專利名稱：：無汞乙腦滅活疫苗組合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及疫苗組合物，尤其涉及乙腦疫苗組合物，更具體的是涉及一種無汞乙腦滅活疫苗組合物。
背景技術(shù)：
：自法國人巴斯德發(fā)明疫苗以來，人類在與傳染病的較量中，疫苗起到了舉足輕重的作用，為提高人類的健康和社會的安定作出了重要的貢獻。現(xiàn)行的疫苗主要分成減毒活疫苗和滅活疫苗兩大類。減毒活疫苗主要包括水痘疫苗、麻風(fēng)腮疫苗、甲肝疫苗和卡介苗等，滅活疫苗主要包括流感疫苗、乙腦疫苗、狂犬疫苗、百白破疫苗、Hib疫苗和流腦疫苗等。滅活疫苗在制劑時，傳統(tǒng)的方法是在疫苗的主要成分(如病毒和細菌的重要抗原成分)中加入緩沖液或賦形劑。塞諾菲巴斯德生物制品有限公司生產(chǎn)的巴斯德流感裂解疫苗使用磷酸緩沖鹽溶液為緩沖液(凡爾靈VAXIGRH^，國藥準(zhǔn)字J20030029)，中國藥典三部記載的乙腦滅活疫苗使用用Earle's液為緩沖液(北京化學(xué)工業(yè)出版社，2005年版，74-76)。中國藥典三部記載了I型腎綜合征出血熱滅活疫苗(北京化學(xué)工業(yè)出版社，2005年版，80-82)和人用狂犬疫苗(北京化學(xué)工業(yè)出版社，2005年版，89-91)使用人血白蛋白為抗原保護劑，A型腦膜炎球菌多糖疫苗中所使用的保護劑則為乳糖(中國藥典三部，北京化學(xué)工業(yè)出版社，2005年版，34-36)。這些現(xiàn)有疫苗大多以硫柳汞為防腐劑，如I型腎綜合征出血熱滅活疫苗、人用狂犬疫苗和吸附百日咳白喉聯(lián)合疫苗(中國藥典三部，北京化學(xué)工業(yè)出版社，2005年版，80-82;89-91;54-57)。先前的滅活疫苗在制劑和分裝時每瓶為多劑量，使用時需從一瓶中多次吸取疫苗進行接種。為了防止因接種操作引起的污染，在滅活疫苗中加入防腐劑(如硫柳汞)以降低疫苗受污染的幾率。硫柳汞(thimerosal)可以有效地降低疫苗接種操作中引起的污染，但由于其中含有汞(Hg)的成分，可能會造成使用者(特別是兒童)被汞污染，引起不良反應(yīng)。美國FDA在1999年的回顧中發(fā)現(xiàn)某些嬰兒疫苗中的汞含量超過了聯(lián)邦標(biāo)準(zhǔn)。因此，1999年7月FDA給疫苗生產(chǎn)商發(fā)了一封信，要求他們在疫苗中去除硫柳汞或說明繼續(xù)使用該防腐劑的原因。這一行動取得了效果，在嬰兒疫苗中汞的含量下降了60%。目前，部分單劑量的滅活疫苗已不含或含低硫柳汞(應(yīng)不高于50iig/劑)，如流感疫苗(凡爾靈VAXIGRH^，塞諾菲巴斯德生物制品有限公司，國藥準(zhǔn)字J20030029)等。但目前國內(nèi)外的乙腦滅活疫苗如國產(chǎn)乙型腦炎滅活疫苗(中國藥典三部，北京化學(xué)工業(yè)出版社，2005年版74-76)、日本產(chǎn)日本腦炎滅活疫苗JE-VAX(BIKEN日本大阪大學(xué)觀音寺研究所生產(chǎn)的乙腦滅活疫苗說明書)、及臺灣國光日本腦炎疫苗(http:〃www.adimmune.com.tw/product.aspp_id=20051028929351YQ4XR)均含有硫柳滎，至今尚未有關(guān)乙腦滅活疫苗不含硫柳汞的報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的在于提供一種無汞乙腦滅活疫苗組合物。在疫苗原液中添加無酚紅199培養(yǎng)液和病毒保護劑制備該組合物。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種無汞乙腦滅活疫苗組合物的用途，該組合物用于無汞乙腦滅活疫苗的制備。病毒保護劑具體為人血白蛋白或重組人血白蛋白。本發(fā)明所述的無汞乙腦滅活疫苗組合物的制備步驟如下1、Vero細胞培育從工作細胞庫中取出細胞接種于細胞培養(yǎng)液中進行復(fù)蘇，具體為含2.5_20%(v/v)小牛血清的199培養(yǎng)液。復(fù)蘇的細胞長成單細胞層后，采用0.1-0.8%(w/v)胰蛋白酶消化傳代，細胞以i:2-i:8比例傳代，培養(yǎng)時間為2-7天，培養(yǎng)溫度37士rc;2、接種乙腦病毒挑選細胞生長良好的培養(yǎng)瓶，用PBSpH7.2緩沖液充分淋洗細胞后加病毒維持液，具體為含1-10%(v/v)20X人血白蛋白的199培養(yǎng)液，接種乙腦病毒，MOI為0.01-0.001;3、乙腦病毒培養(yǎng)將接種病毒的細胞置34士rC培養(yǎng)2-7天。4、收獲乙腦病毒選擇有典型細胞病變和肉眼檢查無污染的培養(yǎng)瓶，收獲病毒液。收獲的病毒液經(jīng)澄清合并，制成病毒收獲液。5、乙腦病毒滅活按1:4000的比例加入5-20%(v/v)P-丙內(nèi)酯，先置4°C24-72小時滅活病毒，再置37t:l-i2小時水解殘余的e-丙內(nèi)酯。病毒收獲液滅活后即為病毒滅活液。6、乙腦病毒純化病毒滅活液經(jīng)300KD膜超濾濃縮10-100倍后即為病毒濃縮液。按病毒濃縮液體積的1_10%(v/v)加入20mg/ml硫酸魚精蛋白進行沉淀，離心后收集上清液。上清液用蔗糖密度梯度超速離心法進一步純化后制成病毒純化液。病毒純化液用300KD膜超濾透析脫糖，再經(jīng)0.22iim除菌過濾后即為疫苗原液。7、乙腦疫苗配制原液檢定合格后，根據(jù)效價測定結(jié)果配制，在疫苗原液中加入無酚紅199培養(yǎng)液和病毒保護劑稀釋合并制得無汞乙腦疫苗。病毒保護劑為5_30%(w/v)人血白蛋白或重組人血白蛋白溶液。病毒保護劑在無酚紅199培養(yǎng)液中的濃度為0.5-10%(v/v)。病毒保護劑可以選擇5-20%(w/v)、5-10%(w/v)、10-20%(w/v)或20-30%(w/v)人血白蛋白或重組人血白蛋白溶液。具體選擇濃度為5%(w/v)、7%(w/v)、10%(w/v)、12%(w/v)、15%(w/v)、17%(w/v)、18%(w/v)、19%(w/v)、20%(w/v)、21%(w/v)、22%(w/v)、25%(w/v)、27%(w/v)或30%(w/v)的人血白蛋白或重組人血白蛋白溶液。病毒保護劑在無酚紅199培養(yǎng)液中的濃度可以選擇0.5-1%(v/v)、1-5%(v/v)或5-10%(v/v)。具體選擇濃度為O.5%(v/v)、0.7%(v/v)、l%(v/v)、1.5%(v/v)、2%(v/v)、2.5%(v/v)、3%(v/v)、3.5%(v/v)、4.5%(v/v)、5%(v/v)、6%(v/v)、7%(v/v)、9%(v/v)或10%(v/v)。4價方法具體為免疫小鼠中和抗體測定法(中國藥典三部，北京化學(xué)工業(yè)出版社，2005，74-76)，計算被檢疫苗和參考疫苗組對病毒對照組的蝕斑減少率，其合格評定標(biāo)準(zhǔn)為T>(RA+RB)/2-0.33，其中，T=被檢疫苗，RA/RB=參考疫苗。疫苗原液按若干稀釋倍數(shù)進行配置，然后根據(jù)測定疫苗效價的結(jié)果確定疫苗原液中加入無酚紅199培養(yǎng)液和病毒保護劑使用量。本發(fā)明實現(xiàn)的有益效果在乙腦疫苗制備中不使用硫柳汞避免了使用者(特別是兒童)所受到的汞污染而引起的不良反應(yīng)，確保了使用者的身體健康。具體實施例方式以下結(jié)合附圖詳細描述本發(fā)明的技術(shù)方案。應(yīng)當(dāng)說明的是，本發(fā)明所述的實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。本發(fā)明所用的試劑若未明確指明，則均購自西格瑪_奧德里奇(Sigma-Aldrich)。實施例1無汞疫苗的配制取一定體積的疫苗原液樣品，使用稀釋液為2.5%(v/v)20X人血白蛋白的無酚紅199培養(yǎng)液進行稀釋5、10、15、20倍后，使用免疫小鼠中和抗體測定法測定效價(其合格評定標(biāo)準(zhǔn)為T>(RA+RB)/2-0.33，其中T=被檢疫苗，RA/RB=參考疫苗)。確定某一個稀釋倍數(shù)落入目標(biāo)效價測定的范圍(在所有合格數(shù)據(jù)中取稀釋倍數(shù)最高者)。按稀釋倍數(shù)將無酚紅199培養(yǎng)液和病毒保護劑(人血白蛋白)加入疫苗原液得到無汞乙腦滅活疫苗。以配制10升疫苗液為例，如果合格實驗測得的稀釋倍數(shù)為10倍，在1升疫苗原液中，加入8.975升無酚紅199培養(yǎng)液和0.25升20%人血白蛋白(購自國家藥監(jiān)局批準(zhǔn)的生產(chǎn)企業(yè)，如上海生物制品研究所)。同樣地，根據(jù)乙腦病毒原液效價測定結(jié)果配制，在疫苗原液中加入無酚紅199培養(yǎng)液和病毒保護劑稀釋合并制得無汞乙腦疫苗。病毒保護劑為5%(w/v)人血白蛋白溶液。病毒保護劑在無酚紅199培養(yǎng)液中的濃度為0.5%(v/v)。同樣地，根據(jù)乙腦病毒原液效價測定結(jié)果配制，在疫苗原液中加入無酚紅199培養(yǎng)液和病毒保護劑稀釋合并制得無汞乙腦疫苗。病毒保護劑為10%(w/v)人血白蛋白溶液。病毒保護劑在無酚紅199培養(yǎng)液中的濃度為1.0%(v/v)。同樣地，根據(jù)乙腦病毒原液效價測定結(jié)果配制，在疫苗原液中加入無酚紅199培養(yǎng)液和病毒保護劑稀釋合并制得無汞乙腦疫苗。病毒保護劑為20%(w/v)人血白蛋白溶液。病毒保護劑在無酚紅199培養(yǎng)液中的濃度為2.0%(v/v)。同樣地，根據(jù)乙腦病毒原液效價測定結(jié)果配制，在疫苗原液中加入無酚紅199培養(yǎng)液和病毒保護劑稀釋合并制得無汞乙腦疫苗。病毒保護劑為30%(w/v)人血白蛋白溶液。病毒保護劑在無酚紅199培養(yǎng)液中的濃度為10.0%(v/v)。同樣地，根據(jù)乙腦病毒原液效價測定結(jié)果配制，在疫苗原液中加入無酚紅199培養(yǎng)液和病毒保護劑稀釋合并制得無汞乙腦疫苗。病毒保護劑為25%(w/v)重組人血白蛋白溶液。病毒保護劑在無酚紅199培養(yǎng)液中的濃度為5%(v/v)。5實施例2無汞疫苗與含汞疫苗菌檢按照本制劑處方配制疫苗液，分別與補加0.01%(v/v)柳硫汞的疫苗液和現(xiàn)有市場銷售的乙腦滅活疫苗(北京天壇生物公司生產(chǎn)，含0.01%硫柳汞)進行了平行無菌檢查驗證。試驗按照中國藥典規(guī)定的無菌檢查法中的直接接種法和薄膜過濾法(中國藥典三部，北京化學(xué)工業(yè)出版社，2005，附錄XII，73-75)進行。將以上三種制劑配方的疫苗液分別接種硫乙醇酸鹽、改良馬丁和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，放置2025t:和3035t:培養(yǎng)14天后評定結(jié)果，試驗同時設(shè)置陰性和陽性對照組。實驗結(jié)果見下表，試驗樣品1為本制劑配方，試驗樣品2為本制劑配方+0.01%(v/V)柳硫汞，試驗樣品3為北京天壇生物生產(chǎn)的乙型腦炎滅活疫苗(含0.01%(v/v)柳硫汞)。"-"表示無細菌生長，"+"表示有細菌生長<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>試驗結(jié)果表明，以上三種制劑配方的疫苗液無菌檢查均為陰性。證明按照本制劑處方配制的疫苗液(不含柳硫汞防腐劑)能達到中國藥典對無菌制品要求的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。權(quán)利要求一種無汞乙腦滅活疫苗組合物，由滅活乙腦病毒、無酚紅199培養(yǎng)液和病毒保護劑組成。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無汞乙腦滅活疫苗組合物，其特征在于所述的病毒保護劑為人血白蛋白或重組人血白蛋白。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的無汞乙腦滅活疫苗組合物，其特征在于所述的病毒保護劑為人血白蛋白或重組人血白蛋白溶液，濃度為5-30%。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的無汞乙腦滅活疫苗組合物，其特征在于所述的病毒保護劑為人血白蛋白或重組人血白蛋白溶液，濃度為5%、7%、10%、12%、15%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、25%、27%或30%。5.根據(jù)權(quán)利要求l-4之一所述的無汞乙腦滅活疫苗組合物，其特征在于所述的病毒保護劑在無酚紅199培養(yǎng)液中的濃度為0.5-10%，體積比。6.根據(jù)權(quán)利要求l-4之一所述的無汞乙腦滅活疫苗組合物，其特征在于所述的病毒保護劑在無酚紅199培養(yǎng)液中的濃度為0.5%、0.7%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4.5%、5%、6%、7%、9%或10%，體積比。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無汞乙腦滅活疫苗組合物，在無汞乙腦滅活疫苗的制備中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種無汞乙腦滅活疫苗組合物，由滅活乙腦病毒、無酚紅199培養(yǎng)液和病毒保護劑組成。經(jīng)過與含汞制劑的菌檢比較，本發(fā)明組合物能達到中國藥典對無菌制品要求的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。在乙腦疫苗制備中不使用硫柳汞避免了使用者所受到的汞污染而引起的不良反應(yīng)，確保了使用者的身體健康。文檔編號A61P31/00GK101732707SQ20081020317公開日2010年6月16日申請日期2008年11月21日優(yōu)先權(quán)日2008年11月21日發(fā)明者朱紹榮申請人:上海榮盛生物藥業(yè)有限公司