟動(dòng)子介導(dǎo)的基因治療的藥物中的應(yīng)用，順鉑在增強(qiáng)hTERT啟動(dòng)子活性、增強(qiáng)下游基因表達(dá)中的作用。同時(shí)還涉及順鉑與hTERT啟動(dòng)子調(diào)控辣根過氧化物酶(HRP)/卩引哚乙酸(IAA)系統(tǒng)產(chǎn)生協(xié)同作用破壞宮頸癌細(xì)胞和抑制宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：縱觀國(guó)內(nèi)外的疾病譜變化模式，惡性腫瘤已成為嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病。隨著分子生物學(xué)的進(jìn)步，基因治療為戰(zhàn)勝腫瘤帶來了希望。各國(guó)在惡性腫瘤基因治療方面開展了大量研究并取得了一定成果，部分基因治療方案已經(jīng)用于臨床，從安全性考慮，可以說適于腫瘤治療。例如，中國(guó)擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的重組人p53腺病毒注射液已獲得國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的新藥證書，用于治療頭頸部癌癥和胃癌等惡性腫瘤?；蛑委煹年P(guān)鍵是靶向性問題，也就是把治療效應(yīng)限定在特定的靶細(xì)胞、靶組織或耙器官內(nèi)，既達(dá)到治療作用又不影響正常細(xì)胞和組織。外源調(diào)控在基因治療中尤為重要。為了能特異而有效地殺傷腫瘤細(xì)胞，需要建立一種特異性高、活性強(qiáng)的啟動(dòng)子，來控制下游目的基因的表達(dá)。通過腫瘤特異性啟動(dòng)子調(diào)控目的基因的表達(dá)被廣泛地運(yùn)用于腫瘤靶向基因治療的研究中，這種方法遇到的困難在于，1.絕大多數(shù)選擇性啟動(dòng)子只針對(duì)特殊的組織來源，而沒有能夠適用于不同組織來源的啟動(dòng)子；2.絕大多數(shù)選擇性啟動(dòng)子啟動(dòng)效力較弱，很難達(dá)到治療水平的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。到目前為止，幾乎沒有既有高特異性，又有高活性的腫瘤特異性啟動(dòng)子，這直接阻礙了基因治療的發(fā)展。目前，hTERT基因啟動(dòng)子己被大多數(shù)學(xué)者公認(rèn)為是針對(duì)惡性腫瘤普遍性最好的啟動(dòng)子，是最有希望應(yīng)用于腫瘤靶向基因治療的啟動(dòng)子。提高基因治療中hTERT啟動(dòng)子活性，將有助于下游治療基因的表達(dá)、提高療效，這一點(diǎn)我們?cè)谥委熯^程中應(yīng)當(dāng)重點(diǎn)考慮。端粒酶是一種核糖核蛋白復(fù)合物，能夠維持染色體末端的端粒長(zhǎng)度。端粒酶在超過85%的人類惡性腫瘤細(xì)胞中具有高活性，而在正常組織(除生殖細(xì)胞和有高度復(fù)制潛能的體細(xì)胞)中被抑制或不表達(dá)(見參考文獻(xiàn)ShayJW，BacchettiS.Asurveyoftelomeraseactivityinhumancancer.EurJCancer,1997，33:787-791)。細(xì)胞中hTERT的表達(dá)是端粒酶活性的主要決定因素，它在大部分腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)(見參考文獻(xiàn)CongYS，WrightWE，ShayJW.Humantelomeraseanditsregulation.MicrobiolMolBiolRev，2002,66:407-425)。hTERT基因啟動(dòng)子作為腫瘤特異性啟動(dòng)子被運(yùn)用到多種腫瘤的靶向基因治療方案中，但其活性較弱，下游基因表達(dá)產(chǎn)物往往難以實(shí)現(xiàn)理想的效果(見參考文獻(xiàn)GuJandFangB:Telomerasepromoter-drivencancergenetherapy.CancerBiolTher，2003，2:S64-S70)。如果能夠增強(qiáng)hTERT基因啟動(dòng)子的活性，必將推動(dòng)腫瘤靶向治療的進(jìn)步，具有重要的理論和臨床意義。部分人嘗試通過添加順式作用元件c-Myc結(jié)合位點(diǎn)、Spl結(jié)合位點(diǎn)(見專利文獻(xiàn)WO/2004/076668)等，來修飾端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因啟動(dòng)子，增強(qiáng)啟動(dòng)子活性。由于啟動(dòng)子的活性調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確，且添加的這些反應(yīng)元件在細(xì)胞內(nèi)廣泛存在，受多種因素調(diào)節(jié)，所以，特異性和強(qiáng)度都有待檢驗(yàn)。20世紀(jì)60年代，Rosenberg等(見參考文獻(xiàn)RosenbergB，VanCampL，TroskoJE，etal.Platinumcompounds:anewclassofpotentantitumorangents.Nature,1969，222:3852-3861)偶然發(fā)現(xiàn)順鉬(DDP)能夠抑制細(xì)胞分裂，引起了人們的強(qiáng)烈興趣，由此拉開了鉑類抗腫瘤藥物研究的序幕。時(shí)至今曰，順鉑仍是用于癌癥治療的最常用的藥物之一，它對(duì)睪丸癌、卵巢癌、喉癌、支氣管癌、宮頸癌、淋巴瘤、骨肉瘤、黑色素瘤、膀胱癌以及神經(jīng)母細(xì)胞瘤等有顯著療效。但是，順鉑具有嚴(yán)重的腎毒性、神經(jīng)毒性、胃腸道毒性及耳毒性，從而限制了其給藥劑量;此外，一些腫瘤組織對(duì)順鉑具有先天耐藥性，還有些腫瘤在初次給藥時(shí)對(duì)順鉬敏感，長(zhǎng)期使用則會(huì)產(chǎn)生耐藥性。到了20世紀(jì)七八十年代，人們以減小順鉑的毒副作用為目的，在順鉑的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，合成了大量的順鉑類似物進(jìn)行抗腫瘤活性篩選，最終有28個(gè)化合物進(jìn)入了臨床(見參考文獻(xiàn):WongE，GiandomenicoCM.Currentstatusofplatinum—basedantitumordugs.ChemRev，1999，99:2451-2466)。目前應(yīng)用于臨床的鉑類化療藥物主要包括順鉑、卡鉑、環(huán)硫鉑、奧沙利鉑、奈達(dá)鉑，它們的作用機(jī)制都是以DNA為耙作用部位，靶原子與DNA形成交聯(lián)，阻斷其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。目前為止，國(guó)外的4家實(shí)驗(yàn)室在研究中用到了DDP和hTERT啟動(dòng)子介導(dǎo)的基因治療，取得了理想的治療效果。2004年，Nakamura等(見參考文獻(xiàn)Nakamura，M.，S.Kyo，etal.hTERT-promoter-basedtumor-specificexpressionofMCP-1effectivelysensitizescervicalcancercellstoalowdoseofcisplatin.CancerGeneTher，2004，11:1_7)它們發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞水平和動(dòng)物水平研究中，用hTERT啟動(dòng)子調(diào)控單核細(xì)胞趨化蛋白-l(MCP-1)在宮頸癌細(xì)胞中特異性表達(dá)，同時(shí)給予非常低濃度的DDP，能夠明顯抑制宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，研究者認(rèn)為是由于MCP-1能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞聚集殺傷腫瘤細(xì)胞，增加宮頸癌細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性。研究者的主要目的在于證明MCP-l用于基因治療的有效性。Takeuchi等(Takeuchi，H.，T.Kanzawa，etal.Combinationofcaspasetransferusingthehumantelomerasereversetranscriptasepromoterandconventionaltherapiesformalignantgliomacells.IntJ"Oncol，2004，25:57-63)在研究hTERT啟動(dòng)子調(diào)控半胱胺酸天冬氨酸蛋白酶-6(Caspase-6)表達(dá)的基因治療中，聯(lián)合凋亡誘導(dǎo)劑(順鉑、紫杉醇、卡氮芥)和非凋亡誘導(dǎo)劑(替莫唑胺、Y射線)，觀察對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它們?cè)诎霐?shù)抑制率(IC50)時(shí)順鉑或卡氮芥的聯(lián)合使用能夠降低細(xì)胞中的端粒酶活性，導(dǎo)致聯(lián)合殺傷作用下降。結(jié)論是hTERT/rev-caspase-6基因治療需要與既可以誘導(dǎo)凋亡，又不抑制端粒酶活性的措施聯(lián)合使用治療惡性膠質(zhì)瘤。紫杉醇是一種較好的選擇。Li等(Xi，B.，J.Fan,etal.Suppressionofcolorectaltumorgrowthbyregulatedsurvivintargeting.JMolMed，2006，84:1077-86)在研究米非司酮(RU486)系統(tǒng)時(shí)，運(yùn)用hTERT啟動(dòng)子調(diào)控RU486實(shí)現(xiàn)下游survivin基因顯性負(fù)性突變體在直腸細(xì)胞中的特異表達(dá)，與順鉑聯(lián)用時(shí)能夠明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)。結(jié)論是這種改造的RU486調(diào)控系統(tǒng)適用于腫瘤耙向治療。Toyota等(Toyota,H.，S.Kondo，etal.EnforcedexpressionofatruncatedformofBax-alpha(tBax)drivenbyhumantelomerasereversetranscriptase(hTERT)promotersensitizestumorcellstochemotherapeuticagentsortumornecrosisfactor-relatedapoptosis-inducingligand(TRAIL).AnticancerRes,2006，26:99-105)采用hTERT啟動(dòng)子調(diào)控tBax基因在腫瘤細(xì)胞中特異性表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)tBax能夠增強(qiáng)腫瘤壞死因子受體高表達(dá)，導(dǎo)致增強(qiáng)細(xì)胞殺傷效果。在高表達(dá)Bel-x(L)的成骨肉瘤細(xì)胞中促凋亡基因tBax能夠有效的誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。結(jié)論是tBax單獨(dú)使用或與包括順鉑在內(nèi)的化療藥物一同使用時(shí)對(duì)高表達(dá)抑凋亡基因Bcl-x(L)的癌細(xì)胞具有較好的殺傷效果。可以發(fā)現(xiàn)，在以上4項(xiàng)研究中，使用hTERT啟動(dòng)子的目的在于限制目的基因在腫瘤細(xì)胞中特異表達(dá)。使用DDP的目的不在、也沒有證明他對(duì)hTERT啟動(dòng)子活性的增強(qiáng)作用及可能的提高下游目的基因的表達(dá)量?；?qū)蛐杂厦壳绑w藥物療法(gene-directedenzym印rodrugtherapy,GDEPT)，亦稱自殺基因療法，是目前基因治療領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。其原理為當(dāng)基因在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)時(shí)可將全身給藥的無毒性或毒性極低的藥物前體轉(zhuǎn)變成毒性代謝產(chǎn)物，在腫瘤局部殺傷腫瘤細(xì)胞，避免全身或局部直接給藥的副作用。人單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)/丙氧鳥苷(GCV)系統(tǒng)和胞嘧啶脫氨酶(CD)/5_氟胞嘧啶(5-FU)系統(tǒng)都是被廣泛研究的自殺基因治療體系。辣根過氧化物酶(冊(cè)P)/吲哚乙酸(IAA)系統(tǒng)是新一代前藥系統(tǒng)，與經(jīng)典的HSV-TK/GCV系統(tǒng)相比具有更加快速和高效的腫瘤細(xì)胞殺傷作用(見參考文獻(xiàn)Greco0，F(xiàn)olkesLK，WardmanP，etal.Developmentofanovelenzyme/prodrugcombinationforgenetherapyofcancer:horseradishperoxidase/indole-3_aceticacid.CancerGeneTher，2000，7:1414-1420)。無毒的HRP/IAA系統(tǒng)顯示出不依賴于細(xì)胞連接的細(xì)胞毒性和旁觀者效應(yīng)，在極端的腫瘤細(xì)胞缺氧條件下甚至更加高效，而且它能夠有效地增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的放射敏感性(見參考文獻(xiàn)Greco0，RossiterS，KanthouC，etal.Horseradishperoxidase-mediatedgenetherapy:choiceofprodrugsinoxicandanoxictumorconditions.MolCancerTher，2001，1:151-160;Greco0，TozerGM，DachsGU.Oxicandanoxicenhancementofradiation—mediatedtoxicitybyhorseradishperoxidase/indole-3-aceticacidgenetherapy.IntJ"RadiatBiol，2002，78:173-81)，HRP/IAA系統(tǒng)是一種理想的基因治療選擇。HRP基因在腫瘤細(xì)胞中特異性表達(dá)是HRP/IAA系統(tǒng)發(fā)揮優(yōu)勢(shì)的關(guān)鍵。同時(shí)暗示了，將朋P/IAA系統(tǒng)與化療藥物，如鉑類聯(lián)用的誘人前景。
發(fā)明內(nèi)容.本發(fā)明的目的是在于提供了一種順鉑在增強(qiáng)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因啟動(dòng)子介導(dǎo)的基因治療的藥物中的應(yīng)用，將順鉑用于腫瘤基因治療中hTERT基因啟動(dòng)子的增強(qiáng)劑，增強(qiáng)hTERT基因啟動(dòng)子活性及下游基因的表達(dá)量。本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種順鉑聯(lián)合phTERTp-服P/IAA作為制備治療或預(yù)防宮頸癌細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用。此方案與單用順鉬、單用phTERTp-HRP/IAA或兩者療效簡(jiǎn)單相加比較，對(duì)宮頸癌細(xì)胞具有更加明顯的殺傷作用。而且，hTERT基因啟動(dòng)子保證服P/IAA只在腫瘤細(xì)胞局部發(fā)揮殺傷作用，具有腫瘤特異性，即增強(qiáng)腫瘤局部療效的同時(shí)不增加對(duì)正常細(xì)胞的損傷。本發(fā)明采用人宮頸癌細(xì)胞進(jìn)行研究，通過hTERT啟動(dòng)子調(diào)控的下游熒光素酶報(bào)告基因(Luc)的表達(dá)，評(píng)價(jià)順鉑對(duì)hTERT啟動(dòng)子活性的影響。并通過檢測(cè)細(xì)胞增殖率、細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞周期來評(píng)價(jià)順鉑與hTERT啟動(dòng)子調(diào)控HRP/IAA系統(tǒng)基因治療聯(lián)合使用時(shí)的協(xié)同殺傷作用和機(jī)制。具體
發(fā)明內(nèi)容如下A.順鉑是鉑類藥物中具有代表性的一種，是目前臨床使用最多的一類鉑類藥物。與其它鉑類藥物一樣，順鉑主要作用靶點(diǎn)為DNA，與DNA鏈間及鏈內(nèi)交鏈，形成DDPDNA復(fù)合物，從而干擾DNA復(fù)制，造成細(xì)胞死亡，屬周期非特異性藥。擴(kuò)大以順鉑為代表的鉑類藥物的應(yīng)用范圍具有明顯的可行性和實(shí)際的臨床意義。B.順鉑對(duì)hTERT啟動(dòng)子活性的增強(qiáng)作用質(zhì)粒phTERTp-Luc由申請(qǐng)人構(gòu)建(見.參考文獻(xiàn)LiaoZK，ZhouFX,LuoZG，ZhangWJ,XiongJ，BaoJ，HanG，ZhangMS，XieCH，ZhouYF.Radio-activationofhTERTpromoterinlarynxsquamouscarcinomacells:An'indirected-activator'strategyinradio-gene-therapy.OncolR印.19(2008)281-286.),內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK和對(duì)照質(zhì)粒pGL3-Basic(購(gòu)于PROMEGA公司)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞(GDC009，中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，CCTCC)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24h，分為0、0.5、1、2、5、10、20、30ug/ml終濃度順鉑組，孵育24小時(shí)，雙熒光試劑盒(Promega公司)檢測(cè)螢火蟲熒光素酶(Uc)和海腎熒光素酶(RL)活性。C.順鉑與hTERT啟動(dòng)子調(diào)控服P/IAA系統(tǒng)基因治療對(duì)宮頸癌細(xì)胞的協(xié)同殺傷作用Hela細(xì)胞分分為4組A對(duì)照組，B順鉑組，C基因組，D聯(lián)合組；基因組和聯(lián)合組轉(zhuǎn)染phTERTp—HRP質(zhì)粒24h后加入終濃度為0.5mmol/L的IAA，順鉑組和聯(lián)合組加入終濃度為5ug/ml順鉑，孵育24小時(shí)，四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)檢測(cè)各組細(xì)胞增殖率，AnnexinV-FITC/PI試劑盒比較各組細(xì)胞凋亡率，流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞周期時(shí)相變化。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果1.本發(fā)明表明，順鉑能增強(qiáng)hTERT啟動(dòng)子活性，增強(qiáng)下游基因的表達(dá)。DDP濃度為2ug/ml和5ug/ml時(shí)，hTERT啟動(dòng)子活性顯著增強(qiáng),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.本發(fā)明表明，順鉑與phTERTp-HRP/IAA聯(lián)合比單純順鈾、單純phTERTp-冊(cè)P/IAA或兩者簡(jiǎn)單相加獲得的殺傷效果都要明顯。聯(lián)合組細(xì)胞增殖率為11.1%，明顯低于其它各組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(PO.Ol)。聯(lián)合組細(xì)胞早期凋亡率達(dá)39.8%，明顯高于其它各組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(PO.Ol)。3.本發(fā)明表明，phTERTp-HRP/IAA自殺基因系統(tǒng)聯(lián)合順鉑作用于Hela細(xì)胞比單一基因治療或單一順鉑治療具有更明顯的生長(zhǎng)抑制和凋亡促進(jìn)作用，進(jìn)一.步使阻滯于S期的細(xì)胞比例增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。4.hTERT啟動(dòng)子調(diào)控下游基因在絕大部分腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，而在絕大部分正常細(xì)胞中不表達(dá)，因此，hTERT啟動(dòng)子介導(dǎo)的基因治療可以實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向治療。5.以順鉑為代表的鉑類藥物在臨床上應(yīng)用于數(shù)十種腫瘤化療方案，hTERT啟動(dòng)子介導(dǎo)的針對(duì)大多數(shù)腫瘤的靶向基因治療方案有百余種，兩者聯(lián)合適用于多種腫瘤的治療，并且能夠選擇不同的hTERT啟動(dòng)子下游基因，達(dá)到不同的治療目的，根據(jù)患者具體情況選擇，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療。6.所述的藥物作為制備治療或預(yù)防肺癌、胃癌、食管癌、結(jié)腸癌、直腸癌、肝癌、子宮癌、子宮頸癌、乳腺癌、白血病、惡性淋巴瘤、鼻咽癌、喉癌、胰'腺癌、卵巢癌、膠質(zhì)瘤、腎癌、頭頸部癌、陰道癌、黑素瘤和非黑素瘤皮膚癌，以及肉瘤等惡性腫瘤中的應(yīng)用。圖l.為不同濃度DDP作用于Hela細(xì)胞后熒光素酶的表達(dá)。DDP濃度為2ug/ml和5ug/ml時(shí)，熒光素酶的表達(dá)顯著增強(qiáng)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PO.01)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明一定劑量的DDP可以提高外源性hTERT啟動(dòng)子活性，使下游報(bào)告基因的表達(dá)增強(qiáng)。圖2.不同濃度DDP對(duì)Hela細(xì)胞增殖率影響。當(dāng)DDP濃度《lug/ml時(shí)，細(xì)胞增殖率與未加藥組無明顯差異，當(dāng)DDP濃度》2ug/ml時(shí)，細(xì)胞增殖率與未加藥組差異有顯著性，且隨著DDP濃度的增加，Hela細(xì)胞的增殖率逐漸下降，在濃度為5ug/ml時(shí)細(xì)胞增殖率約50n/c)，在濃度為30ug/ml時(shí)細(xì)胞增殖率接近于0，因此申請(qǐng)人:選用5ug/ml濃度進(jìn)行后續(xù)研究。圖3.A皿exinV-FITC/PI法檢測(cè)各組細(xì)胞早期凋亡率。A組空白對(duì)照組；B組順鉑治療組；C組HRP/IAA自殺基因治療組；D組聯(lián)合治療組。各組細(xì)胞均可分為四個(gè)區(qū)域，壞死(Dl區(qū))，晚期凋亡(D2區(qū))，非凋亡(D3區(qū))，早期凋亡(D4區(qū))。由圖可見，聯(lián)合治療組能夠最大程度的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。圖4.流式細(xì)胞術(shù)分析各組細(xì)胞周期分布A組空白對(duì)照組；B組順鉑組；C組HRP/IAA自殺基因治療組；D組聯(lián)合治療組。結(jié)果顯示，與A組相比，B、D組G0/G1期細(xì)胞比例顯著降低(pO.Ol)，B，C，D組S期細(xì)胞比例顯著升高(p<0.05)，C、D組G2/M期細(xì)胞比例亦顯著降低(p<0.05);D組與B組比較，G0/G1期、S期細(xì)胞比例無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，G2/M期細(xì)胞比例百分比降低(p<0.05);D組與C組比較，G0/G1期細(xì)胞比例降低，S期細(xì)胞比例百分比升高(p<0.05)，但G2/M期細(xì)胞比例無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表2。提示兩者的聯(lián)合應(yīng)用使滯留于S期的細(xì)胞比例進(jìn)一步增加，推測(cè)這可能是兩者聯(lián)合應(yīng)用能更顯著抑制Hela細(xì)胞生長(zhǎng)的又一重要原因。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例l順鉑增強(qiáng)hTERT啟動(dòng)子活性的作用1實(shí)驗(yàn)材料1.1細(xì)胞人宮頸癌細(xì)胞(Hela，CCTCC編號(hào)GDC009)購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC),常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)和傳代。1.2質(zhì)粒質(zhì)粒phTERTp-Luc已由申請(qǐng)人成功構(gòu)建(見參考文獻(xiàn)LiaoZK，ZhouFX，LuoZG，ZhangWJ，XiongJ"，BaoJ"，HanG，ZhangMS,XieCH，ZhouYF.Radio-activationofhTERTpromoterinlarynxsquamouscarcinomacells:An'indirected-activator'strategyinradio-gene-therapy.OncolR印.19(2008)281—286.),內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK和對(duì)照質(zhì)粒pGL3-Basic購(gòu)于PROMEGA公司。1.3試劑脂質(zhì)體METAFECTENE購(gòu)于Biontex公司，雙熒光檢測(cè)試劑盒購(gòu)于PROMEGA公司。DDP購(gòu)于德州德藥制藥有限公司，含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco公司。1.4儀器TD-20/20型熒光發(fā)光計(jì)(美國(guó)TurnerDesigns公司)，DU530紫外可見光分光光度計(jì)(美國(guó)BeckmanCoulter公司)。2.實(shí)驗(yàn)方法2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前1天，取指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，胰酶消化，以每孔IX105接種于24孔板，用含5%C02的37。C溫箱孵育24h。將phTERTp-Luc和pRL-TK(做為內(nèi)對(duì)照)共同以脂質(zhì)體METAFECTENE介導(dǎo)轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞，按DNA(ug):METAFECTENE(lU)=0.5:2轉(zhuǎn)染，具體操作按脂質(zhì)體METAFECTENE試劑盒說明書進(jìn)行。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后放入含5%C02的37'C溫箱孵育5h后，換含10%的小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。2.2DDP處理細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24h，分為0、0.5、1、2、5、10、20、30ug/ml終濃度順鉑組，每組6個(gè)平行孔，用含5%(:02的37'C溫箱繼續(xù)培養(yǎng)24h，按照雙熒光檢測(cè)試劑盒說明書裂解并收集細(xì)胞2.3檢測(cè)TD-20/20型熒光發(fā)光計(jì)檢測(cè)螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活性使用熒光發(fā)光計(jì)按照雙熒光檢測(cè)試劑盒說明書對(duì)裂解細(xì)胞進(jìn)行熒光檢湖U，記錄數(shù)據(jù)。2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理各組數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件(SPSS公司，美國(guó))進(jìn)行方差分析和組間q檢驗(yàn)，以p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果請(qǐng)見附圖1。實(shí)施例2順鉑化療與phTERTp-HRP/IAA聯(lián)合對(duì)宮頸癌細(xì)胞的殺傷作用1實(shí)驗(yàn)材料1.1細(xì)胞細(xì)胞人宮頸癌細(xì)胞(Hela，CCTCC編號(hào)GDC009)購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)和傳代。1.2質(zhì)粒質(zhì)粒phTERTp-HRP已由申請(qǐng)人成功構(gòu)建(見參考文獻(xiàn)LiaoZK，ZhouFX，LuoZG，ZhangWJ,XiongJ，BaoJ，HanG，ZhangMS,XieCH，ZhouYF.Radio-activationofhTERTpromoterinlarynxsquamouscarcinomacells:An'indirected-activator，strategyinradio-gene-therapy,OncolRep.19(2008)281-286)。1.3試劑脂質(zhì)體METAFECTENE購(gòu)于Biontex公司，雙熒光檢測(cè)試劑盒購(gòu)于PROMEGA公司。n引哚乙酸購(gòu)于Fluka公司，凋亡試劑盒A皿exinV-FITC試劑盒購(gòu)于晶美生物工程有限公司，Rnase和PI購(gòu)于天源生物技術(shù)公司，MTT和DMSO購(gòu)于天源生物技術(shù)公司，DDP購(gòu)于德州德藥制藥有限公司，含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco公司1.4儀器DU530紫外可見光分光光度計(jì)(美國(guó)BeckmanCoulter公司)，F(xiàn)C500全自動(dòng)流式細(xì)胞分析儀(美國(guó)BeckmanCoulter公司)，RT-6000酶標(biāo)儀(北京六一儀器廠)2實(shí)驗(yàn)方法2.1實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分為四組A對(duì)照組，Hela細(xì)胞未經(jīng)任何處理；B順鉑組，順鉑作用于Hela細(xì)胞；C基因組，phTERTp-HRP轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后，聯(lián)合吲哚乙酸；D聯(lián)合組，phTERTp-HRP轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后，聯(lián)合吲哚乙酸和順鉑.。2.2藥物處理IAA和DDP分別溶于滅菌PBS溶液中，用0.22nm微孔濾膜過濾除菌備用，細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24h，在基因組加入終濃度為0.5mmol/L的IAA，化療組中加入終濃度5ug/ml順鉑，在聯(lián)合組加入終濃度為0.5mmol/L的IAA和終濃度5ug/ml順鉑，未加藥組用等體積液體培養(yǎng)基替代IAA或DDP，在5XC02的37。C溫箱孵育48h。2.3MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖率取指數(shù)生長(zhǎng)期Hela細(xì)胞，胰酶消化后以每孔3X104細(xì)胞接種于％孔板(分4組，每組6個(gè)平行孔，并設(shè)一組空白培養(yǎng)基)，每孔總液量為200ul。用含5%<:02的37。C溫箱孵育24h，將phTERTp—HRP按DNA(ug):METAFECTENE(ul)=1:6轉(zhuǎn)染介導(dǎo)轉(zhuǎn)染基因組和聯(lián)合組Hela細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24h，處理如2.2.在處理后44h加入5g/LMTT液20ul，37°C、5%C02下繼續(xù)孵育至48h，棄去上清液，每孔加入DMSO150ul，振蕩10min，于30min內(nèi)在RT-6000酶標(biāo)儀上測(cè)定每孑L492nm光的吸收值(A492)。計(jì)算各組增殖率增殖率=(實(shí)驗(yàn)孔A值一空白組A值)/(對(duì)照孔A值一空白組A值)X100%。2.4AnnexinV/PI凋亡檢測(cè)試劑檢測(cè)細(xì)胞凋亡率轉(zhuǎn)染前1天，取指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，胰酶消化，以每孔5X1()S接種于6孔板，用含5XC02的37t:溫箱孵育24h。將phTERTp-HRP以脂質(zhì)體METAFECTENE介導(dǎo)轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞，按DNA(ug):METAFECTENE(ul)=2:6轉(zhuǎn)染，具體操作按脂質(zhì)體METAFECTENE試劑盒說明書進(jìn)行。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后放入含5%C02的37。C溫箱孵育5h后，換含10%的小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24h，處理如2.2.用去離子水按l:4稀釋結(jié)合緩沖液(20ml結(jié)合緩沖液+60ml去離子水)；將每組單細(xì)胞懸液離心沉淀(2000rpm,10min)，棄去上清，用4。C預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞兩次，用250ul結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為lX10"ml;取100nl的細(xì)胞懸液于5ml流式管中，加入5ulAnnexinV/FITC和10ul20ug/ml的碘化丙錠溶液；混勻后于室溫(20-25°C)避光孵育15min;在反應(yīng)管中加400ulPBS，流式細(xì)胞儀(FCS)分析；本實(shí)驗(yàn)每組設(shè)三個(gè)平行樣本，重復(fù)三次。2.5流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期時(shí)相變化細(xì)胞轉(zhuǎn)染及處理同前；處理48h后收集細(xì)胞，將每組單細(xì)胞懸液離心沉淀(2000rpm，10min)棄去上清，用預(yù)冷的PBS洗滌兩次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1X106/1111，加入lmlPI綜合染液；將加入染液的細(xì)胞懸液置于4'C冰箱，染色2030min;離心(200rpm，10min)洗去PI染液，加入0.5mlPBS，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)平行樣本，重復(fù)三次。2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理各組數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件(SPSS公司，美國(guó))進(jìn)行方差分析和組間q檢驗(yàn)，以p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1DDP人宮頸癌Hela細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用本研究顯示低濃度DDP(《lug/ml)對(duì)Hela細(xì)胞無明顯抑制作用，當(dāng)濃度^2ug/ml時(shí)，隨著DDP濃度的增加，Hda細(xì)胞的增殖率逐漸下降，呈量效關(guān)系，在濃度為30ug/ml時(shí)細(xì)胞增殖率接近于0(圖2);由圖3和表1可見化療組的早期凋亡率為(11.1±1.36)%,顯著高于對(duì)照組；與對(duì)照組相比(圖4，表2)，化療組G0/G1期細(xì)胞比例顯著降低(pO.Ol)，S期細(xì)胞比例顯著升高(pO.Ol)，提示順鉑通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，將細(xì)胞阻滯于S期而抑制Hela細(xì)胞生長(zhǎng)。表l.各組細(xì)胞早期凋亡率(5±s%，n=3)分組早期凋亡率(％)A組(對(duì)照組)2.7±1.10B組(順鉑組)ll.l±1.36aC組(基因組)13.5±1.90aD組(聯(lián)合組)39.8±2.61a'b'e注與A組相比ap〈0.01與B組相比bp〈0.01與C組相比ep〈0.01表l.各組早期凋亡率。結(jié)果顯示，順鉑組、基因組、聯(lián)合組細(xì)胞早期凋亡率與對(duì)照組相比較均顯著增高(PO.01),聯(lián)合組與順鉑組、基因組分別比較，早期凋亡率升高更顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。表2.各組細(xì)胞周期改變(x±s%，n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>c注與A組相比apO.Ol，bp<0.05;與B組相比Cp<0.05;與C組相比dpO.Ol表2.各組細(xì)胞周期分布。B，C，D組與A組比較，G0/G1期細(xì)胞比例顯著降低，S期細(xì)胞比例顯著升高，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3.2HRP/IAA系統(tǒng)對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用表3結(jié)果顯示，C組(HRP/IAA基因治療組)細(xì)胞增殖率明顯低于A組(對(duì)照組)(pO.Ol)，可見HRP/IAA系統(tǒng)能抑制Hda細(xì)胞生長(zhǎng)；C組(HRP/IAA基因治療組)細(xì)胞早期凋亡率明顯高于A組(對(duì)照組)(圖3，表l，p<0.01),可見HRP/IAA系統(tǒng)能誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡；圖4和表2可見C組(HRP/IAA基因治療組)比A組(對(duì)照組)G2/M期細(xì)胞比例降低，S期細(xì)胞比例顯著增高(p<0.05)，表明HRP/IAA可將Hela細(xì)胞阻滯在S期，提示由HRP/IAA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯可能是Hela細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的一個(gè)重要的原因。3.3phTERTp-HRP/IAA聯(lián)合順鉑對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用結(jié)果顯示，D組(聯(lián)合治療組)細(xì)胞增殖率分別高于B(順鉑化療組)、C(基因治療組)兩組(表3,pO.Ol);D組細(xì)胞早期凋亡率分別高于B、C兩組(圖3，表l，p<0.01)，可見兩者聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)起到更顯著的抑制作用。D組與B組比較，G2/M期細(xì)胞比例百分比降低(圖4，表2，p<0.05);D組與C組比較，G0/G1期細(xì)胞比例降低，S期細(xì)胞比例百分比升高(p<0.05)。表3.各組細(xì)胞增殖率(5±s%，n=6)分組增殖率(％)A組(對(duì)照組)100B組(順鉑組)49.4±4.45aC組(基因組)73,7±3.20aD組(聯(lián)合組)ll.l±3.50a'b'e注與A組相比ap〈0.01與B組相比bp〈0.01與C組相比ep〈0.01表3.各組細(xì)胞增殖率。B，C，D組的增殖率均顯著低于對(duì)照組(PO.Ol)，D組與B、C組分別比較，增殖率降低更顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(PO.Ol)。根據(jù)本研究，phTERTp-HRP/IAA自殺基因系統(tǒng)聯(lián)合DDP對(duì)Hela細(xì)胞的協(xié)同作用機(jī)制與下列因素有關(guān)1.DDP可以提高h(yuǎn)TERT基因啟動(dòng)子活性，使下游自殺基因HRP的表達(dá)增強(qiáng)，從而增加IAA對(duì)Hela細(xì)胞的毒性作用。2.HRP/IAA系統(tǒng)和化療藥物DDP各自都可將Hela細(xì)胞阻滯在S期，兩者的聯(lián)合應(yīng)用使滯留于S期的細(xì)胞比例進(jìn)一步增加，具有相互增敏的作用，達(dá)到協(xié)同治療效果。權(quán)利要求1.一種順鉑在端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因啟動(dòng)子介導(dǎo)的基因治療的藥物中的應(yīng)用。2.—種順鉑聯(lián)合phTERTp-HRP/IAA在制備治療或預(yù)防宮頸癌細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種順鉑聯(lián)合phTERTp-HRP/IAA在治療宮頸癌細(xì)胞藥物中的應(yīng)用，具體涉及順鉑對(duì)hTERT基因啟動(dòng)子活性的增強(qiáng)作用，順鉑與phTERTp-HRP/IAA共同用于殺傷人宮頸癌細(xì)胞的協(xié)同作用，并探討其作用機(jī)制。本發(fā)明采用Hela細(xì)胞進(jìn)行研究，通過hTERT啟動(dòng)子調(diào)控的下游熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)，評(píng)價(jià)順鉑對(duì)hTERT啟動(dòng)子活性的影響。并通過檢測(cè)細(xì)胞增殖率、細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞周期來評(píng)價(jià)順鉑與hTERT啟動(dòng)子調(diào)控HRP/IAA系統(tǒng)基因治療聯(lián)合使用時(shí)的協(xié)同殺傷作用和機(jī)制。結(jié)果證實(shí)，順鉑可以增強(qiáng)hTERT基因啟動(dòng)子活性，與phTERTp-HRP/IAA聯(lián)用時(shí)對(duì)人宮頸癌細(xì)胞有顯著的殺傷作用。文檔編號(hào)A61K33/24GK101375860SQ20081019701公開日2009年3月4日申請(qǐng)日期2008年9月18日優(yōu)先權(quán)日2008年9月18日發(fā)明者周云峰,周福祥,廖正凱,張紅艷,謝叢華申請(qǐng)人:武漢大學(xué)