專利名稱：：一種吡喃葡萄糖苷化合物在制備改善高血壓的腦血管重構(gòu)的藥物中的應(yīng)用的制作方法一種吡喃葡萄糖苷化合物在制備改善高血壓的腦血管重構(gòu)的藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種化合物(I),化學(xué)名為20-(S)-原人參二醇-3-[O-fi-D-吡喃葡萄糖(1—2)-1H)-吡喃葡萄糖]-20-0-1H)-吡喃葡萄糖苷，在制藥中的新用途，具體地說是在制備改善高血壓的腦血管重構(gòu)的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：腦血管重構(gòu)是慢性高血壓的重要病理特征，也是腦卒中的主要原因之一(Baumbach,G.L.，Heistad,D.D"1989.Remodelingofcerebralarteriolesinchronichypertension,Hypertension13，968-972),我們最近的研究發(fā)現(xiàn)，在雙腎雙夾(2k2c)易卒中型高血壓大鼠模型中，基底動脈中膜發(fā)生了重構(gòu)，基底平滑肌細(xì)胞(BASMC)的體積和血管中膜的橫截面積都有增大，這表明非遺傳性的高血壓模型與遺傳性高血壓模型在腦基底動脈中膜有相似的形態(tài)學(xué)改變，其發(fā)生重構(gòu)主要的機(jī)制是腦動脈平滑肌細(xì)胞增殖(Shi，X丄.，G.L.Wang,Z.Zhang,Y丄Liu,J.H.Chen,J.G.Zhou,Q.Y.QiuandY.Y.Guan.2007.Alterationofvolume-regulatedchloridemovementinratcerebrovascularsmoothmusclecellsduringhypertension.Hypertension49,1371-1377.)。關(guān)于高血壓中Ca2+內(nèi)流與腦血管重構(gòu)的關(guān)系的研究表明，高血壓患者的動脈平滑肌重構(gòu)與L-型Ca"通道增加和電壓依賴性Ca^內(nèi)流增強(qiáng)有密切聯(lián)系(Simard，J.M.,Li，X.，Tewari，K.，1998.IncreaseinfunctionalCa2+channelsincerebralsmoothmusclewithrenalhypertension.Circ.Res82,1330-1337)，進(jìn)而影響到血管平滑肌的緊張度。人參、三七是中國名貴中藥，作為活血化瘀藥方廣泛應(yīng)用于治療與中醫(yī)"血瘀證"相關(guān)的疾病，如冠心病、偏頭痛等，并取得良好的療效。中國專利01803432.2專利涉及的是本發(fā)明的化合物(I),其提取方法及包含所述化合物的藥物組合物，涉及化合物(I)及其組合物在制備治療急性缺血性腦血管病藥物中的應(yīng)用，未報道化合物(I)的其他用途。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是為了提供化合物(I)在制備改善高血壓的腦血管重構(gòu)的藥物中的應(yīng)用。本.發(fā)明,是實(shí)才羊?qū)崿F(xiàn)的?；衔?I)化學(xué)名為20-(S)-原人參二醇-3-[0各D-吡喃葡萄糖(1—2)-fi-D-吡喃葡萄糖]-20-0-15-0-吡喃葡萄糖苷，其結(jié)構(gòu)式為(I)我們用SD大鼠建造兩腎兩夾腎性腎性高血壓易卒中模型，此高血壓模型易發(fā)生腦血管重構(gòu)并由此導(dǎo)致腦卒中。從造模開始的第一天給藥，兩腎兩夾腎性高血壓大鼠術(shù)后每日腹腔注射化合物(I)。實(shí)驗(yàn)表明化合物(I)(以下稱Rd)預(yù)防性給藥能逆轉(zhuǎn)高血壓過程中的腦血管重構(gòu)，具體表現(xiàn)為Rd預(yù)防性給藥能逆轉(zhuǎn)高血壓誘發(fā)的WD(管壁直徑)；LD(管腔直徑)；W/L(管壁管腔比)；CSA(血管中膜橫截面積)的改變，使其恢復(fù)至正常水平。其效果與臨床廣泛應(yīng)用的降壓藥卡托普利相當(dāng)。另外電鏡觀察發(fā)現(xiàn)預(yù)防性給予化合物(I)Rd能改善高血壓過程中腦動脈的超微結(jié)構(gòu)的損害。細(xì)胞水平研究發(fā)現(xiàn)預(yù)防性給予化合物(I)能抑制腦血管平滑肌的細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期推進(jìn)。我們發(fā)現(xiàn)兩腎兩夾腎性高血壓易卒中大鼠的非電壓依賴性的鈣通道異常(增強(qiáng))，化合物(I)抑制這種異常。因此我們推測化合物(I)是通過糾正高血壓過程中腦動脈平滑肌細(xì)胞的非電壓依賴性的4丐通道(4丐池操作性的鉤通道4SOCC,受體操作性的鈣通道ROCC)的異常而改善腦動脈重構(gòu)的。本發(fā)明的另一方面，提供化合物(I)的藥物組合物，其包含如上所述的化合物(I)以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑，該藥物組合物的劑型為粉針劑或注射液，也可以是口服制劑?；衔?I)應(yīng)用于改善高血壓的腦血管重構(gòu)的藥物時，通常采用以下治療方案添加等滲調(diào)節(jié)劑如NaCl、葡萄糖等，制備成粉針劑或注射液，肌注或靜脈注射530mg/次，每824小時一次，7-14天為一療程。也可以采用口服劑型，但同時劑量應(yīng)加倍。本發(fā)明的化合物(I)也可以與降血壓藥物制成復(fù)方制劑，起到既能降低血壓，又能改善高血壓的腦血管重構(gòu)的作用，例如與卡拉普利或/和氫氯噻"秦復(fù)方，能達(dá)到增強(qiáng)甚至協(xié)同治療效果?；衔?I)也可以制備成衍生物，例如制成琥珀酸鹽供藥用。本發(fā)明的改善應(yīng)當(dāng)理解為預(yù)防、延緩和逆轉(zhuǎn)之意。下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。具體實(shí)施方式實(shí)施例l化合物(I)改善高血壓的腦血管重構(gòu)的實(shí)施例。1.1研究方法l丄l兩腎兩夾高血壓動物才莫型體重90~120克的雄性健康Sprague-Dawley大鼠，飼養(yǎng)于20~25。C環(huán)境中，給予12小時為周期的明暗交替。所有大鼠均詞養(yǎng)于中山大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。體內(nèi)試驗(yàn)的大鼠(11=180)被隨機(jī)抽取進(jìn)行免疫組化反應(yīng)、電子顯微鏡檢查和Mr^+焚光淬滅試驗(yàn)，每組60只大鼠被分為如下5個小組(1)假手術(shù)對照組(sham);(2)雙腎雙夾高血壓組(兩腎兩夾高血壓)；(3)丙二醇(PG)治療高血壓組大鼠術(shù)后每日腹腔注射2ml含20%丙二醇的生理鹽水；(4)化合物(I)Rd組大鼠術(shù)后每日腹腔注射化合物(IM20mg化合物(I)溶于2ml含20%丙二醇的生理鹽水/kg/day];(5)雙腎雙夾易卒中型腎性高血壓大鼠模型依據(jù)文獻(xiàn)構(gòu)建(Zeng:J.,Zhang,.Y"Mo,J.,Su,Z.，Huang,R.,1998.Two-kidney,twocliprenovascularhypertensiveratscanbeusedasstroke-pronerats.Stroke29,1708-1713)。大鼠分別于第4周、第8周和第12周通過注射戊巴比妥(40mg/kg)處死。5l丄2組織制備和免疫組化試驗(yàn)(通過此方法可以完成觀察腦動脈重構(gòu)的參數(shù)測定)a-平滑肌肌動蛋白染色增加的量可作為平滑肌或平滑肌類似細(xì)胞數(shù)量增長的指標(biāo)，直接反映血管重構(gòu)。參照文獻(xiàn)方法(Shieta1,2007)，小心分離大鼠腦部，制備基底動脈的新鮮冰凍切片(8pm)。切片為冠狀方向，位于視神經(jīng)交叉平面，包括中腦動脈。已進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)組織學(xué)檢查(Shietal.,2007)。切片暴露于4。Ca-肌動蛋白單克隆抗體(Sigma;dilutionl:400)過夜，然后在室溫下用FITC(異硫氰酸)結(jié)合的二抗(Sigma;dilutionl:400)處理30分鐘。a-平滑肌-肌動蛋白染色定量的^r測和分析使用共聚焦系統(tǒng)(OLYMPUS,FV500-IX81，magnification400)和生物熒光影像(Image-ProPlus5.0)。每個時間點(diǎn)的每個試驗(yàn)組分別使用12個鼠腦，從每個鼠腦基底動脈隨機(jī)抽取的8個切片使用不同的標(biāo)記定量。1.1.3電子顯微鏡檢查(觀察大鼠腦動脈平滑肌細(xì)胞重構(gòu)后的變化以及預(yù)防性給藥后的效果)大鼠用10°/。水合氯醛深度麻醉，仰臥位固定，開胸，經(jīng)左心室插針入主動脈，固定針頭位置；剪開右心房；快速滴注含肝素(100U/Kg,IV)、硝酸甘油(0.3lag/Kg)生理鹽水，滴下液體以剛能連成線為宜，壓力約為100mmHg;當(dāng)右心房流出液體澄清，改用4。C10。/。多聚曱醛/PB溶液(mM:Na2HP04.12H20100，NaH2P042H20100，PH7.4)滴注，先快后悛;多聚曱醛滴注固定15min后，開顱取腦，取出含腦基底動脈在內(nèi)的3腿厚的腦組織做冠狀切面，在4%多聚曱醛中固定過夜，PBS(mM:NaCl154,Na2HP0412H2019.5，NaH2P042H203.6)中洗3xl0min;;改入濃度分別為5%、10%、15%的蔗糖PBS中各30min梯度脫水以防水晶形成及利于保存，再于20%蔗糖PBS液中于4。C冰箱過夜；組織塊PBS中洗5min3次，組織埋入0.C.T(SAKURA，U.S.A.)中包埋，迅速冷凍；冰凍切片機(jī)(LeicaCM1900,德國)切片，厚度8jum，兩種血管取冠狀切面，基底動脈切片位置取上1/3段。切片經(jīng)冰丙酮后固定15min，室溫自然晾干。用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，用H-600透射電鏡(Hitachi，日本)觀察。注意根據(jù)目測選取矩形的和最薄的切片。1.1.4細(xì)胞培養(yǎng)6參照文獻(xiàn)(Guanetal,1998),我們從大鼠基底動脈上分離培養(yǎng)了基底動脈平滑肌細(xì)胞(BASMCs)。體重180-200克的Sprague-Dawley大鼠被麻醉后斷頭處死，快速取出基底動脈并浸入Kreb溶液(含有NaCl137,KC15.4，CaCl22.0，MgCl2'6H201.1,NaH2P04.2H200.4，Glucose'H2O5.6,NaHC0311.9，penicillin(青霉素)105U/L,streptomycin(鏈霉素)100mg/L,單位mM)。小心剝離與動脈粘連的結(jié)締組織和脂肪組織，然后將動脈切成長約2mm的小段，置于添加了20%胎牛血清的D-MEM/F-12培養(yǎng)液中，在37。C，5%C02環(huán)境下培養(yǎng)。在培養(yǎng)條件下，BASMCs從組織段移行生長，并可進(jìn)行傳代。通過對平滑肌a-肌動蛋白抗體的陽性反應(yīng)驗(yàn)證BASMCs。傳至8~15代的BASMCs可用于試驗(yàn)。1.1.5平滑肌細(xì)胞增殖MTT(四曱基偶氮唑鹽)測定和BrdU(胸腺嘧啶)摻入)實(shí)驗(yàn)證明在MTT測定前，BASMCs置于96孔板中培養(yǎng)，并用0.5%FCS處理24h,使細(xì)胞靜止在G0/G1期。靜止期細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48h,這一培養(yǎng)過程中，可以加入各種濃度的治療藥物。在添加內(nèi)皮素-1之前0.5h力口入化合物(I)。MTT測定中使用20^1MTT(用生理緩沖液PBS配成5mg/ml)檢測細(xì)胞活力。BASMCs作為對照組(對照組的細(xì)胞活力規(guī)定為100%)?；衔?I)對內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)BASMCs增殖的抑制作用通過比較Rd治療組和內(nèi)皮素-1處理組的吸光率得出。在BrdU摻入實(shí)驗(yàn)中，加入BrdU標(biāo)記試劑后，細(xì)胞凈皮固定并用BrdU抗體進(jìn)行免疫熒光分析。結(jié)果用BrdU陽性反應(yīng)率表示。規(guī)定對照組的BrdU摻入率為100%。為了排除可能的毒性，分別將丙二醇和化合物(I)添加到血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基中，并檢測細(xì)胞活性。結(jié)果表明此次研究中使用的濃度對細(xì)胞沒有毒性。1.1.6流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期的狀態(tài)可以用流式細(xì)胞計量術(shù)(ZhangHN,ZhouQiuQY,RenJL,GuanYY.2006;ClC-3chloridechannelpreventsapoptosisinducedbythapsigargininPC12cells.Apoptosis.ll(3):327-36.)。培養(yǎng)的BASMCs用0.5%FCS處理24h，使細(xì)胞靜止在G0/G1期。向靜止期細(xì)胞加入各種藥物，繼續(xù)培養(yǎng)48h(在添加內(nèi)皮素-l之前0.5h加入化合物(1)}。48h之后，將培養(yǎng)的BASMCs在1000rpm、4。C條件下離心5min。沉淀用冰PBS沖洗一次，并用70%乙醇固定24h。樣品于室溫下用染色液(50昭/mlpropidiumiodide(碘化丙咬)，10嗎/mlRNA酶A，0.1%檸檬酸鈉，0.1%TritonX-100(曲拉通X-100)，溶于PBS)染色30min，然后用40|nm濾膜過濾。用流式細(xì)胞測定器分析DNA含量，得出處于細(xì)胞周期中每個階段的細(xì)胞比例。1.1.7測量Mn2+的Fura-2熒光淬滅來4企測SOCC,ROCC,VDCC內(nèi)皮素-1激活SOCC,ROCC和VDCC介導(dǎo)的Ca"內(nèi)流可以用Mn2、々Fura-2熒光淬滅反應(yīng)定量測量(Guanetal,2006)。室溫下將BASMCs置于含有2|liMfiira-2/AM(Guan，YY"Zhou，J.G.,Zhang,Z"Wang,G丄"Cai,B.X.,Hong,L.,Qiu，Q.Y"He，H.，2006.Ginsenoside-RdfrompanaxnotoginsengblocksCa2+influxthroughreceptor-andstore-operatedCa2+channelsinvascularsmoothmusclecells.Eur丄Pharmacol548,129-136.)的DMEM/F12培養(yǎng)基中孵育45min。細(xì)胞外ftira-2/AM用生理溶劍含有NaCl130，KC15,MgCl21,CaCl21.3,HEPES(4-羥乙基哌。秦乙磺酸)20,glucose10,0.1%牛血清白蛋白BSA,pH7.4，單位mM]沖洗。然后用無Ca2+HBSS[含有NaCl127，KC15，MgCl22,NaH2P040.5,NaHC035,HEPES10,Glucose10,0.1%BSA,0.05EGTA(乙二醇二乙醚二胺四乙酸)，pH7.2,單位mM]重懸BASMCs。Fura-2熒光的激發(fā)波長是360nm,發(fā)射波長是510nm。熒光圖象的基線穩(wěn)定后，向小杯中注入500pMMn2+。測量得到Fura-2的最大熒光淬滅率。l丄8統(tǒng)計分析所有數(shù)據(jù)均用均值士標(biāo)準(zhǔn)誤表示。兩組之間使用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，多組之間使用方差分析的最小顯著差異法進(jìn)行比較(SPSSll.O)。P<0.05時認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.2.1血壓和基底動脈結(jié)構(gòu)參數(shù)未治療的雙腎雙夾組術(shù)后血壓進(jìn)行性升高(表1)。高血壓的發(fā)展過程符合這一模型的特征，化合物(I)治療沒有顯著降低升高后的血壓，化合物(I)Rd組、PG(丙二醇)組和兩腎兩夾高血壓組血壓沒有顯著差異(表1)。8表l、預(yù)防性給予Rd對兩腎兩夾高血壓大鼠的血壓的影響血壓(mmHg)1周4周8周12周假手術(shù)99.0±9.9102.5±8.9105.5±8.6106.5±9.4高血壓107.0±11.6146.0±15.8*172.5±14.7*200.5±15.3*卡托普利組98.5±6.799.0±8.8f98.0士7.5t97.5士10.3t溶媒對照組105.5±10.9140.1±15.9*169.1±17.4*195.8±18.7*Rd組107.5±9.2135.8±16.2*151.8±15.7*187.6±17.4**尸<0.01與假手術(shù)組比較；t尸O.01與腎兩夾高血壓組比較，動物數(shù)11=10。腦血管重構(gòu)是慢性高血壓的重要病理特征，也是腦卒中的主要原因之一。腦血管重構(gòu)的指標(biāo)依靠測量WD值、LD值、W/L值和CSA值。管壁直徑(WD)和管腔直徑(LD)的平均值術(shù)后8周內(nèi)保持不變。從第8周開始，兩腎兩夾高血壓組的WD值和LD值較相應(yīng)的Sham組為低。同時，管壁到管腔的區(qū)域比例(W/L)增加，兩腎兩夾高血壓組血管中膜橫截面積(CSA)平均值也有增加。表明雙腎雙夾易卒中高血壓大鼠腦基底動脈發(fā)生了內(nèi)向肥厚重構(gòu)，中膜層增厚，外腔徑減小。預(yù)防性給予化合物(I)有效逆轉(zhuǎn)兩腎兩夾易卒中高血壓大鼠的WD值、LD值、W/L值和CSA值改變，結(jié)果見表2。表2、預(yù)防性給予Rd對高血壓大鼠的動脈重構(gòu)的保護(hù)作用Parameters1week4weeks8weeks12weeks假手術(shù)組WD(nm)336±5333±4335±5358±5LD(拜)305±5303±4304±5320±5W/L(%)8.7±0.29.5±0.39.8±0.711.3±0.3CSA(拜2)15910±124715341±89615936±85320867±1123高血壓組WD(,)335±4327±5317±6*315±5卞(jim)305±4290±5*274±4卞260±3卞W/L(%)10.2±0.4*12.1士0.5卞13.1±0.5卞16.4±0.6卞9<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>WD，管壁直徑；LD,管腔直徑；W/L,管壁管腔比；CSA,血管中膜橫截面積^PO.05vs與假手術(shù)組比較，VO.Ol與假手術(shù)組比較，$P<0.05與溶媒對照組比較，§尸<0.01vs與溶媒對照組比較，n=20。1.2.2腦動脈的電鏡觀察根據(jù)電鏡觀察結(jié)果,術(shù)后第四周，兩腎兩夾高血壓組動脈血管中膜表現(xiàn)出肥大重構(gòu)，平滑肌細(xì)胞移行和增生，膠原纖維增加，上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(IEL)損害。術(shù)后第八周，隨著高血壓的發(fā)展，中膜平滑肌層顯著增厚。內(nèi)膜內(nèi)皮下區(qū)域聚集了大量平滑肌，細(xì)胞內(nèi)充塞著密集的膠原纖維，細(xì)胞排列混亂，形成疤痕結(jié)構(gòu)。在壞死的平滑肌中可見線粒體退化、線粒體嵴石皮壞、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成空泡。高血壓期間第12周，除了以上病理改變，還可以觀察到大量內(nèi)皮細(xì)胞(EC)壞死，細(xì)胞質(zhì)丟失，空泡形成，核固縮。中膜SMC壞死更為顯著，增大的細(xì)胞間隙內(nèi)充滿膠原纖維。預(yù)防性給予化合物(I)Rd能顯著改善高血壓中上述超微結(jié)構(gòu)的重構(gòu)。術(shù)后第8周，與相應(yīng)的兩腎兩夾高血壓組和PG組比較，Rd組表現(xiàn)出較輕的SMC混亂度，細(xì)胞間隙較小，較少膠原纖維充塞，線粒體空泡形成減少。術(shù)后第12周，Rd組基底動脈平滑肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的重構(gòu)明顯減輕。結(jié)果表明，化合物(I)有效地改善(減輕、降低)了高血壓的腦血管重構(gòu)。1.2.3化合物(I)對內(nèi)皮素-1引發(fā)的平滑肌細(xì)胞增殖和Ca^內(nèi)流的影響1.2.3.1內(nèi)皮素-1誘發(fā)BASMCs增殖的效果由MTT實(shí)驗(yàn)、BrdU摻入實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞^f義測定。內(nèi)皮素-1刺激BASMCs的DNA合成呈濃度依賴性(O.lnM到l|uM)。濃度為10nM時，內(nèi)皮素-1增強(qiáng)細(xì)胞活力，BrdU摻入分別達(dá)33。/。和38%。2.5pM化合物(I)Rd共培養(yǎng)對內(nèi)皮素-1引發(fā)的細(xì)胞增殖無影響(細(xì)胞活力對照組133±7%vs.Rd組130±6%;BrdU:對照組138±7%vs.Rd組136±4%,P〉0.05,n=5)。濃度為5,10,20,40pM時，化合物(I)Rd處理48h降低了細(xì)胞活力(規(guī)定對照組為100%),分別從133±7%到106±10%，94±8%和87±4%(P<0.01，n=5);減少了BrdU摻入(規(guī)定對照組為100%)，分別從138±7%到116±4%,115±4%,97±3%(P<0.01,n=5)。為排除化合物(I)Rd和丙二醇抑制BASMCs增殖的可能性，將細(xì)胞用含化合物(I)Rd的培養(yǎng)基孵育48h，兩個培養(yǎng)基中分別加入和不加丙二醇。結(jié)果顯示化合物(I)Rd和丙二醇對細(xì)胞活力和BrdU纟參入沒有顯著抑制作用(P〉0.05,t^5)如表3。表3、Rd對內(nèi)皮素誘導(dǎo)的腦血管平滑肌細(xì)胞增殖的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>空白對照的細(xì)胞存活率為100%，內(nèi)皮素1能引起細(xì)胞數(shù)目的增力口(細(xì)胞增殖)和BrdU摻入(細(xì)胞增殖)，Rd濃度依賴抑制細(xì)胞增殖(例數(shù)n=5)我們通過流式細(xì)胞儀檢驗(yàn)了化合物(I)Rd對內(nèi)皮素-1引發(fā)的BASMCs增殖的作用。10nM的內(nèi)皮素-1可以促進(jìn)BASMCs的細(xì)胞周期從G0/G1期轉(zhuǎn)變到S期，10nM內(nèi)皮素-1孵育組與對照組比較，G0/G1期的細(xì)胞數(shù)目顯著減少，S期細(xì)胞顯著增加(PO.01,r^5)。表明內(nèi)皮素-l誘發(fā)了BASMCs增殖。用10pM化合物(I)Rd處理后，內(nèi)皮素-1孵育組處于G0/G1期的細(xì)胞比例從65±2%上升到71±2%(P<0.05，n=5),處于S期的細(xì)胞比例從27±2%下降到18±2%(PO.01，n=5)?；衔?I)Rd處理組和未處理組處于G2/M期的細(xì)胞比例沒有顯著差異(ET-1:8土10/0vs.ET-1+Rd:11±2%，P>0.05，n=5)。上述結(jié)果表明化合物(I)Rd通過阻止細(xì)胞周期從G0/G1期進(jìn)入S期，抑制內(nèi)皮素-1引發(fā)的細(xì)胞增殖。1.2.3.2高血壓中BASMCs上不同Ca"內(nèi)流通路的變化BASMCs上不同Ca"內(nèi)流通路的變化可以用Mn"的熒光淬滅反應(yīng)定量測量。Thapsigargin(TG),l-oleoyl-2-acetyl畫sn-glycero1(OAG)和BayK8644引發(fā)的Mn"內(nèi)流作為評價Ca"內(nèi)流的指標(biāo)，相關(guān)的離子通道是SOCC(TG耗竭肌漿網(wǎng)Ca2+池)，ROCC(OAG直接引發(fā)受體操縱性Ca"內(nèi)流)和VDCC(BayK8644激動L-型Ca2+通道)(Guan,Y.Y"Zhou,J.G"Zhang，Z"Wang，G.L.，Cai，B.X.,Hong，L.,Qiu,Q.Y"He，H.,2006.Ginsenoside-RdfrompanaxnotoginsengblocksCa2+influxthroughreceptor-andstore-operatedCa2+channelsinvascularsmoothmusclecells.Eur.J.Pharmacol548,129-136.)。不同纟且在術(shù)后不同時間點(diǎn)BASMCs上Mn"的最大熒光淬滅率的數(shù)據(jù)表明，與相應(yīng)的對照組比較，隨著血壓的上升，SOCC、ROCC和VDCC介導(dǎo)的Mi^+內(nèi)流顯著增加。在高血壓組中，TG、OAG或BayK8644誘發(fā)的Mn"內(nèi)流增加與血壓水平之間有很好的相關(guān)性(11=24每組的不同試驗(yàn)使用10只大鼠，TGr=-0.97;OAQr二-0.88;BayK8644,r=-0.97;PO.OOOl.)?；衔?I)Rd治療有效降低了TG和OAG引發(fā)的Mn"熒光淬滅率。Rd組和假手術(shù)組比較，在不同時間點(diǎn)TG和OAG引發(fā)的M^+熒光淬滅沒有顯著性差異(PX).05)。BayK8644引發(fā)的Mn"+內(nèi)流(通過L-型VDCC)不受化合物(I)Rd治療的影響(P〉0.05)。說明了Rd對受體操縱Ca"通道及Ca"+池操縱Ca"通道有選擇性阻斷作用而對VDCC無影響。1.2.3.3我們通過Mn"熒光淬滅試驗(yàn)檢驗(yàn)了化合物(I)Rd對內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)的受體介導(dǎo)/Ca"池操縱性Ca"內(nèi)流。結(jié)果表明,加入lpM內(nèi)皮素-1時，Mn"熒光淬滅率從9士l。/。上升到43±2%(PO.01,n=8)?；衔?I)Rd顯著抑制了內(nèi)皮素-1激活的Mn"熒光淬滅，這種抑制作用呈濃度依賴性。當(dāng)濃度是10,20,40pM時，化合物(I)Rd分別將內(nèi)皮素-1激活的Mn"最大熒光淬滅率從43士3。/。降低到32±4%,30±4%,26±2%(表4)。表4、Mn2+淬滅試驗(yàn)結(jié)果Mn2+淬滅率(％)\^3于間(秒)組別306090120150180210空白對照01.7士0.23.4±0.54.7±16.0±0.77.6±1.68.5±1內(nèi)皮素1處理組015.1±5.324.0±7.529.8±735.4±638.6±642.5士7.2內(nèi)皮素1+RdlOpM09.2±1.715.8±2.320.7±2.726.3±2.929.8±3.432.3±4.4內(nèi)皮素1+Rd20pM09.5±3.115.1±3.220.1±2.924.8±3.828.1±3.230.2±4.1內(nèi)皮素l+Rd40^M08.3±2.312.8±2.217.6±2.121.8±1.424.8±0.825.8±1.7內(nèi)皮素1+Rd80nM06.0±2.310.6±2.614.7±3.318.5±4.020.1±4.320.8±3,9高血壓誘發(fā)腦卒中的過程中伴隨有腦動脈重構(gòu)，在體外用內(nèi)皮素-l(ET-l)誘導(dǎo)腦動脈平滑肌細(xì)胞增殖沖莫擬體內(nèi)的腦動脈細(xì)胞重構(gòu)，我們發(fā)現(xiàn)腦動脈平滑肌細(xì)胞增殖時，非電壓依賴性鈣通道活性增強(qiáng)，化合物(I)Rd可以逆轉(zhuǎn)細(xì)胞增殖過程中被激活的鈣通道。因此我們認(rèn)為藥物Rd通過糾正非電壓依賴性Ca"通道(ROCC及SOCC)活性增強(qiáng)，改善高血壓導(dǎo)致的腦動脈重構(gòu)。1.3結(jié)論實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，我們利用大鼠兩腎兩夾腎性高血壓易卒中模型，在造模開始，預(yù)防性給予化合物(I)能逆轉(zhuǎn)、延緩高血壓過程中的腦血管重構(gòu)，改善高血壓過程中腦動脈超微結(jié)構(gòu)的損害，抑制腦管平滑肌的細(xì)胞增殖和細(xì)胞周13期推進(jìn)。藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，兩腎兩夾腎性高血壓易卒中模型大鼠的非電壓依賴性的4丐通常異常增強(qiáng)，而化合物(I)能抑制這種異常。我們認(rèn)為，化合物(I)改善腦動脈重構(gòu)的作用機(jī)理是通過糾正高血壓過程中腦動脈平滑肌細(xì)胞的非電壓依賴性的鈣通道的異常而實(shí)現(xiàn)的。實(shí)施例2注射液實(shí)施例藥物與載體的配比(處方)化合物(I)100mg,丙二醇10ml，NaC10.9g,水90ml制法1)取化合物(I),用丙二醇溶解，過濾；2)取NaCl，溶于80ml水中，過濾；3)將化合物(I)丙二醇溶液力口入NaCl溶液中，加水至100ml;滅菌分裝成20支。實(shí)施例3復(fù)方注射液的制備處方化合物(I)100mg，卡托普利100mg,丙二醇20ml,葡萄糖5g,水100ml制法1)取化合物(I)、卡托普利，用丙二醇溶解，過濾；2)取葡萄糖，加水80ml溶解，.過濾；3)將步驟l)的濾液緩慢加入葡萄糖水中，攪勻，添加水至全量，滅菌分裝，即得。實(shí)施例4復(fù)方片劑的制備處方化合物(I)100mg，卡托普利100mg,氫氯瘞。秦100mg制法1)取上述藥物，用淀粉制粒，烘干；2)添加適量滑石粉，硬脂S臾鎂，壓片機(jī)壓片；3)包透明薄膜衣。本發(fā)明不限于上述實(shí)施例。權(quán)利要求1、化合物(I)在制備改善高血壓的腦血管重構(gòu)藥物中的應(yīng)用。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物(I)在制備改善高血壓的腦血管重構(gòu)藥物中的應(yīng)用，其特征在于劑型為注射液或粉針劑。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物(I)在制備改善高血壓的腦血管重構(gòu)藥物中的應(yīng)用，其特征在于劑型為口服劑型。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物(I)在制備改善高血壓的腦血管重構(gòu)藥物中的應(yīng)用，其特征在于化合物(I)與其它藥物復(fù)方制成復(fù)方制劑。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物(I)在制備改善高血壓的腦血管重構(gòu)藥物中的應(yīng)用，其特征在于制劑包括化合物(I)以及藥學(xué)上可接受的載體或者賦形劑。全文摘要化合物(I)在制備改善高血壓的腦血管重構(gòu)藥物中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，我們利用大鼠兩腎兩夾腎性高血壓易卒中模型，在造模開始，預(yù)防性給予化合物(I)能逆轉(zhuǎn)、延緩高血壓過程中的腦血管重構(gòu)，改善高血壓過程中腦動脈超微結(jié)構(gòu)的損害，抑制腦管平滑肌的細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期推進(jìn)。文檔編號A61K31/704GK101485670SQ200810220218公開日2009年7月22日申請日期2008年12月22日優(yōu)先權(quán)日2008年12月22日發(fā)明者關(guān)永源申請人:廣州中大中山醫(yī)科技開發(fā)有限公司