專利名稱：：從酸棗仁中提取抗焦慮物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥，特別是一種從酸棗仁中提取抗焦慮物質(zhì)的方法。二、
背景技術(shù)：
酸麥仁為鼠李禾斗植物酸麥[ZiziphusjujubaMill.Var,柳'/osa(Bunge)HuexH.F.Chou]的干燥成熟種子，其味酸性平，歸肝、膽、心經(jīng)，主要用于治療虛煩不眠，驚悸多夢(mèng)，體虛多汗，津傷口渴等癥，為中醫(yī)常用安神藥。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)酸棗仁有了深入的研究，發(fā)現(xiàn)酸棗仁中主要含黃酮類和皂苷類成分，這兩類成分可以通過乙醇回流提取獲得，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)酸棗仁醇提物具有抗焦慮作用，從酸棗仁中提取抗焦慮物質(zhì)是制備抗焦慮藥物的有效途徑，因此，如何從酸棗仁中提取黃酮和皂苷類抗焦慮物質(zhì)為人們所重視。近年來，雖有多種從酸棗仁提取黃酮、皂苷類成分的方法，但由于提取率低，成本高，提取過程使用有毒試劑，不能達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)要求而未得到有效應(yīng)用，因此，研制新的方法勢(shì)在必行。三、
發(fā)明內(nèi)容針對(duì)上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種從酸棗仁中提取抗焦慮物質(zhì)的方法，可有效解決提取率低，成本高，資源浪費(fèi)大的問題，其解決的技術(shù)方案是，對(duì)樹脂進(jìn)行預(yù)處理，即用乙醇對(duì)樹脂進(jìn)行浸泡，使其充分溶脹，濕法裝柱，用乙醇洗脫至流出液加水不出現(xiàn)混濁為止，再用蒸餾水洗脫至無醇味，將搗碎的酸棗仁用乙醇回流提取3次，合并濾液，減壓回收，再將濃縮液經(jīng)上述處理過的樹脂進(jìn)行純化，減壓干燥得固體物，即酸棗仁抗焦慮物質(zhì)，本發(fā)明方法獨(dú)特，特別是用D101大孔吸附樹脂對(duì)酸棗仁醇提物中黃酮、皂苷類成分進(jìn)行同步純化，至今未見有任何報(bào)導(dǎo)，本發(fā)明為首創(chuàng)，該方法總黃酮得率高，純化度高，有效保證了酸棗仁醇提物的質(zhì)量和用于制備抗焦慮藥物的療效，為制備酸棗仁制備抗焦慮藥物作出創(chuàng)造性貢獻(xiàn)，造福于人類。四具體實(shí)施方式以下結(jié)合實(shí)施情況，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作詳細(xì)說明。本發(fā)明在實(shí)際生產(chǎn)中，是由以下步驟實(shí)現(xiàn)的-1、對(duì)樹脂進(jìn)行預(yù)處理，方法是將D101大孔吸附樹脂加其重量體積10倍的95%乙醇浸泡24h,使其充分溶脹，濕法裝柱，用95%乙醇洗脫至流出液1份加5份水(體積比)不出現(xiàn)混濁為止，再用蒸餾水洗脫，至無醇味，流速為2ml/min，備用；2、對(duì)炒酸棗仁乙醇回流提取，方法是，對(duì)酸棗仁炒制后，將炒制的酸棗仁搗碎，用乙醇回流提取三次，每次2h,每次用藥物重量體積(即炒酸棗仁用g計(jì)，乙醇用ml計(jì))8倍量的80%乙醇，合并三次濾液，減壓回收，得5倍原藥物重量體積的濃縮藥液，備用；3、用D101大孔吸附樹脂對(duì)濃縮藥液進(jìn)行純化，得純化酸棗仁抗焦慮物質(zhì)，方法是，對(duì)上述濃縮藥液上預(yù)處理好的D101大孔吸附樹脂進(jìn)行純化，流速為2.2mL/min，純化后靜置2h，用蒸餾水洗脫至無色，苯酚-硫酸顯陰性為止，再用4倍量樹脂床體積的50%乙醇洗脫，洗脫流速為2ml/min，收集洗脫液，減壓干燥得固形物，即為酸棗仁抗焦慮物質(zhì)，測(cè)定固形物中含酸棗仁總黃酮38.96%。本發(fā)明在具體實(shí)施中，還可由以下實(shí)施例給出的方法步驟實(shí)現(xiàn)實(shí)施例11、對(duì)樹脂進(jìn)行預(yù)處理，方法是稱取D101大孔吸附樹脂100g，加1000mL的95%乙醇浸泡24h，使其充分溶脹，濕法裝柱，用95%乙醇洗脫至流出液1份加5份水(體積比)不出現(xiàn)混濁為止，再用蒸餾水洗脫，至無醇味，流速為2ml/min，備用；2、對(duì)炒酸棗仁乙醇回流提取，方法是，對(duì)酸棗仁炒制后，將炒制的酸棗仁100g搗碎，用乙醇回流提取三次，每次2h，每次用800ml80%乙醇，合并三次濾液，減壓回收，得500ml濃縮藥液，備用；3、用D101大孔吸附樹脂對(duì)濃縮藥液進(jìn)行純化，得純化酸棗仁抗焦慮物質(zhì)，方法是，對(duì)上述濃縮藥液上預(yù)處理好的D101大孔吸附樹脂進(jìn)行純化，流速為2.2mL/min，純化后靜置2h，用蒸餾水洗脫至無色，苯酚-硫酸顯陰性為止，再用4倍量樹脂床體積的50%乙醇洗脫，洗脫流速為2ml/min，收集洗脫液，減壓干燥得固形物，即為酸棗仁抗焦慮物質(zhì)，測(cè)定固形物中含酸棗仁總黃酮38.96%。實(shí)施例21、對(duì)樹脂進(jìn)行預(yù)處理，方法是稱取D101大孔吸附樹脂200g，加2000mL95呢乙醇浸泡24h，使其充分溶脹，濕法裝柱，用95%乙醇洗脫至流出液1份加5份水(體積比)不出現(xiàn)混濁為止，再用蒸餾水洗脫，至無醇味，流速為2ml/min，2、對(duì)炒酸棗仁乙醇回流提取，方法是，對(duì)酸棗仁炒制后，將炒制的酸棗仁200g搗碎，用乙醇回流提取三次，每次2h，每次用1600ml80%乙醇，合并三次濾液，減壓回收，得1000ml濃縮藥液，備用；3、用D101大孔吸附樹脂對(duì)濃縮藥液進(jìn)行純化，得純化酸棗仁抗焦慮物質(zhì)，方法是，對(duì)上述濃縮藥液上預(yù)處理好的D101大孔吸附樹脂進(jìn)行純化，流速為2.2mL/min，純化后靜置2h，用蒸餾水洗脫至無色，苯酚-硫酸顯陰性為止，再用4倍量樹脂床體積的50%乙醇洗脫，洗脫流速為2ml/min，收集洗脫液，減壓干燥得固形物，即為酸棗仁抗焦慮物質(zhì)，測(cè)定固形物中含酸棗仁總黃酮38.96%。實(shí)施例31、對(duì)樹脂進(jìn)行預(yù)處理，方法是稱取D101大孔吸附樹脂300g，加3000mL的95。/。乙醇浸泡24h，使其充分溶脹，濕法裝柱，用95%乙醇洗脫至流出液1份加5份水(體積比)不出現(xiàn)混濁為止，再用蒸餾水洗脫，至無醇味，流速均為2ml/min，備用；2、對(duì)炒酸棗仁乙醇回流提取，方法是，對(duì)酸棗仁炒制后，將炒制的酸棗仁300g搗碎，用乙醇回流提取三次，每次2h，每次用2400ml80%乙醇，合并三次濾液，減壓回收，得1500ml濃縮藥液，備用；3、用D101大孔吸附樹脂對(duì)濃縮藥液進(jìn)行純化，得純化酸棗仁抗焦慮物質(zhì)，方法是，對(duì)上述濃縮藥液上預(yù)處理好的D101大孔吸附樹脂進(jìn)行純化，流速為2.2mL/min,純化后靜置2h，用蒸餾水洗脫至無色，苯酚-硫酸顯陰性為止，再用4倍量樹脂床體積的50%乙醇洗脫，洗脫流速為2ml/min，收集洗脫液，減壓干燥得固形物，即為酸棗仁抗焦慮物質(zhì)，測(cè)定固形物中含酸棗仁總黃酮38.96%。根據(jù)上述方法和比例關(guān)系，可以制得任意量的酸棗仁抗焦慮物質(zhì)，本發(fā)明酸棗仁醇提物可有效用于制備治療抗焦慮藥物的應(yīng)用，其方法科學(xué)，節(jié)約資源，得率高、純度高，治療焦慮癥效果好，并經(jīng)試驗(yàn)取得了滿意的效果，有關(guān)試驗(yàn)資料如下一、正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選酸棗仁純化工藝吸取按1項(xiàng)操作所得酸棗仁濃縮藥液100mL，按照正交表中條件上柱(預(yù)處理好的樹脂)，穿透樹脂吸附2次，吸附完，靜止2h后，再用蒸餾水洗脫，除糖類成分，接流份，沒有顏色且苯酚-硫酸反應(yīng)檢識(shí)，顯陰性為止。再按正交表中條件用乙醇液洗脫，收集洗脫液，減壓干燥，恒重，得總黃酮和總皂苷純化物。測(cè)定純化物中總黃酮含量(以盧丁計(jì))、酸棗仁皂苷A的含量，綜合優(yōu)選工藝。因素水平見下表l:表l"(34)因素水平表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>二、含量測(cè)定2.1總黃酮含量測(cè)定2.1.l標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱定蘆丁對(duì)照品10.42mg，力口70%乙醇配成0.2084mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。吸取蘆丁溶液l.5mL和樣品溶液5.0mL，分別置于25mL量瓶中，加入O.2mo1'L三氯化鋁溶液2.5mL和lmolL醋酸鉀溶液5.0mL,力口70%乙醇至刻度，搖勻，放置10min。用紫外一可見分光光度在200550nm處掃描，結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)品和樣品液均在272nm處有最大吸收波長(zhǎng)(272±1)nm。再精密吸取O.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL蘆丁對(duì)照品液按以上操作，在272nm處測(cè)定吸光度。以濃度X對(duì)吸收度y進(jìn)行直線回歸，得回歸方程Y二0.0426X-0.0017，r=0.9998，線性范圍4,16825,008ug/mL。2.1.2精密度實(shí)驗(yàn)吸取對(duì)照品溶液1.0mL，按以上方法，連續(xù)測(cè)定5次，吸收度RSD。/cF0.32，表明儀器精密良好。2.1.3重現(xiàn)性試驗(yàn)稱取同一樣品5份，按樣品處理方法平行制備，測(cè)定吸收度，RSD%=0.77。2.1.4回收率試驗(yàn)吸取已知含量同一樣品液5份，等量加入對(duì)照品，平均回收率為100.06%，RSD%=2,43。2.1.5穩(wěn)定性考察將樣品每隔2h測(cè)定吸收度一次，結(jié)果12h內(nèi)基本穩(wěn)定，RSD%=2.1。2.1.6供試品溶液的測(cè)定精密稱取已恒重的正交樣品粉末，加70%乙醇配成0.2mg/mL溶液。按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測(cè)定，計(jì)算含量。2.2酸棗仁皂苷A含量測(cè)定2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱取酸棗仁皂苷A5.17mg，加甲醇配制成0.5170mg/ml溶液。精密吸取1、2、3、4、5、6ul點(diǎn)于硅膠G板上，以正丁醇—冰醋酸一水(4:1:5)上層展開，展距9cm，晾干，噴以2%香草醛硫酸乙醇溶液，105'C烘至顯天藍(lán)色斑點(diǎn)。稍冷，蓋一干凈玻璃板，在最大吸收波長(zhǎng)631nm處掃描峰面積。以點(diǎn)樣量對(duì)峰面積做回歸方程，得Y=2057.4X-301.4，r=0.9967，線性范圍0.51703.102mg/mL。2.2.2精密度試驗(yàn)精密吸取對(duì)照品3uL，6份，點(diǎn)于同一薄層板上，展開，晾干，顯色，掃描峰面積，RSD%=4.88。2.2.3重現(xiàn)性試驗(yàn)取同一樣品5份，按相同方法處理，掃描峰面積，RSD%=4.32。2.2.4回收率試驗(yàn)稱取已知含量的樣品粉末3份，50mg，精密加入對(duì)照品1.2mg，溶解，按樣品處理方法制備，平均回收率98.72%，RSD%=3.45。2.2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)4h內(nèi)基本穩(wěn)定，峰面積RSD%=2.32。2.2.6供試品溶液的測(cè)定精密稱取純化物50mg，加甲醇超聲溶解，定容得5mg/ml左右溶液。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品1nL、3uL與樣品15uL交叉點(diǎn)于同一薄層板上，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法操作，測(cè)定峰面積，以外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算含量。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果見實(shí)驗(yàn)結(jié)果U(3)4表2和方差分析表3、4。實(shí)驗(yàn)號(hào)ABCD總黃酮含量酸棗仁皂苷A含量1iiii38.962122231.751.763133329.551.124212327.693.495223126.692.7862312'34.461.697313223.651.248321331.581.969332129.781.80H總黃酮方差分析表離差平方和自由度均值F值PA41.960867220.98043314.27〉0.05B107.3966600253.69830036.51<0.05C8.42206724.2110332.86>0.05D2.94126721.470633表4酸棗仁皂苷A方差分析表離差平方和自由度均值F值PA1.722220.86112.75〉0.05B1.167020.58351.86〉0.05C1.056320.52811.68〉0.05D0.627320.3136從總黃酮含量來看，因素影響順序?yàn)锽〉A(chǔ)〉C〉D,即吸附時(shí)間〉干樹脂生藥〉洗脫液濃度〉洗脫液用量，其中B因素有顯著性影響。從正交表中結(jié)果，選擇AACA最優(yōu)。從酸棗仁皂苷A來看，因素影響順序?yàn)锳>B〉C〉D，即干樹脂生藥〉吸附時(shí)間〉洗脫液濃度〉洗脫液用量，最優(yōu)選擇A2BAD,。綜合以上，考慮醇提物的純度(總黃酮+酸棗仁皂苷A)，選擇正交實(shí)驗(yàn)l純化條件，即用相當(dāng)于生藥l倍量的干樹脂，0.2g/mL藥液上樣流速為2.2mL/min，用4倍量樹脂床體積的50%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓干燥。四、結(jié)論酸棗仁抗焦慮物質(zhì)最佳工藝為稱取搗碎炒酸棗仁，加8倍量80%乙醇，回流三次，每次2h，濾液回收至相當(dāng)于原藥材0.2g/mL。將相當(dāng)于生藥l倍量的干樹脂用95。/o乙醇浸泡24h，充分溶脹，濕法裝柱，乙醇和水處理后，藥液上樣，流速為2.2mL/min，上樣完靜置2h，水洗至洗脫液無色，苯酚-硫酸顯陰性為止，再用4倍量樹脂床體積的50%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓干燥即可。五、本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)5.1工藝新穎酸棗仁中的有效成分為皂苷和黃酮類，研究表明，乙醇回流提取酸棗仁皂苷和黃酮類成分時(shí)，用60%的醇提取皂苷最佳，80%乙醇提取黃酮類含量最高。本發(fā)明中，酸棗仁中抗焦慮物質(zhì)以黃酮類成分為獲取目標(biāo)。首次運(yùn)用D101大孔吸附樹脂對(duì)酸棗仁中黃酮、皂苷類成分同步純化，實(shí)驗(yàn)測(cè)得，純化前所得固形物中總黃酮含量為10.03%，純化后含量為38.96%,純度提高288.43%，純化效率高。5.2藥效值得肯定在本發(fā)明中，前期采用傳統(tǒng)方法所得酸棗仁醇提物，給甲狀腺所致陰虛小鼠，劑量55mg/kg"d—i才取得抗焦慮效果。而現(xiàn)采用本發(fā)明提取、純化，所得醇提物，僅用12.5mg/kg，d—、就取得抗焦慮療效，這大大減小在制劑中的用量，節(jié)約了原料，且提高了療效。5.3工藝安全無毒關(guān)于酸棗仁中黃酮類成分提取、純化工藝，傳統(tǒng)多采用石油醚脫脂，乙醇提取、正丁醇萃取，此過程采用有毒試劑，造價(jià)高，大生產(chǎn)無法實(shí)現(xiàn)。而本發(fā)明不經(jīng)過有毒試劑，安全，能滿足工業(yè)生產(chǎn)，而且經(jīng)濟(jì)、高效，經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益巨大。權(quán)利要求1、一種從酸棗仁中提取抗焦慮物質(zhì)的方法，其特征在于，由以下步驟實(shí)現(xiàn)的(1)、對(duì)樹脂進(jìn)行預(yù)處理，方法是將D101大孔吸附樹脂加其重量體積10倍的95％乙醇浸泡24h，使其充分溶脹，濕法裝柱，用95％乙醇洗脫至流出液1份加5份水不出現(xiàn)混濁為止，再用蒸餾水洗脫，至無醇味，流速為2ml/min，備用；(2)、對(duì)炒酸棗仁乙醇回流提取，方法是，對(duì)酸棗仁炒制后，將炒制的酸棗仁搗碎，用乙醇回流提取三次，每次2h，每次用藥物重量體積8倍量的80％乙醇，合并三次濾液，減壓回收，得5倍原藥物重量體積的濃縮藥液，備用；(3)、用D101大孔吸附樹脂對(duì)濃縮藥液進(jìn)行純化，得純化酸棗仁抗焦慮物質(zhì)，方法是，對(duì)上述濃縮藥液上預(yù)處理好的D101大孔吸附樹脂進(jìn)行純化，流速為2.2mL/min，純化后靜置2h，用蒸餾水洗脫至無色，苯酚-硫酸顯陰性為止，再用4倍量樹脂床體積的50％乙醇洗脫，洗脫流速為2ml/min，收集洗脫液，減壓干燥得固形物，即為酸棗仁抗焦慮物質(zhì)，測(cè)定固形物中含酸棗仁總黃酮38.96％。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的從酸棗仁中提取抗焦慮物質(zhì)的方法，其特征在于，由以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)、對(duì)樹脂進(jìn)行預(yù)處理，方法是稱取D101大孔吸附樹脂100g，加1000mL的95。/。乙醇浸泡24h，使其充分溶脹，濕法裝柱，用95%乙醇洗脫至流出液1份加5份水不出現(xiàn)混濁為止，再用蒸餾水洗脫，至無醇味，流速為2ml/min，備用；(2)、對(duì)炒酸棗仁乙醇回流提取，方法是，對(duì)酸棗仁炒制后，將炒制的酸棗仁100g搗碎，用乙醇回流提取三次，每次2h，每次用800ml80%乙醇，合并三次濾液，減壓回收，得500ml濃縮藥液，備用；(3)、用D101大孔吸附樹脂對(duì)濃縮藥液進(jìn)行純化，得純化酸棗仁抗焦慮物質(zhì)，方法是，對(duì)上述濃縮藥液上預(yù)處理好的D101大孔吸附樹脂進(jìn)行純化，流速為2.2mL/min，純化后靜置2h，用蒸餾水洗脫至無色，苯酚-硫酸顯陰性為止，再用4倍量樹脂床體積的50%乙醇洗脫，洗脫流速為2ml/min，收集洗脫液，減壓干燥得固形物，即為酸棗仁抗焦慮物質(zhì)，測(cè)定固形物中含酸棗仁總黃酮38.96%。全文摘要本發(fā)明涉及從酸棗仁中提取抗焦慮物質(zhì)的方法，可有效解決提取率低，成本高，資源浪費(fèi)大的問題，其解決的技術(shù)方案是，對(duì)樹脂進(jìn)行預(yù)處理，即用乙醇對(duì)樹脂進(jìn)行浸泡，使其充分溶脹，濕法裝柱，用乙醇洗脫至流出液加水不出現(xiàn)混濁為止，再用蒸餾水洗脫至無醇味，將搗碎的酸棗仁用乙醇回流提取3次，合并濾液，減壓回收，再將濃縮液經(jīng)上述處理過的樹脂進(jìn)行純化，減壓干燥得固體物，即酸棗仁抗焦慮物質(zhì)，本發(fā)明方法獨(dú)特，特別是用D101大孔吸附樹脂對(duì)酸棗仁醇提物中黃酮、皂苷類成分進(jìn)行同步純化，至今未見有任何報(bào)導(dǎo)，該方法總黃酮得率高，純化度高，有效保證了酸棗仁醇提物的質(zhì)量和用于制備抗焦慮藥物的療效，為制備酸棗仁制備抗焦慮藥物作出創(chuàng)造性貢獻(xiàn)，造福于人類。文檔編號(hào)A61K36/185GK101401855SQ200810230920公開日2009年4月8日申請(qǐng)日期2008年11月17日優(yōu)先權(quán)日2008年11月17日發(fā)明者菊劉,瑛崔申請(qǐng)人:河南中醫(yī)學(xué)院