專利名稱：：一種硫酸鈣復(fù)合骨修復(fù)材料及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于組織工程領(lǐng)域，具體涉及一種硫酸鈣復(fù)合骨修復(fù)材料及其制備方法和用途。技術(shù)背景骨組織損傷是臨床上常見的多發(fā)病，如外力引起的骨折、骨自身的病變等。其中有些病變導(dǎo)致骨的大面積缺損，超過了骨自身修復(fù)能力的極限，或者由于病變引起骨組織功能的喪失等，此時(shí)需要通過手術(shù)，借助于生物材料來修復(fù)、替換缺損或病變的組織[1]。目前移植方式主要有自體骨移植和異體骨移植。自體骨移植無免疫排斥反應(yīng)，移植骨中的細(xì)胞和生物活性分子能在受體部位繼續(xù)存活，并發(fā)揮相應(yīng)功能，促進(jìn)骨缺損的愈合，這是其它材料所無法比擬的，但這種方法取骨量有限，其尺寸和形狀常常受到限制，且供骨區(qū)容易發(fā)病，增加病人痛苦[2]。同種異體骨能提供大量不同形狀、尺寸的皮質(zhì)骨或松質(zhì)骨，但它容易引起免疫排斥反應(yīng)，在骨缺損邊緣與宿主骨的連接速度很慢，并有傳播病毒性疾病的危險(xiǎn)，而且制樣、處理和存貯的成本高，故其應(yīng)用受到很大限制[3]。為了克服這些局限，人們開始研究人工骨修復(fù)材料。目前用于骨修復(fù)的基質(zhì)材料可概括為兩大類，一類是生物骨修復(fù)材料，它們是由天然基質(zhì)轉(zhuǎn)化而得的材料，如熱處理轉(zhuǎn)化的珊瑚材料、生物陶瓷、脫鈣骨基質(zhì)(decalcifiedbonematrix,DBM)等。另一類是全合成材料，如聚乳酸(polylacticacid，PLA)，聚輕基乙酸(polyglycolicacid，PGA)及其共聚物((poly-lacticacid-co-glycolicacid，PLGA)等，這些材料可用人工方法構(gòu)造成多孔質(zhì)材料E4]。由海洋無脊椎動(dòng)物而得到的珊瑚具有與皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨相似的結(jié)構(gòu)。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用證實(shí)，微血管能長入珊瑚移植塊中，而后轉(zhuǎn)化為成熟骨板，其生長過程與自體骨修復(fù)所觀察到的現(xiàn)象相似。到目前為止，珊瑚植入塊己經(jīng)成功地應(yīng)用于干骺端骨缺損的修復(fù)，但易產(chǎn)生結(jié)合不完全的現(xiàn)象并缺乏塑型[5]，用于長骨損傷修復(fù)存在一定困難，珊瑚骨也不易產(chǎn)業(yè)化[6]。生物陶瓷包括輕基磷灰石(hydroapatite，HA)、三磷酸鈣(tricalciumphosphate,TCP),生物活性玻璃(bioglass，BG)等，是生物相容性很好、成分接近正常骨組織且具有一定力學(xué)強(qiáng)度的骨修復(fù)替代材料[7』]，也是骨科領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一，但降解速度太慢，脆性大，受力時(shí)容易破碎[9]。脫鈣骨基質(zhì)(DBM)中含有骨形態(tài)形成蛋白(bonemorphogenicproteins,BMPs)，具有骨誘導(dǎo)作用，是一種良好的修復(fù)材料。Glowacki[W人在臨床上用DBM成功地修復(fù)了顱骨缺損。RobertU"用DBM治療骨不連、骨腫瘤等骨科難癥，進(jìn)行了長達(dá)8年的跟蹤觀察，結(jié)果21個(gè)病人中18人完全痊愈，說明DBM是治療骨缺損的良好材料。然而Becker等[12]報(bào)道移植手術(shù)后脫鈣骨材料被吸收，沒有成骨作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。而且DBM材料力學(xué)強(qiáng)度小，缺乏支撐作用，且大量使用有一定免疫排斥反應(yīng)[13]。合成聚合物具有性能可控、無免疫排斥反應(yīng)以及生物相容性良好等優(yōu)點(diǎn)，從20世紀(jì)60年代中期，就開始用作修復(fù)材料[14]。其中據(jù)聚乳酸(PLA)，聚乙酸(PGA)以及兩者共聚物PLGA是目前應(yīng)用最廣的幾種可降解性材料。PLA是一種具有一定機(jī)械強(qiáng)度和良好加工性能的生物降解性材料，可以以不同形式結(jié)合生長因子或其它化合物制備多相釋放系統(tǒng)，有利于促進(jìn)骨的生長，并可根據(jù)骨缺損的形狀和大小制成適合骨生長的三維結(jié)構(gòu)[1^6]。PLA在骨組織工程的一些實(shí)驗(yàn)研究中表現(xiàn)出良好的骨修復(fù)作用，但同時(shí)也反映出一些不足之處，如強(qiáng)度不足，降解產(chǎn)物呈酸性不利于骨細(xì)胞生長[17]。硫酸鈣用作骨缺損填充修復(fù)材料已經(jīng)達(dá)百年之久，1892年Dreesman首先報(bào)道硫酸鈣作為骨填充劑的應(yīng)用研究，其具有良好的生物相容性，在體內(nèi)能夠被降解吸收，不引起免疫反應(yīng)，對(duì)周圍組織不產(chǎn)生炎癥和異物刺激作用，并能促進(jìn)骨再生。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)[1&19]都證明硫酸鈣的生物相容性和用作骨修復(fù)材料的可行性。硫酸鈣價(jià)格便宜，來源豐富，滅菌方便，目前已廣泛應(yīng)用于矯形外科、五官科、齒科骨缺損的填充。普通硫酸鈣作為植入材料有很大的局限，如材料的無菌性、熱穩(wěn)定性、吸收速度等?，F(xiàn)在臨床上應(yīng)用的醫(yī)用硫酸鈣，其生產(chǎn)工藝受到嚴(yán)格控制，晶體顆粒大小、形狀可以設(shè)計(jì)，這樣的硫酸鈣材料有穩(wěn)定的降解吸收速度。AlRuhaimiKA等。^利用硫酸鈣作為修復(fù)材料來觀察兔子的骨缺損修復(fù)，研究實(shí)驗(yàn)表明硫酸鈣可被吸收，而且在4周時(shí)缺損邊緣的骨能夠再生，軟組織之間的間隙也能夠修復(fù)，進(jìn)一步研究結(jié)果表明硫酸鈣可以加速骨的形成和鈣化[21]。SidquiM。2]等的體外研究表明，成骨細(xì)胞附著于硫酸鈣，在此基礎(chǔ)上成骨，而破骨細(xì)胞吸收硫酸鈣。GitelisS等。3]利用硫酸鈣作為骨修復(fù)材料對(duì)23個(gè)骨缺損病人進(jìn)行了觀察，效果較好，研究實(shí)驗(yàn)表明硫酸鈣是一種具有良好的生物相容性、生物可降解性和骨傳導(dǎo)性的骨修復(fù)替代材料。鍶是人體骨骼及牙齒的正常組成部分，人體99%的鍶蓄積于骨骼，在骨中的含量約占骨重量的0.01%鍶在骨骼和牙齒的沉積過程可分為快速沉積和緩慢滲入兩種形式。前者是血液中的鍶通過離子交換、表面吸收與血漿蛋白結(jié)合而沉積于骨質(zhì);后者是成骨過程中，血液中的鍶緩慢進(jìn)入骨晶格中而沉積。金屬鍶及其化合物屬于無毒或低等毒性。食物和飲水中的鍶含量有一個(gè)相當(dāng)寬的安全范圍，在這個(gè)范圍內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生及誘導(dǎo)毒作用。迄今尚未在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用金屬鍶及其化合物引起職業(yè)中毒的報(bào)告。在鍶的慢性毒性實(shí)驗(yàn)中[24]，采用16000mg/L的乳酸鹽水溶液喂飼小鼠42天，小鼠生長變得遲緩，過量的鍶明顯抑制了發(fā)育中骨骼的鈣化。給大鼠反復(fù)腹腔注射氯化鍶，直至其骨骼無機(jī)成分含量升至7%，未發(fā)現(xiàn)鍶佝僂變化。對(duì)于鍶的生理功能的研究，過去報(bào)道最多的主要集中于鍶在防止齲齒方面的作用。而最近幾年以來，由于關(guān)于鍶具有促進(jìn)成骨細(xì)胞生長和抑制破骨細(xì)胞形成的作用，可以促進(jìn)骨骼的生長[25]以及在治療骨質(zhì)疏松癥方面的研究越來越多。骨科雜志Bone自1996年以來，每年均有關(guān)于鍶治療骨質(zhì)疏松癥的藥劑方面的文章發(fā)表。Canalis。^等人對(duì)口服鍶鹽512911的研究發(fā)現(xiàn)，該含鍶鹽細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，DNA合成量是空白組的3-4倍，成骨細(xì)胞增殖是空白組的3-5倍。Grynpas。7]等人發(fā)現(xiàn)，少量的鍶能促進(jìn)兔缺損脊椎骨的恢復(fù)，并且不會(huì)導(dǎo)致骨礦化缺陷。Buehler。^等人對(duì)猴子進(jìn)行口服S12911的研究發(fā)現(xiàn)，適量的S12911能抑制猴子牙槽骨的骨吸收，同時(shí)增進(jìn)其骨形成。Mari。^等人發(fā)現(xiàn)在飲食中適量攝入鍶可以促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收。對(duì)成年大鼠連續(xù)服用2年銘鹽，可以觀察到骨骼強(qiáng)度得到明顯提高[3<)]。Amma皿^"等人研究發(fā)現(xiàn)鍶元素有利于增強(qiáng)脊椎骨的強(qiáng)度和韌性。從以上的研究結(jié)果可以看出，適量的鍶能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，同時(shí)能抑制骨吸收，從而加速骨修復(fù)，并能一定程度提高骨骼的強(qiáng)度和韌性?？诜J過多，對(duì)其他系統(tǒng)的機(jī)能會(huì)有不利的影響。傳統(tǒng)的硫酸鈣骨修復(fù)材料具有的缺陷使其在臨床應(yīng)用上受到很大的限制，本領(lǐng)域研制需要研究性質(zhì)更為優(yōu)異，并且非常安全的新型骨修復(fù)材料。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供了一種具有很好的理化性能、生物活性及生物相容性的硫酸鈣復(fù)合材料。該硫酸鈣復(fù)合材料是由硫酸鈣與含鍶的化合物組成。所述的含鍶化合物為鍶的氧化物、鍶的氫氧化物或鍶鹽。其中，上述硫酸鈣復(fù)合材料中鍶的摩爾量占鈣和鍶總摩爾量的O.01%5%。優(yōu)選的，上述硫酸鈣復(fù)合材料中鍶的摩爾量占鈣和鍶總摩爾量的O.1%2%。更優(yōu)選的，上述硫酸鈣復(fù)合骨修復(fù)材料中鍶的摩爾量占鈣和鍶總摩爾量的O.1%1%，最優(yōu)為O.3%7%，尤其是O.5%。其中，上述的硫酸鈣為a-半水硫酸鈣。其中，上述鍶的鹽為鍶的鹽酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽或硫酸鹽。本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供了上述硫酸鈣復(fù)合材料在制備骨修復(fù)材料中的用途。本發(fā)明所要解決的第三個(gè)技術(shù)問題是提供了一種制備上述硫酸鈣復(fù)合骨修復(fù)材料的方法，該方法包括以下步驟a、取硫酸鈣、含鍶的化合物，混合后，在研缽中研磨混合均勻得混合粉末，干燥備用b、將步驟a所得的混合粉末和固化液調(diào)和均勻成漿體，將調(diào)好所得的漿體填充入模具，去除氣泡，固化后脫模即得復(fù)合材料。上述的固化液可為生理鹽水或去離子水。本發(fā)明所要解決的第四個(gè)技術(shù)問題是提供了一種骨修復(fù)材料。該骨修復(fù)材料是由上述的硫酸鈣復(fù)合材料添加可接受的輔料制備而成的。本發(fā)明創(chuàng)造性地將鍶元素?fù)饺氲结t(yī)用硫酸鈣中復(fù)合以增加材料的活性，使得到的復(fù)合材料能在骨缺損部位的修復(fù)過程中局部緩慢釋放促進(jìn)成骨的元素鍶，并可用于骨修復(fù)。并且經(jīng)過體內(nèi)外試驗(yàn)證明本發(fā)明硫酸鈣復(fù)合材料的具有很好的理化性能、生物活性、生物相容性，能被成骨細(xì)胞很好的附著，克服了現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，是一種優(yōu)秀的骨修復(fù)材料。本發(fā)明制備方法簡單，可靠，具有很好的應(yīng)用前景。圖l橈骨骨缺損模型各組修復(fù)情況，A:空白對(duì)照組術(shù)后12周；B:摻鍶硫酸鈣組術(shù)后4周；C:摻鍶硫酸鈣組術(shù)后8周；D:摻鍶硫酸鈣組術(shù)后12周；E:a—半水硫酸鈣組術(shù)后4周；F:a—半水硫酸鈣組術(shù)后8周；G:a—半水硫酸鈣組術(shù)后12周。圖2股骨髁模型各組修復(fù)情況，A:空白對(duì)照組術(shù)后12周；B:摻鍶硫酸鈣組術(shù)后4周；C:摻鍶硫酸鈣組術(shù)后8周；D:摻鍶硫酸鈣組術(shù)后12周；E:a—半水硫酸鈣組術(shù)后4周；F:a—半水硫酸鈣組術(shù)后8周；G:a—半水硫酸鈣組術(shù)后12周。圖3術(shù)后12周尺橈骨最大載荷。圖4術(shù)后12周股骨髁壓縮強(qiáng)度。具體實(shí)施方式實(shí)施例一本發(fā)明硫酸鈣復(fù)合材料的制備1、粉末的制取取a-半水硫酸鈣(a-CSH)、氯化鍶(SrCl2)，分別按表l所示下摩爾比混合(下同)，在研缽中研磨混合均勻，過400目篩，干燥備用，所用試劑均為分析純。表l各種硫酸鈣復(fù)合材料的配方<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2、固化液的配制確定液固比液固比將直接影響凝結(jié)時(shí)間及材料的力學(xué)性能。因此，在測(cè)定摻鍶硫酸鈣的凝結(jié)時(shí)間和壓縮強(qiáng)度之前，首先確定了最佳液固比。原則是:使粉末材料達(dá)到完全一致調(diào)和時(shí)的最小液固比即為最佳液固比。按上述原則，通過實(shí)驗(yàn)，確定配方中的液固比為0.3-0.5ml/g，最佳為0.35ml/g，固化液可為生理鹽水或去離子水。3、固化體的制備材料混合粉末和固化液(去離子水)按液固比^.35ml/g的比例，勻調(diào)和60秒，將調(diào)好的漿體填充入5mmX12mm的圓柱形和15mmX2mm的圓盤形模具，用調(diào)拌刀施加一定的壓力兩端壓平，盡可能地去除氣泡，于37'C，100%的濕度環(huán)境中固化。固化lh后脫模，即得硫酸鈣復(fù)合材料(也可叫摻鍶硫酸鈣復(fù)合材料或摻鍶硫酸鈣材料)。試驗(yàn)例一本發(fā)明硫酸鈣復(fù)合材料的體外生物學(xué)性能試驗(yàn)試驗(yàn)材料取實(shí)施例一中用a-半水硫酸鈣(a-CSH)和氯化鍶(SrCl2)采用混合法制得的6組不同摻鍶量的摻鍶硫酸鈣復(fù)合材料，其鍶元素摩爾含量分別為O、0.1%、0.3%、0.5%、1%和2%。并分別將材料加工成5mmX12mm的柱狀和15mmX2mm的盤狀。試驗(yàn)項(xiàng)目和結(jié)果1、物理結(jié)構(gòu)和性能試驗(yàn)用掃描電鏡觀察材料的晶體形態(tài)，測(cè)試各組柱狀材料的抗壓強(qiáng)度。檢測(cè)方法為將上述壓制成的材料脫模后，放入37'C恒溫箱中保持7天。兩端磨平，卡尺精確測(cè)量每一試件的直徑和高度。用AG-10TA電子萬能材料試驗(yàn)機(jī)電子式萬能試驗(yàn)機(jī)測(cè)定試樣的壓縮強(qiáng)度，參照GB/T8489-2006標(biāo)準(zhǔn)加載速度為0.2mm/min，每組10個(gè)試樣。結(jié)果表明制得的各組摻鍶硫酸鈣復(fù)合材料具有均質(zhì)易于加工的特點(diǎn)，氯化鍶的摻入不會(huì)影響硫酸鈣材料的大體外觀，但會(huì)影響到a-半水硫酸鈣的晶體形態(tài)，當(dāng)摻鍶量達(dá)到2%時(shí)，晶體形態(tài)較不均勻，晶體排列比較稀疏。沒有摻鍶的硫酸鈣材料的初始抗壓強(qiáng)度為36.65±2.22Mpa，隨著摻鍶量的增加，抗壓強(qiáng)度有逐漸下降的趨勢(shì)，當(dāng)摻鍶量為2%時(shí)材料初始抗壓強(qiáng)度下降到20.56±2.64Mpa。氯化鍶的摻入在一定程度上改變了硫酸鈣的晶型，并且隨著摻鍶量的增加材料的力學(xué)強(qiáng)度下降。鍶在元素周期表中與鈣同族，鍶和鈣的原子半徑分別為1.13A和0.99A。W，半徑差別小于l5%，用鍶元素?cái)v雜于硫酸鈣可形成置換式固溶體。由于鍶和鈣之間原子半徑和性質(zhì)的差異，鍶的摻入會(huì)使原有晶格發(fā)生畸變。當(dāng)摻鍶量在0.5%以內(nèi)時(shí)，材料的力學(xué)強(qiáng)度下降尚不十分明顯，仍能保持在20MPa以上，如植入體內(nèi)仍能提供較好的支撐強(qiáng)度。但當(dāng)摻鍶量進(jìn)一步增加，材料的力學(xué)強(qiáng)度就開始出現(xiàn)了明顯的下降。2、在模擬體液(SBF)中的降解實(shí)驗(yàn)用模擬體液(SBF)作為降解液來對(duì)材料進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)，并觀測(cè)降解過程中的一些指標(biāo)1)pH值變化，2)重量變化，3)抗壓強(qiáng)度變化，4)降解液中鍶離子濃度變化，結(jié)果見下。隨著不同摻鍶量的6組材料在SBF中降解時(shí)間的增加，其溶液pH值均有一定的下降，不同摻鍶量的材料在降解過程中pH值的變化均較穩(wěn)定，降解12周后pH值下降均不到O.2個(gè)單位。不同摻鍶量的材料在SBF中降解均會(huì)導(dǎo)致失重率的增加。前4周各組材料的重量變化相對(duì)較小，而4周過后失重率有增加的趨勢(shì)。與不摻鍶的硫酸鈣材料比較，摻鍶量為O.1%和0.3%的硫酸鈣材料的失重率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異(P=0.988，P=0.158)，隨著摻鍶量的進(jìn)一步增加，材料的失重率變化有增加的趨勢(shì)(P〈0.05)。摻鍶量為O.1%和0.3%(P=0.581)、0.3%和0.5%(P=0.166)的材料之間失重率變化沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異?？偟内厔?shì)是隨著摻鍶量的增加，材料在降解過程中的失重率將會(huì)增大。隨著降解時(shí)間的延長，各組材料的強(qiáng)度均下降。摻鍶量為O、0.1%、0.3%和0.5%的材料降解前4周的強(qiáng)度下降都比較緩慢，而當(dāng)摻鍶量進(jìn)一步增加后，摻鍶量為1%和2%的材料降解過程中強(qiáng)度下降就較快。與沒有摻鍶的硫酸鈣相比所有摻鍶材料的強(qiáng)度變化都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.0001，Dunnetttest)。在SBF中降解8周過程中，降解液的Sr離子濃度從第四周開始增長加快，且材料的摻鍶量越大，鍶離子濃度越高(P〈0.001)，到第八周時(shí)，含鍶量為O.1%材料降解液的鍶離子濃為64.63±9.47ymol/L，含鍶量為2%材料降解液的鍶離子濃度為175.64±11.25ymol/L。3、體外細(xì)胞毒性和相容性試驗(yàn)選擇R0S17/2.8成骨樣細(xì)胞株采用浸提液法和細(xì)胞直接接觸法對(duì)各種摻鍶比例的硫酸鈣復(fù)合材料的生物相容性進(jìn)行評(píng)價(jià)，進(jìn)行了嚴(yán)格的材料細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，并且對(duì)成骨樣細(xì)胞在材料表面的生長形態(tài)、增殖及功能代謝等方面進(jìn)行了多方面的觀測(cè)。具體方法為用各組材料浸提液來進(jìn)行ROS17/2.8成骨樣細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，同時(shí)設(shè)立正常細(xì)胞組和加入了苯酚的陽性對(duì)照組，并用MTT法來檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。對(duì)正常對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行細(xì)胞堿性磷酸酶活性測(cè)定和堿性磷酸酶酶組織化學(xué)染色來反應(yīng)材料對(duì)成骨細(xì)胞功能的影響。將R0S17/2.8成骨樣細(xì)胞接種到各組盤狀摻鍶硫酸鈣復(fù)合材料上進(jìn)行共培養(yǎng)，并設(shè)立正常對(duì)照組，分別在培養(yǎng)后2天和4天對(duì)材料上細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并在第4天進(jìn)行掃描電鏡觀察細(xì)胞生長情況。結(jié)果及分析如下材料浸提液實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，幾種不同摻鍶量的材料浸提液對(duì)R0S17/2.8細(xì)胞均未出現(xiàn)毒性反應(yīng)，細(xì)胞和在浸提液培養(yǎng)條件下均生長良好，細(xì)胞形態(tài)與正常對(duì)照組相比沒有差別，表明這幾種材料無毒副作用。試驗(yàn)結(jié)論為各組摻鍶硫酸鈣復(fù)合材料均無細(xì)胞毒性，細(xì)胞在其中生長形態(tài)正常。MTT檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果為在培養(yǎng)到4天后與正常對(duì)照組相比含鍶量為0.5%的材料的細(xì)胞增殖率開始增高，隨著培養(yǎng)時(shí)間的進(jìn)一步增加各含鍶材料的細(xì)胞增殖率都開始比正常對(duì)照組增高。其中含鍶量為0.5%和1%的材料的細(xì)胞增殖率較其它含鍶量材料的高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果值顯示細(xì)胞在各組摻鍶硫酸鈣復(fù)合材料浸提液中增殖均正常，其摻鍶硫酸鈣復(fù)合材料浸提液對(duì)細(xì)胞增殖有一定的促進(jìn)作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05)。堿性磷酸酶組織化學(xué)染色和活性分析結(jié)果示摻鍶材料會(huì)增加成骨細(xì)胞堿性磷酸酶的活性(P〈0.05)，且當(dāng)含鍶量為O.5%時(shí)最明顯。本實(shí)驗(yàn)的堿性磷酸酶組織化學(xué)染色和活性測(cè)定均表明不同摻鍶量的硫酸鈣復(fù)合材料對(duì)細(xì)胞的功能沒有造成不良影響，相反當(dāng)摻鍶量為O.31%時(shí)可以提高細(xì)胞的堿性磷酸酶活性。酶的活性改變先于形態(tài)學(xué)的改變，而形態(tài)學(xué)的改變又先于細(xì)胞數(shù)量的改變。各種材料浸提液培養(yǎng)后的堿性磷酸酶活性改變與細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致表明了摻鍶硫酸鈣復(fù)合材料當(dāng)摻鍶量達(dá)到一定濃度范圍時(shí)其對(duì)細(xì)胞的活力與功能有促進(jìn)作用。鍶對(duì)骨再生的影響主要在于對(duì)骨吸收和骨形成的影響[12]。在體內(nèi)，鍶能抑制骨吸收同時(shí)可以刺激骨的形成，研究表明鍶對(duì)骨內(nèi)膜的形成和造骨細(xì)胞的功能有著直接影響[13]。因此，可能是材料降解釋放出來的鍶與細(xì)胞接觸后，起到在仿生環(huán)境中的作用，從而促進(jìn)了細(xì)胞的增殖和ALP的表達(dá)。細(xì)胞與各組摻鍶硫酸鈣復(fù)合材料共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)分別將細(xì)胞接種于不同摻鍶量的硫酸鈣復(fù)合材料和聚乙烯對(duì)照材料上，培養(yǎng)2天、4天后分別消化制成懸液，在鏡下計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨培養(yǎng)時(shí)間延長，每種材料上的細(xì)胞數(shù)逐漸增多，各組摻鍶硫酸鈣復(fù)合材料和對(duì)照組相比無明顯差別。但掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)摻鍶量為O.3%和0.5%的材料上的細(xì)胞形態(tài)更加飽滿，這間接說明了一定的摻鍶濃度可以促進(jìn)材料的細(xì)胞相容性。細(xì)胞與各組摻鍶硫酸鈣復(fù)合共培養(yǎng)結(jié)果示，細(xì)胞能與材料緊密貼附，并能在其上正常生長。共培養(yǎng)2天和4天后，各組摻鍶硫酸鈣復(fù)合細(xì)胞計(jì)數(shù)與正常對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。綜上所述，摻鍶量在O.1-2%內(nèi)時(shí)，本發(fā)明摻鍶硫酸鈣復(fù)合材料具有良好的成骨細(xì)胞相容性，對(duì)成骨細(xì)胞的增殖、形態(tài)發(fā)育以及功能都具有促進(jìn)作用，且當(dāng)摻鍶量在0.3-1%范圍內(nèi)時(shí)作用較優(yōu)，摻鍶量0.5%左右時(shí)候尤佳。該硫酸鈣復(fù)合材料具有作為骨修復(fù)材料使用的前景。實(shí)施例二本發(fā)明硫酸鈣復(fù)合材料體內(nèi)組織相容性實(shí)驗(yàn)由于生物材料的組織相容性是生物醫(yī)用材料研究中首先考慮的重要問題。組織相容性是指生物材料與人體組織接觸后，在材料一組織界面發(fā)生一系列相互作用，最終被人體組織所接受的性能。肌內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)觀察材料植入體內(nèi)后引起的組織學(xué)變化是目前組織相容性評(píng)價(jià)的主要體系。細(xì)胞內(nèi)酶控制著細(xì)胞的生命活動(dòng)，當(dāng)受到外來因素刺激時(shí)，相應(yīng)酶系活性的改變比細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化更早更敏感。先前的實(shí)施例已證明摻鍶量為O.5%的摻鍶硫酸鈣的體外物理、降解特性和細(xì)胞相容性最佳，因此本實(shí)施例采用體內(nèi)肌內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮谝话阈螒B(tài)學(xué)評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上考察實(shí)施例一制備的摻鍶硫酸鈣復(fù)合材料與體內(nèi)組織細(xì)胞相互作用后引起的細(xì)胞功能標(biāo)志酶活性的變化，從而對(duì)材料的組織相容性進(jìn)行系統(tǒng)的評(píng)價(jià)。1材料和方法1.1植入材料及主要試劑a-半水硫酸鈣(成都七星科技有限公司提供)；0.5%摻鍶硫酸鈣復(fù)合材料(實(shí)施例一制備)；酶組織化學(xué)相關(guān)試劑(美國Sigma公司)。1.2主要設(shè)備深低溫冰箱(日本Sanyo公司)；真空干燥箱(德國Heto公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)；冰凍切片機(jī)(Leica公司)石蠟組織切片機(jī)(Leica公司)。1.3動(dòng)物模型和分組12只健康新西南兔，雌雄不限，重量2.0-2.5kg，分組如下(1)在L4一L5棘突間隙兩旁骶棘肌切開后不植入材料，為單純創(chuàng)口組；(2)在L5—L6棘突間隙兩旁骶棘肌切開后各植入一塊5X5mm的a—半水硫酸韓，為對(duì)照組；(3)在L6—L7棘突間隙兩旁骶棘肌切開后各植入一塊5X5mm的0.5%摻鍶硫酸鈣，為實(shí)驗(yàn)組10%水合氯醛腹腔注射麻醉，劑量2.5mL/kg。麻醉生效后兔背部術(shù)野去毛備皮，沿腰椎棘突連線中線切開皮膚，然后離腰椎棘突連線左右各約3cm切開皮下，顯露腰背肌，止血鉗順肌纖維方向鈍性分離造肌袋。沿脊柱兩側(cè)分別植入各組相應(yīng)的材料，同側(cè)植入點(diǎn)間距為5cm。術(shù)前30min—次性肌注青霉素40萬u。分別于手術(shù)后l周，2周，4周，8周四個(gè)時(shí)間段各處死3只兔子取材。取材范圍為植入體周圍1厘米范圍的肌肉組織。將材料從包裹的肌肉組織中去除后從中橫斷肌肉組織，分別進(jìn)行形態(tài)組織學(xué)和酶組織化學(xué)觀察。1.4觀察指標(biāo)1.4.1大體觀察觀察術(shù)后兔子的活動(dòng)、飲食和二便情況。1.4.2組織學(xué)觀察常規(guī)固定、石蠟包埋、切片，每一區(qū)域各時(shí)間點(diǎn)做3張平行切片，HE染色，光鏡觀察細(xì)胞和肌肉組織的形態(tài)學(xué)變化。1.5酶組織化學(xué)觀察植入材料周圍組織冰凍切片(厚度約5um)。每種酶同時(shí)染色3張切片。選擇2種主要細(xì)胞器的標(biāo)志酶，分別為細(xì)胞線粒體膜的標(biāo)志酶細(xì)胞色素氧化酶(CCO)，其活性強(qiáng)弱代表細(xì)胞有氧氧化的水平；胞漿膜的標(biāo)志酶乳酸脫氫酶(LDH)，為無氧酵解關(guān)鍵酶以及肌細(xì)胞溶酶體膜的標(biāo)志酶。細(xì)胞色素氧化酶(CCO)采用DAB法，酶活性顯示為棕色；乳酸脫氫酶(LDH)采用四唑鹽法，酶活性顯示為藍(lán)色；正常骨骼肌細(xì)胞內(nèi)CCO和LDH為陽性表達(dá)。鏡下觀察得出計(jì)數(shù)資料，整理成等級(jí)資料。染色強(qiáng)度分為4個(gè)等級(jí)陰性(0)，陽性(l)，強(qiáng)陽性(2)，和極強(qiáng)陽性(3)。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有計(jì)量數(shù)據(jù)均以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差P士s)表示，以SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以P〈0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1大體觀察所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后l-3小時(shí)恢復(fù)活動(dòng)，l天后進(jìn)食正常。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物傷口均一期愈合。術(shù)后傷口無紅腫、感染等術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生。2.2組織學(xué)觀察摻鍶硫酸鈣復(fù)合材料組術(shù)后lw，植入體周圍的肌纖維斷裂，周圍組織內(nèi)有較多中性粒細(xì)胞浸潤，由成纖維細(xì)胞組成厚薄不均、結(jié)構(gòu)疏松的纖維囊壁。術(shù)后2—4w，植入體周圍組織內(nèi)的中性粒細(xì)胞減少，出現(xiàn)了淋巴細(xì)胞浸潤，淋巴細(xì)胞多于中性粒細(xì)胞；可見纖維囊腔壁部分疏松，部分致密，厚薄不均，由少量成纖維細(xì)胞及纖維細(xì)胞組成。術(shù)后8w，植入體周圍組織內(nèi)未見炎性細(xì)胞浸潤，纖維囊腔壁進(jìn)一步變薄，主要成分為膠原纖維和成纖維細(xì)胞?？傮w來說，隨植入時(shí)間的延長，炎細(xì)胞浸潤越來越少，包膜先變厚再變薄。a-半水硫酸鈣組與摻鍶硫酸鈣組沒有明顯差異，術(shù)后8周植入體周圍沒有炎性細(xì)胞浸潤，纖維囊壁較薄。單純創(chuàng)口組術(shù)后lw，切口處肌纖維斷裂，有少量中性粒細(xì)胞浸潤，無纖維囊壁形成。術(shù)后2—4w，炎性細(xì)胞進(jìn)一步減少，幾乎消失，可見大量纖維母細(xì)胞和波浪狀的膠原纖維以及新生毛細(xì)血管，成纖維細(xì)胞和成纖維母細(xì)胞穿行于肌肉間。術(shù)后8w，炎性細(xì)胞消失，創(chuàng)口周圍肌肉組織形態(tài)、排列恢復(fù)正常，有少量條索狀斑痕組織(圖2C)。2.3酶組織化學(xué)染色正常骨骼肌的CCO和LDH在肌細(xì)胞中表現(xiàn)為強(qiáng)陽性，且染色均勻，相比于正常骨骼肌，摻鍶硫酸鈣組和a-半水硫酸鈣組周邊肌細(xì)胞在l周時(shí)CCO和LDH均活性減弱(p〈0.05)，2周時(shí)CCO和LDH活性均恢復(fù)正常(P>0.05)，其后活性無明顯變化(P〉0.05)。兩組之間兩兩比較無明顯差異(P〉0.05)。單純創(chuàng)口組CC0和LDH也均在術(shù)后2周時(shí)恢復(fù)正常，與摻鍶硫酸鈣組和a-半水硫酸鈣組相比沒有明顯差異(pX).05)。大量的實(shí)驗(yàn)己經(jīng)證明a-半水硫酸鈣具有良好的組織相容性，在體內(nèi)降解過程中對(duì)機(jī)體無不良反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在a-半水硫酸鈣和摻鍶硫酸鈣材料植入初期均有不同程度的急性炎癥反應(yīng)，這可能與手術(shù)創(chuàng)傷，材料機(jī)械作用及機(jī)體對(duì)異物產(chǎn)生輕度的排斥反應(yīng)有關(guān)，其組織學(xué)變化與單純創(chuàng)傷組相似都是非感染性炎癥反應(yīng)。這種炎性反應(yīng)隨著時(shí)間的延長而減輕，最終消失。摻鍶硫酸鈣材料周圍的纖維薄膜與a-半水硫酸鈣組的薄膜相似，都經(jīng)歷了早期形成后逐漸變薄的過程，這些變化符合具有良好組織相容性的生物材料植入機(jī)體后的炎性反應(yīng)變化規(guī)律。酶組織化學(xué)早已被證實(shí)是研究生物材料植入體內(nèi)后對(duì)組織細(xì)胞毒性的一項(xiàng)較為敏感的指標(biāo)。因此本實(shí)驗(yàn)采用酶組織化學(xué)的方法來檢測(cè)摻鍶硫酸鈣生物材料植入體內(nèi)后對(duì)組織細(xì)胞的損害，選用了肌細(xì)胞有氧代謝的2個(gè)關(guān)鍵酶，從亞細(xì)胞的水平來更加靈敏、準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)材料的生物相容性。本研究結(jié)果顯示在摻鍶硫酸鈣材料植入早期，材料周圍肌細(xì)胞的CCO和LDH酶的活性下降，但在術(shù)后2周即恢復(fù)，這一變化過程與單純創(chuàng)傷組和a-半水硫酸鈣組一致。摻鍶硫酸鈣組與a-半水硫酸鈣組及單純創(chuàng)傷組相一致的酶組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果說明了摻鍶硫酸鈣材料植入體內(nèi)后早期出現(xiàn)的CCO和LDH活性下降的原因可能是因?yàn)槭中g(shù)損傷和機(jī)械刺激導(dǎo)致的急性無菌性炎癥反應(yīng)使肌細(xì)胞的呼吸鏈?zhǔn)艿綋p害，而非材料對(duì)組織的毒性所造成的組織損傷；在早期的無菌性炎癥反應(yīng)過后，呼吸鏈即得以恢復(fù)，CCO和LDH的活性恢復(fù)正常。這一結(jié)果表明了摻鍶硫酸鈣有著良好的組織相容性。實(shí)施例四使用本發(fā)明硫酸鈣復(fù)合材料修復(fù)骨缺損臨床上，創(chuàng)傷、感染、腫瘤等許多傷病都能導(dǎo)致骨結(jié)構(gòu)缺損，當(dāng)骨缺損范圍超過了骨自身修復(fù)能力的極限或者由于病變引起骨組織功能的喪失時(shí)，則需要通過外科途徑，并借助于生物材料來修復(fù)骨缺損或取代病變組織，即使用骨移植修復(fù)物來填充缺損、消滅死腔，以恢復(fù)病變處的形態(tài)結(jié)構(gòu)、力學(xué)強(qiáng)度和解剖功能。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這種本發(fā)明摻鍶硫酸鈣復(fù)合材料能否作為良好的骨修復(fù)生物材料，本實(shí)施例將用摻鍶硫酸鈣復(fù)合材料作為骨修復(fù)材料來進(jìn)行兔橈骨節(jié)段性骨缺損和兔股骨髁腔隙性骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)。1材料和方法1.1主要材料及試劑a-半水硫酸鈣(成都七星科技有限公司提供)；0.5%摻鍶硫酸鈣復(fù)合材料(實(shí)施例一制備)；組織染色相關(guān)試劑(美國Sigma公司)。1.2主要設(shè)備倒置顯微鏡(日本OIYMPUS公司)；石蠟組織切片機(jī)(美國Leica公司)；AG-IOTA電子萬能材料試驗(yàn)機(jī)(日本島津shimadzu公司)；ToshibaKX0ISR型X線機(jī)(日本東芝公司)。1.3動(dòng)物模型和分組在評(píng)價(jià)骨修復(fù)材料修復(fù)骨缺損的研究中，橈骨大段骨缺損模型和股骨髁鉆孔模型是兩種最常用的動(dòng)物模型。橈骨大段骨缺損為節(jié)段性骨缺損，主要用于評(píng)價(jià)形態(tài)規(guī)則(比如為柱形或條形)的骨修復(fù)材料，而且要求材料有一定的機(jī)械強(qiáng)度，能對(duì)皮質(zhì)骨缺損區(qū)域起到一定的支撐作用。股骨髁鉆孔制造的是松質(zhì)骨區(qū)的腔隙性骨缺損，(或稱包容性骨缺損)，這種缺損模型對(duì)骨修復(fù)材料的機(jī)械性能和形態(tài)沒有特殊的要求，適合評(píng)價(jià)顆粒型或機(jī)械強(qiáng)度較低的骨修復(fù)材料。對(duì)于兔橈骨節(jié)段性骨缺損模型而言，要求骨缺損至少要在15mm以上，否則骨缺損會(huì)自行修復(fù)。課題組的經(jīng)驗(yàn)也證實(shí)了當(dāng)骨缺損為15mm時(shí)，其缺損區(qū)域在12—14周內(nèi)會(huì)出現(xiàn)自行修復(fù)，而當(dāng)骨缺損達(dá)到20mm時(shí)則很難進(jìn)行自行修復(fù)。因此，本次實(shí)驗(yàn)采取20mm的大段骨缺損來觀察骨修復(fù)材料對(duì)骨缺損的修復(fù)能力。對(duì)于兔股骨髁腔隙性骨缺損模型而言，要求骨缺損直徑至少4mm，否則可以自行修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)采用骨缺損直徑達(dá)到了5mm，缺損區(qū)域很難自行愈合，而且也不會(huì)因骨缺損范圍過大而導(dǎo)致股骨髁的塌陷和骨折。1.3.1橈骨節(jié)段性骨缺損模型和分組27只健康新西南兔，雌雄不限，重量2.0-2.5kg。隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和模擬組，每組按4、8、16周3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3只。無菌條件下手術(shù)造成左撓骨中上段20mm長的骨缺損，連同骨膜一并切除。實(shí)驗(yàn)組骨缺損處植入O.5%的摻鍶硫酸鈣復(fù)合材料，對(duì)照組植入a-半水硫酸鈣材料，模擬組不做任何處理，將骨缺損曠置。1.3.2股骨髁腔隙性骨缺損模型和分組取18只健康新西南兔雌雄不限，體重2.0-2.5kg。10%水合氯醛腹腔注射麻醉，劑量2.5mL/kg。麻醉生效后置于仰臥位，備皮，常規(guī)消毒鋪巾，選膝關(guān)節(jié)外側(cè)切口，長約2cm，切開皮膚、皮下、關(guān)節(jié)外側(cè)支持帶，顯露股骨遠(yuǎn)端，于側(cè)副韌帶與兔腓側(cè)韌帶起點(diǎn)之間中點(diǎn)處平行膝關(guān)節(jié)橫軸鉆一直徑5mm、深12mm的圓柱形骨缺損。生理鹽水反復(fù)沖洗清除骨屑和凝血塊，填塞干紗布徹底止血，保持骨面干燥。按4、8、16周3個(gè)時(shí)間點(diǎn)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只，其中3只右下肢植入摻鍶硫酸鈣復(fù)合骨修復(fù)材料，左下肢植入a—半水硫酸鈣；另外3只右下肢植入摻鍶硫酸鈣復(fù)合骨修復(fù)材料，左下肢骨缺損空置。1.4觀察指標(biāo)1.4.1大體觀察觀察術(shù)后兔子的活動(dòng)、飲食和二便情況，傷口有無腫脹、有無分泌物等。1.4.2X線檢査X線片曝光條件50kV，55mA，曝光時(shí)間O.3sec、投照距離50cm。術(shù)后4、8、16周連續(xù)X線攝片，觀察骨缺損修復(fù)情況，并根據(jù)Lane—Sandhu法對(duì)橈骨節(jié)段性骨缺損模型各組骨缺損修復(fù)區(qū)的骨形成、骨連接和骨塑形情況進(jìn)行評(píng)分(表2)。表2Lane—Sandhu法X線評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>1.4.3生物力學(xué)檢査1.4.3.1橈骨節(jié)段性骨缺損模型各組術(shù)后12周處死動(dòng)物，取動(dòng)物雙前肢，包括尺撓骨全段，去除周圍軟組織，生理鹽水紗布包裹-2(TC冷藏。每組3個(gè)標(biāo)本，使用AG-10TA電子萬能材料試驗(yàn)機(jī)進(jìn)行三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)，測(cè)試過程中保持標(biāo)本濕潤。常溫常壓下，跨距60mm。在標(biāo)本中段加載，加載速度2mm/min，應(yīng)力下降50%時(shí)停止加載，記錄標(biāo)本的最大載荷。1.4.3.2股骨髁腔隙性骨缺損模型各組術(shù)后12周處死動(dòng)物，取動(dòng)物雙股骨下段，垂直膝關(guān)節(jié)橫軸做股骨遠(yuǎn)端修整。將樣本平置于AG-1OTA電子萬能材料試驗(yàn)機(jī)操作臺(tái)上進(jìn)行壓凹實(shí)驗(yàn)。樣本表面滴加生理鹽水保持樣本濕潤，用直徑4.8mm圓柱形不銹鋼平頭置于股骨遠(yuǎn)端缺損區(qū)，施加載荷，預(yù)加載荷3N，加載速度2mm/min，位移深度l.Omm，應(yīng)力下降50%時(shí)停止加載，記錄屈服載荷，計(jì)算測(cè)試區(qū)域極限強(qiáng)度。1.4.4觀測(cè)新骨形成量橈骨和股骨標(biāo)本取下后，經(jīng)4%多聚甲醛固定后，用10。/。的EDTA脫鈣。標(biāo)本常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，石蠟切片，行HE染色，光鏡觀察材料及周圍組織的變化和植入材料內(nèi)新骨形成的情況。采用計(jì)算機(jī)多功能圖象分析Imag印lusCCD系統(tǒng)，對(duì)術(shù)后8、12周橈骨和股骨植骨區(qū)的成骨情況進(jìn)行定量分析，各組在不同時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)選取3個(gè)平面，每個(gè)平面隨機(jī)取3個(gè)不重疊的視野進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算新骨生長面積與骨缺損面積的百分比，取其平均數(shù)。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有計(jì)量數(shù)據(jù)均以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差P士s)表示，以SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以P〈0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.l大體觀察所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后l-3小時(shí)恢復(fù)活動(dòng)，l天后進(jìn)食正常。傷口無紅腫、感染等術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生。術(shù)后2周切口一期愈合，切口縫線自動(dòng)脫落。2.2X線觀察2.2.1橈骨節(jié)段性骨缺損模型各組空白對(duì)照組12周內(nèi)，可見斷端有少量新骨形成，密度較高，但骨缺損未見愈合(圖1A)摻鍶硫酸鈣組骨缺損在術(shù)后4周時(shí)即有明顯的骨膜反應(yīng)，有骨痂形成，植入材料邊緣模糊，材料與自體骨連接端有新骨形成，密度較高(圖1B)。術(shù)后8周時(shí)缺損處有較多新骨形成，植入材料已分辨不清(圖1C)。術(shù)后12周時(shí)植入材料已不能分辨，新骨與自體皮質(zhì)骨相連，髓腔部分再通(圖1D)。a—半水硫酸鈣組骨缺損在術(shù)后4周時(shí)也有明顯的骨膜反應(yīng)，有骨痂形成，還可見較多的植入材料，與自體骨連接處有密度較高的新骨形成(圖1E)。術(shù)后8周，缺損處新骨進(jìn)一步增多，植入材料邊緣模糊，不易分辨(圖1F)。術(shù)后12周，已很難分辨出植入材料，僅可見少于材料的碎片。新生骨組織與自體骨連接，髓腔部分再通(圖1G)。2.2.2股骨髁腔隙性骨缺損模型各組空白對(duì)照組12周內(nèi)骨缺損未修復(fù)，僅在缺損區(qū)邊緣有少量新骨形成，缺損區(qū)中央密度與髓腔接近(圖2A)。摻鍶硫酸鈣組骨缺損在術(shù)后4周時(shí)材料與缺損邊緣處出現(xiàn)高密度的新生骨組織，界面變模糊，難以分清，但仍能大致分辨出植入材料的輪廓(圖2B)。術(shù)后8周時(shí)己經(jīng)無法分辨植入材料的輪廓及原有缺損部位，可見大量高密度新生骨組織形成，植入材料己經(jīng)被略高于正常骨組織密度影的的新生組織修復(fù)(圖2C)。術(shù)后12周時(shí)原骨缺損區(qū)域的密度與正常骨組織密度接近(圖2D)。a—半水硫酸鈣組骨缺損在術(shù)后4周時(shí)材料外形較易分辨，材料與骨缺損界面模糊，有高密度新生骨組織出現(xiàn)(圖2E)。術(shù)后8周，植入材料進(jìn)一步降解，但其輪廓與原有骨缺損部位仍依稀可辨，有較多高密度新生骨組織形成(圖2F)。術(shù)后12周，骨缺損區(qū)域幾乎完全被新生骨組織填充，其密度稍高與正常骨組織，在缺損區(qū)域內(nèi)部仍可見少于植入材料的碎片(圖2G)。2.3X線檢測(cè)評(píng)分結(jié)果橈骨節(jié)段性骨缺損模型摻鍶硫酸鈣組和a—半水硫酸鈣組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)評(píng)分均高于空白對(duì)照組(P〈0.01)，但兩組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.891)(表3)。表3各組骨缺損修復(fù)情況X線Lane—Sandhu法評(píng)估<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>2.4生物力學(xué)測(cè)定結(jié)果2.4.l橈骨節(jié)段性骨缺損模型各組術(shù)后12周各組尺橈骨最大載荷如圖3，摻鍶硫酸鈣組和a—半水硫酸鈣組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=1.000)，均低于正常對(duì)照組(P=0.003，P=0.004);但均高于空白對(duì)照組(P=0.040，P=0.030)(表4)。表4術(shù)后12周最大尺橈骨載荷比較<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>2.4.2股骨髁腔隙性骨缺損模型各組術(shù)后12周各組股骨髁骨缺損區(qū)壓縮強(qiáng)度如圖4，摻鍶硫酸鈣組和a—半水硫酸鈣組均高于空白對(duì)照組(P=0.000，P=0.000)，兩組間比較摻鍶硫酸鈣組壓縮強(qiáng)度高于a—半水硫酸鈣組(P=0.007)。摻鍶硫酸鈣組壓縮強(qiáng)度與正常對(duì)照組接近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000)(表5)。表5術(shù)后12周股骨髁壓縮強(qiáng)度<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>傘與空白對(duì)照組相比P〈0.0]女與a—半水硫酸鈣組相tL;"與正常對(duì)照組相比P〈0.01:匕P〈0.013.5新骨形成率3.5.1橈骨節(jié)段性骨缺損模型各組隨著時(shí)間的推移，植入材料組骨缺損處的材料摻鍶硫酸韓和a—半水硫酸韓分別逐漸降解，摻鍶硫酸鈣的降解速度快于a-半水硫酸鈣，新骨形成逐漸增多，而空白對(duì)照組術(shù)后12周骨缺損處僅見少量新骨形成，有大量纖維組織填充。術(shù)后8周、12周新骨形成率如下表表3，各時(shí)間點(diǎn)摻鍶硫酸鈣組和a—半水硫酸鈣組新骨形成率均明顯高于空白對(duì)照組(P=0.000);摻鍶硫酸鈣組和a—半水硫酸鈣組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000)(表6)。表6橈骨骨缺損區(qū)域新骨形成率<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>3.5.2股骨髁腔隙性骨缺損模型各組8周時(shí)缺損區(qū)填充的摻鍶硫酸鈣和a—半水硫酸鈣兩種植入材料逐漸降解，摻鍶硫酸鈣的降解速度稍快于a-半水硫酸鈣，骨缺損區(qū)內(nèi)可見新生骨形成，細(xì)胞增生活躍。12周時(shí)兩種植入材料已完全降解被新生的骨組織修復(fù)，新生的骨小梁趨于成熟?？瞻讓?duì)照組僅在缺損區(qū)邊緣有少量的新生骨組織，中央被骨髓組織和纖維組織填充。術(shù)后8周、12周新骨形成率如下表，各時(shí)間點(diǎn)摻鍶硫酸鈣組和a—半水硫酸鈣組新骨形成率均明顯高于空白對(duì)照組(P=0.000)。術(shù)后8周和12周摻鍶硫酸鈣組新骨形成率均明顯高于a—半水硫酸鈣組(P=0.030，P=0.043)(表7)。表7股骨髁骨缺損區(qū)域新骨形成率<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>本實(shí)驗(yàn)的x線檢測(cè)結(jié)果顯示摻鍶硫酸鈣對(duì)橈骨大段節(jié)段性骨缺損有明顯的修復(fù)作用，在術(shù)后12周骨缺損已基本被新生骨填充，髓腔已部分再通。隨后進(jìn)行的生物力學(xué)以及新生骨計(jì)量結(jié)果都表明了摻鍶硫酸鈣骨修復(fù)材料的橈骨節(jié)段性骨缺損能起到一定的修復(fù)作用，同空白對(duì)照組相比有明顯的新骨形成并且能明顯提高骨缺損區(qū)域的力學(xué)強(qiáng)度。本實(shí)驗(yàn)的X線、生物力學(xué)和新生骨計(jì)量結(jié)果都表明了摻鍶硫酸鈣對(duì)于股骨髁腔隙性骨缺損有較好的修復(fù)作用，而且這種作用明顯強(qiáng)于a-半水硫酸鈣。雖然本實(shí)驗(yàn)的X線片和組織學(xué)結(jié)果顯示了在骨缺損區(qū)摻鍶硫酸鈣的降解速度要稍快于a-半水硫酸鈣，但是摻鍶硫酸鈣組骨缺損區(qū)的骨缺損修復(fù)和新骨形成情況要好于a-半水硫酸鈣組；骨缺損修復(fù)區(qū)在12周后的力學(xué)強(qiáng)度也明顯高于a-半水硫酸鈣組。這一結(jié)果不同于橈骨節(jié)段性骨缺損的修復(fù)情況。其原因可能是第一，股骨髁是松質(zhì)骨，其骨組織的生長修復(fù)速度快于皮質(zhì)骨。第二，股骨髁松質(zhì)骨中有豐富的血供和成骨細(xì)胞以及成骨前細(xì)胞，有研究證明鍶離子對(duì)于成骨細(xì)胞的成骨活性有促進(jìn)作用，前面體外部分的研究更進(jìn)一步證實(shí)了摻鍶硫酸鈣材料的降解產(chǎn)物同樣具有促進(jìn)成骨細(xì)胞成骨活性的作用，再加上松質(zhì)骨對(duì)材料及其降解產(chǎn)物的腔隙性包裹，使其能在局部骨組織中較持續(xù)的發(fā)揮成骨作用。這些因素使得體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的摻鍶硫酸鈣促成骨作用的特點(diǎn)充分發(fā)揮從而對(duì)松質(zhì)骨區(qū)腔隙性骨缺損起到了較基質(zhì)材料a-半水硫酸鈣更好的修復(fù)作用。綜上所述，采用本發(fā)明摻鍶硫酸鈣骨修復(fù)材料對(duì)于大段皮質(zhì)骨節(jié)段性骨缺損和松質(zhì)骨腔隙性骨缺損有明顯的促成骨作用，在12周內(nèi)能較好的修復(fù)骨缺損。與基質(zhì)材料a-半水硫酸鈣相比，本發(fā)明摻鍶硫酸鈣材料能更好的修復(fù)松質(zhì)骨區(qū)的腔隙性骨缺損。由上述實(shí)例可知，本發(fā)明創(chuàng)造性的將硫酸鈣與含鍶化合物復(fù)合，得到均質(zhì)、具有一定力學(xué)強(qiáng)度的，兼具骨傳導(dǎo)活性和骨誘導(dǎo)活性的摻鍶硫酸鈣復(fù)合材料。0.1%-2%鍶元素的摻入會(huì)在一定程度上影響硫酸鈣的力學(xué)強(qiáng)度和降解速度，但摻鍶硫酸鈣復(fù)合材料在降解過程中仍然能夠保持穩(wěn)定的pH值。當(dāng)摻鍶量在0.5%以內(nèi)時(shí)，摻鍶硫酸鈣復(fù)合材料在體外模擬體液(SBF)中降解前4周內(nèi)能保持重量和力學(xué)強(qiáng)度相對(duì)穩(wěn)定，并在4周后開始釋放具有大量骨誘導(dǎo)活性的鍶元素。摻鍶量為O.1%-2%的硫酸鈣復(fù)合材料無細(xì)胞毒性，材料與細(xì)胞有較好的相容性。成骨細(xì)胞能在本發(fā)明摻鍶硫酸鈣復(fù)合材料上正常的貼附生長，并對(duì)細(xì)胞增殖和成骨細(xì)胞功能有一定的促進(jìn)作用，對(duì)于大段皮質(zhì)骨節(jié)段性骨缺損和松質(zhì)骨腔隙性骨缺損有明顯的促成骨作用，在12周內(nèi)能較好的修復(fù)骨缺損。上述實(shí)例表明本發(fā)明硫酸鈣復(fù)合材料具有穩(wěn)定的力學(xué)性能和體外降解性能，還有利于成骨細(xì)胞的貼附、增殖和修復(fù)骨缺損功能，是一種安全，高效的骨修復(fù)材料，為骨缺損修復(fù)材料領(lǐng)域提供了新的選擇，具有很好的應(yīng)用前景。[參考文獻(xiàn)]1.BertrandN.Strontium:anewtreatmentforosteoporosis.JntBoneSpn，2004，(71):261-263.2.J"ohnssonR，StromqvistcomparingosteogenicB，AspenbergP.Randomizedradiostereometricprotein-1(BMP-7)andautograftboneinhumannoninstrumentedposterolaterallumbarfusion:2002VolvoAwardinclinicalstudies.Spine，2002，27(23):2654-26613.LiuJ"W，ChaoLH，SuLH，WangJ"W，etal.ExperiencewithabonebankoperationandallograftboneinfectioninrecipientsatamedicalcentreinsouthernTaiwan.JHospInfect,2002，50④293-2974.NordstromP，PohjonenT，TormalaP，etal.Shear-loadcarryingcapacityofcancellousboneafterimplantationofself-reinforcedpolyglycolicacidandpoly-L一lacticacidpins:experimentalstudyonrats.Biomaterials，2001，22(18):2557-25615.DemersC，HamdyCR，CorsiK，etal.Naturalcoralexoskeletonasabonegraftsubstitute:areview.BiomedMaterEng，2002，12①I5-356.PetiteH，YiateauV，BensaidW，etal.Tissue-engineeredboneregeneration.NatureBiotechnology.2000，18(9):959-963.7.Ong幾，ChenDCN.Hydroxyapatiteandtheiruseascoatingsindentalimplants:areview.CriticalReviewsinBiomedicalEngineering,2000;28:667-707.8.ItohS，KikuchiM，TakakudaK，etal.Thebiocompatibilityandosteocoiiductiveactivityofanovelhydroxy鄰atite/collagencompositebiomaterialanditsfunctionasacarrierofrhBMP-2.JournalofBiomedicalMaterialsResearch,2001;54:445-453.9.KikuchiM，KoyamaY，TakakudaK，etal.Invitrochangeinmechanicalstrengthofbeta-tricalciumphosphate/copolymerizedpoly-L-lactidecompositesandtheirapplicationforguidedboneregeneration.J"BiomedMaterRes，2002，62(2):265-27210.GlowackiJ"，KabanLB，MurrayJ"E，etal.Applicationofthebiologicalprincipleofinducedosteogenesisforcraniofacialdefects.La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