專利名稱：一種神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及促進(jìn)胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)劑；該誘導(dǎo) 劑的分子結(jié)構(gòu)；該類誘導(dǎo)劑作為藥物化合物誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞成為神經(jīng)細(xì)胞的方法；應(yīng)用該 誘導(dǎo)劑分化得到的神經(jīng)干細(xì)胞植入模型動物腦內(nèi)治療阿爾茨海默病的用途。
背景技術(shù)：
胚胎干細(xì)胞是一種具有自我更新能力和多種分化潛能的細(xì)胞，是一種獨(dú)特的生物 資源。應(yīng)用明確的定向誘導(dǎo)劑可以誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化成為多種類型的功能細(xì)胞，進(jìn)而進(jìn) 行細(xì)胞移植治療或者相關(guān)藥物的篩選。胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞可用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的 機(jī)制研究、細(xì)胞移植治療和神經(jīng)系統(tǒng)治療藥物的篩選，有潛在的社會和經(jīng)濟(jì)價值。但是，目 前還很缺乏高效的神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)劑。 全反式維脯酰胺(N-all-trans-retinoyl-L-proline， ATRP)是基于全反式維甲 酸和芬維A胺結(jié)構(gòu)設(shè)計的化合物。純化的ATRP具有抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用。神經(jīng)細(xì)胞 誘導(dǎo)分化方面的作用尚未有報道。 阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)，又名老年性癡呆(senile dementia), 是一種常見于老年人的以進(jìn)行性癡呆為特征的大腦退行性變性疾病，1907年由德國精神病 學(xué)、神經(jīng)解剖學(xué)專家Alois Alzheimer首次描述并命名。阿爾茨海默病的主要病理表現(xiàn)為 神經(jīng)元細(xì)胞外有大量老年斑、神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)有神經(jīng)纖維纏結(jié)，這些病改變主要由淀粉樣蛋 白沉積和tau蛋白異常磷酸化引起的，主要出現(xiàn)在Entorhinal皮質(zhì)和海馬回，同時病變部 位的神經(jīng)元軸突與樹突退化、神經(jīng)元凋亡。阿爾茨海默病在發(fā)達(dá)國家已經(jīng)成為僅次于心血 管病、腫瘤和卒中而位居第4位的致死原因。 研究顯示，神經(jīng)干細(xì)胞具有自我更新及產(chǎn)生多種類型神經(jīng)細(xì)胞的能力，為神經(jīng)系 統(tǒng)疾病的細(xì)胞移植治療提供了細(xì)胞來源。體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞具有以下優(yōu)點(diǎn)(l)在可 控制的培養(yǎng)條件下實(shí)現(xiàn)快速體外擴(kuò)增，滿足移植所需的細(xì)胞數(shù)量。(2)根據(jù)擬移植部位的細(xì) 胞類型及細(xì)胞結(jié)構(gòu)特異性，在體外使神經(jīng)干細(xì)胞分化成為受者部位細(xì)胞類型與構(gòu)成相似的 細(xì)胞群體后再進(jìn)行移植。也就是說為了滿足特殊部位移植的需要，可事先在體外對供者細(xì) 胞進(jìn)行"裁剪加工"，使之定向分化，能更容易整合入靶組織，提高移植物存活率。(3)利用 神經(jīng)干細(xì)胞可低溫凍存，而且復(fù)蘇后仍能維持原來的生物學(xué)性征這些特點(diǎn)，可構(gòu)建各種不 同類型的神經(jīng)干細(xì)胞庫。(4)神經(jīng)干細(xì)胞可作為"治療性基因"的載體，對損傷或病變部位 施行基因治療，以實(shí)現(xiàn)外源性治療基因的準(zhǔn)確定位，高效表達(dá)。(5)神經(jīng)干細(xì)胞是未分化的 原始細(xì)胞，移植后與宿主發(fā)生的排斥反應(yīng)較小，有利于移植神經(jīng)干細(xì)胞長期成活并與宿主 細(xì)胞更好的融合。移植外源性神經(jīng)干細(xì)胞，既可以直接進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞移植；也可以利用細(xì) 胞因子等進(jìn)行誘導(dǎo)之后再將其移植；還可以對神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行基因修飾后再進(jìn)行移植。
神經(jīng)干細(xì)胞用于神經(jīng)退變性疾病替代治療的設(shè)想始于病變較為局限的帕金森氏 病(Parkinson' s disease,PD)、亨庭頓氏病(Huntington' s disease,HD)等，并在實(shí)驗(yàn)中 取得了較為理想的效果。外源性多分化潛能的神經(jīng)干細(xì)胞(小鼠或大鼠)移植腦內(nèi)后，可以在神經(jīng)系統(tǒng)良好的存活、大量增殖并遷移到不同部位分化為相應(yīng)的神經(jīng)細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì) 胞具有的這種廣泛遷移的特性，使其移植替代治療病變較為廣泛的AD成為可能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)劑，具體涉及式I的化合物全反式維脯 酰胺(簡稱ATRP)在促進(jìn)胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞中的用途，及其誘導(dǎo)分化得到的 神經(jīng)干細(xì)胞在治療阿爾茨海默病模型小鼠中的應(yīng)用。 本發(fā)明所述的誘導(dǎo)劑通過促進(jìn)信號分子ERK的磷酸化而加速胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)
細(xì)胞分化；誘導(dǎo)分化得到的神經(jīng)干細(xì)胞通過立體定位植入阿爾茨海默病模型小鼠腦內(nèi)可以
明顯改善治療小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。
(I )本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn) 通過細(xì)胞學(xué)、組織化學(xué)、分子生物學(xué)和生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)對式I的化合物(ATRP)促進(jìn)
ERK磷酸化的作用及其促進(jìn)胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的作用進(jìn)行分析；通過細(xì)胞學(xué)、組織化學(xué)
和動物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)對神經(jīng)干細(xì)胞治療阿爾茨海默病模型小鼠進(jìn)行分析。 結(jié)果顯示，ATRP在胚胎干細(xì)胞分化早期可以顯著地促進(jìn)ERK的磷酸化，胚胎干細(xì)
胞的標(biāo)志性分子加速丟失，而神經(jīng)前體細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞及神經(jīng)元的標(biāo)志性分子均提前檢
出；應(yīng)用ERK信號通路的抑制劑可以阻斷ATRP的促進(jìn)胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的功能，
從正反兩方面證實(shí)了 ATRP通過促進(jìn)ERK的磷酸化發(fā)揮作用；誘導(dǎo)分化得到的神經(jīng)干細(xì)胞通
過立體定位植入阿爾茨海默病模型小鼠腦內(nèi)可以明顯改善模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。 進(jìn)一步，本發(fā)明所述的化合物可制備促進(jìn)胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的藥
物，其所誘導(dǎo)分化得到的神經(jīng)干細(xì)胞可制備治療阿爾茨海默病藥物。


圖1是RT-PCR結(jié)果顯示ATRP促進(jìn)0ct4mRNA表達(dá)加速下調(diào)。
圖2是Western blot結(jié)果顯示ATRP促進(jìn)0ct4蛋白質(zhì)表達(dá)加速下降。
圖3是細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示ATRP促進(jìn)0ct4陽性的胚胎干細(xì)胞加速減少。
圖4是FACs檢測結(jié)果顯示ATRP促進(jìn)Soxl^陽性的神經(jīng)前體細(xì)胞提前出現(xiàn)。
圖5是細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示ATRP促進(jìn)Sox嚴(yán)P陽性的神經(jīng)前體細(xì)胞提前出現(xiàn)。
圖6是RT-PCR結(jié)果顯示ATRP促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志(Pax6、 Nestin、BLBP、Prominin、01ig2、Musashi)、神經(jīng)元的標(biāo)志(Tujl、 M即2、 NCAM)提前出現(xiàn)。
圖7是細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示ATRP促進(jìn)Nestin陽性的神經(jīng)干細(xì)胞提前出現(xiàn)。
圖8是Western blot結(jié)果顯示ATRP促進(jìn)未成熟神經(jīng)元的標(biāo)志Tujl提前表達(dá)。
圖9是細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示ATRP促進(jìn)MAP2陽性的神經(jīng)元和GFAP陽性的膠質(zhì) 細(xì)胞提前出現(xiàn)。 圖10是Western blot結(jié)果顯示在胚胎干細(xì)胞分化早期，ATRP促進(jìn)ERK的磷酸化。 圖11是RT-PCR結(jié)果顯示ATRP促進(jìn)ERK的靶基因Elkl提前表達(dá)。 圖12是細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示使用ERK信號通路的抑制劑PD0325901和
PD184352可以顯著阻斷ATRP所誘導(dǎo)的Soxl^陽性的神經(jīng)前體細(xì)胞的出現(xiàn)。 圖13是FACs檢測結(jié)果顯示使用ERK信號通路的抑制劑PD0325901和PD184352
可以顯著阻斷ATRP所誘導(dǎo)的SoxlGFP陽性的神經(jīng)前體細(xì)胞的出現(xiàn)。 圖14是細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示獲得的神經(jīng)干細(xì)胞呈神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)志 Nestin陽性。 圖15是細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示神經(jīng)干細(xì)胞能夠分化為表達(dá)MAP2的神經(jīng)元和表達(dá) GFAP的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。 圖16是Morris水迷宮測試指標(biāo)-一 潛伏期治療后模型小鼠能夠更快地找到站 臺° 圖17是Morris水迷宮測試指標(biāo)-一III象限時間百分比治療后模型小鼠在站臺 所在象限游泳時間明顯長于未治療模型小鼠。 圖18是Morris水迷宮測試第15天去除站臺，治療后模型動物在中心區(qū)域的游泳 時間明顯長于未治療模型小鼠。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)例對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)描述但不限制本發(fā)明。
以下實(shí)驗(yàn)中，所需物品說明 (1)所用胚胎干細(xì)胞為46C胚胎干細(xì)胞(在分化為神經(jīng)前體細(xì)胞時表達(dá)Sox嚴(yán)P熒 光)，購于英國愛丁堡大學(xué)干細(xì)胞中心； (2) 46C胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)液成分為GMEM(Sigma公司)含2mM谷氨酰胺(Gibco 公司)、0.001% P-巰基乙醇(Gibco公司)、1X非必需氨基酸(Gibco公司)，10%胎牛血 清和2000單位/毫升重組人LIF(R&D公司)； (3)46C胚胎干細(xì)胞的分化培養(yǎng)液(N2B27)成分為含1 XN2 (Gibco公司)的DMEM/
F12 (Gibco公司)與含IX B27 (Gibco公司)的Neurobasal (Gibco公司)1 : 1混合； (4)細(xì)胞培養(yǎng)皿購于Nunc公司； (5)細(xì)胞培養(yǎng)皿包被用明膠購于Sigma公司； (6)細(xì)胞消化用胰酶購于Gibco公司； (7)無水乙醇購于國藥集團(tuán)； (8) ERK信號通路的抑制劑PD0325901和PD184352購于Calbiochem公司；
(9)胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)方法46C胚胎干細(xì)胞接種于0. 1 %明膠包被的細(xì)胞培養(yǎng)皿 上，隔天換液，生長至90%融合時傳代； (10)胚胎干細(xì)胞的分化培養(yǎng)的方法將46C細(xì)胞胚胎干細(xì)胞以lX10Vcm2 的密度接種于O. 1%明膠包被的細(xì)胞培養(yǎng)皿上黏附培養(yǎng)，以N2B27作為培養(yǎng)液，在無 ATRP[N2B27+0 (對照)或N2B27+0. 02 % ethanol (溶劑對照)]或有ATRP [N2B27+10—6M
5ATRP (實(shí)驗(yàn)組)]的條件下生長分化，隔天換液； (11)阿爾茨海默病模型小鼠(Mo/HuAPPswePSldE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠)購于Johns Hopkins大學(xué)； (12)立體定位注射儀購于Narishige公司，Morris迷宮購于上海吉量生物技術(shù)公 司。 實(shí)施例l ATRP對胚胎干細(xì)胞自我更新狀態(tài)的影響實(shí)驗(yàn)
采用下述三種方法進(jìn)行檢測 (1) RT-PCR檢測胚胎干細(xì)胞分子標(biāo)志0ct4的mRNA表達(dá)水平
收集46C胚胎干細(xì)胞樣品和第1、3、5天的分化細(xì)胞樣品；用TRIzol (Invitrogen 公司)、DNase I和吸附柱(RNeasy MinElute Cleanup, Qiagen公司)獲得無DNA污染的總 RNA ;用逆轉(zhuǎn)錄酶匪LV (Invitrogen公司)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA ;用PCR試劑盒(申能博彩 公司)以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)；在2%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行DNA電泳；用凝膠成像系 統(tǒng)(Bio-Rad公司)采集電泳圖像，結(jié)果見附圖1 ; (2) Western blot檢測胚胎干細(xì)胞分子標(biāo)志0ct4的蛋白質(zhì)表達(dá)水平 收集46C胚胎干細(xì)胞樣品和第5天的分化細(xì)胞樣品；用裂解液裂解(裂解液
成分20mM Tris-HCl， pH 7. 4，2% Triton X_100， 10mM EDTA，5mMNaF and lmM sodium
orthovanadate);加樣于5%聚丙烯酰胺凝膠(濃縮膠)和12%聚丙烯酰胺凝膠(分離膠)
上進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳；電泳后用硝酸纖維素膜(Pall公司)轉(zhuǎn)膜；5%脫脂奶粉室溫封閉1小
時；抗0ct4抗體(Santa Cruz公司)1 : 1000稀釋于5%脫脂奶粉，孵育硝酸纖維素膜4°C
過夜；二抗孵育后，ECL法發(fā)光；用凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)采集圖像，結(jié)果見附圖2; (3)細(xì)胞免疫熒光檢測胚胎干細(xì)胞分子標(biāo)志0ct4的蛋白質(zhì)表達(dá)情況 46C胚胎干細(xì)胞分化培養(yǎng)3天；用4%多聚甲醛固定；以1 : 500抗0ct4抗體稀釋
液4t:孵育過夜；二抗及Hoechst33342染核染料(Sigma公司)孵育后，在倒置熒光顯微鏡
下觀察，結(jié)果見附圖3。 以上結(jié)果顯示ATRP加速胚胎干細(xì)胞的標(biāo)志性分子0ct4的丟失，胚胎干細(xì)胞發(fā)生 分化。 實(shí)施例2 ATRP對胚胎干細(xì)胞神經(jīng)分化的影響實(shí)驗(yàn)
采用下述方法進(jìn)行檢測 (l)FACs檢測分化得到的Sox嚴(yán)P陽性的神經(jīng)前體細(xì)胞比例 將分化不同時間的細(xì)胞用0. 05%的胰酶消化制成單細(xì)胞懸液；在流式細(xì)胞儀上 進(jìn)行GFP熒光的檢測，結(jié)果見附圖4 ; (2)細(xì)胞免疫熒光檢測分化得到的Soxl^陽性的神經(jīng)前體細(xì)胞分布情況
46C胚胎干細(xì)胞分化培養(yǎng)3天；0. 01M PBS洗三次后，直接置于倒置熒光顯微鏡下 觀察，結(jié)果見附圖5; (3) RT-PCR檢測神經(jīng)前體細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志(Pax6、 Nestin、 BLBP、
Prominin、01ig2、Musashi)、神經(jīng)元的標(biāo)志(Tujl、 Map2、 NCAM)的mRNA表達(dá)水平 收集46C胚胎干細(xì)胞樣品、成年小鼠大腦組織和第1、3、5、10天的分化細(xì)胞樣品；
總RNA獲得方法、逆轉(zhuǎn)錄方法及PCR方法同前，結(jié)果見附圖6 ; (4)細(xì)胞免疫熒光檢測Nestin陽性的神經(jīng)干細(xì)胞分布情況
46C胚胎干細(xì)胞分化培養(yǎng)3天；用4%多聚甲醛固定；以1 : 200抗Nestin抗體 (Chemicon公司)稀釋液4t:孵育過夜；二抗及Hoechst33342孵育后，在倒置熒光顯微鏡下 觀察，結(jié)果見附圖7; (5) Western blot檢測未成熟神經(jīng)元的標(biāo)志Tujl的表達(dá)情況 收集46C胚胎干細(xì)胞樣品和第7、9、11天的分化細(xì)胞樣品；用裂解液裂解(裂解
液成分20mM Tris-HC1， pH 7.4，2% Triton X_100， 10mM EDTA，5mM NaF and lmM sodium
orthovanadate);加樣于5%聚丙烯酰胺凝膠(濃縮膠)和12%聚丙烯酰胺凝膠(分離膠)
上進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳；電泳后用硝酸纖維素膜(Pall公司)轉(zhuǎn)膜；5%脫脂奶粉室溫封閉1小
時；抗Tujl抗體(R&D公司)1 : 200稀釋于5%脫脂奶粉，孵育硝酸纖維素膜4。C過夜；二
抗孵育后，ECL法發(fā)光；用凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)采集圖像，結(jié)果見附圖8 ; (6)細(xì)胞免疫熒光檢測MAP2陽性的神經(jīng)元和GFAP陽性的膠質(zhì)細(xì)胞分布情況 46C胚胎干細(xì)胞分化培養(yǎng)9和11天；用4X多聚甲醛固定；以1 : 200抗MAP2抗
體(Sigma公司)稀釋液和1 : 400抗GFAP抗體(Chemicon公司)稀釋液4。C孵育過夜；
二抗及Hoechst33342孵育后，在倒置熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果見附圖9。 以上結(jié)果顯示ATRP促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志性
分子的提前出現(xiàn)，促進(jìn)了胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的分化。 實(shí)施例3胚胎干細(xì)胞分化早期ATRP對ERK磷酸化的影響實(shí)驗(yàn) 采用下述方法進(jìn)行檢測 (1) Western blot檢測在胚胎干細(xì)胞分化早期ERK的磷酸化水平
收集46C胚胎干細(xì)胞分化12小時的細(xì)胞樣品；用裂解液裂解(裂解液成 分20mM Tris-HCl， pH 7.4，2 % Triton X_100，10mM EDTA，5mM NaF andlmM sodium orthovanadate);加樣于5%聚丙烯酰胺凝膠(濃縮膠)和12%聚丙烯酰胺凝膠(分離 膠)上進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳；電泳后用硝酸纖維素膜(Pall公司)轉(zhuǎn)膜；5%脫脂奶粉室溫封 閉1小時；抗ERK抗體(Cell Signaling公司)或抗磷酸化ERK抗體(Cell Signaling公 司)l : 500稀釋于5X脫脂奶粉，孵育硝酸纖維素膜4t:過夜；二抗孵育后，ECL法發(fā)光；用 凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)采集圖像，結(jié)果見附圖10 ; [OO74] (2) RT-PCR檢測ERK的靶基因Elkl的表達(dá)情況 收集46C胚胎干細(xì)胞樣品、成年小鼠大腦組織和第1、3、5、10天的分化細(xì)胞樣品； 總RNA獲得方法、逆轉(zhuǎn)錄方法及PCR方法同前，結(jié)果見附圖11。 以上結(jié)果顯示胚胎干細(xì)胞分化早期，ATRP促進(jìn)ERK的磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)其耙基因 Elkl的表達(dá)。 實(shí)施例4 ERK信號通路的抑制劑對ATRP促神經(jīng)誘導(dǎo)功能的影響實(shí)驗(yàn)
采用下述方法進(jìn)行檢測 (1)細(xì)胞免疫熒光檢測使用ERK信號通路的抑制劑PD0325901和PD184352后 Sox嚴(yán)P陽性的神經(jīng)前體細(xì)胞的分布情況 46C胚胎干細(xì)胞在ATRP和ERK信號通路的抑制劑同時存在情況下分化培養(yǎng)116小 時；0.01M PBS洗三次后，直接置于倒置熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果見附圖12 ;
(2)FACs檢測使用ERK信號通路的抑制劑PD0325901和PD184352后SoxlGFP陽性 的神經(jīng)前體細(xì)胞比例
將在ATRP和ERK信號通路的抑制劑同時存在情況下分化92小時的細(xì)胞用0. 05% 的胰酶消化制成單細(xì)胞懸液；在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行GFP熒光的檢測，結(jié)果見附圖13。
以上結(jié)果顯示ERK信號通路的抑制劑可以阻斷ATRP的促神經(jīng)誘導(dǎo)功能。
實(shí)施例5神經(jīng)干細(xì)胞的獲得與鑒定
(1) 46C胚胎干細(xì)胞單層貼壁培養(yǎng) 將46C胚胎干細(xì)胞以lOVcm2度接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿上，用N2B27作為培養(yǎng)液；
(2)神經(jīng)干細(xì)胞的出現(xiàn)和篩選 培養(yǎng)6天后，以PBS消化細(xì)胞，克隆化密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿上，仍用N2B27作為 培養(yǎng)液；培養(yǎng)1天后，熒光顯微鏡下觀察出現(xiàn)大范圍Soxl^綠色熒光，表明有大量神經(jīng)前體 細(xì)胞存在，改用含有EGF和bFGF各lOng/ml的N2B27作為培養(yǎng)液，并用嘌呤霉素篩選神經(jīng) 干細(xì)胞； (3)神經(jīng)干細(xì)胞的克隆化培養(yǎng) 篩選2天后，用含有EGF和bFGF的N2/B27作為培養(yǎng)液培養(yǎng)2周，挑出克隆，用含 有EGF和bFGF的N2/B27作為培養(yǎng)液擴(kuò)增神經(jīng)干細(xì)胞克隆，獲取克隆化的神經(jīng)干細(xì)胞；
(4)神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定 1)細(xì)胞免疫熒光鑒定神經(jīng)干細(xì)胞呈特異性標(biāo)志Nestin陽性
用4%多聚甲醛固定神經(jīng)干細(xì)胞；以1 : 200抗Nestin抗體(Chemicon公司)稀 釋液4t:孵育過夜；二抗及Hoechst33342孵育后，在倒置熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果見附圖 14 ; 2)細(xì)胞免疫熒光鑒定神經(jīng)干細(xì)胞的分化潛能 在N2B27培養(yǎng)液中培養(yǎng)得到的神經(jīng)干細(xì)胞一周；用4 %多聚甲醛固定細(xì)胞；以 1 : 200抗MAP2抗體(Sigma公司)稀釋液和1 : 400抗GFAP抗體(Chemicon公司)稀釋 液4t:孵育過夜；二抗及Hoechst33342孵育后，在倒置熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果見附圖15。
以上結(jié)果顯示成功獲得神經(jīng)干細(xì)胞，并且該神經(jīng)干細(xì)胞能夠分化為表達(dá)MAP2的 神經(jīng)元和表達(dá)GFAP的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。 實(shí)施例6神經(jīng)干細(xì)胞植入阿爾茨海默病模型小鼠及其對動物認(rèn)知能力的影響實(shí) 驗(yàn) (1)神經(jīng)干細(xì)胞植入阿爾茨海默病模型小鼠 1)所選動物8月齡雄性小鼠，每只體重約30-35g 2)注射靶位右側(cè)腦室 3)注射細(xì)胞數(shù)2. OiU，" 105細(xì)胞 (2)Morris迷宮測試檢測動物的認(rèn)知能力 細(xì)胞植入6周后，用Morris迷宮對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行為期15天的行為學(xué)測試，檢測了 潛伏期、III象限時間百分比和第15天的中心區(qū)域時間百分比等指標(biāo)，結(jié)果見附圖16-18。 注III象限為站臺所在象限。 以上結(jié)果顯示神經(jīng)干細(xì)胞腦內(nèi)移植可以明顯改善阿爾茨海默病模型小鼠的學(xué)習(xí) 記憶能力。
權(quán)利要求
一種神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)劑，其特征在于含有式I的化合物，F(xiàn)2008102080861C0000011.tif
2. —種誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞成為神經(jīng)細(xì)胞的方法，其特征在于采用權(quán)利要求1所述的化合 物通過細(xì)胞學(xué)、組織化學(xué)、分子生物學(xué)和生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)，對所述的化合物促進(jìn)ERK磷酸化的 作用及其促進(jìn)胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的作用進(jìn)行分析；通過細(xì)胞學(xué)、組織化學(xué)和動物行為學(xué) 實(shí)驗(yàn)對神經(jīng)干細(xì)胞治療阿爾茨海默病模型小鼠進(jìn)行分析，從正反兩方面證實(shí)所誘導(dǎo)的胚胎 干細(xì)胞成為神經(jīng)細(xì)胞。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的化合物在制備促進(jìn)胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo) 分化為神經(jīng)細(xì)胞中的用途。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的誘導(dǎo)分化得到的神經(jīng)干細(xì)胞在制備 治療阿爾茨海默病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及促進(jìn)胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)劑；該誘導(dǎo)劑的分子結(jié)構(gòu)；該類誘導(dǎo)劑作為藥物化合物誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞成為神經(jīng)細(xì)胞的方法；應(yīng)用該誘導(dǎo)劑分化得到的神經(jīng)干細(xì)胞植入模型動物腦內(nèi)治療阿爾茨海默病的用途。經(jīng)動物實(shí)驗(yàn)，結(jié)果從正反兩方面證實(shí)了本發(fā)明誘導(dǎo)劑能通過促進(jìn)ERK的磷酸化發(fā)揮作用；誘導(dǎo)分化得到的神經(jīng)干細(xì)胞能通過立體定位植入阿爾茨海默病模型小鼠腦內(nèi)可以明顯改善模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。本發(fā)明的化合物進(jìn)一步可制備促進(jìn)胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的藥物，其所誘導(dǎo)分化得到的神經(jīng)干細(xì)胞可制備治療阿爾茨海默病藥物。
文檔編號A61P25/28GK101768569SQ20081020808
公開日2010年7月7日 申請日期2008年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月29日
發(fā)明者吳興中, 宋后燕, 陸建峰 申請人:復(fù)旦大學(xué)