專利名稱：一種具有協(xié)同作用的治療t細胞淋巴瘤的組合藥物及其應用的制作方法
一種具有協(xié)同作用的治療T細胞淋巴瘤的組合藥物及其應
技術領域：
本發(fā)明涉及一種治療癌癥的藥物，尤其涉及一種具有協(xié)同作用的治療T細胞淋巴瘤的組合藥物及其應用。
背景技術：
淋巴瘤是原發(fā)于淋巴結或結外淋巴組織的惡性腫瘤，分為霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，其中非霍奇金淋巴瘤約占70-80 % 。全球每年約有35萬新發(fā)病例，死亡人數(shù)超過20萬。在我國，目前淋巴瘤發(fā)病率約為3-4/10萬，占惡性腫瘤的第9位，死亡率占惡性腫瘤的第11位，占所有癌癥死亡人數(shù)的4. 8%，在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中僅次于急性白血病。
非霍奇金淋巴瘤又可分為B-細胞性淋巴瘤和T-細胞性淋巴瘤，在我國，T-細胞性淋巴瘤的發(fā)病率遠高于歐美國家，約占非霍奇金淋巴瘤的34%，在年輕人中，比例更高，約占非霍奇金淋巴瘤65%，嚴重危害人民的身體健康。T細胞淋巴瘤的治療目前仍以聯(lián)合化療為主，患者易復發(fā)，5年總的生存率不足30% 。近年來，人們對T-細胞性淋巴瘤的發(fā)病機制有了更多的了解，細胞增殖及凋亡相關基因的改變以及信號傳導通路異常，諸如NF-KB通路、ERK通路、AKT通路、JNK通路及P38等通路異常都參與了淋巴瘤的發(fā)病。因此，我們應該探索新的治療方案，彌補傳統(tǒng)化療的不足，選擇針對淋巴瘤發(fā)病相關的調節(jié)腫瘤細胞生存通路的藥物，尤其是非化療性藥物，以提高T-細胞性淋巴瘤的治療效果。
組蛋白去乙?；敢种苿┛梢源龠M組蛋白乙?；?，使染色質解螺旋，從而影響包括細胞增殖、分化及凋亡等相關基因的轉錄。環(huán)庚基?；桨樊惲u肟酸(SAHA)是異羥肟酸類組蛋白去乙?；敢种苿?，研究表明，單獨使用就對皮膚T-細胞性淋巴瘤有很好的效果。26S蛋白酶體是一種蛋白質復合體，可以與泛素化的蛋白結合，參與這些蛋白的降解。蛋白酶體抑制劑可以與26S蛋白酶體結合，特異性抑制蛋白酶體的功能，對各種腫瘤細胞均具有明顯的抑制活性，可誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡。硼替佐米(又名萬珂，PS-341)是第一個被批準用于臨床治療多發(fā)性骨髓瘤的蛋白酶體抑制劑類藥物，有文獻報道也用于治療T-細胞性淋巴瘤。 以往研究表明，抑制組蛋白去乙酰化酶及蛋白酶體的功能可以治療B-細胞性血液系統(tǒng)惡性腫瘤，如多發(fā)性骨髓瘤、套細胞淋巴瘤和慢性淋巴細胞性白血病。然而，它們聯(lián)合使用對T-細胞性淋巴瘤的療效以及可能機制仍然不太清楚。因此，有必要研究它們聯(lián)合使用在體外及體內實驗中對T-細胞性淋巴瘤的作用。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是，提供一種具有協(xié)同作用的治療T細胞淋巴瘤的組合藥物。
本發(fā)明的再一的目的是，提供一種具有協(xié)同作用的治療T細胞淋巴瘤的組合藥物用途。 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術方案是一種具有協(xié)同作用的治療T細胞淋巴瘤的組合藥物，所述的組合藥物由硼替佐咪和SAHA組成。
所述的硼替佐咪和SAHA比例為5-10nM : 1-2. 0 ii M。
所述的硼替佐咪和SAHA比例為10nM : 2. 0 y M。 為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術方案是一種組合藥物在制備治療淋 巴瘤疾病藥中的應用，所述的組合藥物由硼替佐咪和SAHA組成，硼替佐咪和SAHA比例為 5-10nM : l-2.0iiM。
所述的淋巴瘤是T細胞淋巴瘤。 本發(fā)明優(yōu)點在于通過使用本發(fā)明的組合藥物，發(fā)揮兩種藥的協(xié)同作用，可以協(xié)同 抑制T淋巴瘤細胞生長增殖，協(xié)同誘導T淋巴瘤細胞凋亡，協(xié)同抑制NF- k B、Raf-l/MEK/ERK 和AKT信號通路活性以及激活JNK、P38MAPK信號傳導通路。兩藥組合在提高療效的同時下 可大幅降低費用。使用本發(fā)明的組合藥物可以克服現(xiàn)有技術中單獨使用一種藥物引起耐藥 的缺點。


圖1A:在Jurkat和HUT78細胞中，與單用硼替佐米或SAHA相比，硼替佐米聯(lián)合 SAHA產生明顯的生長抑制。 圖IB :協(xié)同曲線顯示，所有觀察值點落在曲線左下方，表明硼替佐米聯(lián)合SAHA具 有協(xié)同作用。 圖1C :10nM硼替佐米和2iiMSAHA聯(lián)合處理細胞，部分細胞失去正常細胞形態(tài)，出 現(xiàn)細胞固縮、核濃集、及凋亡體形成等典型凋亡特征。 圖2A :在Jurkat和HUT78細胞中，10nM硼替佐米和2 y MSAHA聯(lián)合處理后凋亡細 胞明顯增多，較單用一種藥物明顯。右上方及右下方分別顯示晚期凋亡細胞(A皿exin V+/ PI+)和早期凋亡細胞(Annexin V+/PI-)的百分率。 圖2B :在Jurkat和HUT78細胞中，10nM硼替佐米和2 y MSAHA分別處理后線粒體 膜電位僅輕微降低，兩藥聯(lián)合處理后60%以上細胞的線粒體膜電位降低。
圖2C :免疫印記結果顯示，在Jurkat和HUT78細胞中，10nM硼替佐米和2 y MSAHA 聯(lián)合應用導至文caspase-8， caspase-9禾口 caspase-3激活。 圖2D :在Jurkat和HUT78細胞中，10nM硼替佐米和2 y MSAHA聯(lián)合應用后G2M期 細胞比例明顯增多。 圖2E :免疫印記結果顯示，在Jurkat和HUT78細胞中，10nM硼替佐米和2 y MSAHA
聯(lián)合應用后細胞周期依賴性激酶抑制蛋白P21和P27表達水平明顯增高。 圖3A:核蛋白與漿蛋白分開抽提，用Lamin B做內參檢測核內NF-KB，漿蛋白檢
領UlKBa 、p-IKKa/p禾P IKK a ， lOnM硼替佐米和2 ii MSAHA聯(lián)合應用降低了胞漿內磷酸化
IKK a / |3水平，使胞槳內I k B a水平增加，從而抑制NF_ k B核轉位。 圖3B : Jurkat和HUT78細胞同時用10nM硼替佐米和2 y MSAHA處理后，ERK信號
通路分子Raf-l， MEKK-1， MEKK-2， p-MEK， p-ERK以及其下游靶分子c-Myc明顯下調。 圖3C :Jurkat和HUT78細胞同時用10nM硼替佐米和2 y M SAHA處理后磷酸化AKT
水平明顯下調，但磷酸化JNK和p38MAPK明顯升高。 圖3D :在Jurkat和HUT78細胞中，10nM硼替佐米和2 y MSAHA聯(lián)合處理后組蛋白
4H3和H4的乙?；捷^SAHA單獨處理沒有疊加效應。 圖4 :在Jurkat和HUT78細胞中，10nM硼替佐米和2 y MSAHA使聚集體結構破壞。 左側顯示10nM硼替佐咪可以誘導聚集體形成，右側顯示硼替佐咪聯(lián)合SAHA處理后，聚集體 消失。 圖5A :硼替佐咪聯(lián)合SAHA方案抑制移植瘤模型中小鼠腫瘤的生長。 圖5B :與對照組及單藥處理組相比，硼替佐咪和SAHA聯(lián)合處理組小鼠腫瘤體積明
顯縮小。 圖5C :TUNEL檢測結果顯示，與對照組及單藥處理組相比，硼替佐咪和SAHA聯(lián)合處 理組小鼠腫瘤組織中凋亡細胞數(shù)明顯增多。
具體實施方式( — )試劑 硼替佐米(Bortezomib，購自Millennium Pharmaceuticals),儲存液濃度為 2. 6mM，4t:保存；SAHA(默沙東公司惠贈)溶解于匿S0中，儲存液濃度為100mM， -2(TC保 存。MTT，碘化丙啶(PI)，羅丹明123(Rhol23)，二硫蘇糖醇(DTT)，蛋白酶抑制劑復合物， GAPDH單克隆抗體購自Sigma公司；Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒購自BD公司；P27， NF- k B (P65) ， Lamin B， I k B a ， Raf-l， MEKK-1， MEKK-2， C-myc抗體，辣根過氧化物酶偶聯(lián) 的羊抗鼠二抗，羊抗兔二抗，兔抗羊二抗購自Santa Cruz公司；TUNEL組織標本凋亡檢測試 劑盒購自Promega公司；Caspase-8， Caspase-9， Caspase-3， P21，磷酸化IKK a / p ， IKKa 抗體，磷酸化MEK， MEK，磷酸化ERK1/2， ERK1/2，磷酸化AKT， AKT，磷酸化JNK1/2， JNK1/2，磷 酸化P38MAPK， P38MAPK，化學發(fā)光檢測試劑盒購自Cell Signaling公司；抗-乙?；嚢?酸抗體購自upstate公司。
( 二 )細胞培養(yǎng) 本研究應用了人T-細胞性淋巴瘤細胞株JURKAT和HUT78，均購自美國ATCC庫，細 胞在5% 0)2-95%空氣，飽和濕度以及37。C的條件下，培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)液中(Gibco/ BRL)，并加入10%胎牛血清。在每次實驗中，細胞接種密度為3X107ml。細胞的存活率采 用臺盼蘭拒染實驗檢測。細胞形態(tài)學觀察采用瑞氏染色法。
(三)MTT實驗 在96孔板中，每孔接種180 ii L細胞懸液，細胞總數(shù)為2 X 104，每孔加入10 y L硼 替佐米和10 ii LSAHA，O劑量組用1640培養(yǎng)液代替。硼替佐米終濃度選用0、5、 10、25、50和 100nM， SAHA終濃度選用0、0. 5、 1. 0、2. 0、5. 0和7. 5線每一劑量組設3個平行孔。培養(yǎng)48 小時后，向每孔中加入20ii L MTT(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，離心后每孔吸去上清，再加入 200 ii L DMSO，輕輕震蕩20分鐘后，分光光度計測量492nm下每孔的吸光度值。
(四)流式細胞儀檢測annexin-V，細胞周期，線粒體跨膜電位
細胞凋亡用ApoAlert Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒進行分析。在分析細胞周 期過程中，細胞在-2(TC下用75%乙醇固定過夜，接著用含有1% RNA酶的Tris-HCl緩沖 液(pH7. 4)處理20分鐘，再用50 ii g/ml PI染色5分鐘。在檢測線粒體跨膜電位中，細胞 用PBS洗后，在37t:下與10ii g/ml羅丹明Rho123孵育30分鐘，然后再用50 y g/ml PI染 色5分鐘。[OO38](五)掃描電鏡 lXl(f個細胞用2X戊二醛在4。C固定過夜，3000rpm離心15分鐘，棄上清，用0. 1M 二甲砷酸鹽緩沖液洗后，再用1 %四氧化俄在4°C固定1小時，脫水后用環(huán)氧樹脂812包埋， 用超薄切片機制備樣品，染色后，在電鏡下進行觀察。 [O(HO](六)核、漿蛋白的抽提 每1X1()7個細胞加入400ii 1裂解緩沖液A(10mM HEPES， pH7. 9， 10mMKCl， 1. 5mM MgC12， 0. 5mM DTT)，其中含20%的NP-40及蛋白酶抑制劑復合物，混勻，冰上裂解10分鐘左 右，2500g離心1分鐘，吸取上清漿蛋白，沉淀為細胞核，再加入150 iU裂解緩沖液B(20mM HEPES，pH7. 9，420mM NaCl，O. 5mMDTT，0. 2mM EDTA，25X甘油)，冰上裂解30分鐘，每十分鐘 震蕩一次，12000g離心IO分鐘，取上清核蛋白。
(七)免疫印跡分析 每3X 106細胞加100 ii 1 RIPA裂解緩沖液(50mM Tris-HCl， pH8. 0， 150mM NaCL， 1. 0% NP-40，0. 5% DOC，O. 1% SDS)或Laemmli裂解液(0. 5M Tris-HCl，pH6. 8，2mM EDTA， 10%甘油，2% SDS and 5% P-巰基乙醇)進行裂解。蛋白裂解物(20 y g)用于10%聚丙烯 酰胺凝膠電泳，再轉印至硝酸纖維素膜上。硝酸纖維素膜用5%脫脂牛奶(TBS/0. 1% Tween 20溶解)封閉2小時，之后與一抗在室溫下孵育2小時或在4t:孵育過夜，用TBS/0. 1% Tween 20洗三遍，每次5min，再室溫孵育二抗2小時，再用TBS/O. 1 % Tween 20洗三遍，每 次5min，用辣根過氧化物酶化學發(fā)光檢測試劑盒檢測。
(八)動物實驗 JURKAT小鼠模型雌性裸鼠(5_6周)購自上海實驗動物中心，在無菌條件下飼 養(yǎng)。小鼠分成4組(對照組，硼替佐米治療組，SAHA治療組，硼替佐米+SAHA治療組)，每組 10只小鼠，每只小鼠在右耳翼皮下注射4X 107細胞。接種21天后開始治療，對照組只注射 相同量的匿SO，硼替佐米治療組腹腔注射60 ii g/kg，每日 一次；SAHA治療組腹腔注射50mg/ kg，每日 一次，硼替佐米+SAHA治療組同時腹腔注射硼替佐米和SAHA，連續(xù)治療14天。每只 小鼠治療每天測量腫瘤體積，腫瘤體積通過公式0. 5Xa(長)Xb(寬)2計算。組織標本用 10%甲醛固定，石蠟包埋。(九)末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記(TUNEL， Terminaldeoxy transferase-catalyzed DNA nick_end labeling)分析 裸鼠腫瘤組織中細胞凋亡采用TUNEL檢測試劑盒檢測，腫瘤組織切片厚度為 5 y m，脫蠟后按照試劑盒說明操作。
(十)等效線法分析 硼替佐米和SAHA兩藥聯(lián)合是否具有協(xié)同作用，相加作用或者拮抗作用通過Steel 和Peckham創(chuàng)立的等效線法進行分析
(十一 )統(tǒng)計分析 實驗結果用三次獨立實驗的平均值和標準差表示，用t檢驗來比較差異。P值小于 0. 05則認為具有統(tǒng)計學差異。所有的統(tǒng)計采用SAS8. 2軟件。
結果(— )蛋白酶體抑制劑硼替佐米與組蛋白去乙?；敢种苿㏒AHA聯(lián)合應用具有協(xié) 同作用，誘導T細胞性淋巴瘤細胞發(fā)生凋亡
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單用及聯(lián)合應用不同濃度梯度的硼替佐米和SAHA處理Jurkat和HUT78細胞48 小時后，藥物劑量效應曲線顯示(圖1A) ， 10nM的硼替佐米和2 ii M的SAHA單獨應用時分別 只有約40%和50%的細胞生長受抑，而當兩藥聯(lián)合應用時有80%以上的細胞生長受抑，說 明與單用 一種藥物相比，兩藥聯(lián)合應用后生存率明顯降低。 通過等效線法分析發(fā)現(xiàn)，大部分觀察值點都落在曲線的左下方，顯示在Jurkat和 HUT78細胞中，硼替佐米和SAHA聯(lián)合應用都具有明顯的協(xié)同作用(圖IB)。
通過形態(tài)學分析發(fā)現(xiàn)，當硼替佐米和SAHA聯(lián)合處理24小時就可見到凋亡細胞增 多，而當聯(lián)合處理48小時就可見到凋亡細胞明顯增多(圖1C)。 綜上結果顯示，無明顯毒副作用的小劑量硼替佐米和SAHA聯(lián)合應用就能夠有效 地誘導T細胞性淋巴瘤細胞發(fā)生凋亡。 ( 二 )硼替佐米和SAHA聯(lián)合應用通過使線粒體損傷及Caspase蛋白激活誘導細胞 發(fā)生凋亡 流式細胞計數(shù)凋亡檢測結果證實(圖2A)，硼替佐米和SAHA聯(lián)合處理后很快就可 以引起細胞發(fā)生凋亡。在Jurkat和HUT78細胞中，硼替佐米單獨處理48小時后，A皿exin V陽性細胞分別為3. 6%和10. 7% ;SAHA單獨處理48小時后，An證in V陽性細胞分別為 13. 7%和12. 2X，而兩藥聯(lián)合處理48小時后，A皿exin V陽性細胞分別為46. 4%和72. 7%， 顯著高于硼替佐米或SAHA單獨處理時。 線粒體膜電位的降低通過流式細胞計數(shù)檢測細胞內羅丹明123(Rho 123)熒光的 降低來反映。在Jurkat細胞和HUT78細胞中，硼替佐米單獨處理48小時只有11.0%和 18. 9%的細胞線粒體膜電位降低；SAHA單獨處理48小時也只有3. 7%和18. 0%的細胞線 粒體膜電位降低；而當硼替佐米和SAHA聯(lián)合處理48小時后，則高達78. 3%和93. 9% ，明顯 高于硼替佐米或SAHA單獨處理時(圖2B)。 我們通過免疫印跡檢測了 caspase蛋白裂解情況(圖2C)，結果顯示硼替佐米或 SAHA單獨處理后，只出現(xiàn)極少量caspases-8， caspases-9和caspases-3裂解片段，而當硼 替佐米和SAHA聯(lián)合處理后，caspases-8、 caspases-9和caspases-3裂解片段的量明顯增 多；并且隨著藥物處理時間的延長而進一步增多。 因此，在T細胞性淋巴瘤中，硼替佐米與SAHA聯(lián)合應用可以明顯促進線粒體膜電 位的降低及Caspase蛋白的激活。(三)硼替佐米和SAHA聯(lián)合應用誘導T細胞性淋巴瘤細胞發(fā)生G2M期周期阻滯
通過流式細胞計數(shù)周期檢測顯示(圖2D)，在Jurkat和HUT78細胞中，硼替佐米和 SAHA單獨應用時細胞周期無明顯變化，但當硼替佐米和SAHA聯(lián)合處理后G2/M期細胞的比 例明顯增高，分別達到49. 0%和57. 5X，而對照組G2/M期細胞的比例分別只有14. 1%和 22. 1X，表明硼替佐米和SAHA聯(lián)合應用能夠引起明顯的G2/M期周期阻滯。同時，免疫印跡 結果顯示，在Jurkat和HUT78細胞中，硼替佐米和SAHA單獨處理后，細胞周期依賴性激酶 (CDK)抑制蛋白P21和P27表達升高，而當硼替佐米和SAHA聯(lián)合處理后P21和P27蛋白升 高更明顯，并且聯(lián)合處理48小時后升高最明顯(圖2E)。(四)硼替佐米和SAHA聯(lián)合應用影響了多個信號傳導通路削弱了細胞保護性信 號傳導通路，促進了細胞應激相關性通路。 為了更深入地探討硼替佐米和SAHA誘導細胞凋亡的分子機制，我們對一些與凋亡和周期進展相關的信號傳導通路進行了研究。 NF-KB通路是促進細胞增殖和抗凋亡基因表達的一條重要的信號傳導通路。 NF-KB—般在細胞胞漿內與其抑制齊IJ，主要是lKBa結合，呈現(xiàn)非活性狀態(tài)。而IkBci又 通過包含水解IKK a / |3亞基的激酶的IKKa復合體調節(jié)。如圖3A所示，硼替佐米和SAHA 聯(lián)合處理后核內NF-KB水平明顯降低。同時胞漿內磷酸化IKKa水平也降低，但胞漿內基 礎IKKa水平沒有明顯變化。另外，硼替佐米單獨應用或與SAHA聯(lián)合應用都能夠增加胞漿 內lKBa水平。這些結果表明兩藥具有互補作用，通過使lKBa去憐酸化并與NF-kB結 合，抑制NF-KB的核轉位。 Raf-l/MEK/ERK信號傳導通路是調控造血干細胞增殖的重要途徑，其阻斷可以引 起凋亡信號的產生。免疫印跡結果表明(圖3B)，不論在Jurkat細胞或HUT78細胞，單獨 應用硼替佐米或SAHA可引起Raf-l， MEKK-1及MEKK2蛋白的輕微減少，兩藥聯(lián)合應用可明 顯降低Raf-l，MEKK-1及MEKK2的蛋白水平，結果導致磷酸化MEK和磷酸化ERK蛋白水平降 低，而不影響總的MEK和ERK蛋白水平。 硼替佐米和SAHA單獨應用時可以引起磷酸化AKT蛋白輕微降低，當兩藥聯(lián)合應用 時可以引起磷酸化AKT蛋白明顯降低。 JNK屬于應激激活的蛋白激酶，它是細胞發(fā)生應激反應的標志，我們的研究發(fā)現(xiàn)， 兩種藥物單獨使用時對JNK的磷酸化水平影響很小，當兩種藥物聯(lián)合使用時，總的JNK水平 以及磷酸化JNK水平都明顯增高。此外，單獨應用硼替佐米可以使磷酸化P38MAPK水平輕 微升高，單獨應用SAHA對磷酸化P38MAPK水平無明顯升高，但當兩藥合用后磷酸化P38MAPK 水平明顯增高(圖3D)。 最后我們也研究了硼替佐米和SAHA兩藥協(xié)同作用是否與組蛋白乙?；嘘P，結 果表明硼替佐米與SAHA協(xié)同誘導的細胞凋亡可能與組蛋白H3/H4的乙?；療o關。
(五)聚集體的形成以及破壞 就蛋白酶體抑制劑和組蛋白去乙?；敢种苿┰阱e誤折疊蛋白應激反應中的作 用而言，我們研究了硼替佐米和SAHA對聚集體形成的影響。透射電鏡下聚集體是位于核周 的電子致密顆粒，我們的研究揭示硼替佐米作用12小時就可以看到聚集體的出現(xiàn)，而SAHA 處理后細胞不出現(xiàn)聚集體，當硼替佐米和SAHA同時處理細胞時，聚集體體積變小，變分散， 電子密度降低(圖4)。(六)硼替佐米和SAHA聯(lián)合使用可抑制移植小鼠模型中腫瘤生長
我們通過小鼠移植腫瘤模型研究了硼替佐米和SAHA在體內的抗淋巴瘤活性。所 有裸鼠在皮下接種Jurkat細胞28天后，接種部位都出現(xiàn)了瘤塊(圖5A)。硼替佐米和SAHA 聯(lián)合治療組裸鼠的瘤體積明顯小于對照組裸鼠以及單一藥物治療組裸鼠的瘤體積(圖 5B)。為了證實這種瘤體積縮小是由于腫瘤細胞凋亡引起，我們通過TUNEL方法檢測了瘤組 織切片中凋亡情況，結果顯示淋巴瘤細胞凋亡細胞數(shù)在硼替佐米和SAHA聯(lián)合治療組最高， 明顯高于對照組及單藥治療組(圖5C)。
討論 本研究顯示蛋白酶體抑制劑硼替佐米與臨床可接受劑量的組蛋白去乙?；敢?制劑SAHA聯(lián)合應用在體外實驗中對T-細胞性淋巴瘤細胞株具有協(xié)同抑制作用，在體內裸 鼠T-細胞性淋巴瘤移植模型中也具有很好的療效。進一步研究發(fā)現(xiàn)，這種協(xié)同作用是諸如線粒體膜電位異常、Caspase激活以及P21、P27蛋白上調等多因素導致凋亡發(fā)生。
多種分子機制也參與了硼替佐米和SAHA聯(lián)合應用對T-細胞性淋巴瘤的協(xié)同作 用機制。細胞保護性通路，諸如NF- k B通路、ERK通路和AKT通路都有利于淋巴瘤細胞生 存，它們不僅可以保護腫瘤細胞不發(fā)生凋亡，也可以使瘤細胞對傳統(tǒng)的細胞毒性藥物表現(xiàn) 耐藥。蛋白酶體抑制劑可以通過引起胞漿內I k Ba蛋白水平增高，阻止與其結合的NF-k B 進入胞核發(fā)揮轉錄活性。硼替佐米通過抑制NF- k B通路，降低了組蛋白去乙?；敢种苿?毒性的域值。近來研究發(fā)現(xiàn)硼替佐米通過抑制NF- k B通路增加B-細胞性淋巴瘤對組蛋白 去乙酰化酶抑制劑的敏感性。 Raf-l/MEK/ERK信號傳導通路參與了細胞增殖、分化和生存過程，特異性阻斷該通 路可以與組蛋白去乙酰化酶抑制劑發(fā)生協(xié)同作用，誘導白血病細胞發(fā)生凋亡。硼替佐米不 僅可以抑制NF-k B通路，也可以抑制MEK、 ERK以及它們的上游調節(jié)蛋白Raf-l， MEKK1和 MEKK2蛋白，因此，硼替佐米與組蛋白去乙?；敢种苿┞?lián)合使用可以抑制Raf-l/MEK/ERK 信號傳導通路并提高抗淋巴瘤作用。硼替佐米和SAHA單獨使用就可以引起AKT通路阻斷， 我們的研究發(fā)現(xiàn)，它們都能夠引起AKT水平及磷酸化AKT水平下調，從而使細胞更利于凋 亡。另外，文獻報道AKT和ERK通路之間本身有交叉，因此，AKT和ERK兩個通路同時被抑 制對腫瘤細胞的殺傷作用比一個通路受到抑制更明顯。 與ERK—樣，JNK、P38MAPK同屬于絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)家族成員，這一家 組蛋白參與了細胞生存的調控以及應激反應。ERK通路的激活一般會促進細胞生存，而JNK 和P38MAPK蛋白相反的可以引起細胞死亡。我們的研究中，SAHA處理后的Jurkat和HUT78 細胞中JNK和P38MAPK通路蛋白水平上調，與文獻報道一致，SAHA處理后的Bcr/abl+白血 病細胞JNK和P38MAPK通路蛋白水平上調。應激相關通路的激活也被認為是參與蛋白酶體 抑制劑介導的細胞殺傷作用的重要因素，硼替佐米引起的細胞凋亡與JNK和P38MAPK激活 有關。在我們的研究中，硼替佐米和SAHA聯(lián)合處理后JNK和P38MAPK蛋白表達明顯增高， 顯示在T-細胞性淋巴瘤中兩藥的協(xié)同機制亦與應激相關通路蛋白的激活相關。
細胞保護通路與細胞應激通路之間的平衡對細胞存亡起著決定性作用。硼替佐米 可能與SAHA —起共同作用，通過破壞多條細胞保護性信號傳導通路以及促進細胞應激性 信號傳導通路打破這種平衡，使淋巴瘤細胞線粒體膜電位異常以及caspase激活，最終導 致凋亡信號通路激活，細胞發(fā)生凋亡。文獻也有類似報道，硼替佐米與SAHA具有協(xié)同作用， 可以引起8(^/￡^1+白血病細胞發(fā)生凋亡。 聚集體是蛋白質聚集物沿微管系統(tǒng)逆向轉運形成的位于核周的微管包涵體，是細 胞對胞漿內錯誤折疊蛋白的一種反應。錯誤折疊蛋白不僅缺乏功能，而且易于形成聚集物， 影響細胞的正常功能。正常情況下這種蛋白質聚集物最終會被蛋白酶體途徑降解，不會形 成聚集體，只有當細胞內錯誤折疊蛋白的產生超出了蛋白酶體的降解能力或者蛋白酶體功 能受到抑制時，細胞內才會形成聚集體。聚集體最初由分散于胞漿外周的蛋白質聚集物沿 著微管系統(tǒng)轉運至微管組織中心區(qū)，再與崩解的中間絲形成穩(wěn)定的顆粒狀結構。在聚集體 的形成中，組蛋白去乙酰化酶6(HDAC6)也起到了重要作用，它不僅具有使組蛋白乙?；?作用，還具有泛素結合活性，它既可以和泛素化的錯誤折疊蛋白結合，也可以與肌動蛋白結 合，并募集錯誤折疊蛋白沿著微管系統(tǒng)轉運到聚集體。組蛋白去乙化酶抑制劑SAHA可以通 過抑制組蛋白去乙?；?的功能，阻止錯誤折疊蛋白在細胞內積聚，硼替佐米處理的細胞可以看到特征性的聚集體，當硼替佐米與SAHA同時處理時，聚集體消失。文獻也報道在 骨髓瘤中，硼替佐米與組蛋白去乙?；敢种苿┞?lián)合應用可以抑制聚集體的形成。因此，通 過硼替佐米和組蛋白去乙酰化酶抑制劑分別抑制蛋白酶體和聚集體，可以明顯增加兩藥對 T-細胞性淋巴瘤細胞的細胞毒性。 總之，靶向作用于組蛋白去乙?；负偷鞍酌阁w的藥物可以產生協(xié)同作用，誘導 T-細胞性淋巴瘤細胞發(fā)生凋亡。硼替佐米與SAHA聯(lián)合應用可以作為T-細胞性淋巴瘤患者 治療的一種很有效的新方案。 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人 員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為 本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
一種具有協(xié)同作用的治療T細胞淋巴瘤的組合藥物，其特征在于，所述的組合藥物由硼替佐咪和SAHA組成。
2. 根據(jù)權利要求1所述的組合藥物，其特征在于，所述的硼替佐咪和SAHA比例為5-10nM : l-2.0iiM。
3. 根據(jù)權利要求1所述的組合藥物，其特征在于，所述的硼替佐咪和SAHA比例為10nM : 2.0iiM。
4. 一種組合藥物在制備治療淋巴瘤疾病藥中的應用，所述的組合藥物由硼替佐咪和SAHA組成，硼替佐咪和SAHA比例為5_10nM : 1_2. 0 ii M。
5. 根據(jù)權利要求4所述的應用，其特征在于，所述的淋巴瘤是T細胞淋巴瘤。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有協(xié)同作用的治療T細胞淋巴瘤的組合藥物。所述的組合藥物由硼替佐咪和SAHA組成，硼替佐咪和SAHA比例為5-10nM∶1-2.0μM。本發(fā)明還提供了組合藥物在制備治療淋巴瘤疾病藥中的應用，所述的淋巴瘤是T細胞淋巴瘤。通過使用本發(fā)明的組合藥物，發(fā)揮兩種藥的協(xié)同作用，可以協(xié)同抑制T淋巴瘤細胞生長增殖。兩藥組合在提高療效的同時下可大幅降低費用。
文檔編號A61K31/16GK101732329SQ20081020315
公開日2010年6月16日 申請日期2008年11月21日 優(yōu)先權日2008年11月21日
發(fā)明者姜曉星, 張群嶺, 張軼文, 王黎, 趙維蒞, 陳賽娟 申請人:上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院