專利名稱：一種血小板膜糖蛋白寡肽或其修飾物/衍生物以及它們的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的合成的可穿膜寡肽，其氨基酸序列及其抑制血小板功能的能力。 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和血液病學(xué)。
背景技術(shù)：
血栓栓塞性疾病，如心肌梗死、缺血性腦梗死、靜脈血栓栓塞等，是當(dāng)前嚴(yán)重危害 人類健康，導(dǎo)致死亡率較高的原因之一，預(yù)防和治療血栓形成，已成為當(dāng)前臨床上重要的防 治方法。血小板在血栓形成過程中起著十分重要的作用。在正常血液循環(huán)過程中，血小板 處于靜止?fàn)顟B(tài)，而在發(fā)生血管壁損傷處，特別在血管中高切應(yīng)力環(huán)境下，血小板就會通過其 表面膜糖蛋白(GP)Ib-IX復(fù)合物中的Ib受體與血漿von Willebrand因子(vWF)結(jié)合并 粘附于受損血管處暴露的內(nèi)皮下組織，進(jìn)而引起粘附的血小板被內(nèi)皮下組織或局部形成的 凝血酶所激活，發(fā)生釋放反應(yīng)和花生四烯酸代謝。由前者分泌釋放的ADP或由后者形成的 血栓烷(TX)A2均可引起血小板聚集。血小板聚集是由血小板GPIIb/IIIa受體所調(diào)解，激 活的GPIIb/IIIa受體通過纖維蛋白原分子在相鄰的血小板之間形成橫橋，構(gòu)成血小板聚 集的骨架，最終導(dǎo)至血栓形成。血小板釋放產(chǎn)物TXA2等還可進(jìn)一步與血漿蛋白作用促進(jìn)血 栓的形成?？梢姡“迥ぬ堑鞍譍PIb與vWF的結(jié)合是血小板血栓形成的起始關(guān)鍵過程。 而GPIba的膜外部分含有vWF的結(jié)合位點(diǎn)，最新研究表明，細(xì)胞內(nèi)信號分子14-3-3蛋白與 GPIb a C末端的結(jié)合，是調(diào)控GPIb-IX與vWF結(jié)合并進(jìn)而導(dǎo)致血小板活化以及形成血小板血 栓的關(guān)健。 有效抑制各階段血小板的作用，是預(yù)防或治療血栓形成性疾病的一個基本思路和 有效途徑。而目前國內(nèi)外臨床上常用抗血小板藥物如阿斯匹林、噻氯匹啶等都是抑制血小 板與vWF結(jié)合黏附后功能的某一環(huán)節(jié)，這些藥物，在發(fā)揮抗栓作用的同時，由于此前粘附而 活化的血小板釋放出的生物活性物質(zhì)，同樣會對出、凝血的生理平衡產(chǎn)生消極影響，而均存 在著較大的缺點(diǎn)如引起血小板減少，出血以及使用后栓塞的再形成。而以調(diào)節(jié)或抑制vWF 與血小板GPIba的結(jié)合為靶標(biāo)，創(chuàng)制一種可調(diào)節(jié)或抑制血小板的始動活化途徑，從而調(diào)節(jié) 或抑制血小板聚集的新型抗血小板藥物，必將會對血栓性疾病的治療和預(yù)防產(chǎn)生意想不到 的效果。 現(xiàn)有研究表明，在調(diào)控血小板GPIb-IX與vWF結(jié)合過程中，細(xì)胞內(nèi)信號分子14-3-3 蛋白與GPIb的結(jié)合起關(guān)鍵作用。在GPIb中，已知有3個14-3-3蛋白結(jié)合位點(diǎn)，分別為 GPIb a 609位點(diǎn)，GPIb a 587-590位點(diǎn)和GPIb P 166位點(diǎn)。這些位點(diǎn)對GPIb與vWF結(jié)合的 作用各不相同，但這些位點(diǎn)都是以磷酸化Ser為中心的結(jié)構(gòu)域。在此領(lǐng)域的多年研究之中， 本室發(fā)現(xiàn)在GPIba 559位點(diǎn)為14-3-3蛋白的又一結(jié)合位點(diǎn)，故此本發(fā)明在現(xiàn)有研究基礎(chǔ) 上，本室研究創(chuàng)建了新的可穿膜寡肽。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的就是研究構(gòu)建新的寡肽序列，并合成可穿膜寡肽，對其抑制血小板粘 附、聚集的功能進(jìn)行研究驗證，最終創(chuàng)制一種具有自主知識產(chǎn)權(quán)，可有效抑制血栓形成，并 對出、凝血功能不產(chǎn)生消極影響的新型藥物。 技術(shù)方案本發(fā)明應(yīng)用抗體制備技術(shù)制備血小板GPIba 559Ser磷酸化抗體， ELESA檢測所制備抗體與血小板結(jié)合情況，從而設(shè)計合成新的可穿膜寡肽，瑞斯托霉素和 ADP誘導(dǎo)血小板聚集試驗對可穿膜寡肽功能進(jìn)行研究。結(jié)果表明可穿膜寡肽可降低瑞斯托 霉素誘導(dǎo)的血小板聚集，而對ADP誘導(dǎo)的血小板聚集沒有影響。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于 1.可穿膜寡肽只對血小板GPIba與vWF的結(jié)合功能有抑制作用，即對血栓形成的 起始有抑制作用，而對其他凝血功能無影響。 2.不同濃度的可穿膜寡肽，對瑞斯托霉素誘導(dǎo)的血小板聚集作用的抑制程度不 同，即對瑞斯托霉素誘導(dǎo)的血小板聚集作用具有調(diào)節(jié)功能，具有良好的藥物開發(fā)潛力。
3.可穿膜寡肽分子量較小，對人體免疫原性低，可直接用于人體。 4.可穿膜寡肽分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，易于合成與純化，可大量生產(chǎn)，具有廣闊的產(chǎn)業(yè)化前
旦 豕。 而現(xiàn)有國內(nèi)外臨床上使用的抗血小板藥物都是抑制血小板黏附后功能的一個環(huán) 節(jié)，其防栓作用相對較弱，且對出、凝血生理平衡產(chǎn)生消極影響，并受適用范圍、生產(chǎn)工藝、 知識產(chǎn)權(quán)等等諸多因素的限制。


圖1顯示制備抗血小板GPIb a 559Ser磷酸化抗體的免疫原即所合成的小分子寡 肽的氨基酸序列。 圖2顯示所制備的抗血小板GPIb a 559Ser磷酸化抗體的特異性及效價。 圖3顯示所制備的抗血小板GPIb a 559Ser磷酸化抗體檢測血小板GPIb a ELISA結(jié)果。 圖4顯示本發(fā)明構(gòu)建的可穿膜寡肽的氨基酸序列。 圖5顯示可穿膜寡肽降低瑞斯托霉素誘導(dǎo)的血小板聚集功能。A為陰性對照，B為
可穿膜寡肽(100 i！ M)抑制瑞斯托霉素誘導(dǎo)血小板聚集功能，C， D為對照寡肽。 圖6顯示不同濃度可穿膜寡肽對瑞斯托霉素誘導(dǎo)的血小板聚集功能的影響。A為
陰性對照，B， C， D， E分別為不同濃度可穿膜寡肽(25 ii M， 50 ii M， 100 y M， 200 y M)抑制瑞斯
托霉素誘導(dǎo)血小板聚集功能。 圖7顯示在添加GP II b/IIIa拮抗劑RGDS的條件下可穿膜寡肽對瑞斯托霉素誘 導(dǎo)的血小板聚集功能的影響。A為陰性對照，B為陰性對照添加RGDS后瑞斯托霉素誘導(dǎo)的 血小板聚集功能，C為可穿膜寡肽(100i!M)抑制瑞斯托霉素誘導(dǎo)血小板聚集功能，D為可穿 膜寡肽(lOOi!M)添加RGDS后抑制瑞斯托霉素誘導(dǎo)血小板聚集功能。 圖8顯示可穿膜寡肽對ADP誘導(dǎo)的血小板聚集功能無影響。A為陰性對照，B為可 穿膜寡肽，C，D為對照寡肽。 圖9顯示可穿膜寡肽對流動腔裝置中血小板在vWF表面黏附功能的影響。
具體實施例方式
以下借助非限制性實施例舉例詳細(xì)描述本發(fā)明。 實施例1 :抗血小板GPIb a 559Ser磷酸化抗體的制備，鑒定及對血小板GPIb a的 檢測。 1.材料與試劑合成寡肽，新西蘭大白兔，福氏佐劑、MBS、KLH均購自Sigma公司。 羊抗兔IgG-HRP購自中山公司。ECL反應(yīng)試劑購自普利萊公司，其余均為國產(chǎn)分析純試劑。
2.方法 (1)血小板GPIb a 559Ser磷酸化抗體制備試驗合成寡肽通過MBS與KLH交聯(lián)， 作為免疫抗原，與福氏佐劑充分混勻乳化后，進(jìn)行背部多點(diǎn)皮下免疫，三次免疫后，收集分 離免疫血清。合成寡肽序列如圖l所示。 (2)血小板GPIb a 559Ser磷酸化抗體效價及特異性檢測ELISA試驗合成寡肽 以10ug/ml濃度包被ELISA檢測板，每孔100 yl， 4。C孵育過夜后，每孔200 1%明膠封 閉，37t:孵育l小時，PBS洗滌3次。每孔加入100iU按四倍梯度稀釋的抗血清(對照為
免疫前兔血清)，37t:孵育i小時，洗滌3次后每孔加入ioOiU i : ioooo稀釋的羊抗兔
IgG-HRP， 37t:孵育1小時，洗滌3次后進(jìn)行OPD顯色，室溫避光孵育10min， 50 yl 3M硫酸 中止反應(yīng)后，測定樣品在A492的吸光值。由圖2可見，所制備抗體特異識別抗原，且抗體效 價較高。 (3)血小板GPIb a 559Ser磷酸化ELISA檢測試驗:同(2)方法，將血小板GPIb a
以1 P g/ml的濃度包被ELISA檢測板，檢測結(jié)果由圖3可見，血小板GPIb a與所制備抗體
特異結(jié)合，表明血小板GPIb a 559Ser存在磷酸化狀態(tài)。 實施例2 :可穿膜寡肽對血小板粘附、聚集功能影響的研究 1.材料與試劑 可穿膜寡肽(序列如圖4所示)，瑞斯托霉素、ADP、RGDS為Sigma產(chǎn)品；其余均為
國產(chǎn)分析純試劑。
2.方法 (1)可穿膜寡肽抑制瑞斯托霉素誘導(dǎo)血小板聚集試驗健康人全血枸櫞酸鹽抗 凝，分離富含血小板血漿(PRP)，調(diào)整血小板濃度為3X 108/ml，取3 i！ 1可穿膜寡肽加入 300 iil PRP中，同時取3 iil寡肽溶劑匿SO作為對照(另兩種合成的寡肽同為對照)，22°C 孵育5分鐘后，37。C孵育5分鐘，加入瑞斯托霉素(終濃度為1.25mg/ml)誘導(dǎo)血小板聚集。 血小板聚集儀檢測聚集結(jié)果。結(jié)果表明，可穿膜寡肽可有效抑制瑞斯托霉素誘導(dǎo)血小板聚 集(見圖5)。 (2)不同濃度可穿膜寡肽抑制瑞斯托霉素誘導(dǎo)血小板聚集試驗同(1)方法，加入 不同濃度的可穿膜寡肽，檢測瑞斯托霉素誘導(dǎo)血小板聚集結(jié)果。由圖6可見，不同濃度可穿 膜寡肽對瑞斯托霉素誘導(dǎo)血小板聚集抑制程度不同。 (3)添加RGDS的條件下可穿膜寡肽對瑞斯托霉素誘導(dǎo)血小板聚集試驗同(1)方 法，加入RGDS和可穿膜寡肽后，檢測檢測瑞斯托霉素誘導(dǎo)血小板聚集結(jié)果。由圖7可見，在 RGDS拮抗GP Ilb/IIIa條件下，可穿膜寡肽對瑞斯托霉素誘導(dǎo)血小板聚集有抑制作用。
(4)可穿膜寡肽對ADP誘導(dǎo)血小板聚集試驗作用同(1)方法，加入ADP(終濃度
5為2yM)誘導(dǎo)血小板聚集，檢測聚集結(jié)果。由圖8可見，可穿膜寡肽對ADP誘導(dǎo)血小板聚集 無抑制作用。 實施例3 :可穿膜寡肽降低流動腔裝置中血小板與vWF包被表面的黏附。
1.材料與試劑 可穿膜寡肽，vWF(本室自備)，新鮮健康人全血。
2.方法 vWF(濃度為30 ii g/ml)包被玻璃細(xì)管(GC120-7. 5， Harvard Apparatus Inc.)， 濕盒中4t:孵育過夜，PBS沖洗3次之后5% BSA(PBS)室溫封閉2小時，PBS沖洗3次備 用。健康人全血ACD(2.5X檸檬酸三鈉，2.0X D-葡萄糖，1.5X檸檬酸)抗凝，分離富含血 小板血漿(PRP)。使用血小板洗滌液CGS(O. 12M NaCl，O. 0129M檸檬酸三鈉，0. 03M D-葡萄 糖，O. 1X牛血清白蛋，pH 6.5)洗滌后，Modified Tyrode' s Buffer(2.5mM H印ese， 150mM NaCl，2.5mM KC1， 12mMNaHC03， 5. 5mM D-葡萄糖，lmM CaC12， lmM MgC12， lmg/ml BSA， pH 7. 4)調(diào)整血小板濃度為3X 108/ml。在剪切率為250s—1條件下血小板流經(jīng)玻璃細(xì)管，之后 相同剪切率條件PBS沖洗玻璃細(xì)管5分鐘，記錄黏附在vWF包被的玻璃細(xì)管表面的血小板 數(shù)目。由圖9可見，可穿膜寡肽對流動腔裝置中血小板與vWF包被表面的黏附有降低作用。SEQUENCE LISTING〈110〉北京航空航天大學(xué)〈120〉 一種血小板膜糖蛋白寡肽或其修飾物/衍生物以及它們的應(yīng)用〈160>1〈170>PatentIn version 3. 3〈210>1〈211>5〈212>PRT〈213>Artifical sequence〈220〉〈221>M0D_RES〈222〉 (3) (3)〈223〉PH0SPH0RYLATI0N〈400>1Arg Gly Ser Leu Pro1 權(quán)利要求
一種可穿膜寡肽，其特征在于該寡肽的氨基酸序列為RGS(p)LP，其中(p)是指絲氨酸(S)磷酸化。
2. —種如權(quán)利要求1所述的寡肽的修飾物，其特征在于，所述寡肽的修飾物是對寡肽 RGS(p)LP的N端進(jìn)行修飾后得到的產(chǎn)物，所述修飾包括化學(xué)修飾和具有膜穿透作用的多肽 修飾。
3. 如權(quán)利要求2所述的寡肽的修飾物，其特征在于，所述化學(xué)修飾為十四烷?；揎?和十六烷?；揎?。
4. 如權(quán)利要求3所述的寡肽的修飾物，其特征在于，所述化學(xué)修飾為十四烷?；揎棥?br> 5. 如權(quán)利要求2所述的寡肽的修飾物，其特征在于，所述多肽修飾為HIV-TAT修飾。
6. —種如權(quán)利要求l所述的寡肽的衍生物。
7. 如權(quán)利要求1 6中任一項所述的寡肽或其修飾物/衍生物的應(yīng)用，其特征在于， 用于選擇性地阻斷血小板膜糖蛋白Ibalpha與ABP的結(jié)合并影響其所對應(yīng)的膜糖蛋白 Ibalpha受體功能。
8. 如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，用于制備預(yù)防和/或治療與血小板膜糖蛋白 Ibalpha與ABP的結(jié)合所對應(yīng)的膜糖蛋白Ibalpha受體活性相關(guān)的疾病的藥物。
9. 如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，用于與血小板膜糖蛋白Ibalpha與ABP的結(jié) 合所對應(yīng)的膜糖蛋白Ibalpha受體活性相關(guān)的疾病包括動脈血栓性疾病。
10. 如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述動脈血栓性疾病包括心肌梗塞和腦梗塞。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種能夠影響血小板功能的寡肽R-G-S(p)-L-P或其修飾物/衍生物，以及該寡肽R-G-S(p)-L-P或其修飾物/衍生物在預(yù)防和/或治療動脈血栓性疾病和/或其它與血小板GPIbalpha與ABP相互作用相關(guān)疾病方面的應(yīng)用。以寡肽R-G-S(p)-L-P或其修飾物/衍生物處理后的血小板，可有效抑制血小板的粘附功能，包括抑制瑞斯托霉素誘導(dǎo)的血小板聚集功能，而不影響血小板聚集功能，包括ADP誘導(dǎo)血小板聚集功能等，因而能抑制血栓形成并能基本維持血小板功能狀態(tài)的完整性?？芍苯佑糜谂R床抗血栓藥物的研發(fā)。
文檔編號A61P7/02GK101735307SQ200810226840
公開日2010年6月16日 申請日期2008年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月18日
發(fā)明者戴克勝 申請人:北京航空航天大學(xué)