專利名稱：化合物及其在治療良性前列腺增生及相關(guān)癥狀中的應(yīng)用的制作方法
本申請(qǐng)為2004年9月24日提交的申請(qǐng)?zhí)枮?00410080081.7、發(fā)明名稱為“化合物及其在治療良性前列腺增生及相關(guān)癥狀中的應(yīng)用”的專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明涉及1-α-氟-25-羥基-16，23E-二烯-26，27-雙高-20-表-維生素D3在制備用于預(yù)防和/或治療良性前列腺增生(BPH)及相關(guān)癥狀的藥物中的用途。本發(fā)明還涉及預(yù)防和/或治療良性前列腺增生及相關(guān)癥狀的方法，該方法包括單獨(dú)施用或與其它活性劑聯(lián)合施用預(yù)防和/或治療所述疾病有效量的1-α-氟-25-羥基-16，23E-二烯-26，27-雙高-20-表-維生素D3。

背景技術(shù)：
BPH是老年男性中的一種常見疾病，在60歲的男性中大約有50％的人發(fā)病，在那些85歲的男性中約有90％的人發(fā)病。BPH為一種特殊的以基質(zhì)和上皮細(xì)胞增生為特征的組織病理學(xué)疾病。
一個(gè)多世紀(jì)以來，BPH發(fā)病機(jī)制的兩個(gè)已知致病因素為老齡和存在有功能的睪丸。然而，隨著前列腺生物科學(xué)的發(fā)展，這一觀念由于不能覆含BPH發(fā)病機(jī)制的所有方面而顯得不足。在前列腺的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)中，其它的致病因素也發(fā)揮了重要作用。特別是有證據(jù)顯示，前列腺的生長(zhǎng)受前列腺細(xì)胞所產(chǎn)生的特殊生長(zhǎng)因子的直接控制，所述生長(zhǎng)因子以旁分泌機(jī)制局部作用于相鄰的細(xì)胞或以自分泌機(jī)制作用于同種細(xì)胞。因此，目前正在投入大量的工作以確定旨在抑制前列腺內(nèi)生長(zhǎng)因子的治療策略。
BPH為可同時(shí)影響排尿周期中的充盈(刺激癥狀)期和排尿(梗阻癥狀)期的慢性下泌尿道癥狀的常見病因。這些癥狀影響著患者的社交、心理、家庭、工作、身體健康以及性生活，對(duì)其生活質(zhì)量產(chǎn)生深遠(yuǎn)的負(fù)面影響。除此之外，BPH還可導(dǎo)致其它更急性的泌尿系統(tǒng)并發(fā)癥，特別是通常被認(rèn)為是BPH的最嚴(yán)重并發(fā)癥的急性尿潴留(AUR)以及發(fā)病頻率稍低的反復(fù)發(fā)作性泌尿道感染、上泌尿道擴(kuò)張、膀胱結(jié)石形成以及反復(fù)發(fā)作性血尿。
BPH的控制伴隨著極高的社會(huì)成本，據(jù)估計(jì)僅在美國，1993年便花費(fèi)了40億美元，并計(jì)劃在2003年還將花費(fèi)260億美元。
目前BPH的藥物治療包括口服5α還原酶抑制劑(近期通過FDA認(rèn)證的非那雄胺和度他雄胺(dutasteride))以及α1受體拮抗劑(特拉唑嗪、多沙唑嗪、坦洛新以及西羅多辛(silodosin)、AIO-8507L、RBx-2258等)。每一種可供選擇的治療措施均伴有與其不同作用機(jī)制有關(guān)的優(yōu)缺點(diǎn)。盡管α1受體拮抗劑可非常有效地減輕與下泌尿道癥狀(LUTS)相關(guān)的癥狀，但其在減小前列腺體積方面卻沒有效果，因而也無法避免與BPH相關(guān)的手術(shù)。相反，5α還原酶抑制劑，如非那雄胺和度他雄胺，可以通過減少二氫睪酮形成來減小前列腺的大小，從而減少對(duì)手術(shù)的需求。此外，涉及超過18,000名健康老年男性的為期七年的前列腺癌預(yù)防試驗(yàn)的近期結(jié)果表明，非那雄胺可預(yù)防或延遲前列腺癌的發(fā)生(參見Thompson IM等，《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》(New England Journal of Medicine)(2003)349第215-224頁)。但是，正如所預(yù)料的(參見Kassabian VS，Lancet(2003)362，60-62頁)，非那雄胺并沒有消除其對(duì)性功能的抗雄激素不良作用，例如降低性交能力、減弱性欲以及男性乳房發(fā)育，而這大大削弱了其作為防癌藥品的吸引力。此外，非那雄胺治療與高分化前列腺癌檢測(cè)增多相關(guān)，可能因?yàn)榉悄切郯氛T導(dǎo)的低雄激素狀態(tài)可選擇最具侵襲性的、雄激素不敏感的惡性生長(zhǎng)細(xì)胞(參見Scardino PT，《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》(2003)349第297-299頁)。
因而，仍需要一種新型的用于BPH藥物治療的藥物，它應(yīng)當(dāng)能夠預(yù)防急性尿潴留，并同時(shí)能夠通過降低雄激素誘導(dǎo)的前列腺生長(zhǎng)來避免相關(guān)的對(duì)手術(shù)的需求而不會(huì)直接干擾雄激素受體(AR)，因此不會(huì)有前列腺以及前列腺外的抗雄激素不良作用，例如性方面的副作用。這種藥物通過中斷前列腺內(nèi)的生長(zhǎng)因子信號(hào)傳導(dǎo)，不僅可用于治療BPH，而且可用于預(yù)防前列腺癌，并可防止選擇出AR不敏感的惡性克隆。
本發(fā)明描述 如文中所述，本發(fā)明人已經(jīng)確定出不會(huì)引起高鈣血癥的、耐受性良好的維生素D3類似物1-α-氟-25-羥基-16，23E-二烯-26，27-雙高-20-表-維生素D3(化合物A)就是這種藥物的一個(gè)基本范例，它可通過不依賴于雄激素受體的方式以多種控制BPH細(xì)胞生長(zhǎng)(包括生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的前列腺增生)的途徑為靶向，來對(duì)抗BPH。
1，25-二羥基維生素D3[1，25(OH)2D3]為維生素D3的活化形式，是一種開環(huán)甾體物質(zhì)(secosteroid)，它不僅在骨骼和鈣代謝中起著中心作用，還與免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)以及許多細(xì)胞種類、包括惡性細(xì)胞的分化和凋亡有關(guān)。
但是，骨化三醇治療應(yīng)用的一個(gè)問題為其本身所具有的誘導(dǎo)高鈣血癥和高磷酸鹽血癥的特性。因此，便開發(fā)出了保留其生物活性但不引起高鈣血癥副作用的骨化三醇類似物。
美國專利5,939,408和EP808833公布了許多1，25(OH)2D3的類似物，包括化合物1-α-氟-25-羥基-16，23E-二烯-26，27-雙高-20-表-維生素D3(化合物A)。美國專利5,939,408和EP808833揭示，這些化合物在許多皮膚和癌細(xì)胞系中可誘導(dǎo)分化和抑制增殖，并可用于治療過度增殖性皮膚疾病(如牛皮癬)、腫瘤性疾病(如白血病、乳腺癌)、皮脂腺疾病(如痤瘡和脂溢性皮炎)以及骨質(zhì)疏松。
目前，在本發(fā)明人所進(jìn)行的多項(xiàng)研究中，已令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，與某些其它的1，25(OH)2D3類似物不同，1，25(OH)2D3類似物化合物A
化合物A 可在體外通過介導(dǎo)人體BPH細(xì)胞凋亡而顯著減慢其生長(zhǎng)并在體內(nèi)減慢前列腺生長(zhǎng)，而不影響睪酮和二氫睪酮水平。此外，在不引起高鈣血癥的劑量下便可抑制前列腺生長(zhǎng)。因此，化合物A是一種用于治療良性前列腺增生的有效藥劑。
如文中的實(shí)施例所述，化合物A可減小前列腺大小。此外，如使用非那雄胺所觀察到的，化合物A也可在體內(nèi)和體外對(duì)抗睪酮的增殖活性。但是，值得注意的是，與非那雄胺不同，化合物A不抑制1類或2類5α還原酶活性，并且不僅能對(duì)抗睪酮，甚至還能對(duì)抗二氫睪酮所介導(dǎo)的BPH細(xì)胞生長(zhǎng)。正如化合物A不能與AR相結(jié)合，也不能作為AR激動(dòng)劑或拮抗劑所示，化合物A的這些抗雄激素特性與和AR的相互作用無關(guān)。此外，化合物A不影響性激素分泌。在我們的研究中，化合物A對(duì)PSA水平?jīng)]有明顯影響，因此使用化合物A治療不會(huì)掩蓋可能患前列腺癌的這一重要指標(biāo)。
化合物A的另一個(gè)顯著優(yōu)點(diǎn)為體外實(shí)驗(yàn)顯示，此藥物與非那雄胺不同，它能夠抑制膀胱細(xì)胞的基礎(chǔ)生長(zhǎng)和睪酮所刺激的生長(zhǎng)，預(yù)計(jì)可用于預(yù)防和/或治療人體膀胱功能障礙。膀胱功能障礙的有效大鼠膀胱出口梗阻模型中的體外實(shí)驗(yàn)也已同樣顯示了化合物A的有益效果。因?yàn)榘螂坠δ苷系K為BPH的常見和麻煩的后遺癥，因而這一點(diǎn)很重要。因此化合物A能夠減小前列腺大小并改善膀胱功能，即通過化合物A對(duì)前列腺和膀胱兩者的直接作用同時(shí)改善膀胱功能以及BPH的膀胱相關(guān)癥狀。預(yù)計(jì)這一效果可以超過僅僅是減小前列腺大小所能帶來的膀胱癥狀改善。膀胱癥狀包括膀胱過動(dòng)癥，膀胱功能改善的指標(biāo)包括非排尿收縮減少和殘余尿減少。
因此，本發(fā)明提供了1-α-氟-25-羥基-16，23E-二烯-26，27-雙高-20-表-維生素D3在生產(chǎn)用于預(yù)防和/或治療良性前列腺增生的藥物中的用途。化合物A的可藥用酯和鹽也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明提供了1-α-氟-25-羥基-16，23E-二烯-26，27-雙高-20-表-維生素D3或其可藥用鹽或酯在生產(chǎn)用于預(yù)防和/或治療良性前列腺增生的藥物中的用途。
本發(fā)明還提供了一種在有需要的患者中預(yù)防和/或治療良性前列腺增生的方法，該方法包括施用治療有效量的1-α-氟-25-羥基-16，23E-二烯-26，27-雙高-20-表-維生素D3或其可藥用鹽或酯。
本發(fā)明還提供了1-α-氟-25-羥基-16，23E-二烯-26，27-雙高-20-表-維生素D3或其可藥用鹽或酯用于預(yù)防和/或治療良性前列腺增生的用途。
本發(fā)明還提供了用于預(yù)防和/或治療良性前列腺增生的1-α-氟-25-羥基-16，23E-二烯-26，27-雙高-20-表-維生素D3或其可藥用鹽或酯。
本發(fā)明還提供了1-α-氟-25-羥基-16，23E-二烯-26，27-雙高-20-表-維生素D3或其可藥用鹽或酯用于預(yù)防和/或治療良性前列腺增生并且沒有前列腺內(nèi)和前列腺外的抗雄激素副作用的用途。本發(fā)明還提供了一種在有需要的患者中預(yù)防和/或治療良性前列腺增生并且沒有前列腺內(nèi)和前列腺外的抗雄激素副作用的方法，該方法包括施用治療有效量的1-α-氟-25-羥基-16，23E-二烯-26，27-雙高-20-表-維生素D3或其可藥用鹽或酯。
本發(fā)明還提供了1-α-氟-25-羥基-16，23E-二烯-26，27-雙高-20-表-維生素D3或其可藥用鹽或酯用于預(yù)防和/或治療良性前列腺增生并同時(shí)預(yù)防和/或治療膀胱功能障礙的用途。本發(fā)明還提供了一種在有需要的患者中預(yù)防和/或治療良性前列腺增生并同時(shí)預(yù)防和/或治療膀胱功能障礙的方法，該方法包括施用治療有效量的1-α-氟-25-羥基-16，23E-二烯-26，27-雙高-20-表-維生素D3或其可藥用鹽或酯。
1-α-氟-25-羥基-16，23E-二烯-26，27-雙高-20-表-維生素D3系一種已知的化合物，其制備在美國專利5,939,408中有述，其說明書引入本文作為參考。
其酯包括一種可藥用的不穩(wěn)定酯，在體內(nèi)可水解釋放出化合物A。
化合物A的鹽包括其與堿和堿土金屬離子以及金屬離子鹽(如鈉離子、鉀離子和鈣離子及其鹽，例如氯化鈣、丙二酸鈣等)所可能形成的加合物和復(fù)合物。
化合物A或其鹽或酯，可用作單藥治療，也可聯(lián)合其它已知的抗良性前列腺增生活性劑給藥，如腎上腺素α受體阻斷劑，例如α1受體拮抗劑(例如特拉唑嗪、多沙唑嗪、坦洛新或西羅多辛、AIO-8507L或RBx-2258)或5α還原酶抑制劑(例如非那雄胺和度他雄胺)?！翱沽夹郧傲邢僭錾钚詣边@種表述包括那些能夠或已知在治療或預(yù)防BPH中具有活性的藥劑，如上述的舉例藥物。聯(lián)合的配伍藥物可與化合物A或其鹽或酯以不同比例混和，并以單獨(dú)或聯(lián)合的藥物制劑的形式分別、相繼或同時(shí)給藥。已知治療劑的合適劑量是本領(lǐng)域技術(shù)人員易于掌握的?？梢栽O(shè)想化合物A與兩種或多種例如3種BPH活性化合物聯(lián)合，例如與一種α1受體拮抗劑和一種5α還原酶抑制劑聯(lián)合。當(dāng)與化合物A(或鹽或酯)聯(lián)合給藥時(shí)，與單獨(dú)用藥相比，聯(lián)合配伍藥物可以使用較低的劑量，甚至可以為單獨(dú)用藥時(shí)的亞治療劑量。
因此，本發(fā)明還提供了如上所述的用途，其中的藥物以單獨(dú)或聯(lián)合的藥物制劑的形式與第二種抗良性前列腺增生活性劑分別、相繼或同時(shí)給藥。
因此，本發(fā)明還提供了1-α-氟-25-羥基-16，23E-二烯-26，27-雙高-20-表-維生素D3或其可藥用鹽或酯與第二種抗良性前列腺增生活性劑聯(lián)合在制備用于預(yù)防和/或治療良性前列腺增生的藥物中的用途。
本發(fā)明還提供了一種在有需要的患者中預(yù)防和/或治療良性前列腺增生的方法，該方法包括以單獨(dú)或聯(lián)合的藥物制劑的形式與第二種抗良性前列腺增生活性劑分別、相繼或同時(shí)給藥治療有效量的1-α-氟-25-羥基-16，23E-二烯-26，27-雙高-20-表-維生素D3或其可藥用鹽或酯。
上述的聯(lián)合用藥可以藥物制劑的形式便利的使用。這樣生產(chǎn)的藥物制劑也代表了本發(fā)明的另一個(gè)方面。
本發(fā)明的藥物制劑中活性成分的劑量水平和給藥時(shí)程可以變化，以便獲得可以使特定的患者、組合物以及給藥模式產(chǎn)生所需治療反應(yīng)的活性成分的有效量，同時(shí)又不會(huì)對(duì)患者產(chǎn)生毒性?；衔顰的示范劑量范圍為每天0.1至300μg，舉例來說為每天50至150μg，例如每天75或150μg。單位劑量制劑優(yōu)選含有50至150μg(例如75或150μg)，并且優(yōu)選每天給藥一次。
特別的，化合物A的優(yōu)選劑量是患者能夠耐受并且不會(huì)發(fā)生高鈣血癥或其它不良副作用(如高鈣尿癥)的最大劑量。優(yōu)選將化合物A以約0.001μg至約100μg/Kg體重、約0.001至約10μg/Kg或約0.001μg至約100μg/Kg的劑量給藥。上述所列數(shù)值之間的范圍也是本發(fā)明的一部分。
如上所述，化合物A可以其可藥用鹽或酯的形式給藥，但是，優(yōu)選使用化合物A，即，不以其酯或鹽的形式給藥。
該劑量可以常規(guī)的藥物制劑的形式根據(jù)達(dá)到最佳效果的需要通過單次給藥、多次給藥或控釋給藥來遞送，優(yōu)選每天一或兩次口服給藥(特別是每日一次)。在某些情況下，更改每日劑量也證明可獲得所需的治療反應(yīng)。
精確劑量和配方以及最適給藥方案的選擇特別受制劑的藥學(xué)特性、所治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度、以及藥物接受者的健康狀況和精力充沛度的影響。
代表性給藥方式包括口服、胃腸外給藥(包括皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)給藥)、直腸給藥、口腔給藥(包括舌下給藥)、肺部給藥、透皮給藥、以及鼻內(nèi)給藥，最佳為口服給藥。可持續(xù)或間斷給藥(例如推注(bolus injection))。
本發(fā)明還提供了一種用于預(yù)防和/或治療良性前列腺增生的藥物組合物，其含有1-α-氟-25-羥基-16，23E-二烯-26，27-雙高-20-表-維生素D3或其可藥用鹽或酯以及一種可藥用載體。
本發(fā)明還提供了一種包裝的制劑，其包含一種含有1-α-氟-25-羥基-16，23E-二烯-26，27-雙高-20-表-維生素D3或其可藥用鹽或酯以及可藥用載體的藥物組合物并包裝附有用于治療良性前列腺增生的使用說明書。
如上所述，該組合物可制備成用于胃腸外(皮下、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi))給藥、特別是液態(tài)的溶液或混懸液的形式；用于口服或口腔給藥、特別是片劑或膠囊的形式；用于肺部或鼻腔內(nèi)給藥、特別是粉劑、滴鼻液或噴霧劑的形式；以及用于直腸或透皮給藥的形式。
組合物可以單位劑量形式方便的給藥，并可通過藥學(xué)領(lǐng)域中任何熟知的方法制備，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第17版(Mack出版公司，Easton，PA)中所述。用于胃腸外給藥的制劑可含有賦形劑無菌水或鹽水、亞烷基二醇(例如丙二醇)、聚亞烷基二醇(例如聚乙二醇)、植物油、氫化萘等。用于鼻腔給藥的制劑可為固態(tài)并可含有賦形劑(例如乳糖或葡聚糖)，或者也可為用于以滴鼻液或計(jì)量噴霧形式使用的含水或油性溶液。用于口腔給藥的典型的賦形劑包括糖類、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、預(yù)糊化淀粉等。
口服給藥組合物可為固體或液體形式，并可包含一種或多種生理學(xué)相容性載體和/或賦形劑。片劑和膠囊可用粘合劑(如糖漿、阿拉伯膠、明膠、山梨醇、黃蓍膠或聚乙烯吡咯烷酮)、填充劑(如乳糖、蔗糖、玉米淀粉、磷酸鈣、山梨醇或甘氨酸)、潤(rùn)滑劑(如硬脂酸鎂、滑石、聚乙二醇或二氧化硅)以及表面活性物質(zhì)(如月桂硫酸鈉)制備。液體組合物可含有常規(guī)的添加劑，例如助懸劑(如山梨醇糖漿、甲基纖維素、糖漿、明膠、羧甲基纖維素或食用脂肪)、乳化劑(如卵磷脂或阿拉伯膠)、植物油(如杏仁油、椰子油、鱈魚肝油或花生油)、防腐劑(如丁基化羥基苯甲醚(BHA)以及丁基化羥基甲苯(BHT))。液體組合物可封裝在例如明膠膠囊中以提供一種單位劑量形式。
優(yōu)選的固體口服劑量形式包括片劑、兩節(jié)的硬殼膠囊以及軟彈性明膠(SEG)膠囊。由于SEG膠囊較其它兩種形式有獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，因而倍受關(guān)注(參見Seager H.“軟明膠膠囊一種許多片劑問題的解決方法”，PharmaceuticalTechnology，第9期(1985年))。使用SEG膠囊的部分優(yōu)點(diǎn)為a)因?yàn)樗幬锉蝗芙饣蚍稚⒃谝后w中，且液體可精確的按劑量裝入膠囊中，故而在SEG膠囊中，劑量含量均一性最優(yōu)；b)因?yàn)樗幬锉蝗芙?、增溶或分散在水可混溶的液體或油性液體中，因此在體內(nèi)釋放時(shí)，溶液溶解或乳化產(chǎn)生高表面面積的藥物分散度，因而SEG膠囊配制的藥物可顯示良好的生物利用度；c)因?yàn)檐浢髂z膠囊的干外殼可提供一種抵御氧氣擴(kuò)散的屏障，因而軟明膠膠囊可預(yù)防在長(zhǎng)期儲(chǔ)存中，對(duì)氧化作用敏感的藥物降解。
干外殼配方通常含有約40％至60％濃度的明膠、約20％至30％濃度的增塑劑(如甘油、山梨醇或丙二醇)以及約30％至40％濃度的水。也可同時(shí)含有其它材料，如防腐劑、染料、遮光劑和矯味劑。液體填充材料包含已溶解、增溶或分散(與助懸劑一起分散，如蜂蠟、氫化蓖麻油或聚乙二醇4000)了的固體藥物，或在賦形劑或賦形劑的組合(如礦物油、植物油、甘油三酯、乙二醇、多元醇以及表面活性劑)中的液體藥物。
在一個(gè)制劑的實(shí)例中，軟明膠膠囊為2號(hào)、白色、不透明的、含有液體填充物的橢圓形明膠膠囊，其液體填充物由溶于Miglyol 812(經(jīng)分餾的C8-C12椰子油脂肪酸甘油三酯)中的活性成分化合物A以及作為防腐劑的丁基化羥基甲苯(BHT)和丁基化羥基苯甲醚(BHA)組成。軟明膠膠囊可配制含有0.01至25mg化合物A，如75或150μg化合物A。軟明膠膠囊應(yīng)避光保存于2至8攝氏度。
含有化合物A或其可藥用鹽或酯并任選地含有第二種抗良性前列腺增生活性劑的制劑可以通過將各成分混合來制備。
優(yōu)選在黃光燈下、氮?dú)庵兄苽渲苿?br> 現(xiàn)在，本發(fā)明將參照下述非限定性實(shí)施例和附圖加以說明 附圖描述 附

圖1顯示BPH細(xì)胞增殖受骨化三醇和化合物A的抑制。(圖A)增加骨化三醇(圓圈)或化合物A(正方形)的濃度(10-18-10-7M)，孵育48小時(shí)可導(dǎo)致BPH細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯的劑量依賴性抑制(＊與對(duì)照相比，P值＜0.01)。ALLFIT分析顯示，兩種開環(huán)甾體物質(zhì)有著相同的最大細(xì)胞生長(zhǎng)抑制(Imax＝43±1％)，但效能等級(jí)有顯著差異(-logIC50化合物A＝15.8±0.3；-logIC50骨化三醇＝10.2±0.6，P值＜0.005)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以在三個(gè)不同實(shí)驗(yàn)中(每個(gè)實(shí)驗(yàn)又進(jìn)行三次)相對(duì)于其相應(yīng)對(duì)照的抑制％表示(平均值±SEM)。(圖B)化合物A濃度增加(10-18-10-7M)對(duì)T(10nM，正方形)、KGF(10ng/ml，圓圈)或Des(1-3)IGF-I(10ng/ml，三角形)刺激的BPH細(xì)胞增殖的影響。在存在所有試驗(yàn)的刺激物時(shí)，化合物A均可對(duì)BPH細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生顯著抑制(＊與T或GF處理的細(xì)胞相比，P值＜0.01)，并且有著相似的最大抑制率Imax＝66.6±7.3％。但是，化合物A抑制T對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的刺激(-logIC50＝16.4±0.6)較抑制其它兩種生長(zhǎng)因子對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的刺激更加有效(-logIC50Des(1-3)IGF-I＝12.7±0.6，-logIC50KGF＝14.2±0.6，P值＜0.0001)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以在三個(gè)不同實(shí)驗(yàn)中(每個(gè)實(shí)驗(yàn)又進(jìn)行三次)相對(duì)于最大刺激的變化％表示(平均值±SEM)。
附圖2顯示化合物A、環(huán)丙孕酮以及非那雄胺對(duì)雄激素刺激的BPH細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。在存在T(10nM，圖A)或DHT(10nM，圖B)時(shí)，將BPH細(xì)胞與化合物A(1nM)或雄激素拮抗藥(非那雄胺，F(xiàn)，1nM；環(huán)丙孕酮，Cyp，100nM)一起孵育48小時(shí)。圖A同時(shí)也顯示了在未受刺激的BPH細(xì)胞中所獲得的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以在三個(gè)不同實(shí)驗(yàn)中(每個(gè)實(shí)驗(yàn)又進(jìn)行四次)相對(duì)于其相應(yīng)對(duì)照的變化％表示(平均值±SEM)。化合物A和環(huán)丙孕酮均可顯著阻滯T-和DHT-誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)，而非那雄胺只可有效抑制T誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)。＊與對(duì)照相比，P值＜0.01；°與雄激素處理的細(xì)胞相比，P值＜0.01。
附圖3顯示化合物A對(duì)人體AR無激動(dòng)劑或拮抗劑特性。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了人體AR的AR缺陷型PC3細(xì)胞系以2×104細(xì)胞/孔的密度鋪于24孔平板上。24小時(shí)后，將細(xì)胞用AR反應(yīng)性質(zhì)粒pLSPP轉(zhuǎn)染。48小時(shí)后，將細(xì)胞與濃度遞增的DHT(正方形)或化合物A(圓圈)一起孵育18小時(shí)(圖A)；或者在比卡魯胺(正方形)或化合物A(圓圈)的存在下，將細(xì)胞與固定濃度的DHT(3nM)一起孵育18小時(shí)(圖B)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(三次轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的平均值)以每μg總蛋白的生物發(fā)光百分率表示。將DHT 100nM時(shí)設(shè)定為熒光素酶活性100％以評(píng)估激動(dòng)劑活性(圖A)；將DHT 3nM時(shí)設(shè)定為熒光素酶活性100％以檢測(cè)拮抗活性(圖B)。
附圖4顯示大鼠前列腺腹葉生長(zhǎng)受化合物A或非那雄胺的抑制。圖A將閹割并注射了T庚酸鹽(30mg/千克體重/周)的大鼠，以口服賦形劑或口服劑量遞增的化合物A(10、30、100和300μg/Kg)或非那雄胺(F，10和40mg/Kg)進(jìn)行處理(每周處理5天，連續(xù)處理兩周)。其前列腺腹葉重量以相對(duì)于未閹割的、賦形劑處理的大鼠前列腺腹葉重量的變化％表示(平均值±SEM)(^P值＜0.01；＊與對(duì)照大鼠相比，P值＜0.01；°與補(bǔ)充T的大鼠相比，P值＜0.01)。圖B未閹割的成年大鼠以賦形劑(對(duì)照)或濃度遞增的化合物A(10、30、100和300μg/Kg)或非那雄胺(F，10和40mg/Kg)口服給藥處理一個(gè)月(每周處理5次，總計(jì)給藥27次)。其前列腺腹葉重量以相對(duì)于對(duì)照的、賦形劑處理的大鼠前列腺腹葉重量的變化％表示(平均值±SEM)(＊與對(duì)照大鼠相比，P值＜0.01)。
附圖5顯示在大鼠前列腺腹葉中，化合物A和非那雄胺對(duì)凝聚素(clusterin)基因表達(dá)的影響。圖A賦形劑處理的未閹割大鼠前列腺腹葉中(泳道1)或睪丸切除的大鼠前列腺腹葉中(泳道2)的凝聚素mRNA表達(dá)的Northern分析。泳道3-6顯示了在補(bǔ)充兩周T庚酸鹽(30mg/千克體重)的睪丸切除大鼠中，口服賦形劑(泳道3)、化合物A(300μg/Kg，泳道4和100μg/Kg，泳道5)或非那雄胺(40mg/千克體重，泳道6)處理后的凝聚素基因表達(dá)。每一泳道加量10μg的總RNA。印跡下方顯示相應(yīng)的GAPDH表達(dá)和凝膠的溴乙錠染色。印跡代表兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。圖B用賦形劑(泳道1)、濃度遞增的化合物A(10、30μg/Kg，泳道2和3)或非那雄胺(40mg/Kg，泳道4)口服處理一個(gè)月(每周處理5次，共計(jì)給藥27次)的成年未閹割大鼠前列腺腹葉中，凝聚素mRNA表達(dá)的Northern分析。每一泳道加量10μg的總RNA。印跡下方顯示相應(yīng)的GAPDH表達(dá)和凝膠的溴乙錠染色。印跡代表兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。
附圖6顯示化合物A對(duì)閹割并補(bǔ)充T的大鼠前列腺腹葉的形態(tài)學(xué)影響。圖A、B、C和E為從整個(gè)前列腺橫切面所獲取的，用抗大鼠凝聚素的單克隆抗體免疫染色，并經(jīng)蘇木素復(fù)染的代表性視野。在賦形劑處理的于四天前閹割的大鼠中，可在萎縮的立方上皮細(xì)胞胞漿中檢測(cè)到凝聚素標(biāo)記(圖A，10×)。在補(bǔ)充兩周T后(圖B，10×)，幾乎所有的凝聚素標(biāo)記均消失。相反，在使用T和不同劑量的化合物A(100μg/Kg，圖C；300μg/Kg，圖E，黑箭頭)處理的大鼠中，凝聚素陽性細(xì)胞仍然存在。為突出通過末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)所確定的DNA碎裂，圖D和F顯示了與圖C和E連續(xù)的切面。兩周化合物A(100μg/Kg，圖D；300μg/Kg，圖F)的處理(9次給藥)在大部分的上皮和基質(zhì)細(xì)胞中引起了大規(guī)模的凋亡。應(yīng)注意(黑箭頭)，所有凝聚素陽性細(xì)胞均產(chǎn)生凋亡，同時(shí)與此相一致的一部分凝聚素未標(biāo)記的細(xì)胞也顯示核碎裂。
附圖7顯示化合物A和非那雄胺對(duì)未閹割的成年大鼠前列腺的形態(tài)學(xué)影響。圖A、B、D、E、F和H為從整個(gè)前列腺橫切面所獲取的，用抗大鼠凝聚素的單克隆抗體免疫染色，并經(jīng)蘇木素復(fù)染的代表性視野。在圖A中(10×)，一抗被省略了。圖B(10×)顯示，在未處理的成年大鼠中，在一些腺體中只有極少的上皮細(xì)胞被標(biāo)記(黑箭頭)。相反的，在經(jīng)過濃度遞增的化合物A處理后的大鼠前列腺中，顯示出萎縮特點(diǎn)的立方上皮細(xì)胞被凝聚素劑量依賴性的染色(見黑箭頭，10μg/Kg，圖D；30μg/Kg，圖E；100μg/Kg，圖F，10×)。在用非那雄胺(40mg/Kg，圖H，10×)處理的大鼠中獲得了相似的結(jié)果。為突出通過末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)所確定的DNA碎裂，圖C、G和I分別顯示了與圖B、D和F中相連續(xù)的切片。應(yīng)注意(黑箭頭)，所有凝聚素陽性細(xì)胞均產(chǎn)生凋亡，同時(shí)與此相一致的一部分凝聚素未標(biāo)記的細(xì)胞也顯示核碎裂。
附圖8顯示狗的慢性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。與安慰劑相比，在使用化合物A處理9個(gè)月后，前列腺重量可顯示有明顯減輕。
附圖9顯示狗的慢性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。與安慰劑相比，在從化合物A處理中恢復(fù)后，前列腺重量減輕。
附圖10顯示化合物A對(duì)睪酮刺激的膀胱細(xì)胞生長(zhǎng)的影響?！癶B”＝人體膀胱。
附圖11顯示化合物A和其它對(duì)照的化合物對(duì)受刺激的和基礎(chǔ)膀胱細(xì)胞生長(zhǎng)的影響?！癟 10nM”＝睪酮；“F 1nM”＝非那雄胺。
附圖12顯示維生素D化合物對(duì)膀胱重量的影響。
附圖13顯示維生素D化合物對(duì)自發(fā)性非排尿收縮頻率的影響 附圖14顯示維生素D化合物對(duì)自發(fā)性非排尿收縮幅度的影響。
附圖15顯示維生素D化合物對(duì)排尿壓力的影響。
附圖16顯示維生素D化合物對(duì)殘余尿的影響。
附圖17顯示維生素D化合物對(duì)膀胱條的EFS(電場(chǎng)刺激)收縮反應(yīng)的影響。
實(shí)施例 實(shí)施例1化合物A在體外對(duì)BPH細(xì)胞的影響 材料和方法 材料 最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MEM)和DMEM-F121∶1混和液、Ham’s F12培養(yǎng)液、磷酸鹽緩沖液(PBS)、牛血清白蛋白(BSA)第五部分、谷酰胺、geneticine、膠原酶IV、維生素D3、睪酮(T)、二氫睪酮(DHT)、環(huán)丙孕酮、還原型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸3’-磷酸(NADPH)、二硫蘇糖醇(DTT)、苯甲磺酰氟(PMSF)以及測(cè)量血鈣的試劑盒購自Sigma公司(St.Louis，MO)。蛋白測(cè)量試劑盒購自Bio-Rad Laboratories公司(Hercμles，CA)。胎牛血清(FBS)購自Unipath公司(Bedford，UK)。β鏈特異性單克隆抗大鼠凝聚素抗體(小鼠單克隆免疫球蛋白IgG)購自UPSTATE Biotechnology(Lake Placid，NY)。Apop Tag原位末端標(biāo)記(ISEL)試劑盒購自O(shè)ncor(MD，USA)。CHO1827和CHO 1829由Serono Internationl(Geneva，瑞士)提供。Instagel plus購自Packard(St Louis，MO)。非那雄胺(純藥)(17β-(N，叔丁基)氨甲酰-4-氮雜-5α-雄甾-1-烯-3-酮)由Merck Sharp & Dohme Reaserch Laboratories(Rahway，NJ)惠贈(zèng)。比卡魯胺由AstraZeneca(AstraZeneca，米蘭，意大利)惠贈(zèng)。類似物1-α-氟-25-羥基-16，23E-二烯-26，27-雙高-20-表-維生素D3(化合物A)由Bioxell(Bioxell，米蘭，意大利)提供。角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)購自Perpro Tech EC(倫敦，英國)，人體類胰島素生長(zhǎng)因子-1[Des(1-3)IGF-I]購自GroPep有限公司(Adelaide，澳大利亞)。用于末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)的原位細(xì)胞死亡檢測(cè)試劑盒POD購自Roche Diagnostics Corpotation(Indianapolis，IN)。用于細(xì)胞培養(yǎng)基的塑料器皿購自Falcon(Oxnard，CA)。用于生長(zhǎng)培養(yǎng)基制備的一次性過濾部件購自PBI International(米蘭，意大利)。用于熒光素酶轉(zhuǎn)染的Lipofectamine 2000及Opti-MEM I培養(yǎng)基購自Invitrogen Life Technologies(San Giμliano Milanese，米蘭，意大利)。薄層色譜(TLC)硅膠板獲自Merck(Darmstad，德國)。庚酸睪酮(T庚酸鹽)購自GeymonaT(Anagni，意大利)。Coat-A-

總睪酮檢測(cè)試劑盒購自Medical System(Genova Struppa，意大利)。大鼠黃體生成素(rLH)[125I]分析系統(tǒng)購自Anersham Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)。
BPH細(xì)胞 如文獻(xiàn)所述(Crescioli C等人，《臨床和內(nèi)分泌代謝雜志》(Journal ofClinical and Endocrinology)(2000)85第2576-2583頁)制備、保存以及使用的人體BPH細(xì)胞得自5名患者的前列腺組織，這5名患者在知情同意并經(jīng)當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會(huì)批準(zhǔn)后，行BPH的恥上腺體切除術(shù)。在手術(shù)前三個(gè)月內(nèi)，這些患者均未接受任何藥物治療。
5α還原酶轉(zhuǎn)染的CHO-1827和CHO-1829細(xì)胞系 分別轉(zhuǎn)染了5α還原酶1(5αR-1)或2(5αR-2)的CHO-1827和CHO-1829細(xì)胞(參見Steers W，《泌尿科學(xué)》(Urology)(2001)58第17-24頁)，保存于補(bǔ)充有5％FCS的Ham’s F12培養(yǎng)液中。
AR-轉(zhuǎn)染的PC3細(xì)胞系 如文獻(xiàn)所述(參見Bonaccorsi L等人，《內(nèi)分泌科學(xué)》(Endocrinology)(2000)141第3172-3182頁)，使穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了質(zhì)粒p5HbhAR-A (含有人體雄激素受體(hAR))的人體前列腺癌PC3細(xì)胞在75cm2培養(yǎng)瓶的Ham’s F12培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，培養(yǎng)液中含有50μg/ml的geneticine、10％FCS、青霉素(100U/ml)和鏈霉素(100mg/ml)。
BPH組織 用于結(jié)合試驗(yàn)的前列腺組織獲自行BPH恥上腺體切除術(shù)的患者。患者在手術(shù)前3個(gè)月內(nèi)，未行任何藥物治療。手術(shù)后，立即將所取組織置于液氮中，并于-80攝氏度保存直至進(jìn)行加工處理。
大鼠組織 快速切除大鼠前列腺腹葉，稱重，并立即于干冰中冷凍。在14微米厚連續(xù)的低溫切片中進(jìn)行免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)以直接比較組織形態(tài)學(xué)、凝聚素表達(dá)和通過TUNEL的凋亡定位。收集4至6只大鼠的前列腺腹葉用于總RNA提取和Western印跡分析。
BPH細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將4×104BPH細(xì)胞接種于12孔平板上的生長(zhǎng)培養(yǎng)液中以用于所有的細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，先使細(xì)胞于含0.1％BSA的無酚紅、無血清培養(yǎng)液中受餓24小時(shí)，然后再使用特定刺激物處理48小時(shí)。使用含0.1％BSA的無酚紅、無血清培養(yǎng)液中的細(xì)胞作為對(duì)照。此后，如先前所報(bào)道的(參見Crescioli C等人，《臨床和內(nèi)分泌代謝雜志》(Journal of Clinical and Endocrinology)(2000)85第2576-2583頁)，使用胰蛋白酶消化細(xì)胞，并且每一實(shí)驗(yàn)點(diǎn)均得自血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，每孔至少取六個(gè)不同視野的平均值。使用濃度遞增(10-18-10-7M)的骨化三醇或化合物A，在不含或含有固定濃度T(10nM)、KGF或Des(1-3)IGF-I(10ng/ml)的條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。同時(shí)，使用固定濃度的雄激素(10nM)，在不含或含有化合物A(1nM、10nM)或抗雄激素的非那雄胺(F，1nM)和環(huán)丙孕酮(Cyp，100nM)的條件下進(jìn)行生長(zhǎng)試驗(yàn)。同時(shí)也使用固定濃度的T(10nM)或GF(10ng/ml)，在不含或含有化合物A(10nM)的條件下進(jìn)行生長(zhǎng)試驗(yàn)。在同一實(shí)驗(yàn)中，每一實(shí)驗(yàn)點(diǎn)均重復(fù)三次或四次，同時(shí)每一實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以相對(duì)于最大T或GF誘導(dǎo)的刺激的變化％表示(平均值±SEM)。
原位末端標(biāo)記(ISEL) 依照制造商提供的使用說明，使用Apop Tag原位凋亡檢測(cè)試劑盒過氧化物酶對(duì)BPH細(xì)胞進(jìn)行ISEL。在不含或含有化合物A(10nM)的條件下，將細(xì)胞與T(10nM)、KGF(10ng/ml)或Des(1-3)IGF-I(10ng/ml)一起孵育。在五片不同的切片中計(jì)算凋亡細(xì)胞的百分率(染色細(xì)胞的數(shù)量除以總細(xì)胞數(shù)量)，每一切片至少計(jì)算五個(gè)不同的視野。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以得自三次不同實(shí)驗(yàn)的平均值±SEM表示。
5α還原酶抑制試驗(yàn) 如文獻(xiàn)所述(參見Guarna A等人，《藥物化學(xué)雜志》(Journal of MedicinalChemistry)(2000)43第3718-3735頁)，使用轉(zhuǎn)染了5α-1的CHO 1827細(xì)胞或轉(zhuǎn)染了5α-2的CHO 1829細(xì)胞進(jìn)行5α還原酶抑制試驗(yàn)。在10-9至10-5M濃度范圍內(nèi)添加化合物A，每一實(shí)驗(yàn)同時(shí)使用非那雄胺作為對(duì)照抑制劑。
結(jié)合試驗(yàn) 如前所報(bào)道的(參見Crescioli C等人，《內(nèi)分泌科學(xué)》(Endocrinology)(2003)144第3046-3057頁)，在BPH碎片的細(xì)胞液成分上進(jìn)行結(jié)合試驗(yàn)(最終蛋白濃度1.8mg/ml)。在不含或存在([3H]-R18811nM)濃度遞增的冷R1881(10-10-10-6M)、DHT(10-10-10-6M)、T(10-10-10-6M)、比卡魯胺(10-10-10-4M)以及化合物A(10-10-10-4M)的條件下，將細(xì)胞液成分與濃度遞增(0.125、0.25、0.5、1nM)的[3H]-R1881(比活性83.5Ci/mmol)一起孵育。為防止R1881與黃體酮受體結(jié)合，向每支試管中添加1μM的曲安奈德。如前所述(參見Crescioli C等人，《內(nèi)分泌科學(xué)》(Endocrinology)(2003)144第3046-3057頁)進(jìn)行分離結(jié)合和未結(jié)合的配體。使用BSA作為標(biāo)準(zhǔn)，通過已知的Bradford法確定蛋白質(zhì)含量。
熒光素酶實(shí)驗(yàn) 將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人體AR的PC3細(xì)胞以2×104的密度，鋪于24孔板上添加了10％FCS的Ham’s F 12培養(yǎng)液中。24小時(shí)后，根據(jù)制造商所提供的使用說明，使用Lipofectamine 2000(1mg/ml)，用含有已結(jié)合至螢火蟲熒光素酶基因的野生型MMTV-LTR序列結(jié)構(gòu)的pLSPP質(zhì)粒(750ng/孔)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。(參見Pazzagli M等人，《分析生物化學(xué)》(Analytical Biochemistry)(1992)204第315至323頁)。48小時(shí)后，將細(xì)胞與DHT (10-12-10-6M)或在存在3nM的DHT的條件下與比卡魯胺(10-9-10-5M)以及等摩爾濃度的化合物A一起孵育18小時(shí)。將類固醇和化合物A類似物溶于乙醇。與乙醇一起孵育的轉(zhuǎn)染細(xì)胞只可作為陽性對(duì)照。
根據(jù)制造商所提供的使用說明，使用Berthold光度計(jì)(LuciferaseAssay System，Promega，米蘭，意大利)進(jìn)行熒光素酶實(shí)驗(yàn)。使用200μl裂解緩沖液直接在平板中裂解細(xì)胞。在加入100μl的蟲熒光素后，取20μl細(xì)胞裂解液測(cè)定其熒光素酶活性10秒鐘。取20μl細(xì)胞裂解液進(jìn)行總蛋白測(cè)定。一式兩份地進(jìn)行至少三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。
結(jié)果 將BPH細(xì)胞與濃度遞增的骨化三醇或化合物A一起孵育可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)(附圖1圖A)。兩種化合物均可劑量依賴性地抑制細(xì)胞增殖。ALLFIT(參見De Lean A等人，《美國生理學(xué)雜志》(American Journal of Physiology)(1978)235第E97至E102頁)分析顯示，盡管骨化三醇和化合物A (圖中的“Cmpd A”)的最大細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率之間沒有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Imax＝43±1％)，然而其相對(duì)抑制能力，化合物A要較骨化三醇有效數(shù)個(gè)對(duì)數(shù)單位(-logIC50化合物A＝15.8±0.3；-logIC50骨化三醇＝10.2±0.6，P值＜0.005)。
睪酮(T)和生長(zhǎng)因子(GF)(如Des(1-3)IGF-I或KGF)可顯著增加BPH細(xì)胞的增殖(P值＜0.01)(T，156±8％；Des(1-3)IGF-I，194±6％；KGF，183±5％)。在細(xì)胞經(jīng)T或GF刺激了48小時(shí)后(附圖1，圖B)，化合物A的抑制效果甚至更加顯著(Imax＝66.6±7.3％)。抑制曲線的數(shù)學(xué)模擬(參見DeLean A等人，《美國生理學(xué)雜志》(American Journal of Physiology)(1978)235第E97至E102頁)顯示，化合物A抑制T對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的刺激(-logIC50＝16.4±0.6)較抑制其它兩種生長(zhǎng)因子對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的刺激更加有效(-logIC50Des(1-3)IGF-I＝12.7±0.6，-logIC50KGF＝14.2±0.6，P值＜0.0001)。
化合物A(1nM)不只可以拮抗T-刺激的BPH細(xì)胞增殖，也可拮抗DHT-刺激的BPH細(xì)胞增殖，并且其拮抗的程度與AR拮抗劑環(huán)丙孕酮相似(Cyp，100nM；附圖2，圖A和B)。相反，5α還原酶抑制劑非那雄胺(F，1nM)只可拮抗T誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)(附圖2，圖A)。此外，化合物A甚至可以減慢非雄激素刺激的細(xì)胞生長(zhǎng)(附圖2，圖A)。
為評(píng)估化合物A可能的抗雄激素特性，除BPH細(xì)胞生長(zhǎng)抑制外，我們還研究了其與AR的相互作用。首先，我們使用合成的雄激素[3H]-R1881作為標(biāo)記的配體，通過在人體BPH組織勻漿中進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)，排除了化合物A與AR相結(jié)合的可能。數(shù)據(jù)的LIGAND分析(參見Munson PJ等人，《分析生物化學(xué)》(Analytical Biochemistry)(1980)107第220至239頁)顯示，非標(biāo)記的R1881、DHT、T以及AR拮抗劑比卡魯胺完全取代[3H]-R1881結(jié)合(表I)。相反，在任何檢測(cè)濃度，化合物A均不競(jìng)爭(zhēng)[3H]-R1881結(jié)合(表I)。使用熒光素酶報(bào)道基因分析可證實(shí)并拓展這些結(jié)果。在表達(dá)結(jié)合至熒光素酶報(bào)道基因的全長(zhǎng)AR的PC3細(xì)胞中，DHT刺激熒光素酶活性劑量依賴性增加(EC50＝2±1.3nM，圖A)，而比卡魯胺抑制受DHT刺激的活性(IC50＝194±80nM，圖B)。在此系統(tǒng)中，增加化合物A的濃度既不刺激也不抑制AR介導(dǎo)的熒光素酶活性增加(附圖3)。最后，為檢驗(yàn)化合物A是否與DHT(T的活性代謝物)的形成發(fā)生相互作用，我們?cè)谵D(zhuǎn)染了1類和2類5α還原酶的CHO細(xì)胞中進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，并將結(jié)果與使用非那雄胺(F)所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了比較。結(jié)果為F以預(yù)期的IC50抑制T轉(zhuǎn)化為DHT(1類5α還原酶IC50＝659±100nM，2類5α還原酶IC50＝53.7±11nM，n＝3)，而直至微摩爾范圍，化合物A也不妨礙任一種同工酶的轉(zhuǎn)化(數(shù)據(jù)未顯示)。
表I在人體BPH組織勻漿中，通過[3H]-R1881結(jié)合檢測(cè)得到的雄激素激動(dòng)劑(R1881、DHT、T)、拮抗劑(比卡魯胺)以及化合物A的親和常數(shù)。
化合物A在BPH細(xì)胞中的作用應(yīng)歸于(至少部分歸于)通過ISEL所檢測(cè)到的細(xì)胞程序死亡的激活(n＝3，表II)。在暴露于10nM化合物A 48小時(shí)后，凋亡細(xì)胞核的百分?jǐn)?shù)顯著升高(270％)(與對(duì)照相比，P值＜0.01)。相反的，與未經(jīng)處理的細(xì)胞相比，使用T(10nM)或GF(10ng/ml)處理可顯著降低發(fā)生凋亡的BPH細(xì)胞數(shù)(Des(1-3)IGF-I＝-42％；KGF＝-54％；T＝-27％)。但是，即使在存在GF或T時(shí)，化合物A也可誘導(dǎo)ISEL-陽性的BPH細(xì)胞數(shù)量持續(xù)(250％以上)和顯著(p＜0.01)的升高。
凋亡指數(shù)(％) 表II在BPH細(xì)胞中，化合物A(10nM)、GF(10ng/ml)或T(10nM)對(duì)DNA碎裂的作用。凋亡指數(shù)(％)代表在每張切片的至少5個(gè)不同視野中，通過ISEL檢測(cè)得到的染色細(xì)胞數(shù)量占總的BPH細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。在三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±SEM的形式表示?；衔顰能夠在未經(jīng)處理的BPH細(xì)胞以及與GF或T一起孵育的BPH細(xì)胞中，均誘導(dǎo)凋亡(a與對(duì)照相比，P值＜0.01；b與經(jīng)化合物A處理的細(xì)胞相比，P值＜0.01；c與經(jīng)GF或T處理的細(xì)胞相比，P值＜0.01)。
實(shí)施例2化合物A在體內(nèi)前列腺生長(zhǎng)模型中的抗增殖特性 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案 雄性斯普拉格-道利鼠(28日齡)購自Charles River Laboratories(Calco，Lecco，意大利)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均依照公認(rèn)的動(dòng)物保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。在氯胺酮/賽拉嗪麻醉下，經(jīng)陰囊路徑對(duì)大鼠進(jìn)行閹割。在閹割三天后，不使用T庚酸鹽對(duì)大鼠進(jìn)行處理，或分別在兩周內(nèi)經(jīng)皮下注射的方式使用T庚酸鹽(30mg/Kg)對(duì)大鼠進(jìn)行處理(每組5-8只大鼠)。使用賦形劑(Miglyol812)、化合物A(10、30、100以及300μg/Kg)或非那雄胺(10和40mg/Kg)對(duì)大鼠口服給藥處理，第一周，處理5天；第二周，處理四天，共計(jì)給藥9次，一日后處死大鼠。
或者，除非另有說明，否則給以成年未閹割的雄性斯普拉格-道利鼠(體重250g)口服賦形劑(Miglyol 812)、化合物A(10、30、100以及300μg/Kg)或非那雄胺(10和40mg/Kg)，先連續(xù)給藥五周(每周給藥5天)，在接下來的兩周各在第六天給藥一次(共計(jì)給藥27次)。在每一實(shí)驗(yàn)方案結(jié)束時(shí)，獲取動(dòng)物血液以用于鈣和激素檢測(cè)。
Northern雜交分析 使用來自Molecμlar System(San Diego，CA)的RNAFast提取總RNA。依照所報(bào)道的步驟(Bettuzzi等人，《生物化學(xué)雜志》(Biochemical Journal)(1989)，257，第293-296頁以及Marinelli等人，《生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)》(Biochemical and Cell Biology)(1994)，72，第515-521頁)準(zhǔn)備印跡、標(biāo)記、雜交條件和探針。使用LKB μltrascan XL光密度計(jì)，通過光密度掃描獲取放射自顯影定量。
免疫組織化學(xué) 如文獻(xiàn)所述(Astancolle等人，《內(nèi)分泌科學(xué)》(Endocrinology)(2000)167第197-204頁)，同時(shí)平行處理獲自對(duì)照大鼠和處理后大鼠的所有低溫切片。對(duì)于每一實(shí)驗(yàn)條件，檢查來自三個(gè)不同大鼠前列腺的三個(gè)不同切片。陰性對(duì)照經(jīng)反應(yīng)中排除特異抗體制得，其顯示無特異染色。使用蘇木素對(duì)切片進(jìn)行復(fù)染，并使用EukitT(O.Kindle GmbH&Co，德國)固定蓋玻片。通過顯微鏡，使用CCD相機(jī)獲取高倍放大彩色數(shù)字影像。
原位DNA碎裂分析(TUNEL) 如制造商所推薦的，使用原位細(xì)胞死亡檢測(cè)試劑盒In Stitu Cell DeathDetection Kit(POD，Roche)，通過末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)對(duì)前列腺低溫切片中的DNA碎裂進(jìn)行確定。通過顯微鏡，使用CCD相機(jī)獲取其高倍放大彩色數(shù)字影像，并通過影像對(duì)TUNEL陽性調(diào)亡細(xì)胞核進(jìn)行記錄。使用伊紅對(duì)切片進(jìn)行復(fù)染，并使用Eukitt(O.Kindle GmbH & Co，德國)固定蓋玻片。
鈣測(cè)定 使用市面上可購得的比色測(cè)定裝置(Sigma)，依照制造商所提供的使用說明，測(cè)定血清鈣水平。
睪酮和rLH測(cè)定 通過市面上可購得的放射免疫測(cè)定試劑盒，依照制造商所提供的使用說明，測(cè)定血清T和rLH水平。欲測(cè)定大鼠中血清T水平，首先向樣本中添加4體積的乙醚，輕柔翻轉(zhuǎn)混勻15分鐘，然后于2000rpm離心5分鐘。在干冰中冷凍溶液水相，同時(shí)回收有機(jī)相并在氮?dú)庵姓舾?，最后按照如下比例在?shí)驗(yàn)緩沖液中重新溶解干燥后的提取物在未閹割大鼠中(1∶1體積)，在閹割大鼠中(4∶1體積)。
統(tǒng)計(jì)分析 在合適時(shí)，使用單因素方差分析(One-Way ANOVA)及成對(duì)或不成對(duì)學(xué)生t-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用計(jì)算機(jī)化程序LIGAND對(duì)結(jié)合數(shù)據(jù)進(jìn)行分析(Munson等人，《分析生物化學(xué)》(Analytical Biochemistry)(1980)107第220-139頁)。
使用計(jì)算機(jī)程序ALLFIT(DeLean等人，《美國生理學(xué)雜志》(AmericanJournal of Physiology)(1978)235第E97-E102頁)對(duì)S形劑量反應(yīng)曲線進(jìn)行分析，以獲得半最大抑制值(IC50)和半最大刺激值(EC50)以及最大抑制值(Imax)和最大刺激值(Emax)。數(shù)據(jù)以(平均值±SEM)表示。
結(jié)果 為測(cè)試化合物A在體內(nèi)前列腺生長(zhǎng)模型中的抗增殖特性，將閹割和未閹割的大鼠以濃度遞增的化合物A(10-300μg/Kg)或非那雄胺(F)(10，40mg/Kg)口服處理。如附圖4圖A所示，閹割顯著的減小前列腺腹葉重量，而兩周的庚酸睪酮(T)處理(30mg/Kg)不僅使前列腺腹葉完全復(fù)原，還進(jìn)一步刺激了其生長(zhǎng)。在任何測(cè)試的劑量時(shí)，化合物A均可完全阻滯被T刺激的前列腺過度生長(zhǎng)，減輕前列腺腹葉重量，使其低于未處理大鼠的前列腺腹葉重量。使用非那雄胺(10、40mg/Kg)可獲得相似的結(jié)果。使用化合物A處理未閹割成年大鼠一個(gè)月可顯著降低其前列腺腹葉重量，并在測(cè)試的最高劑量(300μg/Kg)時(shí)獲得最大的重量減輕(30％)。在此劑量時(shí)，化合物A對(duì)前列腺生長(zhǎng)的抑制效果與10或40mg/Kg非那雄胺所誘導(dǎo)的抑制效果相當(dāng)(附圖4圖B)。在所有的實(shí)驗(yàn)方案中，口服不同劑量的化合物A時(shí)，僅在所試驗(yàn)的最高劑量(300μg/Kg)時(shí)，化合物A可導(dǎo)致很弱的血鈣升高(表III)。尚未觀察到其它明確的副反應(yīng)。
表III在不同劑量(10、30、100以及300μg/Kg)的化合物A處理后，經(jīng)T替代治療的被閹割大鼠的血鈣(mg/dl)。與對(duì)照相比，化合物A不會(huì)改變經(jīng)T庚酸鹽替代治療(30mg/Kg/周)的被閹割大鼠的血清鈣水平。在未閹割的大鼠中也可獲得相似結(jié)果(未顯示)。結(jié)果代表大鼠/組的平均值±SEM。
化合物A可誘導(dǎo)前列腺重量減輕，為更好的理解這一現(xiàn)象之下的分子機(jī)制，通過末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)來鑒定凝聚素基因和蛋白的表達(dá)以及凋亡的形態(tài)學(xué)標(biāo)志。凝聚素為一普遍存在的產(chǎn)物基因，并與細(xì)胞周期阻滯及凋亡嚴(yán)格相關(guān)，其表達(dá)可被雄激素下調(diào)。附圖5圖A顯示在補(bǔ)充T及未補(bǔ)充T的睪丸切除大鼠前列腺中，通過Northern分析所檢測(cè)得到的凝聚素mRNA的表達(dá)。閹割可顯著上調(diào)凝聚素mRNA數(shù)量，而此效果在給以兩周的T后可被完全逆轉(zhuǎn)。同時(shí)給以不同濃度的化合物A(300和100μg/Kg)或F(40mg/Kg)處理可部分阻滯T誘導(dǎo)的凝聚素基因表達(dá)下調(diào)。在未閹割的大鼠中(附圖5圖B)，給以一個(gè)月的不同濃度的化合物A(30和100μg/Kg)處理可在前列腺中引起凝聚素基因表達(dá)的持續(xù)升高，且此基因表達(dá)增強(qiáng)與40mg/Kg的F所誘導(dǎo)的基因表達(dá)增強(qiáng)相當(dāng)，甚至更高。
附圖6顯示睪丸切除大鼠前列腺中凝聚素的局部表達(dá)。閹割在前列腺中引起了顯著和廣泛的萎縮，幾乎所有面對(duì)腺體管腔的立方上皮細(xì)胞均為凝聚素陽性(圖A)。T替代治療(圖B)可逆轉(zhuǎn)萎縮的形態(tài)學(xué)標(biāo)志，并持續(xù)減弱凝聚素染色。同時(shí)給以化合物A處理可預(yù)防此效果(圖C和E)。圖D和F顯示與圖C和E中相鄰切片中的TUNEL結(jié)果。化合物A處理(圖D100μg/Kg，圖F 300μg/Kg)在上皮和基質(zhì)細(xì)胞中導(dǎo)致了明顯的細(xì)胞核碎裂，并且在凝聚素陽性和陰性細(xì)胞中均可檢測(cè)到凋亡。附圖7的前兩張圖顯示在略去(圖A)和未略去(圖B)一抗時(shí)，經(jīng)凝聚素檢測(cè)處理過的未閹割大鼠前列腺的形態(tài)。應(yīng)注意在未經(jīng)處理的成年大鼠前列腺中，凝聚素標(biāo)記幾乎完全缺失(圖B)，細(xì)胞核碎裂也和此情況相同(TUNEL，圖C)。相反，不同劑量的化合物A處理可誘導(dǎo)凝聚素表達(dá)(圖D-F)及凋亡(圖C、G和I)。用于比較，圖F顯示前列腺中非那雄胺(40mg/Kg)對(duì)凝聚素陽性的影響。
為排除化合物A通過影響垂體或睪丸功能從而減慢體內(nèi)前列腺生長(zhǎng)之可能，對(duì)經(jīng)閹割和未閹割大鼠中的黃體生成素(rLH)和T的血清水平進(jìn)行了測(cè)定。如預(yù)期所料(表IV，表A)，閹割顯著降低T的血清水平，而升高rLH的血清水平。給以T庚酸鹽(30mg/Kg)處理兩周可完全逆轉(zhuǎn)閹割的影響。T替代治療的經(jīng)閹割大鼠，給以化合物A(100和300μg/Kg)口服處理不顯著影響其rLH或T的血清水平。在未閹割大鼠中也獲得相似結(jié)果(表IV，表B)。實(shí)際上，未閹割大鼠長(zhǎng)期(一個(gè)月)給以化合物A(10、30、100和300μg/Kg)或F(40mg/Kg)不改變r(jià)LH或T的血清水平。
表A 表B 表IV T替代治療的閹割大鼠(表A)或未閹割大鼠(表B)中，使用不同劑量的化合物A處理后的rLH(ng/ml)和T(nM)血清水平。表A閹割顯著降低血清T水平(＊與對(duì)照相比，P值＜0.01)，而升高血清rLH水平(＊與對(duì)照相比，P值＜0.05)。使用T庚酸鹽治療后(30mg/Kg/周)，rLH和T的血清水平恢復(fù)。在所有的測(cè)試劑量下，化合物A均不顯著影響任何rLH或T的血清水平。表B長(zhǎng)期(一個(gè)月)給以F(40mg/Kg)或化合物A(10、30、100μg/Kg)在未閹割大鼠中不改變?nèi)魏蝦LH或T的血清水平。
本實(shí)驗(yàn)表明，化合物A可減小未閹割大鼠的前列腺大小，其減小程度與使用非那雄胺相似。另外，如非那雄胺一樣，化合物A可消除睪酮的體外和體內(nèi)增殖活性。但是，與非那雄胺不同，化合物A不抑制1類或2類5α還原酶活性，同時(shí)不僅可對(duì)抗T誘導(dǎo)的BPH細(xì)胞生長(zhǎng)，還可對(duì)抗DHT誘導(dǎo)的BPH細(xì)胞生長(zhǎng)。正如化合物A不能與AR相結(jié)合，在AR轉(zhuǎn)染的PC3細(xì)胞中也不能作為AR激動(dòng)劑或拮抗劑所示，化合物A的這些抗雄激素特性與和AR的相互作用無關(guān)。此外，因?yàn)樵诖笫笾?，每日給以化合物A直至一個(gè)月，其促性腺激素和T的血漿水平?jīng)]有改變，因而化合物A不影響性激素的分泌。因此，化合物A作用于下游的AR受體-配體相互作用。不希望被理論所束縛，此作用最可能通過中斷睪酮-生長(zhǎng)因子的交流而發(fā)生。
非常低濃度的化合物A不僅能完全拮抗T刺激的BPH細(xì)胞增殖，還能完全拮抗另外兩種最重要的前列腺內(nèi)生長(zhǎng)因子所誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖IGF-I和KGF。此外，即使在存在T或GF時(shí)，化合物A也可在BPH細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。同時(shí)，在未閹割的大鼠以及補(bǔ)充T的睪丸切除大鼠中，化合物A所誘導(dǎo)的程序死亡均很明顯，并且其特征為彌漫出現(xiàn)的DNA碎裂，并伴隨有凝聚素基因和蛋白表達(dá)的增加。凝聚素系一種前列腺中嚴(yán)格受雄激素調(diào)節(jié)的蛋白(Bettuzzi等人，《生物化學(xué)雜志》(Biochemical Journal)(1989)，257，第293-296頁)。盡管對(duì)凝聚素的功能仍未很好了解，但在腺體萎縮(Bettuzzi等人，《腫瘤學(xué)》(Oncogene)(2002)，21，第4328-4334頁以及Betuzzi等人，《內(nèi)分泌雜志》(Journal of Endocrinology)(1992)，132，第361-367頁)和凋亡(Leskov等人《生物化學(xué)雜志》(BiochemicalJournal)(2003)，278，第11590-11600頁)時(shí)，其顯著上調(diào)。因此，化合物A所產(chǎn)生的凝聚素誘導(dǎo)與該化合物在前列腺細(xì)胞中抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的性能一致。
總之，此實(shí)驗(yàn)顯示，在不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，化合物A可有效減慢前列腺細(xì)胞生長(zhǎng)。
實(shí)施例3經(jīng)化合物A處理的健康狗中前列腺重量的減輕。
在四組雄性比格犬中進(jìn)行了一項(xiàng)9個(gè)月的毒性實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)中，每日通過管飼法口服施用0.5μg、1.5μg和5μg/千克體重/天的化合物A(在賦形劑Miglyol 812中)或單獨(dú)使用賦形劑進(jìn)行處理。對(duì)于接受最高劑量(5μg)的組，在處理后再接以兩個(gè)月的恢復(fù)期，然后再測(cè)量前列腺重量。除全部有利的毒性資料外，在使用化合物A處理結(jié)束時(shí)(參見附圖8)和恢復(fù)期后(參見附圖9)，還觀察到較低的前列腺重量。通過單尾學(xué)生t檢驗(yàn)對(duì)恢復(fù)期后所得的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并發(fā)現(xiàn)在化合物A和賦形劑之間有顯著差異(P值＜0.05)。這些結(jié)果進(jìn)一步表明化合物A在體內(nèi)減小前列腺大小的能力。
實(shí)施例4軟明膠膠囊的口服劑量形式 在黃光燈下、氮?dú)庵信渲朴糜诳诜o藥的膠囊，所述膠囊含有填充在軟明膠膠囊中的在150mg經(jīng)分餾椰子油(例如Miglyol 812)中的0.01至25.0mg化合物A以及0.015mg丁基化羥基甲苯(BHT)和0.015mg丁基化羥基苯甲醚(BHA)。
按照以下步驟制備膠囊 1.將BHT和BHA懸浮于經(jīng)分餾的椰子油(如Miglyol 812)中，并攪拌加熱至約50攝氏度，直至其溶解。
2.在50攝氏度，將化合物A溶解于步驟1中的溶液中。
3.將步驟2所得溶液冷卻至室溫。
4.將步驟3所得溶液裝入軟明膠膠囊中。
避自然光并在氮?dú)獗Ｗo(hù)中進(jìn)行所有制造步驟。
實(shí)施例4A軟明膠膠囊的口服劑量形式 在黃光燈下、氮?dú)庵信渲朴糜诳诜o藥的膠囊將150mg經(jīng)分餾椰子油(Miglyol 812)中的150μg化合物A以及0.015mg丁基化羥基甲苯(BHT)和0.015mg丁基化羥基苯甲醚(BHA)裝入軟明膠膠囊中。
實(shí)施例4B軟明膠膠囊的口服劑量形式 在黃光燈下、氮?dú)庵信渲朴糜诳诜o藥的膠囊將150mg經(jīng)分餾椰子油(Miglyol 812)中的75μg化合物A以及0.015mg丁基化羥基甲苯(BHT)和0.015mg丁基化羥基苯甲醚(BHA)裝入軟明膠膠囊中。
實(shí)施例5人體臨床試驗(yàn)中前列腺重量的減輕 在患有BPH的患者中進(jìn)行隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照、平行組試驗(yàn)以確定化合物A(1-α-氟-25-羥基-16，23E-二烯-26，27-雙高-20-表-維生素D3)的作用。
其主要入組標(biāo)準(zhǔn)為經(jīng)診斷患有BPH且經(jīng)直腸超聲(TRUS)確定其前列腺體積＞40ml的男性患者。
統(tǒng)計(jì)方法 計(jì)劃對(duì)符合治療方案人群(Per-Protocol(PP)Popμlation)使用初級(jí)效益分析(primary efficacy analyse)，同時(shí)，也對(duì)意向治療(intent-to-treat)人群進(jìn)行相同分析以作支持。可以進(jìn)行經(jīng)符合治療方案分析的患者為滿足治療方案標(biāo)準(zhǔn)并完成了整個(gè)試驗(yàn)療程，同時(shí)沒有重大治療方案違背并進(jìn)行了前列腺體積有效確定的所有隨機(jī)化患者。滿足意向治療(ITT)人群的患者為接受至少一種試驗(yàn)藥物劑量并且具有在基線及12周就診時(shí)的有效前列腺體積數(shù)據(jù)的所有隨機(jī)化患者。
對(duì)接受至少一種試驗(yàn)藥物的所有隨機(jī)化患者進(jìn)行安全性分析評(píng)定。
在基線時(shí)以描述性意義(descriptive meaning)對(duì)所有患者評(píng)估治療組可比性。通過Chi-Square檢驗(yàn)和ANOVA模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理以得到分類變數(shù)和連續(xù)變量。
通過常用方法來計(jì)算描述統(tǒng)計(jì)(descriptive statistics)平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、連續(xù)變量的最小和最大值、以及分類變量的絕對(duì)和相對(duì)頻率。每次治療和每周就診均進(jìn)行描述統(tǒng)計(jì)。合并少于4名患者的試驗(yàn)中心。
初級(jí)效益變量為通過統(tǒng)一的MRI軸向掃描所測(cè)定的前列腺體積變化百分?jǐn)?shù)。將治療和試驗(yàn)中心作為固定影響，使用ANOVA模型用于分析。
試驗(yàn)參與者每天早晨服用一次150μg的膠囊(如實(shí)施例4A所述，在安慰劑的情況下，膠囊中不含藥物)。治療為期12周。所涉及的患者數(shù)如下 通過軸向掃描所測(cè)定的前列腺體積變化百分?jǐn)?shù) 符合治療方案人群中的前列腺體積變化百分?jǐn)?shù)為化合物A組為1.89+5.2，安慰劑組為4.99+5.99，P值＜0.0001，有顯著意義并支持化合物A。治療組間差異(化合物A減去安慰劑)的估算值為-7.24，其95％置信限為-9.54和-4.94。中心影響也很顯著(p＝0.0176)。對(duì)意向治療人群所進(jìn)行的相同分析證實(shí)了此結(jié)果(p＝0.001)，即化合物A可較安慰劑更有效的減小前列腺體積。
與基線前列腺體積＜60ml的患者中治療組間的差異相比(p＝0.0320)，基線前列腺體積＞＝80ml的患者中治療組間的差異(p＝＜0.0001)更加明顯，特別是在PP人群中。
在年齡在61-70歲之間的患者中，其治療組間的差異始終也支持化合物A，且較更高齡的患者(年齡＞70歲)更加明顯。事實(shí)上，在ITT人群中，年齡＞70的患者中的治療組間差異的顯著性p＝0.0540，而其它各年齡組患者p＝＜0.0001。
反應(yīng)者 在PP人群中，使用化合物A所觀察到的反應(yīng)者比例為27.5％，無變化的比例為65％，只有7.5％的患者無反應(yīng)。在安慰劑組中，反應(yīng)者組為零，實(shí)際上，患者被合理的分為無變化和無反應(yīng)組(每組50％病人)。比較各組比例的Chi-Square檢驗(yàn)證實(shí)了在初級(jí)效益變量中所觀察到的結(jié)果，p＝＜0.0001，即化合物A可較安慰劑更有效的減小前列腺體積。
在ITT人群中，此結(jié)果得到了證實(shí)在化合物A組中，反應(yīng)者比例為28.8％，其治療組間的Chi-Square p值＜0.0001。
在PP人群中，與基線體積相比，反應(yīng)者患者中平均前列腺體積減小為-6.88±2.5，而在化合物A組和安慰劑組，無變化患者的平均差異分別為-0.35±2.3和0.40±2.0。對(duì)于無反應(yīng)患者，在化合物A組及安慰劑組其平均差異分別為3.93±0.8及7.48±4.9，這證實(shí)化合物A控制和減小前列腺體積的效果更顯著。
通過統(tǒng)一的旁軸和過渡(transitional)掃描所測(cè)定的前列腺體積變化百分比 對(duì)旁軸和過渡掃描所采集資料的支持性分析證實(shí)了軸向掃描所得結(jié)果。特別是，在PP人群中，旁軸掃描所獲得的變化百分比為化合物A組中-1.30±6.9，安慰劑組中2.57±6.8，p＝0.0172；而過渡掃描所獲得的變化百分比為化合物A組中-0.22±9.6，安慰劑組中6.18±10.9，p＝0.0028。同時(shí)，在ITT人群中，治療組間在減小前列腺體積方面也存在支持化合物A的顯著差異。
血清總PSA和激素水平 PP人群中，化合物A組和安慰劑組中的平均PSA變化為0.23±1.3與0.43±1.7。兩治療組間未觀察到顯著差異(p＝0.2722)。
同樣對(duì)于睪酮，在PP人群中，化合物A組和安慰劑組中的平均變化分別為0.07±1.5與0.22±1.4，兩治療組間也無顯著差異(p＝0.2150)。
對(duì)于二氫睪酮，在PP人群中，化合物A組和安慰劑組中所觀察到的平均變化分別為-30.77±227.71和-166.76±490.26，兩治療組間也無顯著差異(p＝0.7275-PP人群)。
對(duì)于PP人群，化合物A組和安慰劑組中LH的平均變化分別為-0.02±1.7和-0.00±1.8，亦無差異(p＝0.9320-PP人群)。
除DHT外，所觀察到的PSA和激素水平的平均變化約為零，化合物A不改變激素水平。
在ITT人群中證實(shí)了相同結(jié)果。
安全性 至少發(fā)生一種不良事件的患者數(shù)為31名(化合物A組中17名，安慰劑組中14名)；沒有患者因?yàn)椴涣际录顺鲈囼?yàn)，只有一名安慰劑組患者發(fā)生了嚴(yán)重的不良事件急性膽囊炎，經(jīng)住院治療處理解決。
與化合物A治療相關(guān)的不良事件患者數(shù)為3名(5.26％)，而在安慰劑組中與治療相關(guān)的不良事件患者數(shù)為6名(9.68％)。與化合物A相關(guān)的不良事件為眩暈、頭痛、性欲下降和潮紅；而與安慰劑相關(guān)的不良事件為尿磷升高、頭痛、暈厥、性欲下降(3名患者)、高鈣尿癥、勃起障礙和熱潮紅。
尿鈣值在試驗(yàn)全程均進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，化合物A組與安慰劑組之間尿鈣值并沒有顯著差異。
結(jié)論 本試驗(yàn)研究了化合物A對(duì)前列腺大小的影響，在此概念研究(conceptstudy)的預(yù)檢驗(yàn)中，該藥物經(jīng)證實(shí)有效。試驗(yàn)基本變量分析(即前列腺大小的評(píng)定)顯示，化合物A和安慰劑之間存在顯著差異，因而證實(shí)了被試驗(yàn)藥物能夠阻滯疾病的進(jìn)展。該藥物的安全性方面良好，在化合物A和安慰劑之間，不良事件的發(fā)生率沒有差別，同時(shí)，在化合物A組中也未報(bào)道發(fā)生嚴(yán)重的不良事件。測(cè)試藥物無任何抗雄激素作用，對(duì)PSA水平?jīng)]有影響，同時(shí)對(duì)鈣離子的體內(nèi)穩(wěn)定作用也沒有顯著影響。
實(shí)施例6化合物A對(duì)膀胱細(xì)胞生長(zhǎng)和功能的活性 化合物A顯示可有效抑制膀胱細(xì)胞的基礎(chǔ)生長(zhǎng)和經(jīng)睪酮刺激的生長(zhǎng)。該活性以前從未報(bào)道過，它是劑量依賴性的，對(duì)于1-α-氟-25-羥基-16，23E-二烯-26，27-雙高-20-表-維生素D3(“化合物A”/圖中的“Cmpd A”)(對(duì)經(jīng)刺激的細(xì)胞)為1.6±7×10-15(參見附圖10和附圖11)。
化合物A的此作用顯著強(qiáng)于在泌尿生殖系統(tǒng)疾病的治療中所廣泛使用的抗雄激素藥物非那雄胺的作用(附圖11)。
實(shí)施例7膀胱出口梗阻模型中化合物A對(duì)膀胱功能障礙的作用 實(shí)驗(yàn) 材料 1.1動(dòng)物 雌性斯普拉格-道利鼠，重200-250g 1.2分組 A組BOO大鼠，自梗阻產(chǎn)生一天后開始，使用化合物A處理2周(n＝12) B組BOO大鼠，自梗阻產(chǎn)生一天后開始，使用賦形劑處理2周(n＝12) C組假手術(shù)大鼠，自手術(shù)一天后開始，使用化合物A處理2周(n＝12) 1.3試驗(yàn) a)有知覺狀態(tài)下的膀胱內(nèi)壓測(cè)量法(末次給藥/賦形劑后約18小時(shí)，解除梗阻結(jié)扎后12小時(shí))。
b)膀胱重量測(cè)量 c)體外研究 2.方法 2.1膀胱出口梗阻(BOO) 通過下腹中線切口暴露膀胱和尿道膀胱連接處。將一0.9mm的金屬棒插入近端尿道，然后以3-0絲線沿尿道和金屬棒周圍緊緊結(jié)扎，然后去除金屬棒。依照此手術(shù)步驟，不施行結(jié)扎，進(jìn)行假手術(shù)。13天后，去除結(jié)扎，并將一導(dǎo)尿管取道皮下插入膀胱頂中。
2.2膀胱內(nèi)壓測(cè)量 在置入導(dǎo)尿管的第二天早晨，不施行任何麻醉或代謝籠約束，進(jìn)行膀胱內(nèi)壓測(cè)量研究。通過連接至力-位移傳感器的液體收集器測(cè)量排出尿量。在室溫下，向膀胱中持續(xù)注入鹽水。同時(shí)，導(dǎo)尿管也連接至一壓力傳感器。30-60分鐘的穩(wěn)定期后，在實(shí)現(xiàn)可重復(fù)的排尿模式時(shí)，記錄為期30分鐘的下列參數(shù)基礎(chǔ)膀胱壓力、排尿壓力、臨界壓力、排尿間隔和容量、以及非排尿收縮。在膀胱內(nèi)壓測(cè)量結(jié)束時(shí)，手動(dòng)測(cè)量三次殘余尿量。依據(jù)所測(cè)得數(shù)值計(jì)算膀胱容量。
2.3體外研究 2.3.1標(biāo)本。
完成膀胱內(nèi)壓測(cè)量后，通過一氧化碳窒息并接以放血處死大鼠。通過下腹中線切口進(jìn)入腹腔，然后打開恥骨聯(lián)合。仔細(xì)游離解剖膀胱，并立即置于冰冷的Krebs液中，同時(shí)切割膀胱條標(biāo)本。
2.3.2力學(xué)活性記錄 在膀胱頸水平分離膀胱和尿道，并從逼尿肌的中三分之一制備半環(huán)形膀胱條(1×2×5mm)。所有標(biāo)本在切除后立即使用。
將膀胱條移至5ml含有Krebs液的組織浴中。
在37攝氏度保存Krebs液，并持續(xù)鼓入95％O2和5％CO2的混合氣泡，使其pH值為7.4。通過絲線結(jié)扎，使膀胱條懸掛在兩L形鉤之間。一個(gè)鉤子連于可調(diào)整被動(dòng)張力的可動(dòng)裝置上，另一個(gè)鉤子連于Grass FT03C(Grass Instruments Co，MA，美國)力傳感器上。使用Grass多導(dǎo)生理儀(7D)記錄等張力。安裝后，牽拉膀胱條使其被動(dòng)張力為4mN(所有標(biāo)本均同樣張力)，在進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)前，平衡膀胱條45-60分鐘。
2.3.3電場(chǎng)刺激 將兩鉑金電極置于標(biāo)本兩側(cè)以實(shí)現(xiàn)電場(chǎng)刺激(EFS)，使用Grass S48或S88刺激器，以選定的頻率傳輸單方波脈沖進(jìn)行電場(chǎng)刺激。脈沖串的持續(xù)時(shí)間為5s，脈沖持續(xù)時(shí)間為0.8ms，刺激間隔2分鐘。通過極性變換設(shè)備在每一脈沖后，改變電極的極性。
2.3.4步驟 將標(biāo)本暴露于高K+(124mM)Krebs液直至獲得兩次可重復(fù)的收縮以開始每次實(shí)驗(yàn)。然后進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn) a)在沒有和存在阿托品時(shí)，分別進(jìn)行神經(jīng)電刺激并獲取頻率-響應(yīng)關(guān)系。
b)構(gòu)建卡巴膽堿和ATP的濃度-響應(yīng)曲線。
結(jié)果 使用上述有效的大鼠膀胱出口梗阻模型測(cè)試化合物A控制和治療膀胱功能障礙的性能。實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑u(píng)估一種維生素D3的類似物(1-α-氟-25-羥基-16，23E-二烯-26，27-雙高-20-表-維生素D3-化合物A，劑量為150μg/Kg/天)是否能預(yù)防膀胱肥大和膀胱功能障礙(例如膀胱過度活動(dòng)癥)。
在該模型中，通過手術(shù)在放置導(dǎo)尿管的膀胱出口周圍進(jìn)行結(jié)扎。這樣在拔除導(dǎo)尿管時(shí)，膀胱將承受增大的尿道阻力。持續(xù)對(duì)大鼠進(jìn)行膀胱內(nèi)壓測(cè)量以評(píng)估膀胱功能。此外，在電場(chǎng)刺激(EFS)下，體外研究離體膀胱標(biāo)本對(duì)神經(jīng)刺激和外界刺激反應(yīng)的收縮特性。
研究下列膀胱內(nèi)壓參數(shù)(參見附圖12-16) -排尿壓力(排尿中的最大膀胱壓力) -膀胱容量(排尿后的殘余容積加上引起排尿所注入的鹽水體積) -排尿量(所排尿液的體積) -殘余尿(膀胱容量減去排尿量) 以及 -膀胱內(nèi)壓自發(fā)改變的頻率和幅度(非排尿收縮)。
在該模型中，所評(píng)估的類似物對(duì)膀胱功能具有有益作用。該作用在正常膀胱中很明顯，并在膀胱出口梗阻模型中得到保持。特別的，在如下參數(shù)中觀察到相對(duì)于賦形劑的顯著差異 -自發(fā)非排尿收縮的頻率和幅度(附圖13和14)； -殘余尿(使用化合物A無殘余尿，附圖16)； -排尿壓力(附圖15)； 此外，體外試驗(yàn)證實(shí)了其對(duì)膀胱功能的有益作用 -K反應(yīng)； -EFS反應(yīng)(附圖17)； -卡巴膽堿反應(yīng)。
最后，使用化合物A觀察到膀胱重量輕微減輕(附圖12)。
這些數(shù)據(jù)顯示了化合物A(從50μg至300μg的劑量范圍-相當(dāng)于人體中約0.725至5μg/千克體重)在預(yù)防和治療膀胱功能障礙(例如膀胱過度活動(dòng)癥)中的用途，正如例如在患有BPH患者中所顯示的。
縮寫 T 睪酮 DHT二氫睪酮 GF 生長(zhǎng)因子 BPH良性前列腺增生 PP 符合治療方案 ITT意向治療 ANOVA 方差分析 TRUS 經(jīng)直腸超聲 BOO膀胱出口梗阻 AR 雄激素受體 PSA前列腺特異性抗原 本申請(qǐng)中所涉及的所有參考文獻(xiàn)包括專利及專利申請(qǐng)均盡可能最大程度的引入本文作為參考。
在整個(gè)說明書及隨后的權(quán)利要求書中，除非上下文另有要求，否則詞語“包含/含有”應(yīng)理解為包括所述的整數(shù)或步驟或一組整數(shù)，但不排除任何其它的整數(shù)或步驟或一組整數(shù)或步驟。
本說明書和權(quán)利要求書構(gòu)成其一部分的申請(qǐng)可以作為任何后續(xù)申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)的基礎(chǔ)。所述后續(xù)申請(qǐng)的權(quán)利要求可涉及本文中所描述的任何特點(diǎn)或特點(diǎn)的組合。它們可以采用產(chǎn)品、組合物、方法的形式或是用途權(quán)利要求的形式，并可包括例如但不僅限于如下
權(quán)利要求
權(quán)利要求
1.包含50-150μg 1-α-氟-25-羥基-16，23E-二烯-26，27-雙高-20-表-維生素D3的單位劑量藥物制劑。
2.權(quán)利要求1所述的包含50-150μg 1-α-氟-25-羥基-16，23E-二烯-26，27-雙高-20-表-維生素D3的單位劑量藥物制劑，條件是不包括50μg。
3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的單位劑量藥物制劑，其包含75-150μg 1-α-氟-25-羥基-16，23E-二烯-26，27-雙高-20-表-維生素D3。
4.權(quán)利要求1至3任意一項(xiàng)所述的單位劑量藥物制劑，其包含75μg1-α-氟-25-羥基-16，23E-二烯-26，27-雙高-20-表-維生素D3。
5.權(quán)利要求1至3任意一項(xiàng)所述的單位劑量藥物制劑，其包含150μg1-α-氟-25-羥基-16，23E-二烯-26，27-雙高-20-表-維生素D3。
6.用于口服給藥的權(quán)利要求1至5任意一項(xiàng)所述的單位劑量藥物制劑。
7.用于口服給藥的權(quán)利要求6所述的單位劑量藥物制劑，其為片劑或膠囊的形式。
8.權(quán)利要求1至7任意一項(xiàng)所述的單位劑量藥物制劑，其包含溶解于經(jīng)分餾的椰子油中的1-α-氟-25-羥基-16，23E-二烯-26，27-雙高-20-表-維生素D3以及一種或多種防腐劑。
9.權(quán)利要求8所述的單位劑量藥物制劑，其中經(jīng)分餾的椰子油為Miglyol 812。
10.權(quán)利要求8或權(quán)利要求9所述的單位劑量藥物制劑，其中的防腐劑選自丁基化羥基甲苯、丁基化羥基苯甲醚以及其混合物。
11.權(quán)利要求9所述的單位劑量藥物制劑，其在150mg經(jīng)分餾的椰子油(Miglyol 812)中包含150μg化合物A以及0.015mg丁基化羥基甲苯(BHT)和0.015mg丁基化羥基苯甲醚(BHA)。
12.權(quán)利要求9所述的單位劑量藥物制劑，其在150mg經(jīng)分餾的椰子油(Miglyol 812)中包含75μg化合物A以及0.015mg丁基化羥基甲苯(BHT)和0.015mg丁基化羥基苯甲醚(BHA)。
13.在其中填充有權(quán)利要求11或權(quán)利要求12所述的單位劑量藥物制劑的軟明膠膠囊。
14.權(quán)利要求1至12任意一項(xiàng)所述的單位劑量藥物制劑，其包含1-α-氟-25-羥基-16，23E-二烯-26，27-雙高-20-表-維生素D3以及第二種或另外的抗良性前列腺增生活性劑。
15.權(quán)利要求1至12任意一項(xiàng)所述的單位劑量藥物制劑在生產(chǎn)用于每天給藥一次的藥物中的用途。
16.權(quán)利要求15所述的單位劑量藥物制劑的用途，用于生產(chǎn)治療良性前列腺增生的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及1-α-氟-25-羥基-16，23E-二烯-26，27-雙高-20-表-維生素D3或其可藥用鹽或酯在制備用于預(yù)防和/或治療良性前列腺增生(BPH)及相關(guān)癥狀的藥物中的用途。
文檔編號(hào)A61K31/593GK101352446SQ20081021251
公開日2009年1月28日 申請(qǐng)日期2004年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月24日
發(fā)明者L·阿多里尼, E·科利 申請(qǐng)人:拜奧克塞爾有限公司