專利名稱：一種腫瘤組織全抗原的制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及腫瘤免疫治療領域，尤其涉及腫瘤組織全抗原的制備方法和用途。
背景技術：
樹突狀細胞(dendritic cells, DC)是體內激活腫瘤特異性CTL功能最強大的抗
原提呈細胞。目前通過體外分離或培養(yǎng)的方法，可以獲得足量的患者自身的DC，體外負載腫
瘤抗原后制備成腫瘤疫苗，回輸患者后在體內能夠誘導較強的抗腫瘤免疫功能。 DC疫苗最早被用于惡性淋巴瘤的臨床治療。Hue等首次報道應用DC疫苗治療4
例濾泡型B細胞淋巴瘤患者，獲得較好的療效；2002年Timmerman等報道DC應用于臨床治
療35例B細胞淋巴瘤患者，結果也取得一定的療效。 目前治療淋巴瘤的DC疫苗的類型較多，各有優(yōu)缺點。 1、淋巴瘤相關抗原蛋白沖擊的DC疫苗 獨特型(idiotype， Id)抗原、hFCRLA抗原、Survivin抗原等淋巴瘤相關抗原蛋白 體外沖擊DC，制備成為DC疫苗，優(yōu)點是腫瘤抗原明確，缺點是抗原表位單一，抗原性較弱。 目前在多組以獨特性抗原負載的DC疫苗免疫治療淋巴瘤的臨床試驗中，其有效性未能獲 得確認。 2、人工合成淋巴瘤相關肽沖擊的DC疫苗 CD19、 CD20分子來源的HLA-A2. 1特異性多肽(CD19150-158， KLMSPKLYV ; CD20188-196，SLFLGILSV) ，RHA匪/CD168分子來源特異性多肽(ILSLELMKL)等沖擊DC制備 的疫苗，可以激發(fā)抗淋巴瘤的免疫力。優(yōu)點是多肽序列明確，可以人工合成，純度高，易于質 控。缺點是受到HLA限制，不能適于大部分淋巴瘤患者的治療，且抗原性弱，抗原表位單一， 療效受限。 3 、酸洗脫肽沖擊的DC疫苗 使用弱酸洗脫的淋巴瘤細胞表面的抗原肽，沖擊DC制備的疫苗，具有一定的抗腫 瘤效應，優(yōu)點是酸洗脫肽純度高、包含的腫瘤抗原較全面，缺點是酸洗脫肽提取操作復雜， 難度高，另一方面大多數淋巴瘤患者都不能獲得足夠數量的淋巴瘤細胞用于提取抗原。
4、淋巴瘤細胞-DC融合疫苗 通過細胞融合雜交瘤技術制備疫苗，操作復雜，疫苗活性低，功能不穩(wěn)定，療效不
5j中瘤細胞mRNA轉染的DC疫苗 純化腫瘤細胞mRNA后體外轉染DC制備獲得的疫苗，動物實驗顯示抗腫瘤療效較 好，但操作較復雜，mRNA體外轉染使用電轉移或脂類試劑介導，致使DC疫苗活性差，部分DC 疫苗較快死亡，難以有效發(fā)揮療效。
6J中瘤細胞成分沖擊的DC疫苗 腫瘤細胞來源的各類細胞成分，包括凋亡小體、外排小體(exosome)、自噬小體 (autophage)等沖擊DC制備的疫苗，包含的腫瘤抗原全面，抗原性強，但所含腫瘤抗原不明確，難以精確定量，大部分患者不能獲得足夠數量的淋巴瘤細胞用于制備抗原，限制了其廣 泛應用。 7、淋巴瘤凍融抗原沖擊的DC疫苗 腫瘤凍融抗原沖擊DC制備的疫苗，可以產生較好的抗腫瘤效應，優(yōu)點是無需鑒定 出腫瘤特異性抗原或純化特異性抗原蛋白，易于制備，可以適用于大部分患者，缺點是凍融 抗原使用腫瘤組織或細胞凍融上清，大部分膜抗原不能成分裂解而被去除，因此凍融抗原 只含有胞槳內抗原，抗原性降低。如果使用全部凍融物，則凍融物不均一，大部分膜抗原體 積較大，不能被內吞處理，制備的DC疫苗含細胞碎片太多，不能被應用。
凍融抗原的方法無法滅活蛋白酶，在保存和加入DC沖擊培養(yǎng)時蛋白酶大量降解 腫瘤抗原；同時也不能有效破碎細胞膜，導致碎片太大不能被DC有效攝取，通常的制備中 通過離心和過濾方法棄去，導致腫瘤抗原大量丟失。超聲破碎組織能力差， 一般只能用于破 碎細胞，同時也不能滅活蛋白酶。用去污劑之類的試劑可以裂解組織，但導致蛋白變性，難 以復性，并影響后繼使用(去污劑也會影響DC活性)。 因此，本領域迫切需要提供一種腫瘤抗原沖擊的疫苗，它含有腫瘤全部蛋白抗原、 抗原穩(wěn)定，操作簡便、易于質控，疫苗活性強。
發(fā)明內容
本發(fā)明旨在提供一種腫瘤組織全抗原及其制備方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種腫瘤疫苗及其制備方法。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種腫瘤組織全抗原的用途。 在本發(fā)明的第一方面，提供了一種腫瘤組織全抗原的制備方法，所述的方法包括 步驟 (1)將片狀新鮮腫瘤活檢組織置于水蒸汽中進行滅活細胞漿中蛋白酶的處理 10-30分鐘，得到滅活了細胞漿中蛋白酶的腫瘤組織； (2)將步驟(1)得到的腫瘤組織進行勻漿處理，得到乳糜狀液體；禾口
(3)將乳糜狀液體和生理鹽水混合得到腫瘤組織全抗原。 在另 一優(yōu)選例中，所述腫瘤是惡性腫瘤，所述惡性腫瘤選自淋巴瘤、骨髓瘤、腎癌、
前列腺癌、惡性黑色素瘤、乳腺癌、或結腸癌等實體腫瘤。 在另一優(yōu)選例中，步驟(1)中的水蒸汽溫度為100-150°C。 在另一優(yōu)選例中，步驟(1)中的水蒸汽在0.05-0.3mPa壓力下產生；更佳地，在 0. 1-0. 2mPa壓力下產生。 在另一優(yōu)選例中，所述的片狀新鮮腫瘤活檢組織厚度為l-5mm;優(yōu)選厚度為 l一3mm。 在本發(fā)明的第二方面，提供了一種腫瘤疫苗的制備方法，所述的方法包括步驟
(a)將片狀新鮮腫瘤活檢組織置于水蒸汽中進行滅活細胞漿中蛋白酶的處理 10-30分鐘，得到滅活了細胞漿中蛋白酶的腫瘤組織； (b)將步驟(a)得到的腫瘤組織進行勻漿處理，得到乳糜狀液體；
(c)將乳糜狀液體和生理鹽水混合得到腫瘤組織全抗原；禾口 (d)將樹突狀細胞和步驟(C)得到的腫瘤組織全抗原混合、培養(yǎng)，得到腫瘤疫苗。
在另一優(yōu)選例中，步驟(a)中的水蒸汽在0.05-0.3mPa壓力下產生；更佳地，在0. 1-0. 2mPa壓力下產生。 在另一優(yōu)選例中，步驟(d)中的水蒸汽溫度為100-150°C。 在另一優(yōu)選例中，在步驟(d)中將樹突狀細胞、腫瘤壞死因子、和步驟(c)得到的腫瘤組織全抗原混合、培養(yǎng)，得到腫瘤疫苗。 在另 一優(yōu)選例中，所述腫瘤是惡性腫瘤，所述惡性腫瘤選自淋巴瘤、骨髓瘤、腎癌、前列腺癌、惡性黑色素瘤、乳腺癌、或結腸癌等實體腫瘤。 在本發(fā)明的第三方面，提供了一種如上所述的制備方法得到的腫瘤組織全抗原。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種疫苗組合物，所述的組合物包括如上所述的腫瘤組織全抗原和樹突狀細胞。 在本發(fā)明的第五方面，提供了一種如上所述的制備方法得到的腫瘤疫苗。 在本發(fā)明的第六方面，提供了一種如上所述的腫瘤組織全抗原的用途，它用作或
被用于制備腫瘤疫苗。 據此，本發(fā)明提供了一種腫瘤抗原沖擊的疫苗，它含有腫瘤全部蛋白抗原、抗原穩(wěn)定，操作簡便、易于質控，疫苗活性強。
圖1顯示了 ATDC免疫后小鼠對A20腫瘤攻擊的抵抗作用。
圖2顯示了 ATDC疫苗體外誘導的特異性CTL活性。
具體實施例方式
發(fā)明人經過廣泛而深入的研究，意外發(fā)現如果將腫瘤活檢組織切割成薄片，經勻漿處理后，便能獲得腫瘤組織的全抗原。用這樣獲得的腫瘤組織全抗原沖擊DC，可以獲得具有更佳活性的腫瘤疫苗。 具體地，可以將新鮮腫瘤活檢組織，切割成為l-3mm厚的薄片；經滅活細胞漿中蛋白酶的處理、勻漿，獲得充分裂解的全部腫瘤抗原，體外加入DC，進一步加入腫瘤壞死因子(TNF a )，培養(yǎng)、收集抗原沖擊的DC，制備獲得疫苗。
定義 如本文所用，"新鮮腫瘤活檢組織"是指不經任何處理，自手術摘取時起0-5天的腫瘤活檢組織，更佳地為0-4小時。 如本文所用，"腫瘤組織全抗原"、"腫瘤組織的全抗原"和"腫瘤組織提取的全抗
原""腫瘤抗原"、"腫瘤組織來源抗原"、"腫瘤裂解抗原"、"腫瘤裂解物"、"腫瘤組織裂解抗
原"、"腫瘤組織裂解物"可以互換使用，包括所有的膜抗原和胞漿內抗原，含有各種腫瘤特
異性抗原、腫瘤相關性抗原、組織細胞特異性(或高表達)抗原等的蛋白、多肽。 如本文所用，"DC"和"樹突狀細胞"都是指具有抗原攝取、體內遷移能力的專職抗
原提呈細胞，具有典型的形態(tài)特征(樹突狀)、免疫表型(HLA-DR+、CD80+、CD86+) 、T細胞激
活功能的一群免疫細胞。本發(fā)明選用來自于腫瘤組織全抗原同一生物體的DC，也可以是同
種異體DC。本發(fā)明的DC的培養(yǎng)方法是本領域常規(guī)的方法，例如但不限于直接從外周血分離
DC、從外周全血直接分離單個核細胞培養(yǎng)DC、經免疫磁珠分離單核細胞后培養(yǎng)DC、和/或從
5骨髓造血干細胞培養(yǎng)DC。
本發(fā)明提供的了一種制備腫瘤組織全抗原的方法，包括步驟 (1)將片狀新鮮腫瘤活檢組織置于水蒸汽中進行滅活細胞漿中蛋白酶的處理10-30分鐘，得到滅活了細胞漿中蛋白酶的腫瘤組織； (2)將步驟(1)得到的腫瘤組織進行勻漿處理，得到乳糜狀液體；禾口
(3)將乳糜狀液體和生理鹽水混合得到腫瘤組織全抗原。 本發(fā)明的制備方法經過水蒸汽處理，軟化組織，經勻漿器研磨破碎細胞，更好地得到均一微小的抗原物質，另一方面高壓蒸汽處理滅活了蛋白酶，避免細胞勻漿破碎后降解腫瘤抗原?？梢允褂帽绢I域熟知的方法進行水蒸汽處理，例如但不限于高壓蒸氣滅活、常壓蒸氣處理；優(yōu)選在0. 05-0. 3mPa壓力下處理，更佳地，為在0. 1_0. 2mPa壓力下處理。
本發(fā)明提供的腫瘤疫苗的制備方法，適用于各種實體腫瘤的DC疫苗制備，所述的腫瘤選自淋巴瘤、骨髓瘤、腎癌、前列腺癌、惡性黑色素瘤、乳腺癌、或結腸癌等實體腫瘤。；優(yōu)選淋巴瘤。 在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，是一種新的淋巴瘤疫苗-淋巴瘤組織提取的全抗原體外沖擊DC疫苗的制備方法，具體操作步驟如下
( — )提取淋巴瘤組織全抗原 1.將淋巴瘤新鮮活檢組織，切割成為l-3mm厚的薄片；
2.進行滅活細胞漿中的蛋白酶的處理； 3.將處理后的組織薄片勻槳，可以使用本領域常規(guī)的方法；禾口
4.溶解獲得淋巴瘤組織提取的全抗原。(二 )體外培養(yǎng)不成熟DC 1.獲得上述淋巴瘤患者單個核細胞液； 2.將單個核細胞液和淋巴細胞分離液混合、離心； 3.吸取界面細胞，加入培養(yǎng)基，離心、收取細胞；所述培養(yǎng)基可以使用本領域常規(guī)
的培養(yǎng)DC的培養(yǎng)基，例如但不限于，RPMI1640， 、 DMEM、生理鹽水、PBS等； 4.將單個核細胞和無血清DC培養(yǎng)基混合、接種細胞，進行培養(yǎng)；禾口 5.將貼壁細胞和無血清DC培養(yǎng)基混合、培養(yǎng)，獲得DC ;所述的無血清DC培養(yǎng)基中
還含有重組人粒細胞_巨噬細胞生長因子(rhGM-CSF)和重組人白細胞介素_4(rhIL-4)。
和(三)抗原沖擊DC及誘導成熟 將DC和上述制備的淋巴瘤組織提取的全抗原混合，再加入重組人腫瘤壞死因子(rhTNF a )、培養(yǎng)1-5天，得到DC疫苗。所述DC和上述制備的淋巴瘤組織提取的全抗原可以按本領域常規(guī)的細胞比例范圍進行混合，例如但不限于20-200 ii g抗原/1X106DC。
本發(fā)明提供的治療淋巴瘤的DC疫苗的制備方法，能夠克服目前各類淋巴瘤DC疫苗的不足，疫苗的活性好，抗原性強，攜帶腫瘤抗原靶點全面，激發(fā)機體抗腫瘤能力更強，并可適用于幾乎所有淋巴瘤患者。 本發(fā)明提到的上述特征，或實施例提到的特征可以任意組合。本案說明書所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。 本發(fā)明的主要優(yōu)點在于 1、無需鑒定出腫瘤特異性抗原或純化特異性抗原蛋白，無需選擇特定的HLA亞型患者，大部分患者都可以獲得足夠量的腫瘤組織，DC疫苗易于制備，易于質控，可以適用于大部分患者的治療。 2、制備DC疫苗的過程避免接觸脂質轉染劑、融合劑，DC疫苗的活性好，回輸體內后存活時間長。 3、獲得腫瘤全部蛋白抗原，包括所有的膜抗原和胞漿內抗原，含有各種腫瘤抗原的蛋白、多肽，抗原性強，DC攝取后制備的疫苗攜帶的腫瘤抗原靶點全面，激發(fā)機體產生的抗腫瘤免疫更全面。 4、經高壓處理，滅活了細胞漿中的蛋白酶，不會消化掉腫瘤相關抗原，抗原性更穩(wěn)定。 5、抗原性質均一，易于定量沖擊DC ;顆粒小，易于被DC攝取和抗原提呈；制備的DC疫苗負載腫瘤抗原量大，抗原提呈功能更強大。 下面將結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYork :Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分比和份數按重量計。 除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意
義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明方法中。文
中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。 實施例1 制備淋巴瘤DC疫苗( — )提取淋巴瘤組織全抗原 1.獲取淋巴瘤新鮮活檢組織，切取0. 2g腫瘤組織，切割成為l-3mm厚的薄片；
2.置高壓蒸汽滅菌鍋中15磅、15分鐘處理； 3.將處理后的組織薄片放入無菌玻璃勻漿器中勻漿至全部呈均質乳糜狀液體；
4.加入無菌生理鹽水2ml，輕輕吹打數次，溶解獲得無菌的淋巴瘤組織提取的全抗原； 5.分裝后-20。C保存?zhèn)溆谩?br>
( 二 )體外培養(yǎng)不成熟DC 1.上述淋巴瘤患者，經血細胞分離機分離4個循環(huán)，獲得l-5Xl(f單個核細胞液(100-200ml); 2.將收取的單個核細胞液緩慢加入(20ml)數個預加20ml淋巴細胞分離液的50mlFalcon離心管(細胞懸液體積與分離液體積相等)，400Xg室溫離心20分鐘；
3.離心后吸取界面細胞，加入全部界面細胞(各人不同，大約5X108-2X1()9，一般取1X1()9細胞量)到50ml RPMI1640培養(yǎng)基(購自Gibco)中，200 X g離心10分鐘，洗滌
3遍，收取細胞；
4.將經離心洗滌的單個核細胞用無血清DC培養(yǎng)基配成4X 106/ml的細胞懸液，種入750ml無菌Falcon培養(yǎng)瓶，接種體積50ml ; 5.將盛有細胞的培養(yǎng)瓶置37t:、5X二氧化碳，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)貼壁2小時； 6.將培養(yǎng)瓶取出，輕輕搖晃十數次，使非貼壁細胞懸起，去除懸浮細胞，再緩慢往瓶中加入50ml RPMI1640培養(yǎng)基，輕輕晃動洗去殘留非貼壁細胞。 7.往保留貼壁細胞的培養(yǎng)瓶中加入50ml含重組人粒細胞-巨噬細胞生長因子(rhGM-CSF) 1000U/ml 、重組人白細胞介素-4 (rhIL-4) 500U/ml的無血清DC培養(yǎng)基(Cellgro-DC)，置5%二氧化碳，37"，飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)； 8.培養(yǎng)至第3天，往培養(yǎng)瓶中補充50ml含重組人粒細胞-巨噬細胞生長因子(rhGM-CSF) 1000U/ml 、重組人白細胞介素-4 (rhIL-4) 500U/ml的無血清DC培養(yǎng)基(Cellgro-DC)，繼續(xù)培養(yǎng)3天，即培養(yǎng)獲得DC。(三)抗原沖擊DC及誘導成熟
1.將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液(含懸浮的不成熟DC)吸入50ml離心管，200Xg離心10分鐘，收取細胞。將收取的DC用含重組人粒細胞-巨噬細胞生長因子(rhGM-CSF) 1000U/ml、重組人白細胞介素_4(rhIL-4)500U/ml的無血清DC培養(yǎng)基配成2X 106/ml的細胞懸液；
2.加入制備的淋巴瘤組織提取的全抗原50ii g抗原/ml細胞懸液，再加入重組人腫瘤壞死因子(rhTNF a ) 100ng/ml，培養(yǎng)8_18小時； 3.用數支50ml離心管收取經與腫瘤抗原孵育過夜的樹突狀細胞懸液(150ml)，200Xg離心IO分鐘，收取細胞；再加入40ml無菌生理鹽水，200 X g離心IO分鐘洗滌，連續(xù)3次。收集細胞即為DC疫苗。
實施例2 DC疫苗治療小鼠B細胞淋巴瘤 1.制備腫瘤抗原選用小鼠淋巴瘤細胞株A20細胞用生理鹽水重懸(1X107/ml)，小鼠皮下注射100iU，3周后切取瘤體組織0. 2g，按照實施例1的步驟制備腫瘤全抗原。
對照為腫瘤凍融抗原，制備方法為切取瘤體組織0.2g，經100目鋼網研磨，收集全部研磨液2ml ，裝入5ml無菌凍存管，將凍存管迅速浸入液氮速凍，10分鐘后取出，放入室溫融化；如此反復凍融5次，3000 X g離心30分鐘，收取上清，經0. 22 y m的一次性無菌濾器過濾除菌，即為腫瘤凍融抗原。 2.小鼠DC培養(yǎng)無菌取BALB/c小鼠股骨骨髓細胞，用含10X胎牛血清(FCS)、重組小鼠GM-CSF (20ng/ml)、重組小鼠IL-4 (5ng/ml)的RPMI1640培養(yǎng)基配成2 X 106/ml的細胞懸液，種入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。培養(yǎng)第3天、6天、9天，補充新鮮DC培養(yǎng)基，細胞培養(yǎng)至第12天，收集懸浮細胞即小鼠DC。 3.DC抗原沖擊及成熟將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液(含懸浮的不成熟DC)吸入50ml離心管，200Xg離心IO分鐘，收取細胞。將收取的DC用含10%胎牛血清(FCS)、重組小鼠GM-CSF (20ng/ml)、重組小鼠IL-4 (5ng/ml)的RPMI1640培養(yǎng)基配成2 X 106/ml的細胞懸液，加入制備的淋巴瘤組織提取的全抗原20ia/ml，再加入重組人腫瘤壞死因子(rhTNFa ) 100ng/ml，培養(yǎng)18小時。用50ml離心管收取經與腫瘤抗原孵育過夜的樹突狀細胞懸液，200Xg離心10分鐘，收取細胞；再加入40ml無菌生理鹽水，200 X g離心10分鐘洗滌，連續(xù)3次。收集細胞即為DC疫苗(ATDC)。同樣方法制備凍融抗原沖擊的DC疫苗(TLDC)。 4.分組及治療將小鼠隨機分為4組，每組10只，分別通過尾靜脈注射抗原致敏 的DC (ATDC) 5 X 107只，另設生理鹽水組、無抗原沖擊DC組、凍融抗原沖擊的DC疫苗(TLDC) 治療組。免疫1周后，小鼠右脅下接種A20細胞1X106/只，其后隔天測量腫瘤大小，觀察 小鼠生存期。腫瘤直徑> 20mm時、或腫瘤出現潰破出血時處死小鼠。
5.療效判定觀察各組小鼠的存活率。
結果 ATDC回輸小鼠體內7天后，給小鼠皮下種植野生型A20細胞，接受免疫的小鼠腫瘤 生長速度較慢，2周后腫瘤開始消退，在觀察期內80%小鼠存活；接受TLDC免疫的小鼠腫瘤 生長速度較慢，在觀察期內40%小鼠存活；而生理鹽水對照組及無抗原沖擊DC組小鼠腫瘤 生長速度快，在觀察期內全部死亡(圖1)。 結果表明，ATDC回輸小鼠體內，能夠產生較強的抗腫瘤免疫反應水平，誘導小鼠抵 抗野生型腫瘤攻擊的能力強于TLDC。
實施例3 DC疫苗體外誘導腫瘤特異性CTL 1.制備腫瘤抗原取患者淋巴瘤新鮮活檢組織0. 2g，按照實施例1的步驟制備腫 瘤全抗原。 腫瘤凍融抗原的制備方法為切取瘤體組織0.2g，經100目鋼網研磨，收集全部研 磨液2ml，裝入5ml無菌凍存管，將凍存管迅速浸入液氮速凍，10分鐘后取出，放入室溫融 化；如此反復凍融5次，3000 X g離心30分鐘，收取上清，經0. 22 ii m的一次性無菌濾器過 濾除菌，即為腫瘤凍融抗原。 2.患者DC培養(yǎng)按照實施例1的步驟制備DC。 3.DC抗原沖擊及成熟按照實施例1的步驟制備，獲得DC疫苗(ATDC)。同樣方法 制備腫瘤凍融抗原沖擊的DC疫苗(TLDC)及無抗原沖擊的DC(DC)。 4.分組及體外CTL培養(yǎng)制備患者外周血單個核細胞，用含10%胎牛血清(FCS)、 重組人白細胞介素2(rh IL-2) (100U/ml)的RPMI1640培養(yǎng)基配成5X 105/ml的細胞懸液， 種入4個培養(yǎng)瓶中，每瓶20ml，各瓶中再分別加入1X105ATDC、 TLDC、 DC及等量生理鹽水， 培養(yǎng)第7天補充新鮮完全培養(yǎng)基及DC疫苗等，細胞培養(yǎng)至第14天。
5. CTL檢測以患者淋巴瘤細胞作為靶細胞，LDH法檢測CTL體外殺傷活性。
結果 ATDC體外誘導的CTL殺傷淋巴瘤細胞的活性顯著高于其它各組(圖2)。 結果表明，ATDC可以較好激活腫瘤特異性CTL，誘導較強的抗腫瘤免疫力，較TLDC
的免疫激活能力更強。 在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可 以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范 圍。
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權利要求
一種腫瘤組織全抗原的制備方法，其特征在于，所述的方法包括步驟(1)將片狀新鮮腫瘤活檢組織置于水蒸汽中進行滅活細胞漿中蛋白酶的處理10-30分鐘，得到滅活了細胞漿中蛋白酶的腫瘤組織；(2)將步驟(1)得到的腫瘤組織進行勻漿處理，得到乳糜狀液體；和(3)將乳糜狀液體和生理鹽水混合得到腫瘤組織全抗原。
2. 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述腫瘤是惡性腫瘤，所述惡性腫瘤選自淋巴瘤、骨髓瘤、腎癌、前列腺癌、惡性黑色素瘤、乳腺癌、或結腸癌等實體腫瘤。
3. 如權利要求l所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)中的水蒸汽溫度為100-150°C。
4. 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的片狀新鮮腫瘤活檢組織厚度為l-5mm ;優(yōu)選厚度為l-3mm。
5. —種腫瘤疫苗的制備方法，其特征在于，所述的方法包括步驟(a) 將片狀新鮮腫瘤活檢組織置于水蒸汽中進行滅活細胞漿中蛋白酶的處理10-30分鐘，得到滅活了細胞漿中蛋白酶的腫瘤組織；(b) 將步驟(a)得到的腫瘤組織進行勻漿處理，得到乳糜狀液體；(c) 將乳糜狀液體和生理鹽水混合得到腫瘤組織全抗原；禾口(d) 將樹突狀細胞和步驟(c)得到的腫瘤組織全抗原混合、培養(yǎng)，得到腫瘤疫苗。
6. 如權利要求5所述的制備方法，其特征在于，在步驟(d)中將樹突狀細胞、腫瘤壞死因子、和步驟(c)得到的腫瘤組織全抗原混合、培養(yǎng)，得到腫瘤疫苗。
7. —種如權利要求l-4任一所述的制備方法得到的腫瘤組織全抗原。
8. —種疫苗組合物，其特征在于，所述的組合物包括如權利要求7所述的腫瘤組織全抗原和樹突狀細胞。
9. 一種如權利要求5或6任一所述的制備方法得到的腫瘤疫苗。
10. 如權利要求7所述的腫瘤組織全抗原的用途，其特征在于，用作或被用于制備腫瘤疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種腫瘤組織全抗原的制備方法和用途，所述的方法包括步驟(1)將片狀新鮮腫瘤活檢組織置于水蒸汽中進行滅活細胞漿中蛋白酶的處理10-30分鐘，得到滅活了細胞漿中蛋白酶的腫瘤組織；(2)將步驟(1)得到的腫瘤組織進行勻漿處理，得到乳糜狀液體；和(3)將乳糜狀液體和生理鹽水混合得到腫瘤組織全抗原。本發(fā)明還公開了將所述的腫瘤組織全抗原沖擊樹突狀細胞獲得腫瘤疫苗的方法。
文檔編號A61P35/00GK101724011SQ200810201439
公開日2010年6月9日 申請日期2008年10月21日 優(yōu)先權日2008年10月21日
發(fā)明者何龍, 朱學軍, 相文杰, 胡海鴿 申請人:南京瑞爾醫(yī)藥有限公司