專利名稱：紫草素衍生物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中草藥領(lǐng)域，具體地說，是關(guān)于紫草素衍生物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
孤兒受體Nur77 (又稱為TR3或NGFI-B)，是核受體超家族的重要成員，它也是一種立 刻早期基因，其表達可以被血清、生長因子、十四烷酰佛波醋酸酯-13 (TPA)以及鈣信號 迅速誘導(dǎo)(Zhang XK. ".a/.， Expert Opin Ther Tar 2007;11:69-79; Moll UM， w.a/" Oncogene 2006; 25:4725-43.)。
Nur77最初被認為是一種細胞存活因子，它可以介導(dǎo)多種存活信號通路，包括蛋白激 酶A、蛋白激酶C、 MAPK和NF-kB通路。Nur77表達的促生長作用在多種腫瘤中都被證實 (Chen GQ, ".a/" Int J Cancer 2002; 99: 171-8; Wu Q, w.a/., Carcinogenesis 2002; 23: 1583-92.)，己有報道表明，Nur77的mRNA在癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織。
最近，越來越多的證據(jù)表明Nur77同時也是一種促凋亡分子。Nur77對凋亡的作用首先 在未成熟的胸腺細胞和T-細胞雜交瘤通過T-細胞受體信號的凋亡中被報道。Nur77對細胞 凋亡的作用己在多種類型的癌細胞中被證實，它可以對多種凋亡因子，如鈣離子載體、依 托泊甙(VP-16)、佛波酯、鎘以及l(fā),l-Bis (3'-indolyl) -1- (p-substitutedphenyl) methanes 做出應(yīng)答(Stasik I, ".fl/" BBA-Mol Cell Res 2007;1773:1483-90; Gennari A, ".fl/.，Toxico1 Appl Pharmacol 2002;181:27-31; Liu S, e,.a/., World J Gastroenterol 2002;8:446-50; Wilson AJ: ".a/.， Cancer Res 2003;63:5401-7; Chintharlapalli S， w.a/.， J Biol Chem 2005;280:24903-14.)。
調(diào)控Nur77的增殖作用和凋亡作用的生物活性機制之一是通過Nur77的亞細胞定位來 實現(xiàn)的。Nur77通過其在細胞核中的作用實現(xiàn)生長促進，這一作用需要Nur77與靶基因 DNA反應(yīng)調(diào)控元件相結(jié)合，即Nur77在細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄激活作用具有誘導(dǎo)細胞增殖的功 能。而Nur77的凋亡作用不依賴于轉(zhuǎn)錄，在其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域缺失時，這種凋亡誘導(dǎo)作 用仍可發(fā)生。
最近，發(fā)明人通過一系列的研究發(fā)現(xiàn)，在某些促凋亡因素的作用下，Nur77可被誘導(dǎo) 出核，并且定位到線粒體、高爾基體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，誘導(dǎo)細胞凋亡，這種凋亡作用可通過誘導(dǎo) Nur77與Bcl-2的相互作用，引起B(yǎng)d-2構(gòu)象發(fā)生變化，暴露出Bcl-2中蘊藏的BH3結(jié)構(gòu)域，使Bcl-2從一個細胞抗凋亡蛋白轉(zhuǎn)化成細胞促凋亡蛋白。已證明，在前列腺癌、肺癌、 結(jié)腸癌、卵巢癌以及胃癌等許多不同腫瘤中，不同的凋亡因子可誘導(dǎo)Nur77的線粒體定位。 由于許多腫瘤高表達Nur77和Bcl-2，因而，通過調(diào)控Nur77/Bcl-2凋亡通路成為一種非常 有效的篩選腫瘤治療藥物的方法。
紫草為紫草科植物(Boraginaceae),在我國有新疆軟紫草Arnebia euchroma (Royle) Johnst、遼寧硬紫草(Lithospermum erythrorhizon Sieb.et Zucc.)或內(nèi)蒙紫草(Arnebia guttata Bimge)等幾類。紫草性甘、咸、寒，歸心、肝經(jīng)，味苦，性寒，有清熱涼血，透疹解毒 的功能。
紫草含多種萘醌類色素如紫草素、乙酰紫草色素等。新疆紫草含有(3，P-二甲基丙烯酰 紫草素(p, p-Dimethyl-acryl-shikonin)、紫草素(shikonin)、乙酰紫草素(Acetyl shikonin)、 異丁酰紫草素(Isobutyrylshikonin)、異戊酰紫草素(Isovalerylshikonin) 、 P-羥基異戊酰紫 草素(|3-Hydroxyixovalerylshikonin)、去氧紫草素(Deoxyshikonin)等，它們具有多種生 物活性。
近年來，中醫(yī)臨床研究證明紫草對于治療多種癌癥有較好的效果，并證明了其主要的 活性成分是紫草素及其衍生物。目前對紫草素及其衍生物抗腫瘤作用的研究報道，包括抑 制腫瘤細胞生長、誘導(dǎo)細胞凋亡、抑制DNA拓撲異構(gòu)酶、抑制蛋白酪氨酸激酶核抗血管 增生活性等(Chen X, " a/., Phytother Res. 2002 May; 16:199-209.; Shen CC， " a/., J Nat Prod. 2002 Dec;65:1857-62)。但是，紫草素及其衍生物抗腫瘤作用的機理至今尚不明了，并且 一直沒有找到一個明確的作用靶點，因而難以對該結(jié)構(gòu)進行有效的修飾和優(yōu)化，這是制約 其進一步開發(fā)成為抗癌藥物的最主要原因。

發(fā)明內(nèi)容
本申請的發(fā)明人在研究紫草素衍生物對于腫瘤細胞的作用機理的過程中發(fā)現(xiàn)，某些紫 草素衍生物可通過誘導(dǎo)Nur77/Bcl-2凋亡途徑誘導(dǎo)多種腫瘤細胞的凋亡。
因此，本發(fā)明的第一個目的在于，提供一種紫草素衍生物用于制備治療癌癥藥物的應(yīng)用。
本發(fā)明的第二個目的在于，提供一種孤兒受體Nur77作為作用靶點用于篩選紫草素衍 生物的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明，紫草素衍生物用于制備治療癌癥的藥物的應(yīng)用，所述藥物以孤兒受體 Nur77作為作用靶點。根據(jù)本發(fā)明，紫草素衍生物可以誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡，具體的，紫草素衍生物可以誘 導(dǎo)孤兒受體Nur77的表達、誘導(dǎo)孤兒受體Nur77出核且定位在線粒體上、誘導(dǎo)Bcl-2的構(gòu) 象變化、激活Bax，以及引起細胞色素C從線粒體釋放和細胞凋亡。
根據(jù)本發(fā)明，所述紫草素衍生物包括乙酰紫草素、5，8-二乙酰氧基-2- (1，乙酰氧基-4， 甲基-3，戊烯基)-1，4-萘醌和5， 8-二乙酰氧基-6- (r乙酰氧基-4，甲基-3，戊烯基)-1，4-萘醌。
根據(jù)本發(fā)明，所述癌癥優(yōu)選為肺癌、子宮頸癌、乳腺癌、肝癌、胃癌。
根據(jù)本發(fā)明，以孤兒受體Nur77作為作用靶點，可以用于篩選紫草素衍生物，以進一 步開發(fā)用于治療各種癌癥。
本發(fā)明提供的作用于孤兒受體Nur77誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡可以用于指導(dǎo)篩選紫草素衍 生物，從中獲得具有抗腫瘤活性的化合物，并可將獲得的藥物進而制備可作用于孤兒受體 Nur77誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的活性與功能的藥物。


圖1A顯示紫草素衍生物對NIH-460細胞中Nur77蛋白的表達量調(diào)控結(jié)果；圖1B顯 示紫草素衍生物對HeLa細胞中Nur77蛋白的表達量調(diào)控結(jié)果；圖1C顯示SK07對誘導(dǎo) Nur77的表達量增高具有良好的時效和量效關(guān)系；圖1D顯示熒光染色檢測紫草素衍生物 導(dǎo)致Nur77從細胞核中遷移出，并且出核后定位于線粒體上。
圖2A顯示熒光染色檢測紫草素衍生物誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡；圖2B顯示凋亡的百分 比結(jié)果；圖2C顯示紫草素衍生物誘導(dǎo)腫瘤細胞中的PARP蛋白降解。
圖3A為流式細胞儀分析Annexin-V/PI雙染檢測紫草素衍生物誘導(dǎo)NIH-H460肺癌細 胞的凋亡結(jié)果；圖3B為流式細胞儀分析Annexin-V/PI雙染檢測紫草素衍生物誘導(dǎo)小鼠胚 胎成纖維細胞MEF及MEF Nur77-A細胞的凋亡結(jié)果。
圖4A、 B顯示熒光染色檢測紫草素衍生物誘導(dǎo)凋亡依賴于Nur77的表達及其出核； 圖4C顯示細胞凋亡率結(jié)果。
圖5A顯示熒光染色檢測Nur77和Bcl-2的共定位；圖5B顯示熒光染色檢測SK07激 活了Bax;圖5C顯示熒光染色檢測Bax的激活伴隨著細胞色素c的釋放；圖5D顯示熒 光染色檢測SK07誘導(dǎo)了 Bcl-2構(gòu)象變化。
具體實施例方式
以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進一步說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā) 明而非用于限定本發(fā)明的范圍。
實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如《分子克隆實驗室手冊》
(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商 所建議的條件。
本發(fā)明中使用的試劑
脂質(zhì)體2000、 TrizolLS購自Invitrogen公司；ECL、山羊抗兔、山羊抗鼠辣根過氧化 物酶二抗購自Thermo公司；Cy3標(biāo)記的山羊抗鼠二抗購自Chenicon international; Nur77 多抗(sc-5569)、 Hsp60 (sc-7150)、 Bcl-2 (sc-509)、 Bax (sc-493)、 Bax (6A7) (sc-23959) 抗體、PARP(sc-556494)及FITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自Santa Cruz;細胞色素C( 556433 ) 抗體購自BD公司；p-actin抗體購自Sigma公司。Nur77單抗購自R&D; Bcl2-BH3( API303a) 抗體購自Abgent， PVDF膜購自Millipore。無特別注明外，其它本發(fā)明中所用的化學(xué)試劑 均購自Sigma。
實施例l、紫草素衍生物的制備
稱取20kg遼寧硬紫草(市售)，磨碎后過80目篩，收集過篩后獲得的紫草粉末，用
95%乙醇進行常溫滲濾提取，至提取液為近無色為止。
合并提取液，減壓濃縮至溶液變?yōu)樽霞t色，得到紫褐色油狀物粗產(chǎn)物約250g。 過濾除去不溶物后，加入濃HC1酸化溶液，至溶液由藍色變?yōu)樽霞t色，此時有大量沉
淀生成，靜置過夜。
將粗產(chǎn)物用三氯甲烷溶解，并每50毫升加17克200 300目的硅膠，攪拌均勻上柱。 洗脫劑分別用石油醚(60 90°C)—丙酮和石油醚(1: 1) 一丙酮一三氯甲烷(1: 1), 依次洗脫并分別收集洗脫液。
將洗脫液濃縮至沉淀析出，然后重結(jié)晶(重結(jié)晶方法參考專利號為02114973.9的中國 專利)，純化紫草類化合物，產(chǎn)物經(jīng)MNR、 MSUV和元素分析數(shù)據(jù)確定為乙酰紫草素，其 結(jié)構(gòu)式如下
7OH 0
OH O OAc
乙酰紫草素 (汰03)
參考申請?zhí)枮?00710046917.5和200710041978.2的中國專利申請的方法，合成衍生 物5,8-二乙酰氧基-2-(l，-乙酰氧基-4，-甲基-3，-戊烯基)-l,4-萘醌(SK06)和5，8-二乙酰氧 基-6-(l，-乙酰氧基-4，-甲基-3，-戊烯基)-l， 4-萘醌(SK07)， SK06和SK07的結(jié)構(gòu)式分別如
下 OAcO O OAc
OAcO OAc O OAc OAc
2'-二乙酰紫草素 6'-二乙酰紫草素 (SK06) (SK07)
實施例2、紫草素衍生物對于Nur77表達的誘導(dǎo)作用 2.1、細胞培養(yǎng)
選擇肺癌細胞NIH-H460 (ATCC， HTB-177)和宮頸癌細胞HeLa (ATCC， CCL-2)， 用RPM1640培養(yǎng)基(購自Hyclone)，在37。C和5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)于24孔板組織 培養(yǎng)板中，24小時后換液，饑餓16小時后進行加藥(不含血清)處理。紫草素衍生物溶 解于DMSO (DMSO終濃度<0.1%)中，對照組用同樣濃度的DMSO處理，具體處理如 下
(1) 對照組(DMSO)
(2) SK03組
(3) SK06組
(4) SK07組
SK03、 SK06、 SK07的濃度均為5或10pM，處理時間為12或24小時，以未經(jīng)任何 處理的NIH-H460細胞和HeLa細胞作為對照。為了確證時效及量效關(guān)系，用SK07處理 NIH-H460細胞，處理濃度為1、 5或l(HiM，處理時間為6、 12或24小時，以未經(jīng)任何 處理的NIH-H460細胞作為對照。
82. 2、 Western blotting分析Nur77的表達
細胞以改進的RIPA裂解緩沖液(50mMTris-Hcl， pH7.4; 150mMNaCl; 5mMEDTA; l%NP-40， 0.5%脫氧膽酸鈉，0.P/。SDS)于冰上裂解30分鐘。以相同上樣量，8% SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，以5。/。脫脂奶粉的TBST (50mMTris-HCl (pH7.4) ， 150 mM NaCl and 0.1% Tween20)室溫封閉1小時，于室溫2小時或4。C過夜孵育一抗，室溫孵育二抗一小時， ECL顯色，曝光，結(jié)果如圖1A、 1B、 1C所示。
由圖1A的結(jié)果可知，在NIH-H460肺癌細胞中，紫草素衍生物SK03能夠有效誘導(dǎo) Nur77的表達。以SK03 5-10pM的濃度處理細胞12-24小時，其誘導(dǎo)的Nur77蛋白的表達 量約為對照的3-5倍。以SK07處理NIH-H460細胞具有類似的調(diào)控Nur77表達的作用， 但SK06對Nur77的表達作用被顯著抑制。
由圖lB的結(jié)果可知，在HeLa宮頸癌細胞中，紫草素衍生物SK03能夠有效誘導(dǎo)Nur77 的表達。以SK03 5-10pM的濃度處理細胞12-24小時，其誘導(dǎo)的Nur77蛋白的表達量顯著 提高。以SK07處理HeLa細胞也可導(dǎo)致Nur77表達的顯著提高，而SK06對Nur77的誘 導(dǎo)作用被抑制。
由圖1C的結(jié)果可知，隨著SK07處理濃度的增加及處理時間的延長，Nur77的表達 量顯著提高，具有良好的時效和量效關(guān)系。
2.3、紫草素衍生物誘導(dǎo)Nur77出核
選擇肺癌細胞NIH-H460 (ATCC， HTB-177)，用RPM1640培養(yǎng)基(購自Hyclone)， 在37'C和5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)于覆有蓋玻片的24孔板組織培養(yǎng)板中，24小時后換液 和進行加藥(不含血清)處理。紫草素衍生物溶解于DMSO (DMS0終濃度O.1。/。)中， 對照組用同樣濃度的DMSO處理，具體處理如下
(1) 對照組(DMSO)
(2) TPA組
(3) SK03組
(4) SK06組
(5) S認組
(6) 用普霉素A (LMB) (10ng/mL)預(yù)處理后、加入SK07組。 其中，以(1)作為對照組、(2)為陽性對照組。
反應(yīng)板中各孔溶液的總體積均為lml， SK03、 SK06和SK07的濃度均為5pM。細胞經(jīng)處理24小時后，用0.1M磷酸緩沖鹽PBS洗滌3遍，用4%多聚甲醛溶液40ul 固定，再以含1^Triton的0.1MPBS溶液穿孔5min;接著，用含5%BSA的0.1M PBS溶 液、37'C封閉半小時，然后加入兔抗Nur77多克隆抗體(h 200稀釋)(Santa Cruz, sc-5569) 作為一抗，4'C過夜。
取上步過夜處理后的細胞溶液，于室溫放置15min，吸掉一抗后，用0.1M的PBS洗 滌3遍，每遍5min;加入cy3耦連的羊抗鼠二抗(1: 500稀釋，購自Chemicon)，于37 。C放置30min后，吸掉二抗，用0.1MPBS洗滌3遍，每遍5min。
DAPI (購自Sigma)染色用于檢測細胞核。然后用熒光顯微鏡(Carl Zeiss)觀察內(nèi)源 性Nur77的亞細胞定位(BioRad)，結(jié)果如圖1D所示。
根據(jù)圖1D的結(jié)果可知，以紫草素衍生物處理24小時后，Nur77從細胞核中遷移出， 并且出核后定位于線粒體上；而對照組中的Nur77仍留在細胞核中；LMB是已知的依賴 于CRM1的出核轉(zhuǎn)運通路和抑制劑，用LMB和SK07共同處理細胞后，SK07誘導(dǎo)的Nur77 在細胞質(zhì)中的積累可以顯著地被LMB所抑制，說明SK07增強了 Nur77的出核。
上述結(jié)果表明紫草素衍生物可以誘導(dǎo)Nur77從細胞核向細胞質(zhì)的遷移且定位在線粒 體上。
實施例3、紫草素衍生物誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡 3.1紫草素衍生物誘導(dǎo)NIH-H460細胞凋亡
選擇肺癌細胞NIH-H460 (ATCC， HTB-177)，用RPM1640培養(yǎng)基(購自Hyclone)， 在37'C和5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)于24孔板組織培養(yǎng)板中，24小時后換液和進行加藥(不 含血清)處理。紫草素衍生物溶解于DMSO (DMSO終濃度O.P/。)中，對照組用同樣濃 度的DMSO處理，具體處理如下
(1)對照組(DMSO)
(2〉 SK03組
(3) S腿組
(4) SK07組
反應(yīng)板中各孔溶液的總體積均為lml， SK03、 SK06和SK07的濃度均為5pM。 處理24h后，細胞用0.5%胰酶消化，用0.1M PBS洗滌后，用4%多聚甲醛進行固 定，以lpg/mlDAPI進行染色，用熒光顯微鏡(CarlZeiss)觀察細胞核的形態(tài)，結(jié)果如圖 2A所示。隨機選5個視野，計算每視野300個細胞的凋亡數(shù)，取5個視野細胞凋亡的平 均數(shù)，計算凋亡的百分比，結(jié)果如圖2B所示。
10由圖2A可見，以紫草素衍生物處理24小時后，細胞明顯發(fā)生凋亡。凋亡的細胞表現(xiàn) 出典型的形態(tài)學(xué)上的特征，如細胞質(zhì)濃縮、膜呈泡狀，核濃縮以及產(chǎn)生碎片等。由圖2B 的結(jié)果可知，未用紫草素衍生物處理的細胞很少有凋亡現(xiàn)象發(fā)生(7%)，用SK03處理可 引起細胞明顯凋亡(22%), SK07的促凋亡作用顯著增強(33%)，而SK06對凋亡的作用 較弱(14%)。由此可以看出，紫草素衍生物癌細胞具有不同程度的促凋亡作用。
3.2 SK07誘導(dǎo)NIH-H460細胞和HeLa細胞的PARP蛋白降解
選擇肺癌細胞NIH-H460 (ATCC， HTB-177)和宮頸癌細胞HeLa (ATCC， CCL-2)， 用RPM1640培養(yǎng)基(購自Hyclone)，在37°0和5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)于24孔板組織 培養(yǎng)板中，24小時后，分別用加有5pM SK07的無血清的RPMI1640處理3、 6、 12、 24 小時。細胞以改進的RIPA裂解緩沖液(50mM Tris-Hcl ， pH 7.4; 150mM NaCl; 5mM EDTA; l%NP-40， 0.5%脫氧膽酸鈉，0.1。/。SDS)于冰上裂解30分鐘。以相同上樣量，8% SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，以5%脫脂奶粉的TBST (50 mM Tris陽HCl (pH 7.4) ， 150 mM NaCl and 0.1% Tween20)室溫封閉1小時，于室溫2小時或4'C過夜孵育一抗anti-PARP(l: 1000稀釋)， 室溫孵育二抗一小時，ECL顯色，曝光，結(jié)果如圖2C所示。
如圖2C所示，SK07可以誘導(dǎo)113kD的PARP蛋白降解為89kD的特異性降解產(chǎn)物。 隨SK07作用時間的延長89kD的降解產(chǎn)物量逐漸增多，特別是HeLa細胞中在作用12小 時和24小時后，113kD的PARP蛋白幾乎完全消失，全部被降解。
實施例4、利用Annexin-V/PI雙染檢測紫草素衍生物誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡 在無血清RPM1640培養(yǎng)基(購自Hyclone)中用5pM SK07在普霉素A (LMB)存 在和缺少的情況下處理NIH-H460肺癌細胞24小時，以不加SK07的細胞作為對照。細胞 根據(jù)VybrantApoptosis Assay Kit#2操作手冊染色PI和AnnexinV，用流式細胞儀(Beckman Coulter EPICS ALTRA)分析。用EXP032 ADC軟件(Beckman Coulter EPICS ALTRA) 分析，結(jié)果如圖3A所示。
由圖3A可以看出，5pM的SK07在缺少LMB的情況下導(dǎo)致37.9%的NIH-H460細胞 早期凋亡，而在存在LMB的情況下基本不會誘導(dǎo)NIH-H460細胞發(fā)生凋亡。表明SK07 處理可以誘導(dǎo)NIH-H460細胞的早期凋亡，而并不引起細胞壞死(圖中右下象限表示早期 凋亡，右上象限表示壞死)；且這種早期凋亡的誘導(dǎo)可被LMB抑制。
11同樣地，將小鼠胚胎成纖維細胞MEF (ATCC、 SCRC-1046)和Nur77敲除的MEF Nur77-A細胞(Carcinogenesis, vol 28, pp 1653-1658, 2007)用1 和10 pM SK07或10 nM SK03處理24小時，用流式細胞儀分析凋亡，結(jié)果如圖3B所示。
由圖3B可以看出，Nur77敲除的MEFNur77^細胞，SK07的促凋亡作用被顯著抑制。 用lpM SK07處理24小時，MEF細胞的凋亡率為14.6%，而同樣的處理不能引起MEF Nur77一細胞的凋亡。高濃度的SK07 (10pM)雖然可以引起MEF Nur77一細胞23.7%的凋 亡率，但明顯小于MEF細胞57。/。的凋亡率。這一結(jié)果表明，SK07誘導(dǎo)的細胞凋亡極大程 度地依賴于Nur77的表達。當(dāng)用SK03 (lO^M)處理細胞時，發(fā)現(xiàn)它可以引起MEF細胞 54.6%以及MEFNur77一細胞66.8%的壞死率，這說明SK03的作用不依賴于Nur77的表達， 并對于細胞具有非特異的毒性。
實施例5、紫草素衍生物誘導(dǎo)凋亡依賴于Nur77的表達水平以及Nur77的出核轉(zhuǎn)運
為了研究Nur77的易位在紫草素衍生物誘導(dǎo)的細胞凋亡中所起的作用，用Nur77的抗 體和DAPI共同染色SK07處理后的NIH-H460細胞(細胞培養(yǎng)同實施例2.3),熒光顯微 鏡觀察結(jié)果如圖4A所示。根據(jù)圖4A的結(jié)果可以看出，胞質(zhì)Nur77分布的細胞中，細胞 核多呈現(xiàn)凋亡的典型形態(tài)，而細胞核完好的細胞中Nur77不表達或分布于核中。
為了進一步證明Nur77的易位同細胞凋亡誘導(dǎo)之間的關(guān)系，將轉(zhuǎn)染GFP-Nur77的 NIH-H460細胞用10 nM的SK07處理24小時，然后DAPI染色檢測凋亡，用熒光顯微鏡 觀察，結(jié)果如圖4B所示。
從圖4B的結(jié)果可以看出，在對照組細胞中，GFP-Nur77定位于細胞核中，細胞核形 態(tài)正常。而SK07處理后的細胞GFP-Nur77則定位于細胞質(zhì)中，細胞核凝縮，破碎。
如果Nur77的出核轉(zhuǎn)運在SK07誘導(dǎo)的細胞凋亡中起作用，抑制Nur77的出核將可以 減少細胞凋亡。因此，轉(zhuǎn)染GFP-Nur77的NIH-H460細胞在LMB存在或是缺乏的情況下， 以SK07處理。然后DAPI染色檢測細胞凋亡，將顯微鏡觀察的結(jié)果繪制柱形圖，結(jié)果見 圖4C。
從圖4C的結(jié)果可以看出，在無GFP-Nur77轉(zhuǎn)染的條件下，以SK07處理H460細胞， 凋亡率近35%，而對照組為7%。在GFP-Nur77轉(zhuǎn)染的細胞中，SK07處理后，凋亡率達 到88%。而當(dāng)細胞經(jīng)LMB同時處理，SK07誘導(dǎo)的凋亡率顯著降低，未轉(zhuǎn)染細胞為10%， 轉(zhuǎn)染細胞為16%。
以上的結(jié)果說明SK07誘導(dǎo)的細胞凋亡不僅依賴于Nur77的表達水平也依賴于其細胞 質(zhì)定位。實施例6、 SK07誘導(dǎo)Bcl-2構(gòu)象變化、激活Bax
NIH-H460細胞在用SK07處理24小時后，利用免疫染色對抑凋亡蛋白Nur77、 Bcl-2 的定位，Bax的激活，細胞色素C的釋放和Bcl-2的構(gòu)象變化進行分析，以下抗體的稀釋 比例均為1: 500。
6.1、 Nur77和Bcl-2的共定位
SK07 (5pM)在LMB存在和缺少的情況下作用于細胞24小時后，用Nur77的抗體 和Bcl-2的抗體共同染色處理后的細胞。熒光顯微鏡分析Nur77和Bcl-2的分布，結(jié)果如 圖5A所示。圖5A顯示了Nur77和Bcl-2的共定位。
6.2、 SK07激活了Bax
細胞用5pM SK07處理24小時后，共染Bax (6A7)的抗體和Hsp60的抗體。熒光顯 微鏡分析結(jié)果如圖5B所示。根據(jù)圖5B的結(jié)果可知，在對照細胞中，并沒有觀察到激活 的Bax，但是在SK07處理的細胞中，卻表現(xiàn)得很明顯，Nur77與線粒體特異蛋白Hsp60 共同定位。激活Bax細胞的染色通常表現(xiàn)核固縮，表明了 SK07誘導(dǎo)的凋亡與Bax的激活 有關(guān)，SK07激活了Bax， Bax (6A7)和Hsp60的共定位與細胞凋亡相關(guān)聯(lián)。
6.3 Bax的激活伴隨著細胞色素C的釋放
SK07 (5nM)在LMB存在和缺少的情況下作用于細胞24小時，Bax (6A7)的抗體 和細胞色素C的抗體及DAPI共染細胞，熒光顯微鏡分析結(jié)果如圖5C所示。根據(jù)圖5C 的結(jié)果可知，細胞色素C與它的線粒體定位一樣，表現(xiàn)出小染色斑點。但是，細胞色素C 在用激活的Bax免疫染色處理的細胞中呈彌散分布。這種現(xiàn)象表明SK07誘導(dǎo)了 Bax的激 活與細胞色素C的釋放有關(guān)。LMB共同處理細胞，阻止了Nur77的出核和Bcl-2構(gòu)象變 化，幾乎完全抑制SK07誘導(dǎo)的Bax激活和細胞色素C的釋放。
6.4 SK07誘導(dǎo)了 Bcl-2構(gòu)象變化
SK07 (5pM)處理NIH-H460細胞24小時后，以Bcl2 (BH3)禾B BAX (6a7)的抗 體及DAPI染色，熒光顯微鏡分析結(jié)果如圖5D所示。根據(jù)圖5D的結(jié)果可知，Bcl-2(BH3) 的抗體不能染色對照細胞，但可以在SK07處理后的細胞中強染色，且大多和Bax(6A7) 的染色相一致。共聚焦分析表明，SK07處理后的大多數(shù)細胞這兩種蛋白呈共定位。從而 說明，SK07誘導(dǎo)的Bcl-2構(gòu)象變化和Bax的激活以及細胞凋亡密切相關(guān)。由以上的結(jié)果可知，SK03在MEF和MEFNur77-A細胞中均誘導(dǎo)了明顯的早期凋亡和 壞死細胞(圖3B)，因此說明SK03的生物活性很大程度地依賴于Nur-77-非依賴途徑；而 SK07的凋亡效應(yīng)與誘導(dǎo)Nur77表達及出核有關(guān)，通過誘導(dǎo)Nur77表達及出核轉(zhuǎn)運，線粒 體定位，Bcl-2構(gòu)象變化和激活Bax來有效的激活Nur77途徑，導(dǎo)致細胞色素C從線粒體 釋放，誘導(dǎo)凋亡；而SK06卻沒有上述作用。
綜上所述，本發(fā)明的紫草素衍生物通過誘導(dǎo)Nur77表達及從細胞核定位到細胞質(zhì)，從 而誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡。因此本發(fā)明的紫草素衍生物可以用于制備治療癌癥的以孤兒受體 Nur77作為作用靶點的藥物。另外，孤兒受體Nur77可以作為作用耙點用于篩選紫草素衍 生物。
權(quán)利要求
1、一種紫草素衍生物用于制備治療癌癥藥物的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物以孤兒受體Nur77作為作用靶點。
2、 如權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物用于誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡。
3、 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡是通過誘導(dǎo)孤 兒受體Nur77的表達。
4、 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡是通過誘導(dǎo)孤 兒受體Nur77出核且定位在線粒體上。
5、 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡是通過誘導(dǎo)Bcl-2 的構(gòu)象變化。
6、 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡是通過激活Bax。
7、 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡是通過引起細 胞色素C從線粒體釋放。
8、 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述紫草素衍生物包括乙酰紫草素、5,8-二乙酰氧基-2- (r乙酰氧基-4，甲基-3，戊烯基)-1,4-萘醌和5, 8-二乙酰氧基-6- (l，乙酰氧 基-4，甲基-3，戊烯基)-1，4-萘醌。
9、 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述癌癥為肺癌、子宮頸癌、乳腺癌、 肝癌、胃癌。
10、 一種孤兒受體Nur77的應(yīng)用，其特征在于，以孤兒受體Nur77作為作用靶點用于 篩選紫草素衍生物。
11、 如權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其特征在于，所述篩選是篩選作用于孤兒受體Nur77 誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的紫草素衍生物。
12、 如權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其特征在于，所述誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡是通過誘導(dǎo) 孤兒受體Nur77的表達。
13、 如權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其特征在于，所述誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡是通過誘導(dǎo) 孤兒受體Nur77出核且定位在線粒體上。
14、 如權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其特征在于，所述誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡是通過誘導(dǎo) Bcl-2的構(gòu)象變化。
15、 如權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其特征在于，所述誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡是通過激活Bax。
16、如權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其特征在于，所述誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡是通過引起 細胞色素C從線粒體釋放。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種紫草素衍生物用于制備治療癌癥的藥物的應(yīng)用，所述藥物以孤兒受體Nur77作為作用靶點。本發(fā)明還提供了孤兒受體Nur77作為作用靶點用于篩選紫草素衍生物的應(yīng)用。本發(fā)明的紫草素衍生物通過作用于孤兒受體Nur77誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的這一重大發(fā)現(xiàn)，闡明了紫草素衍生物的抗腫瘤作用的機理，為該類結(jié)構(gòu)的修飾和優(yōu)化提供了有效的靶點。
文檔編號A61P35/00GK101683331SQ20081020071
公開日2010年3月31日 申請日期2008年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月27日
發(fā)明者婕 劉, 文 周, 張曉坤, 曾錦章, 李紹順, 王光輝 申請人:廈門大學(xué)