專利名稱：：一種口蹄疫病毒抑制劑、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于遺傳工程領(lǐng)域，具體涉及一種應(yīng)用RNAi技術(shù)設(shè)計(jì)的口蹄疫病毒病抑制劑、其制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：家畜口蹄疫(Footandmouthdisease,FMD)是當(dāng)今世界上最為嚴(yán)重的家畜傳染病，主要危害豬、牛、羊等偶蹄類動(dòng)物，國(guó)際獸醫(yī)局將口蹄疫列為A類傳染病之首。多年來(lái)，口蹄疫在世界范圍內(nèi)大規(guī)模爆發(fā)和流行，給畜牧業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。根據(jù)免疫原性，口蹄疫病毒有A、0、C、SATI、SATII、SATIII及Asial共7個(gè)血清型?，F(xiàn)在市場(chǎng)上銷售的滅活疫苗對(duì)家畜有免疫保護(hù)能力，但是疫苗注射后10天左右才能誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生大量抗體對(duì)動(dòng)物進(jìn)行保護(hù)。口蹄疫病毒感染動(dòng)物后2到3天就能使大量動(dòng)物發(fā)病，為此尋找快速保護(hù)動(dòng)物的病毒抑制劑非常必要。RNAi技術(shù)是科學(xué)研究領(lǐng)域近年來(lái)取得的重大成就之一，它最大的優(yōu)點(diǎn)在于具有快速的防御與治療效果。在自然界中，各種病毒都會(huì)存在多種突變株，口蹄疫病毒就有七種血清型和很多的變異株，這給口蹄疫病的防治工作帶來(lái)了巨大的困難。而siRNA能否到達(dá)口蹄疫病毒在動(dòng)物體內(nèi)感染與復(fù)制的部位就成為siRNA是否能夠高效的干擾靶基因進(jìn)而抑制病毒的重要問(wèn)題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的之一是提供一種高效的口蹄疫病毒病抑制劑，以抑制同一型中不同毒株甚至不同型的口蹄疫病毒在動(dòng)物個(gè)體中復(fù)制與感染。本發(fā)明目的之二是提供上述抑制劑的制備方法。本發(fā)明提供了一種口蹄疫病毒抑制劑，該抑制劑含有表達(dá)抗口蹄疫病毒的siRNA的質(zhì)粒和以減毒豬霍亂沙門(mén)氏菌為受體菌的活菌苗，表達(dá)抗口蹄疫病毒的siRNA的質(zhì)粒分布于以減毒豬霍亂沙門(mén)氏菌為受體菌的活菌苗中。本發(fā)明的口蹄疫病毒抑制劑中，所述的siRNA序列的耙點(diǎn)是口蹄疫病毒0型HNK/2002毒株3D基因(GenBank登錄號(hào)AY317098)，口蹄疫病毒AsiaI型YNBS/58毒株1A基因(GenBank登錄號(hào)AY390432)，口蹄疫病毒AsiaI型JIANGSU毒株1A基因(GenBank登錄號(hào)EF149009)，口蹄疫病毒0型CHA/99毒株2B基因(GenBank登錄號(hào)AJ539138)。本發(fā)明中，siRNA的序列因不同口蹄疫病毒毒株結(jié)構(gòu)特征siRNA的序列可以根據(jù)病毒基因中靶點(diǎn)序列，前后浮動(dòng)適當(dāng)個(gè)數(shù)(一般為6個(gè)以內(nèi))的核苷酸殘基，而不影響siRNA對(duì)病毒的抑制效應(yīng)。即本發(fā)明可將前述的各質(zhì)粒的siRNA序列按病毒基因靶，前后浮動(dòng)6個(gè)以內(nèi)的核苷酸殘基。同時(shí)，設(shè)計(jì)siRNA的序列也可根據(jù)不同口蹄疫病毒毒株基因變異做相應(yīng)的改變，這樣可以保證siRNA對(duì)病毒株有最高效的抑制效果。本發(fā)明的實(shí)施例中描述了構(gòu)建5個(gè)表達(dá)siRNA的質(zhì)粒即P3D_NT56，p3Dl，p1A-NT65，p1A-NT19，和p2B。上述各質(zhì)粒中siRNA序列的靶點(diǎn)分別作用在口蹄疫病毒0型HNK/2002毒株3D基因cDNA的(3D-NT56)和(3D1);口蹄疫病毒AsiaI型YNBS/58毒株1A基因cDNA的(1A-NT65);口蹄疫病毒AsiaI型JIANGSU毒株1A基因(1A-NT19)以及口蹄疫病毒0型CHA/99毒株2B基因cDNA的(2B)。本發(fā)明的口蹄疫病毒抑制劑中，所述的表達(dá)抗口蹄疫病毒的siRNA的質(zhì)粒是p3D-NT56、p3D1、p1A-NT65、p1A-NT19、p2B中的一種或者幾種。本發(fā)明的口蹄疫病毒抑制劑中，所述的表達(dá)抗口蹄疫病毒的siRNA的質(zhì)粒含有如SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4或者SEQIDNO5中所示序列的任意一種或者幾種。本發(fā)明的口蹄疫病毒抑制劑中，所述的表達(dá)抗口蹄疫病毒的siRNA的質(zhì)粒是將p3Dl、plA-NT19和p2B按任意比例混合而得，例如(0.1-10):(0.1-10):1。較好的，如l:2:i，或者i:i:i等。本發(fā)明的口蹄疫病毒抑制劑中，所述的表達(dá)抗口蹄疫病毒的siRNA的質(zhì)粒p3D-NT56、p2B和plA-NT65按任意比例混合而得，例如(0.1-10):(0.1-10):1。較好的，如i:2:i，或者i:i:i等。本發(fā)明的口蹄疫病毒抑制劑中，所述的活菌苗是以仔豬副傷寒活菌苗(減毒豬霍亂沙門(mén)氏菌C500)Salmonellacholeraesuis為傳遞系統(tǒng)的活菌苗。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證能夠傳遞DNA疫苗的減毒沙門(mén)氏菌均可被采用作為傳遞系統(tǒng)，如減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphimurium)，腸炎沙門(mén)氏菌(SalmonellaentericaserovarEnteritidis)。本發(fā)明還提供了上述口蹄疫病毒抑制劑的制備方法，該制備方法包括如下步驟(1)將表達(dá)抗口蹄疫病毒的siRNA的模板序列及其相應(yīng)的啟動(dòng)子插入表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)抗口蹄疫病毒的siRNA的模板序列位于相應(yīng)啟動(dòng)子之后；(2)擴(kuò)增(1)所得的質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化減毒豬霍亂沙門(mén)氏菌。本發(fā)明的口蹄疫病毒抑制劑制備方法中，(2)中將(1)所得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌進(jìn)行擴(kuò)增。上述的啟動(dòng)子可以是小鼠或人組織細(xì)胞中擴(kuò)增U6(根據(jù)6enBank公布小鼠U6啟動(dòng)子基因序列，登錄號(hào)X06980)。本發(fā)明提出的表達(dá)抗口蹄疫的siRNA的活菌苗的制備方法，包括基因制備、重組、或菌苗的組建和活菌苗制備，通常包括如下步驟(1)用PCR方法從小鼠或人組織細(xì)胞中擴(kuò)增U6啟動(dòng)子。將啟動(dòng)子基因插入質(zhì)粒。用化學(xué)合成的方法合成編碼siRNA的DNA模板序列，并將其插入啟動(dòng)子之后，構(gòu)成能夠表達(dá)siRNA的重組質(zhì)粒。(2)將siRNA表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)過(guò)中間宿主鼠傷寒沙門(mén)氏菌LB5010后，電轉(zhuǎn)化到減毒的豬霍亂沙門(mén)氏菌C500中，構(gòu)建成抗口蹄疫病毒的重組活菌抑制劑。本發(fā)明首先在BHK-21細(xì)胞水平和乳鼠水平檢測(cè)各siRNA表達(dá)質(zhì)粒對(duì)于不同血清型口蹄疫病毒的抗病毒活性。試驗(yàn)結(jié)果顯示，p3D-NT56，p3Dl，plA-NT65，plA-NT19和p2B對(duì)O型口蹄疫病毒均有抑制作用(表1)，p3D-NT56，p2B，plA-NT65對(duì)AsiaI型口蹄疫病毒同樣具有較顯著的抑制作用(表1)。p3D-NT56，p2B，plA-NT65在乳鼠水平上具有抑制0型和Asial型兩種不同血清型病毒的能力(表2)。在細(xì)胞水平上，混合使用p3Dl+plA-NT19+p2B的抗病毒能力要高于單一質(zhì)粒。混合使用p3D-NT56+p2B+plA-NT65不僅在細(xì)胞水平表現(xiàn)出4優(yōu)于其它質(zhì)粒的抗病毒效果(表l)，而且在乳鼠水平上同樣顯示出比其他單一質(zhì)粒更為顯著的抗病毒效果(表2)。更進(jìn)一步，將上述siRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入減毒沙門(mén)氏菌C500，獲得口蹄疫病毒抑制劑活菌苗，如p3D-NT56/S.cho等。本發(fā)明用血清凝集實(shí)驗(yàn)檢測(cè)重組菌的沙門(mén)氏菌血清學(xué)特性，以保證減毒豬霍亂沙門(mén)氏菌C500自身作為仔豬副傷寒疫苗的有效性。然后，將保存的重組活菌抑制劑菌種經(jīng)活化后，按照約1%的接種量轉(zhuǎn)接到三角瓶中靜置培養(yǎng)，約6h以后，可得到2X10g-5Xl()gCFU/ml的重組活菌抑制劑培養(yǎng)物。采用肌肉注射方法免疫豚鼠和家豬。對(duì)豚鼠達(dá)到了80%的保護(hù)(表3)，家豬被100%保護(hù)了10天(圖1)。本發(fā)明的一大特點(diǎn)是該活菌苗能將表達(dá)siRNA的質(zhì)粒直接呈遞給免疫應(yīng)答相應(yīng)器官的特異性抗原呈遞細(xì)胞(APC)，從而使表達(dá)的siRNA可以高效的干擾靶基因-口蹄疫病毒的基因，直接在病毒入侵的部位對(duì)病毒復(fù)制進(jìn)行抑制。本發(fā)明的另一個(gè)特點(diǎn)是具有交叉抑制力。其所攜帶的質(zhì)粒能夠表達(dá)靶向口蹄疫病毒保守序列的siRNA，因此可以抑制0型和Asial型口蹄疫病毒的復(fù)制。本發(fā)明利用RNAi技術(shù)，選取了口蹄疫病毒基因組中保守的特異區(qū)段作為靶序列干擾和抑制病毒復(fù)制，從而實(shí)現(xiàn)了siRNA對(duì)多種型和變異株的口蹄疫病毒的快速防治。本發(fā)明組建的重組活菌苗儲(chǔ)存、使用方便。保存采用菌體凍干方式。既可以口服適用，又可以肌肉注射?？诜p毒沙門(mén)氏菌還可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生粘膜免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，綜合提高機(jī)體對(duì)病毒的抵抗能力。減毒沙門(mén)氏菌作為載體傳遞外源質(zhì)粒，不僅可以使機(jī)體抵抗外源質(zhì)粒攜帶的siRNA靶向的病毒，同時(shí)也可以抗沙門(mén)氏菌感染。附圖是一次注射不同劑量p3D-NT56/S.cho抑制病毒在家豬體內(nèi)復(fù)制的損傷值圖。圖例中的數(shù)字代表每頭動(dòng)物的編號(hào)。對(duì)動(dòng)物發(fā)病損傷值的計(jì)數(shù)方法采用美國(guó)梅島動(dòng)物研究中心計(jì)數(shù)方法(Chinsangaram，J.etal.J.Virol.200377:1621-1625)，即豬的16個(gè)小蹄加上鼻鏡總共計(jì)為17個(gè)單位，攻毒后通過(guò)計(jì)數(shù)發(fā)生病毒性水泡或病毒性潰爛的單位數(shù)目多少來(lái)表示癥狀的嚴(yán)重程度。圖1是p3D-NT56/S.cho注射劑量109的損傷值圖。圖2是p3D-NT56/S.cho注射劑量101Q損傷值圖。圖3是pLacZ/S.cho注射劑量109損傷值圖。圖4是S.cho注射劑量l(f損傷值圖。圖5是PBS(磷酸緩沖液，空白對(duì)照)的損傷值圖?？梢?jiàn)，與圖3-5相比，圖1和圖2所用注射劑都有一定的抑制病毒作用。具體實(shí)施例方式以下新型抑制劑的制備和檢驗(yàn)過(guò)程以靶向3D基因的活菌抑制劑為例進(jìn)行說(shuō)明。實(shí)施例1用PCR方法從小鼠NIH/3T3細(xì)胞中擴(kuò)增核糖體RNA的U6啟動(dòng)子。用該啟動(dòng)子序列替換質(zhì)粒pcDNA3.1的多克隆位點(diǎn)前的啟動(dòng)子?；瘜W(xué)合成SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4或者SEQIDN05各序列，各序列的反向重復(fù)序列以及發(fā)夾接頭DNA序列。將各序列與對(duì)應(yīng)的反向重復(fù)序列通過(guò)發(fā)夾接頭DNA連接形成siRNA模板序列。將各siRNA模板序列插在U6啟動(dòng)子之后，分別構(gòu)建成p3D-NT56，p3Dl，plA_NT65，plA_NT19和p2B。在細(xì)胞和乳鼠水平檢測(cè)這些質(zhì)粒對(duì)于不同血清型口蹄疫病毒毒株的抑制。然后將對(duì)于各毒株具有交叉保護(hù)作用的質(zhì)粒p3D-NT56用CaCl2法轉(zhuǎn)化到中間宿主減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌LB5010。從LB5010中提取質(zhì)粒，再用電擊法轉(zhuǎn)化減毒豬霍亂沙門(mén)氏菌C500，得到p3D-NT56/S.cho。用玻片凝集實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證重組菌p3D-NT56/S.cho的血清學(xué)特性，即具有免疫原性。實(shí)施例2用本發(fā)明組建的重組活菌抑制劑以107101QCFU/只的劑量對(duì)體重為250-300克的豚鼠進(jìn)行后腿股內(nèi)側(cè)肌肉注射(用平板稀釋計(jì)數(shù)法計(jì)算活菌數(shù)目)。36小時(shí)后用50IDs。的口蹄疫病毒對(duì)豚鼠進(jìn)行后腳掌穿剌攻擊。結(jié)果顯示，未注射活菌抑制劑的豚鼠在口蹄疫病毒攻擊的48小時(shí)內(nèi)均發(fā)病，而預(yù)先注射了活菌抑制劑的豚鼠對(duì)口蹄疫病毒的攻擊產(chǎn)生了強(qiáng)烈的抵抗力，約有80%的豚鼠最終得到保護(hù)(表3)，而且注射活菌抑制劑的發(fā)病豚鼠在癥狀上比對(duì)照組動(dòng)物要輕得多。實(shí)施例3用本發(fā)明組建的重組活菌抑制劑以10810"CFU/只的劑量對(duì)家豬進(jìn)行頸部肌肉注射。24小時(shí)后用50IDs。的口蹄疫病毒對(duì)家豬進(jìn)行頸部肌肉注射攻擊。攻毒七天和十四天后對(duì)家豬取血，血液靜置過(guò)夜，3500r/min離心10min，取上層血清。檢測(cè)中和抗體和非結(jié)構(gòu)蛋白抗體。結(jié)果顯示，未注射活菌抑制劑的家豬在口蹄疫病毒攻擊的4天內(nèi)均發(fā)病，而預(yù)先注射了活菌抑制劑的家豬被100%的保護(hù)到10天(圖1)。血清學(xué)分析結(jié)果表明(表4)，未發(fā)病動(dòng)物的中和抗體以及非結(jié)構(gòu)蛋白抗體效價(jià)均為陰性，從而說(shuō)明活菌抑制劑有效的抑制了口蹄疫病毒在家豬體內(nèi)的復(fù)制。細(xì)胞中和抗體測(cè)定方法(1)細(xì)胞傳代，傳細(xì)胞于96孔板，371\5%C02條件下培養(yǎng)24小時(shí)，細(xì)胞鋪滿板底面。(2)稀釋血清樣品，稀釋4個(gè)梯度，各稀釋梯度為2的倍數(shù)。(3)將病毒液稀釋到100ID5。/0.lml。(4)每一血清稀釋度樣品加入病毒液(病毒液與血清樣品體積為1:1)?；靹蚝螅?7"溫箱放置1小時(shí)。(5)倒掉96孔板細(xì)胞上清液，每孔加入100ii1血清病毒混和液，每一稀釋度加4孔。37°C、5%C02條件下培養(yǎng)，48-72小時(shí)后觀察每孔病變情況，以半數(shù)病變的稀釋度作為中抗體指標(biāo)。表lsiRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞降低口蹄疫病毒的效價(jià)6<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注Mixl=p3D_NT56+p2B+plA_NT65;Mix2=p3D1+p2B+p1A-NT19;2pLacZ+pNTH21，pNTH21，Lip，LacZ和空白均為對(duì)照組。pNTH21和pLacZ為表達(dá)非特異性shRNA的質(zhì)粒，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。Lip為單純脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞組。空白為非轉(zhuǎn)染組。病毒效價(jià)計(jì)算方法在96孔板上培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞，直至長(zhǎng)滿孔底。以無(wú)血清無(wú)抗生素的匿EM培養(yǎng)基對(duì)原始病毒液作十倍的系列稀釋(例如，10—3-10—8)。吸去細(xì)胞孔中的培養(yǎng)基，每孔中加入100iU某一稀釋度的病毒液，每一稀釋度作4個(gè)重復(fù)孔。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱371\5%(A條件下培養(yǎng)。72h后，通過(guò)倒置顯微鏡觀察并記錄每個(gè)稀釋度細(xì)胞發(fā)生病理學(xué)病變[17]的孔數(shù)，以Reed-Muench公式(Reed，L.J.，Muench，H.A.Am.J.Hyg.193827:493-497)計(jì)算半數(shù)細(xì)胞感染劑量(TCID5。)表2注射siRNA表達(dá)質(zhì)粒降低感染口蹄疫病毒的乳鼠的死亡率7<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注Mixl=p3D-NT56+plA-NT65+p2B;Mix2=p3Dl+plA-NT19+p2B;PBS為注射磷酸緩沖液的實(shí)驗(yàn)組。每組20只乳鼠。存活率=每組存活動(dòng)物數(shù)+每組動(dòng)物總數(shù)X100%。表3重組活菌苗在豚鼠體內(nèi)抗病毒效果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表中"-"表示保護(hù)率不再降低。保護(hù)率=每組未發(fā)病動(dòng)物數(shù)+每組動(dòng)物總數(shù)X100%。表4p3D-NT56/S.cho—次注射動(dòng)物的血清學(xué)分析組別動(dòng)物編號(hào)中和抗體ELISA阻斷率(%)o天7天14天0天7天14天PBS28-8《3108362NDND冊(cè)1-48《3362362NDNDND3-2《3128362么6±0.239.5±0.136.2±2.0pLacZ/S.cho6-2《3180362NDNDND10943-14《3180362NDNDND43-5《3256256NDNDND49-3《3128180NDNDNDp3D-NT56"c力o2-7《32318012.16±1.112.6±2.425.8±0.410'5-6《3111806.5±1.010.1±0.327.8±423-3《31118012肚0.89.5±0.232.9±5.21-1《32318011.9±0.521.2±3.829.5±27p3D-NT56/Xc/w1-3《3108》1283.出.O36.5±1.250.0±4310'。7-1《323》180&4±0.027.9±0.233.6±3.23-4《3108》1807.4±0.739.1±1.8必.5±0.21-34《364》180NDNDND6_4《336236212.9±2.942.9±1.155.9±1.11094-6《318031513.6±1.9545±1.963.2±0.7ND:未檢測(cè)到注測(cè)定非結(jié)構(gòu)蛋白抗體使用北京世紀(jì)元亨公司的口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白抗體單抗阻斷ELISA試劑盒。本試劑盒的非結(jié)構(gòu)蛋白抗體判定標(biāo)準(zhǔn)為，當(dāng)被檢血清的阻斷率>30%，判為抗體陽(yáng)性；20%《被檢血清阻斷率<30%，判為抗體可疑；被檢血清阻斷率<20%，判為抗體陰性。序列表〈210>1〈211>56〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>1gaggctatcctctcctttgcacgccgtgggaccatacaggagaagttgatctccgt〈210>2〈211>19〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>2gttcttggtcactccataa〈210>3〈211>65<212>DNA〈213〉人工序列〈400>3tcaggc朋cactgg朋gceitcatta已c朋ctecteceitgcagcagteccagaactccertg60gacac65〈210>4〈211>19<212>DNA〈213〉人工序列〈400>4ac朋ctectacatgcagca19<210>5〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>5ccagatgcaggaggacatgt2510權(quán)利要求一種口蹄疫病毒抑制劑，其特征在于，該抑制劑含有表達(dá)抗口蹄疫病毒的siRNA的質(zhì)粒和以減毒豬霍亂沙門(mén)氏菌為受體菌的活菌苗，表達(dá)抗口蹄疫病毒的siRNA的質(zhì)粒存在于以減毒豬霍亂沙門(mén)氏菌為受體菌的活菌苗中。2.如權(quán)利要求1所述的口蹄疫病毒抑制劑，其特征在于，所述的表達(dá)抗口蹄疫病毒的siRNA的質(zhì)粒是p3D-NT56、p3Dl、plA-NT65、plA-NT19、p2B中的一種或者幾種。3.如權(quán)利要求1所述的口蹄疫病毒抑制劑，其特征在于，所述的表達(dá)抗口蹄疫病毒的siRNA的質(zhì)粒含有SEQIDN01、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4或者SEQIDNO5中所示序列的任意一種或者幾種。4.如權(quán)利要求2所述的口蹄疫病毒抑制劑，其特征在于，所述的表達(dá)抗口蹄疫病毒的siRNA的質(zhì)粒是將p3Dl、plA-NT19和p2B按任意比例混合而得。5.如權(quán)利要求2所述的口蹄疫病毒抑制劑，其特征在于，所述的表達(dá)抗口蹄疫病毒的siRNA的質(zhì)粒p3D-NT56、p2B和plA-NT65按任意比例混合而得。6.如權(quán)利要求l所述的口蹄疫病毒抑制劑，其特征在于，所述的活菌苗是p3D-NT56/S.cho、p3Dl/S.cho、plA-NT65/S.cho、plA-NT19/S.cho、p2B/S.cho中的一種或者幾種。7.如權(quán)利要求1所述口蹄疫病毒抑制劑的制備方法，其特征在于，該制備方法包括如下步驟(1)將表達(dá)抗口蹄疫病毒的siRNA的模板序列及其相應(yīng)的啟動(dòng)子插入表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)抗口蹄疫病毒的siRNA的模板序列位于相應(yīng)啟動(dòng)子之后；(2)擴(kuò)增(1)所得的質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化減毒豬霍亂沙門(mén)氏菌。8.如權(quán)利要求7所述口蹄疫病毒抑制劑的制備方法，其特征在于，(2)中將(1)所得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌進(jìn)行擴(kuò)增。全文摘要本發(fā)明屬于遺傳工程領(lǐng)域，具體涉及一種應(yīng)用RNAi技術(shù)設(shè)計(jì)的口蹄疫病毒病抑制劑、其制備方法及應(yīng)用。該抑制劑是含有表達(dá)抗口蹄疫病毒的siRNA的質(zhì)粒、以減毒豬霍亂沙門(mén)氏菌為受體菌的重組活菌苗。本發(fā)明的重組活菌苗儲(chǔ)存、使用方便。既可以口服適用，又可以肌肉注射。減毒沙門(mén)氏菌作為載體傳遞siRNA表達(dá)質(zhì)粒，不僅可以使機(jī)體抵抗該siRNA靶向的病毒，同時(shí)也可以抗沙門(mén)氏菌感染。文檔編號(hào)A61P31/14GK101732710SQ20081020305公開(kāi)日2010年6月16日申請(qǐng)日期2008年11月20日優(yōu)先權(quán)日2008年11月20日發(fā)明者叢薇,嚴(yán)維耀,劉明秋,鄭兆鑫,金虹申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)