專利名稱：：一種制備基因工程N-乙酰化胸腺素α1的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種制備基因工程N-乙?；叵偎豠1的方法。
背景技術(shù)：
：胸腺素a是一族具有相同或相似N-端序列的免疫調(diào)節(jié)多肽，包括胸腺素a原、胸腺素a1和胸腺素a11等。其中，胸腺素a1和胸腺素a11是胸腺素a原在體內(nèi)降解的產(chǎn)物。天然來源的胸腺素a的N-端都具有N-乙?；揎棧琋-乙?；揎棇π叵偎豠1的體內(nèi)穩(wěn)定性具有重要作用。采用化學(xué)方法合成的N-乙?；叵偎豠1已經(jīng)上市，商品名為"日達仙"，用于治療病毒性肝炎等，療效顯著。但是采用化學(xué)方法合成N-乙酰化胸腺素al成本高、污染大，制約了該藥的廣泛使用。利用基因工程大腸桿菌制備多肽具有成本低、安全性好、適合于規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)勢，但利用大腸桿菌生產(chǎn)的多肽一般沒有N-乙?；揎棧虼四壳耙呀?jīng)報道的基因工程方法制備的胸腺素al均為非乙?；摹Ｄ壳耙寻l(fā)現(xiàn)用基因工程大腸桿菌可以制備N-乙?；叵偎豠原(WuJ，ChangS，GongX，LiuD，Ma.Q.IdentificationofN_terminalacetylationofrecombinanthumanprothymosinalphainEscherichiacoli.BiochimBiophysActa.2006;1760(8):1241-7.)，并發(fā)現(xiàn)將N-乙酰化胸腺素a原通過羥胺切割可以獲得N-乙?；叵偎豠1的類似物，但該N-乙?；叵偎豠1類似物的C-端為羥胺化修飾的，與天然的N-乙?；叵偎豠1的游離羧基端不同，這種不同，在N-乙?；叵偎豠l作為藥物時可能造成具有免疫原性、影響生物活性等問題。由于胸腺素a原具促進正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化和異常增生的作用，因此具有潛在的致瘤性(RodriguezP，Vi皿uelaJE.OverexpressionofprothymosinaacceleratesproliferationandretardsdifferentiationinHL_60cells.BiochemJ，1998，331:753-761.)，這種致瘤性是由胸腺素a原C端的核定位序列(TKKQKTDEDD)介導(dǎo)的，缺失或替換該C端核定位序列后，胸腺素a原就不再具有致瘤性(FreireJ，CoveloG，SarandesesC，etal.Identificationof皿clear—importandcell—cycleregulatoryproteinsthatbindtoprothymosinalpha.BiochemCellBiol，2001，79:123-31;StevenA，Enkemann，RHWang.FunctionalDiscontinuitiesinProthymosinaCausedbyCaspaseCleavageinApoptoticCells.JournalofCellularPhysiology,2000，182:256-68)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種制備基因工程N-乙?；叵偎豠1的方法。本發(fā)明所提供的制備N-乙?；叵偎豠1的方法，包括以下步驟1)用基因工程大腸桿菌制備含N-乙酰化胸腺素a1多肽序列的前體蛋白或多肽；2)內(nèi)肽酶酶切上述步驟1)的含N-乙?；叵偎豠1多肽序列的前體蛋白或多肽，純化得到N-乙?；叵偎豠1。上述方法中，所述含N-乙酰化胸腺素a1多肽序列的前體蛋白或多肽可以是含N-乙?；叵偎豠l多肽序列的融合蛋白或多肽，也可以是含N-乙?；叵偎豠l序列的N-乙?；叵偎豠原或其突變體。在保持N-乙酰化胸腺素a1序列不變的條件下，可以通過改變其它部分的序列來提高表達、方便純化和減少這些蛋白進入人體后潛在的副作用。上述方法中，所述含N-乙?；叵偎豠1多肽序列的融合蛋白或多肽，可以是為了方便N-乙?；叵偎豠1的表達和純化，在含N-乙酰化胸腺素a1多肽序列的蛋白或多肽上融合多聚組氨酸標(biāo)簽(Histag)、Myc標(biāo)簽、HA標(biāo)簽、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)或麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)等。具體可為N-乙酰化胸腺素a1與谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶形成的融合蛋白。這些標(biāo)簽序列的編碼基因可以用人工合成的方法制備，也可以從商業(yè)化的載體上獲得，這些標(biāo)簽序列的編碼基因與上述含N-乙酰化胸腺素a1多肽序列的蛋白或多肽的編碼序列可以用常規(guī)的分子生物學(xué)方法連接，如用連接酶連接或PCR方法等。上述方法中，所述胸腺素a原突變體，是至少滿足下述條件之一的多肽1)缺失序列表中序列3的自氨基末端第100-109位的氨基酸殘基；2)將序列表中序列3的自氨基末端第100-109位這10個氨基酸殘基中至少一個氨基酸殘基進行替換；3)將序列表中序列3的自氨基末端第36位和第43位均由甘氨酸替換為丙氨酸；4)將序列表中序列3的自氨基末端第35位、第37位、第39位、第42位和第49位這5個位置的Asn中的至少一個替換或缺失；5)缺失序列表中序列3的自氨基末端第32-52位的氨基酸殘基；6)缺失序列表中序列3的自氨基末端第69-109位的氨基酸殘基。上述胸腺素a原變異體是下述多肽之一1)是由缺失序列表中序列3的自氨基末端第100-109位的氨基酸殘基得到的多肽，其氨基酸序列如序列表中序列4所示；2)是將序列表中序列3的自氨基末端第100-109位這10個氨基酸殘基中至少一個氨基酸殘基進行替換得到的多肽；3)是將序列表中序列3的自氨基末端第36位和第43位均由甘氨酸替換為丙氨酸得到的多肽，其氨基酸序列如序列表中序列5所示；4)是將序列表中序列3的自氨基末端第35位、第37位、第39位、第42位和第49位這5個位置的Asn中的至少一個替換或缺失得到的多肽；5)是由缺失序列表中序列3的自氨基末端第32-52位的氨基酸殘基得到的多肽；6)是由缺失序列表中序列3的自氨基末端第32-52位和第69-109位的氨基酸殘基得到的多肽，其氨基酸序列如序列表中序列9所示。上述方法中，所述N-乙酰化胸腺素a1是指至少具有一種與天然或化學(xué)合成的N-乙?；叵偎豠l相同或相似的免疫調(diào)節(jié)功能，且序列與其同源的多肽。不同哺乳動物來源的N-乙?；叵偎豠1的序列略有差別，且即使是人源的胸腺素a1也存在一定的序列多態(tài)性，如大多數(shù)人的胸腺素a1具有序列表中序列1的氨基酸序列(Goodall，G.J.，Dominguez，F(xiàn).，andHorecker，B丄MolecularcloningofcDNAforhumanprothymosin.ProcNatlAcadSciUSA.(1986)，83:8926-8928.)，但少數(shù)人的胸腺素a1的第13位蘇氨酸被異亮氨酸替代(RubtsovIuP，VartapetianAB.Newintronlessmembersofhumanprothymosinalphagenes.(1995)MolBiol(Mosk)29(6):1320-5)，即具有序列表中序列2的氨基酸序列。但這些序列略有差別的胸腺素al具有相同或相似的免疫調(diào)節(jié)功能。所述胸腺素al包括這些胸腺素al，優(yōu)選為與序列表中序列l(wèi)或序列2具有90X以上同源性的多肽，更優(yōu)選的為與序列表中序列1或序列2具有95%以上同源性的多肽，具體可為序列1或序列2的多肽。上述N-乙酰化胸腺素a原或其變異體的氨基酸序列如序列3-9所示，其編碼基因的核苷酸序列如序列表中序列10-18所示。這些變異體具有以下優(yōu)點1)序列3的自氨基末端第100-109位的氨基酸殘基為胸腺素a原的C_端核定位序列。由于胸腺素a原具有促進正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化和異常增生的作用，因此具有潛在的致癌性。這種促細(xì)胞異常增生的作用是通過胸腺素a原C端核定位序列介導(dǎo)的核定位發(fā)生的，去除或改變了C端核定位序列的胸腺素a原不再具有致瘤性，而且又不影響N-乙?；叵偎豠1的制備，因而即使在最后的N-乙?；叵偎豠1制品中含微量的胸腺素a原也不會存在安全隱患，因而明顯提高了本發(fā)明方法產(chǎn)物的臨床適用性。2)胸腺素a原序列上除第28位的天冬酰胺(N28)位點外，還有N35、N37、N39、N42和N49等多個天冬酰胺位點，這些位點均可以被天冬酰胺內(nèi)肽酶切割，因此切割產(chǎn)物較為復(fù)雜，純化困難。本發(fā)明提供了用這些位點突變或缺失(如序列表中序列3的自氨基末端第32-52位的氨基酸殘基的缺失)的胸腺素a原制備N-乙?；叵偎豠l的方法，使切割產(chǎn)物的復(fù)雜性明顯降低，方便了純化。3)G36A和G43A突變可以提高胸腺素a原的表達水平，從而提高N-乙?；叵偎豠1的生產(chǎn)效率。4)去除了部分胸腺素a原中的非胸腺素al部分的序列，提高了表達的蛋白或多肽中N-乙?；叵偎豠1的比例(如序列表中序列3的自氨基末端第69位以后的氨基酸殘基的缺失)。上述N-乙?；叵偎豠原或其變異體的編碼基因可以用PCR、RT-PCR、人工合成或構(gòu)建篩選cDNA文庫等方法獲得，用作PCR模板和用于構(gòu)建cDNA文庫的mRNA或cDNA可以來源于任何含有相應(yīng)mRNA或cDNA的組織、細(xì)胞及文庫等，如從人胚胎胸腺獲得；也可以用人工合成的方法獲得，人工合成時可選用宿主偏愛的密碼子，這樣可以提高產(chǎn)物的表達?？捎矛F(xiàn)有的PCR、酶切連接等方法對多聚核苷酸進行突變、缺失、插入或與其它多聚核苷酸連接等。本發(fā)明的制備N-乙酰化胸腺素a1的方法中，所述N-乙?；叵偎豠原或其變異體是將含有N-乙?；叵偎豠原或其變異體的編碼基因?qū)氡磉_載體中構(gòu)建重組表達載體，再將構(gòu)建好的重組表達載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中表達得到的；所述表達載體上可以帶有復(fù)制位點、篩選標(biāo)記等，具體可為PET系列、PBV220載體等，所述表達載體上還可以帶有各種誘導(dǎo)型或組成型啟動子，具體可為誘導(dǎo)型啟動子，這樣有利于提高重組大腸桿菌的穩(wěn)定性。其中誘導(dǎo)型啟動子具體可為化學(xué)誘導(dǎo)啟動子，如T7、Lac、Tac、Trp等及溫敏啟動子，如PLPR啟動子。所述宿主細(xì)胞可為大腸桿菌細(xì)胞，如DH5a、BL21(DE3)等。重組大腸桿菌細(xì)胞具有生長快、培養(yǎng)成本低廉、易于大規(guī)模生產(chǎn)、已成功用于大量重組藥用蛋白的生產(chǎn)等優(yōu)6勢，因此在工業(yè)生產(chǎn)上具有明顯的優(yōu)勢。可以用搖瓶或生物反應(yīng)器等培養(yǎng)上述重組菌，生產(chǎn)時具體可使用生物反應(yīng)器；培養(yǎng)基應(yīng)能提供菌體生長和產(chǎn)物表達所需的各種營養(yǎng)物質(zhì)，包含氮源、碳源、PH緩沖成份等。重組菌的培養(yǎng)分兩個階段，第一階段主要用于菌體的生長，第二階段主要用于合成產(chǎn)物。從培養(yǎng)物中分離含N-乙?；叵偎豠l多肽序列的蛋白或多肽的方法可以用各種蛋白分離的方法，如破菌、萃取、沉淀、超濾、液相層析等技術(shù)及這些技術(shù)的組合。液相層析可以用離子交換、凝膠排阻、親和、疏水、反相等層析技術(shù)。本發(fā)明所提供的制備基因工程N-乙?；叵偎豠1的方法中，所述內(nèi)肽酶為天冬酰胺內(nèi)肽酶，天冬酰胺內(nèi)肽酶是一類廣泛存在于生物界的內(nèi)肽酶，又被稱為leg咖ain或VPE(vacuolarprocessingenzyme)，它特異性切割多肽或蛋白中天冬酰胺的C端，在植物、動物中均有發(fā)現(xiàn)，Abe，Y(JBC1993，3525-3529)報道了從刀豆(canavaliaensiformis)種子中提取天冬酰胺內(nèi)肽酶的方法及刀豆天冬酰胺內(nèi)肽酶的核苷酸和氨基酸序列(GenBankL05515)。Dalton，JP(Parasitology,1995，111:575-580)等報道了曼森血吸蟲(Schistosomamansoni)的天冬酰胺內(nèi)肽酶，chenJM(JBC1997，272:8090-8098)報道了人的天冬酰胺內(nèi)肽酶。各物種的天冬酰胺內(nèi)肽酶的編碼序列及其對應(yīng)的氨基酸序列可以從美國國立衛(wèi)生研究院的GenBank或歐洲的EMBL等公開的基因或蛋白數(shù)據(jù)庫中直接獲得(在GenBank中人、小鼠、大鼠的天冬酰胺內(nèi)肽酶基因收錄號分別為NM_005606、NM_011175、NM_022226)?；蛘吒鶕?jù)人、曼森血吸蟲、刀豆等物種的天冬酰胺內(nèi)肽酶序列，在上述數(shù)據(jù)庫中通過同源比對獲得。本發(fā)明優(yōu)選的天冬酰胺內(nèi)肽酶為人天冬酰胺內(nèi)肽酶。天冬酰胺內(nèi)肽酶可以用基因工程制備或從各物種提取，優(yōu)選的是用基因工程方法制備，包括用基因工程酵母、昆蟲細(xì)胞、大腸桿菌或哺乳動物細(xì)胞等制備得到。其中用基因工程酵母制備天冬酰胺內(nèi)肽酶具有表達水平高、蛋白可溶、不需要復(fù)性、制備成本低廉、適合于規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)勢。天冬酰胺內(nèi)肽酶可以先以酶原形式制備，以提高其在表達和制備過程中的穩(wěn)定性，使用前通過調(diào)節(jié)溶液的PH至酸性，使其自活化。為了提高酶活性、表達量、穩(wěn)定性及方便酶純化等，天冬酰胺內(nèi)肽酶還可以進行替換、缺失和融合等改造。本發(fā)明制備的N-端乙?；揎椥叵偎豠l還可以有各種衍生物，這些衍生物可以但不局限于其不同形式的鹽或修飾產(chǎn)物等。所述修飾劑可以但不局限于聚乙二醇、葡聚糖或及其衍生物等。本發(fā)明制備的N-端乙?；揎椥叵偎豠1可用于制備治療和/或預(yù)防各種傳染病和腫瘤的藥物，如治療和/或預(yù)防病毒性肝炎、流行性感冒或肝癌等。本發(fā)明的制備基因工程N-乙酰化胸腺素a1的方法具有成本低廉，適合于規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點，制備的基因工程N-乙?；叵偎豠1具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。圖1為N-乙?；叵偎豠原粗制品的SDS-PAGE分析結(jié)果。圖2為N-乙?；叵偎豠原粗制品的RP-HPLC分析結(jié)果。圖3為人天冬酰胺內(nèi)肽酶原活化分析。圖4為人天冬酰胺內(nèi)肽酶對胸腺素a原切割效果分析。圖5為N-乙?；叵偎豠1純化的色譜圖。圖6為N-乙酰化胸腺素a1的RP-HPLC分析。圖7為利用本發(fā)明方法制備的N-乙?；叵偎豠1的質(zhì)譜分子量分析圖8為天然基因和人工合成基因表達C-端缺失或G36A和G43A替換的胸腺素a原變異體的工程菌的SDS-PAGE分析。圖9為用人工合成基因表達自氨基末端第32-52位區(qū)段缺失或截短的G36A和G43A替換的胸腺素a原變異體的工程菌的SDS-PAGE分析。圖10為以del53/G68胸腺素a原變異體為原料制備的N_乙?；叵偎豠1的純化色譜圖。圖11為以del53/G68胸腺素a原變異體為原料制備的N_乙?；叵偎豠1的RP-HPLC分析。具體實施例方式實施例1、以N-乙酰化胸腺素a原制備N-乙?；叵偎豠1實驗中的pfu酶、內(nèi)切酶、連接酶、試劑盒等均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司和北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司。1、表達N-乙?；叵偎豠原的基因工程菌的構(gòu)建取流產(chǎn)的人胎兒胸腺，用總RNA制備試劑盒，按試劑盒提供的方法制備總RNA;用RT-PCR試劑盒，按試劑盒提供的方法將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA;以該cDNA為模板，以Protl:5，-CCCATATGTCTGATGCAGCTGTAGATACC-3，和Prot2:5，-CGGGATCCCTAGTCATCCACGTCGGTCTTCTG-3'為引物，PCR擴增胸腺素的cDNA。100y1反應(yīng)體系中加入1P1cDNA，20ymol/L的Protl、Prot2引物各3ii1，2,1/L的dNTP10ul，10X反應(yīng)緩沖液10ul，pfuDNA聚合酶5U。用Perk-Elmer公司的9600PCR儀，PCR條件為先94。C變性1分鐘，然后52。C退火30秒，最后72t:延伸1分鐘，共35個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物純化回收后用Ndel和BamHI進行雙酶切，酶切產(chǎn)物與經(jīng)同樣酶切的載體PET22b(購自Novagen公司)相連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞(購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司)，用含氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆。對陽性克隆進行酶切鑒定并測序，測序結(jié)果表明，擴增得到的胸腺素基因與天然人胸腺素a原(其脫氧核糖核苷核酸序列如序列表中序列10所示，所編碼的氨基酸殘基序列如序列表中序列3所示)的序列一致，將得到的重組質(zhì)粒命名為pET-NproT，將得到的陽性克隆命名為BL21(DE3)(pET-NproT)。將BL21(DE3)(pET-NproT)單菌落接種于100mlLB液體培養(yǎng)基中，37。C搖床培養(yǎng)過夜，然后轉(zhuǎn)接至含3L培養(yǎng)基(酵母抽提物10g/L，胰蛋白胨10g/L，磷酸二氫鈉20mM，磷酸氫二鈉30mM，葡萄糖10g/L)的B5發(fā)酵罐中(購自德國貝朗公司)，37。C培養(yǎng)，通過攪拌和通氣控制溶氧大于20%。培養(yǎng)4h后，加入3ml0.2mol/L的IPTG誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)4-8h，發(fā)酵液離心，收集菌體。將收集的菌體用水重懸(每克菌加10ml水)，超聲波破壁，離心收集上清，在上清液中加入冰乙酸調(diào)節(jié)pH至4.5，靜置30分鐘，離心收集上清，即為含有N-乙?；叵偎豠原的粗提液。將該粗提液用SPFF①2.5X30cm柱(介質(zhì)購自美國GE公司，空柱購自華美實驗儀器廠)進行純化。具體條件為A液(20mM乙酸鈉和乙酸組成的緩沖液，pH4.5)，B液(A液+1MNaCl)，SPFF柱先用A液平衡，然后從A通道將上述含有N_乙?；叵偎豠原的粗提液上樣至SPFF柱中，再用A液洗去未結(jié)合的蛋白，最后在0—30分鐘A從100%8—0%;8從0%—100%線性梯度洗脫，分段收集洗脫液。將收集到的各級份洗脫液取樣作SDS-PAGE分析，合并含12KDa胸腺素a原的洗脫液(30%-60%B洗脫液中)，獲得N-乙酰化胸腺素a原的粗制品，取樣作SDS-PAGE和RP-HPLC分析，結(jié)果如圖l和圖2所示。圖l為SDS-PAGE結(jié)果，其中，l為N-乙?；叵偎豠原的粗制品，2為分子量標(biāo)準(zhǔn)。RP-HPLC分析采用HP1090高壓液相色譜儀，C18柱(4.6X250mm，中科院大連化學(xué)物理所，A液為含0.1%TFA(體積百分含量)的純水；B液為含O.1%TFA(體積百分含量)的色譜純乙腈，梯度洗脫Omin，A液100%，B液OX30min，A液10%，B液90%)，RP-HPLC結(jié)果如圖2所示。其中，A峰為非乙?；叵偎豠原，B峰為N-乙?；叵偎豠原(WuJ，ChangS，GongX，LiuD，Ma.Q.IdentificationofN_terminalacetylationofrecombinanthumanprothymosinalphainEscherichiacoli.BiochimBiophysActa.2006;1760(8):1241-7.)。結(jié)果表明，上述得到的胸腺素a原粗制品中，70X以上為N-乙?；叵偎豠原。2、制備天冬酰胺內(nèi)肽酶取人肝癌細(xì)胞H印G2(購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)，用總RNA制備試劑盒，按試劑盒提供的方法制備總RNA，用RT-PCR試劑盒，按試劑盒提供的方法將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以該cDNA為模板，以legl:5，-AGAGTCGACAAAAGAGTTCCTATAGATGATCCTGAAG_3，禾Pleg2:5'-TATGTCGACGCGGCCGCTTAGTAGTGACCAAGGCACACGTG-3'為引物，PCR擴增人天冬酰胺內(nèi)肽酶原基因的cDNA。50iU反應(yīng)體系中加入liilcDNA，20iimol/L的legl、leg2引物各liil，2.5mmol/L的dNTP4ul，10X反應(yīng)緩沖液5ul，pfuDNA聚合酶5U。用Perk-Elmer公司的9600PCR儀，PCR條件為先94。C變性1分鐘，然后52。C退火30秒，最后72。C延伸2分鐘，共35個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物純化回收后用XhoI和NotI進行雙酶切，酶切產(chǎn)物與經(jīng)同樣酶切的載體pPIC9(購自Invitrogen公司)相連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，用氨芐青霉素篩選抗性菌落，對陽性克隆提取質(zhì)粒進行測序。將測序結(jié)果與人天冬酰胺內(nèi)肽酶原基因(序列表中序列19)的核苷酸序列一致的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115(購自Invitrogen公司)，采用MD培養(yǎng)基(1.34%YNB(質(zhì)量百分含量)，4X10—5%生物素(質(zhì)量百分含量)，2%葡萄糖(質(zhì)量百分含量)，1.5%瓊脂(質(zhì)量百分含量))平板進行篩選；然后將轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)至YPD培養(yǎng)基(1%酵母提取物(質(zhì)量百分含量)，2%蛋白胨(質(zhì)量百分含量)，2%葡萄糖(質(zhì)量百分含量))中，3(TC條件下250rpm培養(yǎng)24h;然后再以4X(體積百分含量)的接種量接種于25mLBMGY(1X酵母提取物(質(zhì)量百分含量)，2%蛋白胨(質(zhì)量百分含量)，1%甘油(質(zhì)量百分含量)，1.34%YNB(質(zhì)量百分含量)，4X10—5%生物素(質(zhì)量百分含量)，100mMpB，p朋.0)培養(yǎng)基中，3(TC250rpm培養(yǎng)24h，然后在培養(yǎng)基中加入甲醇，使其在培養(yǎng)基中的體積百分含量達O.05%，進行適應(yīng)性誘導(dǎo)；12h后再將培養(yǎng)基中的甲醇含量升至0.5%進行誘導(dǎo)，其后每隔12h每升培養(yǎng)基中補加5ml甲醇；誘導(dǎo)72h后，離心取上清，SDS-PAGE電泳分析，取表達量較高的克隆作為制備人天冬酰胺內(nèi)肽酶原的基因工程酵母。取上述基因工程酵母的單克隆，接種到5mlYPD培養(yǎng)基中，3(TC250rpm培養(yǎng)24h;然后以2X的接種量接種于200mLYPD培養(yǎng)基中，3(TC250rpm培養(yǎng)24h;再以5%的接種量接種于4LBMGY培養(yǎng)基中，3(TC250rpm培養(yǎng)24h;最后在培養(yǎng)基中加入甲醇，使其在培養(yǎng)基中的體積百分含量達O.5%，進行誘導(dǎo)；其后每隔12h每升培養(yǎng)基中補加5ml甲醇；誘導(dǎo)72h9后，離心取上清，用冰乙酸調(diào)pH至5.5，用SPFF①5.0X30cm柱(介質(zhì)購自美國GE公司，空柱購自華美實驗儀器廠購自GE公司)純化。具體條件為A液(20rnM乙酸鈉和乙酸組成的緩沖液，PH5.0)，B液(A液+iMNaCl)各2L，SPFF柱先用A液平衡，然后從A通道將上述含有人天冬酰胺內(nèi)肽酶原的培養(yǎng)上清上樣至SPFF柱中，再用A液洗去未結(jié)合的蛋白，最后在0—30分鐘A從100%—0%;B從0%—100%線性梯度洗脫，收集紫外吸收主峰(50-70%B)即為人天冬酰胺內(nèi)肽酶原。取上述收集到的濃度為0.lmg/ml的人天冬酰胺內(nèi)肽酶原1ml，加入0.lmllmol/LpH4.5檸檬酸鈉溶液、1P1lmol/LDTT，37。C孵育，分別于0.25、1和2小時取樣進行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖3所示。其中，人天冬酰胺內(nèi)肽酶原由416個氨基酸組成，有4個^糖基化位點，分子量約為56KDa;而活化的人天冬酰胺內(nèi)肽酶由298個氨基酸組成，分子量約為46KDa。結(jié)果表明，隨著孵育時間的增加，56KDa的人天冬酰胺內(nèi)肽酶原逐漸減少，46KDa的人天冬酰胺內(nèi)肽酶逐漸增加，2小時后人天冬酰胺內(nèi)肽酶原基本轉(zhuǎn)化為活性形式的人天冬酰胺內(nèi)肽酶。3、以N-乙?；叵偎豠原制備N_乙?；叵偎豠1將上述步驟2的活化2小時的lml人天冬酰胺內(nèi)肽酶加入到50ml上述步驟1的N-乙?；叵偎豠原粗制品溶液中，再加5mllmol/LpH4.5檸檬酸鈉和50lmol/LDTT，37°C孵育切割N-乙?；叵偎豠原，分別于0.25、1和4小時取樣進行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖4所示。其中，1、2、3分別為孵育0.25、1和4小時的樣品，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)。其余樣品孵育過夜。結(jié)果表明，隨著孵育時間的增加，N-乙?；叵偎豠原逐漸減少，而生成了N-乙?；叵偎豠l。4、N_乙?；叵偎豠1的純化及鑒定取上述步驟3的經(jīng)過天冬酰胺內(nèi)肽酶酶切的反應(yīng)液，用C18①2.0X20cm柱(購自大連化學(xué)物理研究所)進行純化，A液為水+0.1%體積百分含量TFA，B液為50%體積百分含量乙腈+0.1%體積百分含量TFA的水溶液。先用A液平衡，然后以5ml/min的流速上樣，上樣完成后，再用A液平衡，然后進行線性梯度洗脫，程序為0—5分鐘A液從100%—70%，B液從0%—30%;5—20分鐘A液從70%—40%，B液從30%—60%。214nm紫外檢測，色譜圖見圖5所示。收集40-45%B組份為制備的N-乙酰化胸腺素a1。采用C18。4.6X250mm柱(購自大連化學(xué)物理所)，A液(水+0.1%體積百分含量三氟乙酸)，B液(乙腈+0.1%體積百分含量三氟乙酸)。HP1090色譜儀，梯度洗脫0—5min，B液0%—15%，A液100%—85%;5—20min，B液15%—30%，A液85%—70%;20—25min，B液30X—100X，A液70X—0%;25—26min，B液100%。參考品為化學(xué)合成的N-乙?；叵偎豠1(商品名Zadaxin，購自解放軍302醫(yī)院)，濃度160yg/ml，上樣量均為10ul。結(jié)果如圖6所示。其中，A為N-乙?；叵偎豠l參考品的色譜圖，保留時間為15.4分鐘，B為上述步驟3純化后的N-乙?；叵偎豠1。其在HPLC上的保留時間也是15.4分鐘，說明純化的是^乙?；叵偎豠l，且該組份為均一的單峰(5分鐘前的峰為純化組份中的鹽和乙酸的吸收峰)。進一步將A、B溶液以1:1的體積比混合后再用HPLC分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其為均一的單峰(C)，說明兩者為同一物質(zhì)。將上述步驟3制備的N-乙?；叵偎豠1作Edman降解法測序，結(jié)果未能測到降解的氨基酸峰，說明樣品的N-端已被修飾。測定上述步驟3制備的N-乙?；叵偎豠1的質(zhì)譜分子量(國家生物醫(yī)學(xué)分析中心分析)，結(jié)果如圖7所示。結(jié)果表明其分子量為3107.66，與N-乙?；叵偎豠1的理論分子量3107.33—致(差別小于儀器誤差I(lǐng)Da)，比非乙?；叵偎豠1的理論分子量3065Da大42Da(乙酰基修飾的分子量)。表明上述步驟3制備的為N-乙?；叵偎豠1。實施例2、N-乙酰化胸腺素a1(Ilel3)(序列表中序列2)的制備以上述實施例1構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-NproT為模板，以Prot3:5'-cccatatgtctgatgcagctgtagataccagctccgaaatcaccatcaaggactta-3，禾口Prot2為弓|物，進行PCR擴增，獲得的脫氧核糖核苷酸序列所編碼的氨基酸殘基為自氨基末端第13位氨基酸為異亮氨酸的胸腺素a原，將該基因命名為NproT(Ile13)。采用與上述實施例1相同的方法將NproT(Ile13)插入到載體PET22b的Ndel和BamHI酶切位點間，得到重組質(zhì)粒pET-NproT(Ilel3);再將重組質(zhì)粒pET-NproT(Ilel3)轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，采用與上述實施例l相同的篩選方法得到重組大腸桿菌BL21(DE3)(pET-NproT(Ilel3))，培養(yǎng)BL21(DE3)(pET-NproT(Ilel3))，表達得到自氨基末端第13位為異亮氨酸的N-乙?；叵偎豠原。將得到的自氨基末端第13位為異亮氨酸的N-乙?；叵偎豠原用上述實施例l步驟2制備的天冬酰胺內(nèi)肽酶進行酶切，純化獲得N-乙?；叵偎豠l(Ilel3)。具體方法同實施例1。實施例3、用天然基因和人工合成基因表達C-端缺失和/或自氨基末端第36位由G替換為A、自氨基末端第43位由G替換為A的胸腺素a原變異體，制備N_乙?；叵偎豠11、表達C-端缺失的胸腺素a原變異體的工程菌的構(gòu)建以上述實施例1構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-NproT為模板，以Protl和Prot4:5'-gtggatccttaATCGACATCGTCATCCTCATC-3'為引物，PCR擴增獲得C_端缺失的胸腺素a原變異體的基因(NproT-C)，其脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列l(wèi)l所示，其編碼的氨基酸序列如序列表中序列4所示。采用與上述實施例1相同的方法將NproT-C插入到載體PET22b的BamHI和Ndel酶切位點間，得到重組質(zhì)粒pET-NproT-C;再將重組質(zhì)粒pET-NproT-C轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，采用與上述實施例1相同的篩選方法得到重組大腸桿菌BL21(DE3)(pET-NproT-C)。2、表達G36A和G43A替換(即胸腺素a原自氨基末端第36位和第43位的甘氨酸(G)替換為丙氨酸(A))的胸腺素a原變異體的工程菌的構(gòu)建以上述實施例l構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-NproT為模板，以Protl和Prot5:5'_ATTGTCAGCCTCCTGCTCagcATTTTCCTCATTAGCATTagcGTTAGCAGGGGCGTCTCT-3'為引物，PCR擴增含G36A和G43A編碼序列的約150bp的核酸片段；以該150bp的核酸片段為megprimer，以Prot2為反向引物，以pET-NproT為模板，PCR擴增含G36A和G43A替換的胸腺素a原變異體基因(NproTG36A，G43A)，其脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列12所示，其編碼的氨基酸序列如序列表中序列5所示。采用與上述實施例1相同的方法將NproTG36A，G43A插入到載體PET22b的Ndel和BamHI酶切位點間，得到重組質(zhì)粒pET-NproTG36A，G43A;再將重組質(zhì)粒pET_NproTG36A，G43A轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，采用與上述實施例1相同的篩選方法得到重組大腸桿菌BL21(DE3)(pET-NproTG36A，G43A)。3、表達C-端缺失且G36A和G43A替換的胸腺素a原變異體的工程菌的構(gòu)建以上述步驟2獲得的pET-NproTG36A，G43A為模板，以Protl和Prot4為引物，PCR擴增G36A和G43A替換且C-端缺失的胸腺素a原變異體基因(NproTG36A，G43A-C)，其脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列13所示，其編碼的氨基酸序列如序列表中序列6所示。采用與上述實施例1相同的方法將NproTG36A，G43A-C插入到載體PET22b的NdeI和BamHI酶切位點間，得到重組質(zhì)粒pET-NproTG36A，G43A-C;再將重組質(zhì)粒pET-NproTG36A，G43A-C轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，采用與上述實施例1相同的篩選方法得到重組大腸桿菌BL21(DE3)(pET-NproTG36A，G43A-C)。4、用人工合成基因表達G36A和G43A替換的胸腺素a原變異體的工程菌的構(gòu)建根據(jù)大腸桿菌偏愛密碼，優(yōu)化mRNA的二級結(jié)構(gòu)，減少發(fā)卡結(jié)構(gòu)，設(shè)計出編碼G36A和G43A替換的胸腺素a原變異體的DNA序列(序列表中序列14)。為了合成該基因，我們采用分段合成，PCR拼接的方法。即先合成序列3的DNA正向片段，每段58bp，及其反向互補序列，每段58bp，每條反向片段分別與正向序列前一段和后一段各有29bp互補。所有DNA片段各取lpmol，混合作為模板，以Prot6:5'-CCCATATGTCTGACGCTGCTGTTGAC-3'和proT7:5'-cgggatccTTAGTCGTCTTCGTCAGTTTTCTG-3'為正向和反向引物，PCR擴增拼接基因。PCR反應(yīng)體系為模板lpmol，Prot6和proT7各100pmo1，10mmol/L的dNTP1ii1，10X反應(yīng)緩沖液5iil，pfuDNA聚合酶5U，加水到50iil。PCR條件為先94。C變性30秒，然后54。C退火30秒，最后72t:延伸30秒，共35個循環(huán)。獲得人工合成的G36A和G43A替換的胸腺素a原變異體的基因(SproTG36A，G43A)，其脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列14所示，其編碼的氨基酸序列如序列表中序列5所示。采用與上述實施例1相同的方法將SproTG36A，G43A插入到載體PET22b的Ndel和BamHI酶切位點間，得到重組質(zhì)粒pET-SproTG36A，G43A;再將重組質(zhì)粒pET-SproTG36A，G43A轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，采用與上述實施例1相同的篩選方法得到重組大腸桿菌BL21(DE3)(pET-SproTG36A，G43A)。5、用人工合成基因表達C-端缺失且G36A和G43A替換的胸腺素a原變異體的工程菌的構(gòu)建以上述步驟4獲得的pET-SproTG36A，G43A為模板，以Prot6和Prot8:5'-cgggatccTTAGTCAACGTCGTCGTCTTCGTC-3'為引物，PCR擴增G36A和G43A替換且C-端缺失的胸腺素a原變異體的基因(SproTG36A，G43A-C)，其脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列18所示，其編碼的氨基酸序列如序列表中序列6所示。采用與上述實施例1相同的方法將SproTG36A，G43A-C插入到載體PET22b的NdeI和BamHI酶切位點間，得到重組質(zhì)粒pET-SproTG36A，G43A-C;再將重組質(zhì)粒pET-SproTG36A，G43A-C轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，采用與上述實施例1相同的篩選方法得到重組大腸桿菌BL21(DE3)(pET-SproTG36A，G43A-C)。6、制備N-乙?；叵偎豠1分別取上述實施例1構(gòu)建的BL21(DE3)(pET-NproT)與上述步驟1_5構(gòu)建的工程菌BL21(DE3)(pET-NproT-C)、BL21(DE3)(pET-NproTG36A，G43A)、BL21(DE3)(pET-NproTG36A，G43A—C)、BL21(DE3)(pET—SproTG36A，G43A)禾PBL21(DE3)(pET—SproTG36A，G43A-C)的單菌落，分別接種到5mlLB液體培養(yǎng)基中，37。C搖床培養(yǎng)過夜；然后再轉(zhuǎn)接至100ml培養(yǎng)基(酵母抽提物10g/L，胰蛋白胨10g/L，磷酸二氫鈉20mM，磷酸氫二鈉30mM，葡萄糖2g/L)中，37。C培養(yǎng)4h，分別加入100yl0.2mol/L的IPTG(異丙基-D-硫代半乳糖苷，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)繼續(xù)培養(yǎng)4-8h，各取lml菌液，離心收集菌體，加50iil水重懸，再和50ii12XSDS-PAGE上樣緩沖液混合，沸水浴裂解菌體，裂解液離心取上清，進行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖8所示。其中，1為BL21(DE3)(pET-NproT)的SDS-PAGE結(jié)果，2為BL21(DE3)(pET-SproTG36A，G43A)的SDS-PAGE結(jié)果，3為BL21(DE3)(pET-NproT-C)的SDS-PAGE結(jié)果，4為BL21(DE3)(pET-NproTG36A，G43A)的SDS-PAGE結(jié)果，5為BL21(DE3)(pET-SproTG36A，G43A)的SDS-PAGE結(jié)果，6為BL21(DE3)(pET-SproTG36A，G43A-C)的SDS-PAGE結(jié)果，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果表明，BL21(DE3)(pET-NproT-C)(圖中樣品3)與BL21(DE3)(pET-NproT)(圖中樣品1)的表達水平相似、BL21(DE3)(pET-NproTG36A，G43A)(圖中樣品4)的表達水平高于BL21(DE3)(pET-NproT)(圖中樣品1)，而BL21(DE3)(pET-SproTG36A，G43A)(圖中樣品2和樣品5)和BL21(DE3)(pET-SproTG36A，G43A-C)(圖中樣品6)的表達水平最高，即C端核定位序列的缺失不影響胸腺素a原的表達，G36A和G43A替換可以明顯提高胸腺素a原的表達，人工合成的基因比天然基因更有利于胸腺素a原的表達。采用與上述實施例1相同的方法培養(yǎng)上述各工程菌，表達得到胸腺素a原變異體。將得到的各胸腺素a原變異體用上述實施例1步驟2方法制備的天冬酰胺內(nèi)肽酶進行酶切，制備得到N-乙酰化胸腺素al。具體的方法同實施例l。由于BL21(DE3)(pET-SproTG36A，G43A)(圖中樣品5)禾卩BL21(DE3)(pET-SproTG36A，G43A-C)(圖中樣品6)的表達量較高，因此單位體積的培養(yǎng)物制備的N-乙?；叵偎豠l也較多。實施例4、用部份天冬酰胺內(nèi)肽酶酶切位點缺陷的胸腺素a原變異體或截短的胸腺素a原變異體制備N-乙酰化胸腺素a11、用人工合成基因表達自氨基末端第32-52位氨基酸殘基序列缺失，并截短的胸腺素a原變異體的工程菌的構(gòu)建以上述實施例3構(gòu)建的pET-SproTG36A，G43A-C為模板，以Prot10:5，-ggcatATGTCTGACGCTGCTGTTGAC-3，和Prot9:5，-ACCACCTTCTTCCTCTTCTTCGTCACGACCGTTTTCAGCTTC-3'為引物，PCR擴增編碼自氨基末端第32-52位氨基酸序列缺失(含多個天冬酰胺位點)的約110bp的核酸片段；以該110bp的核酸片段為megprimer，以Prot8為反向引物，pET-SproTG36A，G43A-C為模板，PCR擴增編碼自氨基末端第32-52位氨基酸序列缺失，并缺失C-端核定位序列的胸腺素a原變異體基因(del53-C)，其脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列17所示，其編碼的氨基酸序列如序列表中序列8所示。將擴增得到的del53-C基因用Ndel和BamHI雙酶切后，與經(jīng)同樣酶切的載體PET-22b(購自Novagen公司)相連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，得到重組大腸桿菌BL21(DE3)(PET-del53-C)。采用同樣的方法，以Protll:5'-cgggatccTTAACCTTCTTCCTCTTCTTCCTC-3'代替Prot8，PCR擴增編碼自氨基末端第32-52位氨基酸序列缺失，且C-端截短至G68的胸腺素a原變異體基因(del53/G68)，其脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列16所示，其編碼的氨基酸序列如序列表中序列9所示。將擴增得到的del53/G68基因用Ndel和BamHI雙酶切后，與經(jīng)同樣酶切的載體PET-22b(購自Novagen公司)相連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，得到重組大腸桿菌BL21(DE3)(PET-del53/G68)。以上述實施例3構(gòu)建的pET-SproTG36A，G43A為模板，以ProtlO和Protll為引物，PCR擴增C-端截短至G68的胸腺素a原變異體基因(G68基因)，其脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列15所示，其編碼的氨基酸序列如序列表中序列7所示。將擴增得到的G68基因分別用Ndel和BamHI雙酶切后，與經(jīng)同樣酶切的載體PET22b(購自Novagen公司)相連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，得到重組大腸桿菌BL21(DE3)(PET-G68)。2、制備N-乙?；叵偎豠1將上述重組大腸桿菌BL21(DE3)(PET-G68)、BL21(DE3)(PET-del53/G68)、BL21(DE3)(PET-del53-C)及實施例3構(gòu)建的BL21(DE3)(PET-SprotG36A，G43A)、BL21(DE3)(PET-SprotG36A，G43A-C)的單菌落分別接種到100mlLB液體培養(yǎng)基中，37。C搖床培養(yǎng)過夜，然后再接種至含3L培養(yǎng)基(酵母抽提物10g/L，胰蛋白胨10g/L，磷酸二氫鈉20mM，磷酸氫二鈉30mM，葡萄糖10g/L)的B5發(fā)酵罐中(購自德國貝朗公司)，37。C培養(yǎng)，通過攪拌和通氣控制溶氧大于20%。培養(yǎng)4后，溶氧突然回升，提示葡萄糖已耗盡，每升培養(yǎng)物加入lm10.2mol/L的IPTG進行誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)4-8和小時，各取50yl菌液，離心收集菌體，加50iil水重懸，再和50ii12XSDS-PAGE上樣緩沖液混合，沸水浴裂解菌體。裂解上清液進行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖9所示。其中，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為表達G36A和G43A替換的胸腺素a原變異體的工程菌BL21(DE3)(PET-SprotG36A，G43A)的SDS-PAGE結(jié)果，2為表達C端截斷至G68的胸腺素a原變異體的工程菌BL21(DE3)(PET-G68)的SDS-PAGE結(jié)果，3為表達自氨基末端第32-52位氨基酸序列缺失，且C-端截短至G68的胸腺素a原變異體的工程菌BL21(DE3)(PET-del53/G68)的SDS-PAGE結(jié)果，4為表達自氨基末端第32-52位氨基酸序列缺失，且C-端核定位序列缺失的胸腺素a原變異體的工程菌BL21(DE3)(PET-del53-C)的SDS-PAGE結(jié)果，5為表達C-端核定位序列缺失的胸腺素a原變異體的工程菌BL21(DE3)(PET-SprotG36A，G43A-C)的SDS-PAGE結(jié)果。圖9結(jié)果表明，BL21(DE3)(PET-SprotG36A，G43A)、BL21(DE3)(PET-SprotG36A，G43A-C)、BL21(DE3)(PET-G68)和BL21(DE3)(PET-del53/G68)的表達較高，而BL21(DE3)(PET-del53—C)的表達較低。由于del53/G68的分子量最小，因此其中含的胸腺素al比例最高。為了進一步比較這些工程菌的N-乙?；叵偎豠1的產(chǎn)率，各取1L上述工程菌的培養(yǎng)產(chǎn)物，用上述實施例1步驟2制備的天冬酰胺內(nèi)肽酶進行酶切，制備N-乙?；叵偎豠1。具體方法同實施例1。將得到的N-乙酰化胸腺素a1進行RP-HPLC分析，具體方法同實施例1。各工程菌所獲得的N-乙?；叵偎豠1的分析結(jié)果見表1。表IN-乙酰化胸腺素a1的含量<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>可見工程菌BL21(DE3)(PET-del53/G68)的N-乙?；叵偎豠1產(chǎn)率最高，其純化過程的色譜圖如圖IO所示。比較圖10與圖5可以發(fā)現(xiàn)，用工程菌BL21(DE3)(PET-de153/G68)表達胸腺素a變異體制備N-乙?；叵偎豠1時，雜峰明顯減少，因此更易于純化，方便大規(guī)模生產(chǎn)。圖11為其制備的N-乙?；叵偎豠1的RP-HPLC分析，保留時間與圖6中化學(xué)合成的N-乙?；叵偎豠1參考品一致，且純度良好。實施例5、用含N-乙?；叵偎豠1的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶融合蛋白制備N-乙?；叵偎豠l1、表達含N-乙酰化胸腺素a1的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶融合蛋白工程菌的構(gòu)建以上述實施例3構(gòu)建的pET-SproTG36A，G43A-C為模板，以Ta5:5，-GGCATATGTCTGACGCTGCTGTTGAC-3，和Ta3:5'-GTTTTCAGCTTCTTCAACAAC-3，為引物，PCR擴增得到約100bp的編碼胸腺素a1的DNA片段，電泳回收該片段。以GST5:5'-GTTGTTGAAGAAGCTGAAAACGGTATGTCCCCTATACTAGGTTAT-3，和GST3:5，-AGGGATCCTTAACGCGGAACCAGATCCGATTT-3;為引物，以pGEX-4T-l載體(構(gòu)自美國GE公司)為模板，PCR擴增得到約680bp的編碼谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的DNA片段，電泳回收該片段。以這兩個DNA片段為模板，以Ta5和GST3為引物，PCR擴增獲得用于表達含N-乙?；叵偎豠1的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶融合蛋白的基因(其脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列20所示，其編碼的氨基酸序列如序列表中序列21所示)。該基因用Ndel和BamHI雙酶切后，與經(jīng)同樣酶切的載體PET-22b(購自Novagen公司)相連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，得到重組大腸桿菌BL21(DE3)(PET-TaGST)。將上述重組大腸桿菌BL21(DE3)(PET-TaGST)的單菌落接種到100mlLB液體培養(yǎng)基中，37t:搖床培養(yǎng)過夜，然后再接種至含3L培養(yǎng)基(酵母抽提物10g/L，胰蛋白胨10g/L，磷酸二氫鈉20mM，磷酸氫二鈉30mM，葡萄糖10g/L)的B5發(fā)酵罐中(購自德國貝朗公司)，37°C培養(yǎng)，通過攪拌和通氣控制溶氧大于20%。培養(yǎng)4-6h后，溶氧突然回升，提示葡萄糖已耗盡，每升加入lm10.2mo1的IPTG(異丙基-D-硫代半乳糖苷，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)進行誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)4-8和小時，離心收集菌體64g。將20g收集的菌體用水重懸(每克菌加10ml水)，超聲波破壁，離心收集上清，為含有N-乙?；叵偎豠l-谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶融合蛋白的粗提液。將該粗提液用GlutathioneS印harose4FastFlow①2.5X30cm柱(介質(zhì)購自美國GE公司，空柱購自華美實驗儀器廠)進行純化。具體條件為A液(20mMTri-HCl，pH7.0)，B液(A液+10mM還原型谷胱甘肽)，層析柱先用A液平衡，然后從A通道將上述含有N-乙?；叵偎豠1-谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶融合蛋白的粗提液上樣，再用A液洗去未結(jié)合的蛋白，最后用100%B洗脫，收集洗脫液30ml，為純化的N-乙?；叵偎豠1-谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶融合蛋白。用G25①2.5X50cm柱(介質(zhì)購自美國GE公司，空柱購自華美實驗儀器廠)層析更換緩沖體系，具體條件為，流動相20mM乙酸-乙酸鈉緩沖液，pH4.5。流速5ml/min。收集17_35min的組分為N_乙?；叵偎豠l-谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶融合蛋白。用上述實施例1步驟2的方法制備活化的天冬酰胺內(nèi)肽酶，在上述N-乙酰化胸腺素a1-谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶融合蛋白組分中加入2ml活化的天冬酰胺內(nèi)肽酶和40yllmol/LDTT，37t:孵育切割融合蛋白12小時。切割產(chǎn)物用C18①2.0X20cm柱(購自大連化學(xué)物理研究所)進行純化。A液為水+0.1%體積百分含量TFA，B液為50%體積百分含量乙腈+0.1X體積百分含量TFA的水溶液。先用A液平衡，然后以5ml/min的流速上樣，上樣完成后，再用A液平衡，然后從30XA液到60X進行線性梯度洗脫。收集40-45XB組份(25ml)為制備的N-乙?；叵偎豠1(濃度為0.9mg/ml)。用實施例1相同的方法分析，在HPLC上的保留時間是15.4分鐘，與化學(xué)合成的^乙?；叵偎豠1的保留時間一致。實施例6、制備的N-乙?；叵偎豠1的活性分析采用T細(xì)胞-E玫瑰花試驗(方法見國家食品藥品監(jiān)督管理局。WSl-XG-042-2000-2003，附錄-T細(xì)胞活性測定法_脫E受體法。《國家藥品標(biāo)準(zhǔn)》第十六冊，2003版；夏天瑤等，T淋巴細(xì)胞-E玫瑰花試驗檢測胸腺肽生物學(xué)活性影響因素的探討，藥物生物技術(shù)，2007，14(3):215-217。)，分析上述實施例1_5制備的N-乙酰化胸腺素a1的生物學(xué)活性，參考品為化學(xué)合成的N-乙?；叵偎豠1(商品名Zadaxin，購自解放軍302醫(yī)院)。試驗結(jié)果見表2。根據(jù)國家相關(guān)規(guī)定，E-花環(huán)形成率大于10%為活性合格，即有明顯的活化T細(xì)胞的作用。表2N-乙酰化胸腺素a1的活性分析<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>結(jié)果表明，上述實施例1-5制備的N-乙酰化胸腺素a1與參考品均具有活化T細(xì)胞的作用，且生物活性相似。序列表〈160>21〈210>1〈211>28〈212>PRT〈213>人工序列〈220〉〈223〉〈400〉1SerAspAlaAlaValAspThrSerSerGlulieThrThrLysAspLeu151015LysGluLysLysGluValValGluGluAlaGluAsn2025〈210>2〈211>28〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>2SerAspAlaAlaValAspThrSerSerGlulieThrlieLysAspLeu151015LysGluLysLysGluValValGluGluAlaGluAsn25〈210>3〈211>109〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>3SerAspAlaAlaValAspThrSerSerGlulieThrThrLysAspLeu151015LysGluLysLysGluValValGluGluAlaGluAsnGlyArgAspAla202530ProAlaAsnGlyAsnAlaAsnGluGluAsnGlyGluGinGluAlaAsp354045AsnGluValAspGluGluGluGluGluGlyGlyGluGluGluGluGlu505560GluGluGluGlyAspGlyGluGluGluAspGlyAspGluAspGluGlu65707580AlaGluSerAlaThrGlyLysArgAlaAlaGluAspAspGluAspAsp859095AspValAspThrLysLysGinLysThrAspGluAspAsp105〈210>4〈211>99〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>4SerAspAlaAlaValAspThrSerSerGlulieThrThrLysAspLeu151015LysGluLysLysGluValValGluGluAlaGluAsnGlyArgAspAla202530ProAlaAsnGlyAsnAlaAsnGluGluAsnGlyGluGinGluAlaAsp354045AsnGluValAspGluGluGluGluGluGlyGlyGluGluGluGluGlu505560GluGluGluGlyAspGlyGluGluGluAspGlyAspGluAspGluGlu65707580AlaGluSerAlaThrGlyLysArgAlaAlaGluAspAspGluAspAsp859095AspValAsp〈210>5〈211>109〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>5SerAspAlaAlaValAspThrSerSerGlulieThrThrLysAspLeu151015LysGluLysLysGluValValGluGluAlaGluAsnGlyArgAspAla202530ProAlaAsnAlaAsnAlaAsnGluGluAsnAlaGluGinGluAlaAsp354045AsnGluValAspGluGluGluGluGluGlyGlyGluGluGluGluGlu505560GluGluGluGlyAspGlyGluGluGluAspGlyAspGluAspGluGlu65707580AlaGluSerAlaThrGlyLysArgAlaAlaGluAspAspGluAspAsp859095AspValAspThrLysLysGinLysThrAspGluAspAsp105〈210>6〈211>99〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉19(400)6SetAspAlaAlaValAsp／hrSetSetGluIle／hr／hrLysAspLeul5lo15LysGluLysLysGluValValGluGluAlaGluAShGlyArgAspAla]202530ProAlaAShAlaAShAlaAShGluGluAShAlaGluGlnGluAlaAsp354045AShGluValAspGluGluGluGluGluGlyGlyGluGluGluGluGlu505560GluGluGluGlyAspGlyGluGluGluAspGlyAspGluAspGluGlu65707580AlaGluSetAla／hrGlyLysArgAlaAlaGluAspAspGluAspAsp859095AspValAsp<210)7<211)68<2l2>PRT<213)人工序列(220)(223)(400)7SetAspAlaAlaValAsp／hrSetSetGluIle／hr／hrLysAspLeul5lo15LysGluLysLysGluValValGluGluAlaGluAShGlyArgAspAla202530ProAlaAShAlaAShAlaAShGluGluAShAlaGluGlnGluAlaAsp354045AShGluValAspGluGluGluGluGluGlyGlyGluGluGluGluGlu505560GluGluGluGly65<210)8<211)78<2l2>PRT<213)人工序列(220)(223)(400)8SetAspAlaAlaValAsp／hrSetSetGluIle／hr／hrLysAspLeu300333SerAlaThrAspThrThrLys151015LysGluLysLysGluValValGluGluAlaGluAsnGlyArgAspGlu202530GluGluGluGluGlyGlyGluGluGluGluGluGluGluGluGlyAsp354045GlyGluGluGluAspGlyAspGluAspGluGluAlaGlu505560GlyLysArgAlaAlaGluAspAspGluAspAspAspVal657075〈210>9〈211>47〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>9SerAspAlaAlaValAspThrSerSerGluI1510LysGluLysLysGluValValGluGluAlaGluAsnGlyArg202530GluGluGluGluGlyGlyGluGluGluGluGluGluGluGlu354045〈210>10〈211>333〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>10atgtctgatgcagctgtegateccagctccg朋3tc3ccacc朋ggactt朋3ggag朋g60朋gg朋gttgtgg朋gaggc3g朋朋tgg33gagacgcccctgcteacggg朋tgct朋t120gagg朋朋tggggagc3ggaggctgac朋tgaggtegacg朋g朋g3gg3ag朋ggtggg180g3gg3卿ggElggElggEl卿卿3ggtg3tggtg3gg朋g3gg3tgg卿tg3卿tg3g240gaagctgagtcagctacgggcaagcgggcagctgaagatgatgaggatgacgatgtcgat3CC33g33gC3g33g3CCg3Cg3gg3tg3Ctaa〈210>11〈211>303AspLeu15AspGluGly21〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>11atgtctgatgcagctgtagataccagctccccaaggactt3肌ggag肌g60肌gg肌gttgtgg肌gElggCag肌肌tgga3g3g3CgCCCctgctaacgg120g3gg肌肌tgggg￡lgC￡lgg￡lgaggtegacg肌g肌gaggaag肌ggtggg180g￡lgg￡l￡lg￡lgg￡lgg￡lgg￡l￡lg￡lag肌ggtgatggtg3gg肌gtg肌gatgag240gaagctgagtcagctacgggc肌gcgggcagctg肌gatgcgatgtcgat300ta303〈210>12〈211>333〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>12atgtctgatgcagctgtagataccagctccccaaggactt3肌ggag肌g60肌gg肌gttgtgg肌gElggC3g3g3CgCCCctgctaacgctaatgctaat120g3gg肌肌tgCtg3gC3gg3gaggtegacg肌g肌gaggaag肌ggtggg180g￡lgg￡l￡lg￡lgg￡lgg￡lgg￡l￡lg￡lag肌ggtgatggtgagg肌gtg肌gatgag240gaagctgagtcagctacgggc肌gcgggcagctg肌gatgcgatgtcgat300g33g3ccgacgagg"gactaa333〈210>13〈211>303〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>13atgtctgatgcagctgtagataccagctccccaaggactt3肌ggag肌g60肌gg肌gttgtgg肌g3ggCag肌肌tgga3g3g3CgCCCctgctaacgctaatgctaat120g3gg肌肌tgCtg3gC3gg3gaggtegacg肌g肌gaggaag肌ggtggg180g￡lgg￡l￡lg￡lgg￡lgg￡lgg￡l￡lg￡lag肌ggtgatggtg3gg肌gtg肌gatgag240gaagctgagtcagctacgggc肌gcgggcagctg肌gatgcgatgtcgat300ta303〈210>14〈211>333〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>14atgtctgacgctgctgttgacacttcttctctaaagacctga肌ga肌肌60肌3g肌gttgttg肌g肌gctg肌肌cggtcgtgacgctccggctaacgctaacgctaac120g肌g肌肌cgCtg肌C3gg3g肌gttgacg肌g肌gaggaag肌ggtggt180g￡l￡lg￡lgg￡lgg￡l￡lg￡l￡lg￡lgg￡l3g肌ggtg3Cggtg肌g肌g3gg3Cggtg3Cg肌g3Cg肌240gaagctgaatctgctactggtaaacgtgctgctg肌gacg3Cg肌g3Cg3cgacgttgac300g3333ctgacg33g3cgactaa333〈210>15〈211>210〈212>DNA〈213〉人工序列23601201802106012014760120180240Ct肌3g3CCtg肌3g肌3肌cggctemcgct肌cgctaac￡l￡lg￡l￡lg￡lgg￡l3g肌ggtggt〈220〉〈223〉〈400>15atgtctgacgg肌g肌肌cg〈223〉〈400>16atgtctgacga肌g肌gttgg3gga肌3g肌gttggaggaggEuaggctgaatctgctgctgttgattgemgemgcctg肌caggactgctgttgattg肌g肌gcgg33gttg肌g朋gc肌gaggaag;actactggtaacacttcttcttg肌肌cggt3gctgac肌caagaatg肌肌cggtcgtgacgctcg肌gttg;acgg3gg3cgtgacg朋gctaaagacct肌gagg朋gaacggtgacga肌g3Cg3Cg33ggtggtg肌gtta3aggtggtg肌cgttgactaa3ggtg;acggtgaagEuagEiggacgtgctgctgaagacgacgg￡iag￡lgg￡lgg〈210>16〈211>147〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉cacttcttctgaaatcactactaaagaccttg肌肌cggtcgtgeicg肌g肌gagg肌gaaag3ggaaga3g〈210>17〈211〉240〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>17atgtctgacgctgctgttgacacttcttctgaaatcacta〈210>18〈211>303〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>18atgtctgacgctgctgttgacacttcttctctaaagacct60a肌g肌gttgttg肌g肌gctg肌肌cggtcgtgacgctccggctaacgctaacgctaac120g肌g肌肌cgCtg肌C3gg3g肌gttgacg肌g肌gaggaag肌ggtggt180g肌gElggElgg肌g肌gagga3g肌ggtg3Cggtg肌g肌g3gg3Cggtg3Cg肌g3Cg肌240g肌gctg肌tctgctactggtaaacgtgctgctg肌gacg3Cg肌g3Cg3cgacgttgac300ta303〈210>19〈211>1251〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>19gttcctatagatgatcctga3g3tgg3ggC肌gcactgggtggtgatcgtggC3ggttC360肌tggctggt3t肌ttataggC3CC3ggC3gacgcgtgccatgcctaccagatcattcac120cgcaatgggattcctgacgaacagatcgttgtgatgatgttgcttactct180g肌gac肌tcccactccaggaattgtgatc肌C3ggCCC3tgtctatcag240ggagtcccga3gg3Ct3C3Ctgg3gaggatgttaccccacaaaatttccttgctgtgttg300ElgElggCgEltgC3g肌gC3gtg肌gggcateggatccggcagagtggcccc360C3gg3tC3Cgtgttcatttacttcactgaccatggatctactggaatactggtttttccc420肌tg肌gatcttcatgtaaagagaccatccattacatgta■atgtaccg肌agatggtgttctacattgaagcctgtgagtctgggtccatgatg肌ccac540ctgccggataacatcaatgtttatgcaactactgctgcca3CCCC3g3g3gtcgtcctac600gcctgttact3tgatgag肌gaggtccacgtacctgggggcgtcaactgg660atgg肌gactcggacgtggaagatctgact肌3g3g3CCCtgC3C肌gC3gtaccacctg720gt肌肌tcgccagccacgtcaatctccacc780atg肌3gtg3tgcagtttcaCgC3肌gCC3gttctcccgtccccctacct840ccagtcacacaccttgacctC3CCCCC3gCcctgatgtgcctctcaccatcatg肌肌gg900肌3Ctg3tg3tctggaggagtccaggcagctC3Cgg3gg3gatccagcgg960catctggatgccaggcaccttcagtgcgtaagatcgtctccttgctggca1020gcgtccgaggctgaggtggagcagctcctgtccgagagagccccgctcacggggC3C3gC1080tgctacccagaggccctgctgcacttccggacccactgcttcaactggcactcccccacg1140tacgagtatgtttgtacgtgctggtcaacctttgtgag肌gccgtatcca1200cttcacaggataaaattgtccatggaccacgtgtg'ccttggtcactactaa1251〈210>20〈211>765〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>20atgtctgacgctgctgttgacacttcttctctaaagacctga肌ga肌肌60a肌g肌gttgttg肌g肌gctg肌肌cggtatgtcccctatactaggtta26120肌gggccttgtgcaacccactcgacttcttttggaatatc180catttgtatgagcgcgatgatggCg肌3C3肌肌gtttgaattgggtttg240gagtttcccaatcttccttattatattgatggtgatgtteaattaacacagtctatggcc300atcatacgttatatagctgaC肌gC3C33CatgttgggtggttgtCC肌33g3gCgtgC3360gagatttc肌tgcttg肌ggagcggttttg3CggtgtttCgag肌ttgca420tat3gta肌gactttgaaactctcaaagttgattttcttagc肌gctecctga肌tgctg■肌肌tgttcgaagatcgtttatggtgatcatgt肌cccat540cctgacttcatgttgtatgacgctcttgatgttgttttatacatggacccaatgtgcctg600gatgcgttccc肌肌ttagtttgttttaaaaagctatcccacaaattgat660肌gtacttga肌tccagc肌tggcctttgc3gggCtggC33gCC3Cgttt720ggtggtggcgaccatcctccaaaatcggatctggttccgcgttaa765〈210>21〈211>253〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>21SerAspAlaAlaValAspThrSerSerGlulieThrThrLysAspLeu151015LysGluLysLysGluValValGluGluAlaGluAsnGlyMetSerPro202530lieLeuGlyTyrTrpLyslieLysGlyLeuValGinProThrArgLeu354045LeuLeuGluTyrLeuGluGluLysTyrGluGluHisLeuTyrGluArg505560AspGluGlyAspLysTrpArgAsnLysLysPheGluLeuGlyLeuGlu2765707580PheProAsnLeuProTyrTyrlieAspGlyAspValLysLeuThrGin859095SerMetAlalielieArgTyrlieAlaAspLysHisAsnMetLeuGly100105110GlyCysProLysGluArgAlaGlulieSerMetLeuGluGlyAlaVal115120125LeuAsplieArgTyrGlyValSerArglieAlaTyrSerLysAspPhe130135140GluThrLeuLysValAspPheLeuSerLysLeuProGluMetLeuLys145150155160MetPheGluAspArgLeuCysHisLysThrTyrLeuAsnGlyAspHis165170175ValThrHisProAspPheMetLeuTyrAspAlaLeuAspValValLeu180185190TyrMetAspProMetCysLeuAspAlaPheProLysLeuValCysPhe195200205LysLysArglieGluAlalieProGinlieAspLysTyrLeuLysSer210215220SerLysTyrlieAlaTrpProLeuGinGlyTrpGinAlaThrPheGly225230235240GlyGlyAspHisProProLysSerAspLeuValProArg24525028權(quán)利要求一種制備基因工程N-乙酰化胸腺素α1的方法，包括以下步驟1)用基因工程大腸桿菌制備含N-乙?；叵偎卅?多肽序列的前體蛋白或多肽；2)內(nèi)肽酶酶切上述步驟1)的含N-乙?；叵偎卅?多肽序列的前體蛋白或多肽，純化得到N-乙?；叵偎卅?。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述含N-乙?；叵偎豠1多肽序列的前體蛋白為N-乙?；叵偎豠1與谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶形成的融合蛋白。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述含N-乙?；叵偎豠1多肽序列的前體蛋白或多肽為N-乙?；叵偎豠原或其變異體；所述胸腺素a原變異體是至少滿足下述條件之一的多肽1)缺失序列表中序列3的自氨基末端第100-109位的氨基酸殘基；2)將序列表中序列3的自氨基末端第100-109位這10個氨基酸殘基中至少一個氨基酸殘基進行替換；3)將序列表中序列3的自氨基末端第36位和第43位均由甘氨酸替換為丙氨酸；4)將序列表中序列3的自氨基末端第35位、第37位、第39位、第42位和第49位這5個位置的Asn中的至少一個替換或缺失；5)缺失序列表中序列3的自氨基末端第32-52位的氨基酸殘基；6)缺失序列表中序列3的自氨基末端第69-109位的氨基酸殘。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述胸腺素a原變異體是下述多肽之1)是由缺失序列表中序列3的自氨基末端第100-109位的氨基酸殘基得到的多肽；2)是將序列表中序列3的自氨基末端第100-109位這10個氨基酸殘基中至少一個氨基酸殘基進行替換得到的多肽；3)是將序列表中序列3的自氨基末端第36位和第43位均由甘氨酸替換為丙氨酸得到的多肽；4)是將序列表中序列3的自氨基末端第35位、第37位、第39位、第42位和第49位這5個位置的Asn中的至少一個替換或缺失得到的多肽；5)是由缺失序列表中序列3的自氨基末端第32-52位的氨基酸殘基得到的多肽；6)是由缺失序列表中序列3的自氨基末端第69-109位的氨基酸殘基得到的多肽。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述胸腺素a1為與序列表中序列1或序列2具有90%以上同源性的多肽，優(yōu)選為與序列表中序列1或序列2具有95%以上同源性的多肽。6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述胸腺素a1是序列表中序列1或序列2的多肽。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述內(nèi)肽酶為天冬酰胺內(nèi)肽酶，優(yōu)選為人天冬酰胺內(nèi)肽酶。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述人天冬酰胺內(nèi)肽酶是利用基因工程方法制備得到的。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述基因工程方法所用的宿主菌為酵母。10.根據(jù)權(quán)利要求l-9中任一所述的方法，其特征在于所述N-乙?；叵偎豠原或其變異體的氨基酸序列是序列表中序列3-9中任一所述的氨基酸序列。11.根據(jù)權(quán)利要求l-9中任一所述的方法，其特征在于所述N-乙?；叵偎豠原或其變異體的編碼基因的核苷酸序列是序列表中序列10-18中任一所述的核苷酸序列。全文摘要本發(fā)明公開了一種制備基因工程N-乙?；叵偎卅?的方法。本發(fā)明所提供的制備N-乙?；叵偎卅?的方法，包括以下步驟1)用基因工程大腸桿菌制備含N-乙?；叵偎卅?多肽序列的前體蛋白或多肽；2)內(nèi)肽酶酶切上述步驟1)的含N-乙酰化胸腺素α1多肽序列的前體蛋白或多肽，純化得到N-乙?；叵偎卅?。本發(fā)明的制備基因工程N-乙?；叵偎卅?的方法，具有成本低廉，可以提高N-乙?；叵偎卅?的表達量，簡化切割，方便N-乙?；叵偎卅?的純化，從而提高N-乙?；叵偎卅?的生產(chǎn)效率，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景等優(yōu)點。文檔編號A61P35/00GK101736008SQ20081022651公開日2010年6月16日申請日期2008年11月13日優(yōu)先權(quán)日2008年11月13日發(fā)明者劉波,吳軍,唱韶紅,鞏新,馬清鈞申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所