專利名稱：：淫羊藿素在制備防治內(nèi)毒素血癥藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬中藥制藥領(lǐng)域，涉及淫羊藿素的醫(yī)藥新用途，具體涉及淫羊藿素在制備防治內(nèi)毒素血癥藥物中的用途。
背景技術(shù)：
：細菌內(nèi)毒素(endotoxin)是革蘭氏陰性細菌生長時釋放或死亡時裂解出來的細胞壁脂多糖成分(lipopolysaccharide,LPS)。現(xiàn)有技術(shù)公開了LPS是產(chǎn)生內(nèi)毒素血癥的重要原因，可刺激機體產(chǎn)生TNF-ci、IL-6等前炎癥細胞因子，后者觸發(fā)瀑布式炎癥級聯(lián)反應，進一步激活炎癥細胞(單核-巨噬細胞、中性粒細胞等)，增加粘附分子表達(CDllb/CD18、ICAM-1)、釋放炎性介質(zhì)(N0、PEG2)，形成復雜的炎癥網(wǎng)絡(luò)，造成組織損傷和微循環(huán)障礙。研究報道，革蘭氏陰性細菌嚴重感染所致膿毒血癥，可弓l起全身炎癥反應綜合征(Systemicinflammatoryresponsesyndrome,SIRS)禾口多器官功能障礙綜合征(Multipleorgandysfunctionsyndrome,MODS)，其死亡率高達20%-40%,尤其在ICU病房中更是高達50%左右。作為防治內(nèi)毒素血癥的手段，現(xiàn)有技術(shù)從抑制內(nèi)毒素發(fā)生源的革蘭氏陰性菌增殖出發(fā)，施予抗菌素。但是抗菌素的大量給藥會出現(xiàn)耐藥菌株，并且被殺死的革蘭氏陰性菌突然釋放大量內(nèi)毒素可加重內(nèi)毒素血癥。因此，臨床實踐需要開發(fā)抗菌素之外的治療藥。由此目的出發(fā)，針對內(nèi)毒素或內(nèi)毒素構(gòu)成成分脂質(zhì)A的拮抗劑、針對炎性因子的單克隆抗體等相繼被研發(fā)出來。然而，據(jù)有關(guān)多中心臨床研究發(fā)現(xiàn)，迄今為止，還沒有一種該些類型的制劑能夠顯著降低死亡率。故，從天然藥物中尋找防治內(nèi)毒素血癥的活性成分，就顯得十分必要。淫羊藿為小檗科植物淫羊藿、箭葉淫羊藿、粗毛淫羊藿、巫山淫羊藿或朝鮮淫羊藿的干燥地上部分。淫羊藿含多種黃酮類成分，如淫羊藿苷、淫羊藿次苷、淫羊藿素等。中醫(yī)認為其味辛、甘性溫，歸腎、肝經(jīng)，能補腎壯陽，祛風除濕。淫羊藿素屬黃酮醇類化合物，少量存在于淫羊藿藥材中，其化學結(jié)構(gòu)式如下淫羊藿素R=CH3,Rl-R2-H目前有關(guān)淫羊蕾素的藥理活性研究報道較少。中國專利CN1869204A公開了"淫羊藿素在誘導干細胞體外定向分化方面的用途"。中國專利CN1194701C公開了"淫羊藿素或去甲基淫羊藿素在制備雌激素受體調(diào)節(jié)劑中的應用"。迄今尚未見有關(guān)于淫羊藿素防治內(nèi)毒素血癥方面的用途的報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供淫羊藿素的醫(yī)藥新用途，具體涉及淫羊藿素在制備防治內(nèi)毒素血癥藥物中的用途。本發(fā)明所述的淫羊藿素屬黃酮醇類化合物，具有如下化學結(jié)構(gòu)式OH0淫羊藿素R=CH3，R1=R2=H本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)以脂多糖(LPS)刺激小鼠巨噬細胞系RAW264.7建立體外內(nèi)毒素炎癥模型，以LPS刺激C57BL/6J小鼠建立內(nèi)毒素血癥動物模型，采用淫羊藿素干預，并以地塞米松為對照，通過觀察LPS攻擊后小鼠死亡率，并檢測巨噬細胞活力、炎性因子TNF-a、IL-6、炎性介質(zhì)NO、黏附分子CDllb及肺臟病理，檢測淫羊藿素的療效。結(jié)果表明，淫羊藿素能顯著降低小鼠內(nèi)毒素攻擊后的死亡率、降低炎性因子、炎癥介質(zhì)和粘附分子的水平、減少組織炎癥細胞浸潤。淫羊藿素可作為防治內(nèi)毒素血癥的有效藥物?？蛇M一步按常規(guī)方法制備含淫羊藿素的口服腸溶膠囊或靜脈注射劑等劑型。圖l是小鼠肺臟炎癥細胞浸潤的觀察結(jié)果，其中，A:為小鼠正常肺組織病理切片；B:為LPS腹腔注射90分鐘后肺組織切片，可見肺間質(zhì)高度充血，大部肺泡間隔明顯增寬，肺泡腔部分融合成肺大泡，部分萎縮；肺間質(zhì)大量中性粒細胞浸潤，腔內(nèi)有紅細胞，可見微血栓形成；C、D分別為提前2h給予地塞米松(5mg/kg)和淫羊藿素(25mg/kg)灌胃，LPS腹腔注射90分鐘后兩組肺組織病理改變基本一致，病理顯示肺中度淤血，肺泡隔增寬，少量微血栓形成，間質(zhì)可見較多白細胞浸潤，與B相比有所改善。具體實施例方式實施例1淫羊藿素對小鼠內(nèi)毒素攻擊后死亡率的影響實驗實驗藥物淫羊藿素(上海融禾醫(yī)藥，批號20081578,HPLC純度98。/0、地塞米松(sigma，批號D4902)、LPS(sigma,L2880)。實驗動物C57BL/6J小鼠，雌雄各半，18-22g(上海斯萊克)，動物給藥前在飼養(yǎng)觀察室內(nèi)觀察3d,動物隨機分組,平均每籠6只群養(yǎng)，室溫20°C25°C,相對濕度為50%70%,光暗周期為12h。實驗方法將實驗動物隨機分為6組空白組、模型組、淫羊藿素低劑量組、淫羊藿素中劑量組、淫羊藿素高劑量組、地塞米松對照組，每組12只。其中，淫羊藿素低劑量組、中劑量組、高劑量組和地塞米松組分別給予25mg/kg.d、50mg/kg.d、100mg/kg.d淫羊藿素、5mg/kg.d地塞米松灌胃，連續(xù)3天，空白組和模型組則以同等體積生理鹽水灌胃。第3天灌胃后2小時模型組、淫羊藿素低劑量組、中劑量組、高劑量組和地塞米松組分別給予28mg/kgLPS腹腔注射，空白組給予同等體積的生理鹽水腹腔注射。觀察各組小鼠48小時內(nèi)的死亡率。5采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，卡方檢驗OO進行比較。P〈0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果表明，與模型組相比，淫羊藿素低(25mg/kg)、中(50mg/kg)、高劑量組(75mg/kg)、地塞米松組(5mg/kg)，能顯著降低小鼠LPS攻擊后的死亡率，然而其量效關(guān)系不明顯。表l是小鼠內(nèi)毒素攻擊后的死亡率。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注與模型組相比較，P<0.05實施例2淫羊藿素對小鼠內(nèi)毒素相關(guān)炎癥影響的體外實驗實驗藥物同實施例l。細胞株小鼠巨噬細胞系RAW264.7(購自中國科學院上海細胞庫)。實驗方法(1)RAW264.7細胞的培養(yǎng)與傳代小鼠巨噬細胞RAW246.7加入含10y。的胎牛血清、100U/ml青霉素、鏈霉素的高糖DMEM,置于5%C02、37"C培養(yǎng)箱中生長，細胞生長至70~80%融合后進行傳代，2_3天傳代一次。(2)RAW264.7細胞活力檢測調(diào)整細胞懸液濃度為lX10Vml,加入96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100u1，置37°〇5%0)2孵箱培養(yǎng)6h，吸除舊培養(yǎng)液，分別加入含淫羊藿素(lug/ml、10ug/ml、飾g/ml)、含地塞米松(5ug/ml)的培養(yǎng)基，空白組加含O.1%DMSO的培養(yǎng)基，每組設(shè)6復孔，繼續(xù)培養(yǎng)22h。加入10ulWST-8溶液，培養(yǎng)2h，在490nm處檢測各孔的吸光值。實驗重復3遍以上。(3)NO的檢測調(diào)整細胞懸液濃度為lX107ml,加入96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100yl，置371)5%0)2孵箱培養(yǎng)6h，吸除舊培養(yǎng)液，分別加入含淫羊藿素(lug/ml、10ug/ml、幽g/ml)、含地塞米松(5ug/ml)的培養(yǎng)基，空白組及模型組加含O.1%DMSO的培養(yǎng)基，每孔100ul，每組設(shè)3復孔，預培養(yǎng)lh;其后加入終濃度為10ug/ml的LPS(空白組加相同體積的培養(yǎng)基)，繼續(xù)培養(yǎng)24h;每孔取50ul上清液，采用GriessReagent法，在540nm處檢測各孔的吸光值，并繪制標準曲線，計算NO濃度。實驗重復3遍以上。(4)TNF-a、IL-6的檢測:調(diào)整細胞懸液濃度為lXl()S/ml，加入48孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔400u1，置37。C5呢C02孵箱培養(yǎng)24h。吸除舊培養(yǎng)液，分別加入含淫羊藿素(lug/ml、10ug/ml、100ug/ml)、含地塞米松(5ug/ml)的培養(yǎng)基，空白組加O.1W的DMS0，每組設(shè)3復孔，預培養(yǎng)lh;其后加入終濃度100ng/mlLPS(空白組加相同體積的培養(yǎng)基)，繼續(xù)培養(yǎng)18h;取培養(yǎng)上清，采用酶免試劑盒檢測TNF-a、IL-6含量。采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件分析，定量資料以均數(shù)土標準差表示，采用方差分析"MWJ進行比較。P〈0.05為差異有統(tǒng)計學意義。RAW264.7細胞活力的檢測結(jié)果表明與空白組相比較，分別給予地塞米松5ug/ml、淫羊藿素lug/ml、淫羊藿素10ug/ml均未顯示出細胞毒性作用(P〉0.05)，給予淫羊藿素100ug/ml不僅未顯示細胞毒性作用，還表現(xiàn)出促細胞增殖作用，P〈0.01。表2是RAW264.7細胞活力。表2組別空白地塞米松淫羊藿素淫羊藿素淫羊藿素5ug/mllug/ml10ug/mllOOug/mlOD0.20±0.040.19±0.03A0.19±0.04A0,23±0.02A0.25±0.O廣注與空白組比較，AP〉0.05，，〈0.01。每組設(shè)6個復孔。RAW264.7細胞上清液N0的檢測結(jié)果表明10ug/mlLPS刺激RAW264.7細胞24h后N0釋放顯著增多，P〈0.01;LPS剌激前l(fā)h給予淫羊藿素lug/ml未顯示出抑制作用，P〉0.05;LPS刺激前l(fā)h分別給予地塞米松5ug/ml、淫羊藿素10ug/ml、淫羊藿素100ug/ml顯示出較強的抑制作用，P〈0.01。表3是RAW264.7細胞上清液N0。表3組正常模型地塞米松淫羊藿素淫羊藿素淫羊藿素別LPS10ug/ml5ug/mllug/ml10ug/ral100ug/mlNO5.78±0.34林26.13±0.117.44±0.34**26.25±0.6厶19.5±0.81**17.96±0.65'*注與模型組比較，AP>0.05,WP<0.01。每組設(shè)3個復孔。7RAW264.7細胞上清液TNF-a、IL-6的檢測結(jié)果表明，100ng/mlLPS刺激RAW264.7細胞18h后，上清液中TNF-a、IL-6含量顯著升高(P〈0.0D，而LPS刺激前l(fā)h給予地塞米松5ug/ml、淫羊藿素10ug/ml、淫羊藿素100ug/ml對TNF-a和IL-6均顯示出明顯的抑制作用(P〈0.01)，而LPS刺激前l(fā)h給予淫羊藿素lug/ml僅對TNF-a顯示出抑制作用(P〈0.01)。表4是RAW264.7細胞上清液TNF-a、IL-6檢測結(jié)果。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注與模型組比較，厶P〉0.05，，〈0.01。每組設(shè)3個復孔。實施例3淫羊藿素對小鼠內(nèi)毒素相關(guān)炎癥影響的體內(nèi)實驗實驗藥物同實施例l。實驗動物同實施例l。動物造模及藥物干預實驗動物隨機分為4組空白組、模型組、治療組和西藥對照組，每組8只；治療組(淫羊藿素25mg/kg)、西藥對照組(地塞米松5mg/kg)均以DMSO助溶后灌胃，空白組和模型組以同等體積的DMSO灌胃；灌胃2h后腹腔注射LPSlmg/kg，空白組注射生理鹽水，90分鐘后戊巴比妥鈉麻醉，心臟采血，并分離肺臟。檢測TNF-a、IL-6:全血室溫靜置30分鐘以上，4000轉(zhuǎn)/10分鐘離心，取上清，采用酶聯(lián)免疫法，根據(jù)試劑盒說明，檢測小鼠血清TNF-a、IL-6。檢測中性細胞CDllb表達取100ul肝素鈉抗凝全血，加入0.25ulPE標記的CDllb抗體，混勻后，室溫避光20min，加PBS2ml，2000轉(zhuǎn)/5分鐘離心，棄上清，再加300ulPBS，重懸后，采用流式細胞儀檢測首先按白細胞鍵門，白細胞中根據(jù)前向和側(cè)向光散射的不同區(qū)分淋巴、中性粒細胞(PMN)和單核細胞(MN)，每個樣本分析10000個細胞，結(jié)果以平均熒光強度(MeanFluorescencelnten-sity,MFI)表示。小鼠肺臟病理觀察福爾馬林液固定小鼠肺組織，無水乙醇脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，顯微鏡下觀察小鼠肺臟病理。采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件分析，定量資料以均數(shù)士標準差表示，采用方差分析進行比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。小鼠血清TNF-a、IL-6的檢測結(jié)果表明給予lmg/kgLPS腹腔注射90分鐘后，小鼠血清TNF-a、IL-6釋放均明顯增多，P〈0.01;提前2h給予地塞米松(5mg/kg)和淫羊藿素(20mg/kg)灌胃，LPS腹腔注射90分鐘后小鼠血清TNF-a均明顯減少，p〈0.01，IL-6未見明顯改變，P〉0.05。表5是小鼠血清TNF-a、IL-6檢測結(jié)果。表5組別正常組模型組地塞米松組淫羊藿素組TNF-a31.32士11.91林556,47±44.96142,12±29.27"224.09±27.87材IL-626.89+24.52**224L33+86.672267.62+24.30A2209.26+52.67A注與模型組比較，AP〉0.05，"P<0.01。每組為8只。小鼠中性粒細胞CDllb表達的檢測結(jié)果表明，給予lmg/kgLPS腹腔注射90分鐘后，小鼠中性粒細胞表面CDllb表達明顯增多(P<0.01)。提前2h給予地塞米松(5mg/kg)和淫羊藿素(25mg/kg)灌胃，LPS腹腔注射90分鐘后小鼠中性粒細胞表面CDllb表達明顯減少(P〈0.01)。表6是小鼠中性粒細胞CDllb表達的檢測結(jié)果。表6組別正常組模型組地塞米松組淫羊藿素組CDllb(MFI)259,67±31**731.67±56.2345±30.51W278.67±59.1**注與模型組比較，"P<0.01。每組為3只小鼠肺臟炎癥細胞浸潤的觀察結(jié)果(圖l)顯示LPS腹腔注射90分鐘后肺組織切片，可見肺間質(zhì)高度充血，大部肺泡間隔明顯增寬，肺泡腔部分融合成肺大泡，部分萎縮；肺間質(zhì)大量中性粒細胞浸潤，腔內(nèi)有紅細胞，可見微血栓形成(圖1B);分別提前2h給予地塞米松(5mg/kg)和淫羊藿素(25mg/kg)灌胃，LPS腹腔注射90分鐘后兩組肺組織病理改變基本一致，病理顯示肺中度淤血，肺泡隔增寬，少量微血栓形成，間質(zhì)可見較多白細胞浸潤，與B相比有所改善(圖lC、圖1D)。權(quán)利要求1、淫羊藿素在制備防治內(nèi)毒素血癥藥物中的用途。2、按權(quán)利要求l所述的用途，其中所述的淫羊藿素屬黃酮醇類化合物，具有如下化學結(jié)構(gòu)式-3、按權(quán)利要求l所述的用途，其中所述的防治內(nèi)毒素血癥是降低內(nèi)毒素攻擊后的死亡率、降低炎性因子、炎癥介質(zhì)和粘附分子的水平以及減少組織炎癥細胞浸潤。4、按權(quán)利要求l所述的用途，其中所述的藥物是含淫羊藿素的口服腸溶膠囊或靜脈注射劑。淫羊藿素<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>全文摘要本發(fā)明屬中藥制藥領(lǐng)域，涉及淫羊藿素的醫(yī)藥新用途，具體涉及淫羊藿素在制備防治內(nèi)毒素血癥藥物中的用途。本發(fā)明以脂多糖(LPS)刺激小鼠巨噬細胞系RAW264.7建立體外內(nèi)毒素炎癥模型，以LPS刺激C57BL/6J小鼠建立內(nèi)毒素血癥動物模型，采用淫羊藿素干預，并以地塞米松為對照，實驗結(jié)果表明，所述的淫羊藿素能降低內(nèi)毒素攻擊小鼠后的死亡率、降低炎性因子、炎癥介質(zhì)和粘附分子的水平以及減少組織炎癥細胞浸潤，證實淫羊藿素能有效防治內(nèi)毒素血癥，可進一步制備防治內(nèi)毒素血癥的有效藥物，包括口服腸溶膠囊或靜脈注射劑等劑型。文檔編號A61P39/00GK101428015SQ20081020234公開日2009年5月13日申請日期2008年11月6日優(yōu)先權(quán)日2008年11月6日發(fā)明者吳金峰,董競成申請人:復旦大學附屬華山醫(yī)院