專利名稱：：靜脈注射用乙型肝炎人免疫球蛋白的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及靜脈注射用乙型肝炎人免疫球蛋白的制備方法，屬于血液制品領(lǐng)域。技術(shù)背景我國是乙型肝炎(HBV)感染的高發(fā)地區(qū)，1992年全國病毒性肝炎血清流行病學(xué)調(diào)査證實人群中乙肝表面抗原(HBsAg)陽性率為9.75%，由此推算HBsAg攜帶者達l億2千萬人；在HBV攜帶者中，約四分之一會發(fā)展為慢性肝病，因此全國慢性乙肝肝病可能不小于3千萬。目前，國內(nèi)外對乙型肝炎的治療，尚無十分有效的方法，從而使許多病人最終發(fā)展為肝纖維化、肝硬化甚至肝癌。肝移植(LT)是目前能夠延長終末期肝病患者生命的唯一方法。在我國，與肝炎病毒感染有關(guān)的急慢性肝病是LT的主要適應(yīng)癥?；颊吒我浦埠蟮拇婊盥适芏喾N因素影響，乙肝的復(fù)發(fā)為主要因素之一。有研究發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎肝硬化的病人，如果術(shù)前HBsAg陽性伴有HBV復(fù)制(HBeAg或HBVDNA陽性)，術(shù)后一年乙型肝炎復(fù)發(fā)率為80—90%，如果術(shù)前HBsAg陽性而病毒沒有復(fù)制，其術(shù)后一年內(nèi)的復(fù)發(fā)率也高達為40—50%。由于使用免疫抑制劑，肝移植后乙型肝炎復(fù)發(fā)的病人預(yù)后很差，可在短期(一般23年)內(nèi)再次肝硬化，且急性重癥肝炎的發(fā)生率也很高。因此有效預(yù)防乙型肝炎的復(fù)發(fā)是此類病人術(shù)后存活的關(guān)鍵。國外文獻報道，使用高效價乙肝免疫球蛋白可使LT后HBsAg陽性率降至17X29X。歐洲多中心臨床研究證實長期應(yīng)用人乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG)可減少乙肝肝硬化LT后的HBV復(fù)發(fā)率，可延長生存期。因此在發(fā)達國家IV-HBIG已成為預(yù)防肝移植后HBV再感染的常規(guī)治療方法。有研究表明，乙型肝炎表面抗體(H印atitisBsurfaceAntibody,HBsAb)必須保持在100500IU/ml才能有效預(yù)防肝移植后HBV的再感染。乙肝相關(guān)肝移植病人HBIG使用劑量為術(shù)中、術(shù)后連續(xù)7天每天2000IU-10000IU，以后HBIG保持在500IU/L以上，即使在與拉米夫定聯(lián)合應(yīng)用的情況下，要達到有效保護水平的血濃度所需注射的劑量也較大。目前，已有HBIG肌肉注射產(chǎn)品上市，但肌肉注射在使用上很不方便，移植時4000、移植后每天2000IU連續(xù)使用7天，每天40或20ml的注射體積需要不斷變換部位多點注射病人十分痛苦。申請?zhí)枮?00710144634.4的發(fā)明專利申請，公開了一種靜脈注射乙型肝炎免疫球蛋白制備方法，但該方法IgG的收率偏低，且純度不夠高(為98%)，該方法采用納米膜過濾病毒，但濾膜孔徑《20納米時，膠狀液體(蛋白溶液)難以過濾，濾膜孔徑為50納米時人細小病毒B19又無法去除，使制備的產(chǎn)品存在安全隱患。因此，本領(lǐng)域目前迫切需求一種純度高、安全性好的制備靜脈注射用乙型肝炎人免疫球蛋白的方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對上述不足提供一種制備靜脈注射用乙型肝炎人免疫球蛋白的方法。本發(fā)明靜脈注射用乙型肝炎人免疫球蛋白的制備方法，包括如下步驟a、融化血漿將乙型肝炎表面抗體效價》8IU/ml的原料血漿于04i:融化；b、組分分離用質(zhì)量百分含量為0.9%的氯化鈉溶液稀釋血漿至蛋白質(zhì)含量為4555g/L，調(diào)節(jié)pH值至7.0士0.4，加入95%乙醇至反應(yīng)液乙醇濃度為8%，反應(yīng)過程溫度控制在-2.5±0.5°C，離心分離上清液，即得FI反應(yīng)液；c、過濾將FI反應(yīng)液調(diào)節(jié)pH值至6.80士0.10，加入95%乙醇至乙醇終濃度為20%，將反應(yīng)液溫度控制在5.0士0.5。C，加入硅藻土吸附雜質(zhì)，攪拌、靜置、過濾，所得沉淀即為FII+III沉淀；d、沉淀溶解將FII+III沉淀用0.01mol/L的氯化鈉溶液溶解，調(diào)節(jié)溶液pH值至5.10±0.05，調(diào)節(jié)溶液離子強度為O.Ol，加入95%乙醇至溶液中乙醇濃度為17%，控制溶液溫度為-4.5士0.5。C，攪拌、靜置、過濾，所得濾液即為FII濾液；e、濾液沉淀FII濾液中加入氯化鈉溶液，調(diào)節(jié)溶液離子強度為0.05，調(diào)節(jié)溶液pH值至6.90士0.05，加入95%乙醇至溶液中乙醇濃度為25%，每升乙醇補加lmol/L氯化鈉溶液0.05L，控制最終反應(yīng)液溫度為一7.5士0.5。C，攪拌、靜置、過濾，即得FII沉淀；f、層析FII沉淀用注射用水溶解后過濾，濾液用注射用水透析脫醇，然后用陰離子交換凝膠層析純化，得到IgG溶液；g、超濾將IgG溶液超濾，所得超濾液4倍濃縮，然后用注射用水調(diào)節(jié)超濾液中蛋白濃度為15士5g/L，用0.5mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)超濾液pH值至4.8士0.1、電導(dǎo)率不超過350uS/cm;h、巴氏滅活病毒將g步驟所得溶液于60士0.5i:水浴中連續(xù)加溫10小時；i:低PH孵放滅活病毒將h步驟滅活病毒后的蛋白溶液過濾、澄清、再次超濾，然后用0.5mol/L的鹽酸調(diào)整蛋白溶液pH值為3.84.4、乙型肝炎表面抗體效價》50IU/ml，補加麥芽糖至麥芽糖質(zhì)量濃度為10%，過濾除菌，然后于2325'C放置21天；j:成品分裝按所需規(guī)格分裝、即得。其中，a步驟中所用的原料血漿應(yīng)采用國家批準的診斷試劑進行傳染性病原微生物標志物如乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、HCV抗體、HIV(1+2)抗體、梅毒、ALT等復(fù)核檢査，結(jié)果應(yīng)為陰性。剔除不符合要求的血漿，嚴格防止在融漿操作過程中不符合要求的血漿袋與正常血漿交叉污染。裝血漿的血漿袋表面應(yīng)消毒，然后破袋、融化血漿。其中，b步驟用質(zhì)量百分含量為O.9%的氯化鈉溶液稀釋血漿蛋白的目的是增加c步驟沉淀中IgG的含量。其中，b、c、d步驟中調(diào)節(jié)pH值所用的pH值調(diào)節(jié)劑可以為常規(guī)的靜脈注射液pH值調(diào)節(jié)劑，優(yōu)選為pH4.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液。其中，為了c步驟中硅藻土的吸附效果最好且不浪費硅藻土以節(jié)約成本，硅藻土加入量優(yōu)選為每升溶液18g。其中，d步驟為了使沉淀中的組分IgG充分溶解，沉淀溶解選用用6-12倍W/V的0.01mol/L氯化鈉溶液溶解。其中，e步驟加入lmol/L氯化鈉溶液，并調(diào)整pH值至6.90士0.05，力陽5%的乙醇至終濃度為25%，其目的是提高高純度IgG的收率。e步驟中調(diào)節(jié)pH值所用的pH值調(diào)節(jié)劑為lmol/L的NaHC03溶液其中，f步驟透析脫醇所用透析袋的截留分子量為30KD，f步驟層析時，采用PS370型陰離子交換凝膠柱，以PH值為6.7士0.3的磷酸鹽緩沖液平衡層析柱，調(diào)整蛋白質(zhì)濃度為1545g/L、pH值為6.7±0.3，上樣，流速控制為40120cm/h，收集IgG，上樣結(jié)束后，用磷酸鹽緩沖液洗滌層析柱上的殘余IgG，與收集的IgG液合并。凝膠層析去除了溶液中絕大部分的雜蛋白與IgA，使流出液IgG的純度》99。/。，IgG單體與二聚體的含量》97呢。其中，h步驟處理中間品時未加保護IgG的穩(wěn)定劑，目的是強化滅活病毒效果；巴氏加熱方法可滅活脂包膜與非脂包膜病毒，常規(guī)巴氏加熱方法滅活產(chǎn)品的pH值為7.0，本發(fā)明中采用巴氏加熱方法滅火病毒時溶液的pH值為4.8士0.1，可以提高滅活速率，其滅活病毒種類譜顯著較單純的低pH孵放法廣泛(對非脂包膜病毒有效)。h步驟滅活病毒結(jié)果滅活HIV、VSV、Sindbis與Polio-l病毒數(shù)量均2;4Log。其中，i步驟中所述的再次超濾所用的超濾膜截留分子量為10KD。為了確保病毒滅活完全，i步驟進行低pH孵放滅活病毒，低pH孵放滅活病毒對HAV(甲型肝炎病毒，H印atitisAVirus)與人細小病毒B19(humanparvovirusB19)等非脂包膜病毒滅活效果好。其中，j步驟所述的規(guī)格為50IU/ml，40ml。本發(fā)明方法制備的注射用乙型肝炎人免疫球蛋白和現(xiàn)有技術(shù)相比，質(zhì)量更好、收率與純度更高(對生產(chǎn)的10批產(chǎn)品進行檢測，IgG的純度均》99。/。，IgG單體與二聚體的含量》97呢)、病毒安全性更高，為注射用乙型肝炎人免疫球蛋白的制備提供了一種更好的選擇，具有廣闊的應(yīng)用前景。圖l是巴氏方法滅活指示病毒的動力曲線圖，圖中橫坐標為滅活時間(h);縱坐標為滴度，其中新德比斯病毒(Sindbis)的滴度用LgPFU/ml表示，水皰性口炎病毒(VSV)、脊髓灰質(zhì)炎病毒(Polio-1)的滴度用LgTCID50/0.lml表示。具體實施方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的具體實施方式做進一步的描述。實施例l靜脈注射用乙型肝炎人免疫球蛋白的制備1、生產(chǎn)前每袋血漿采用國家批準的診斷試劑進行傳染性病原微生物標志物如乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、HCV抗體、HIV(1+2)抗體、梅毒、ALT等復(fù)核檢査，結(jié)果應(yīng)為陰性。剔除不符合要求的血漿，嚴格防止在融漿操作過程中不符合要求的血漿袋與正常血漿交叉污染2、血漿袋表面消毒、破袋、融化血漿溫度至04。C，按低溫乙醇蛋白分離法進行組分分離以9g/L氯化鈉溶液稀釋血漿蛋白質(zhì)含量至4555g/L，調(diào)節(jié)pH值7.0±0.4，加入95%乙醇至反應(yīng)液乙醇濃度為8%。將反應(yīng)液溫度控制在-2.5±0.5°C。3、將FI反應(yīng)液調(diào)節(jié)pH值6.80士0.10，加入95%乙醇至反應(yīng)液乙醇濃度為20%。將反應(yīng)液溫度控制在5.0士0.5。C，加入硅藻土，攪拌后過濾，收集的沉淀立即于-3(TC以下存放。4、FI+n+III沉淀物溶解后，調(diào)節(jié)pH值5.10±0.05，加入95%乙醇至反應(yīng)液乙醇濃度為17%，控制反應(yīng)液溫度在-4.5±0.5°C。攪拌、靜置后過濾。5、每升濾過液加入lmol/L氯化鈉溶液O.04L，調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值6.90±0.05，加入95%乙醇至反應(yīng)液乙醇濃度為25%，每升乙醇補加lmol/L氯化鈉溶液O.05L最終反應(yīng)液溫度控制在一7.5士0.5。C，攪拌靜置后過濾，收集沉淀。6、FII沉淀物以注射用水溶解后過濾，濾過液以注射用水透析脫醇。采用陰離子交換凝膠層析，以P朋.7士0.3磷酸鹽緩沖液平衡層析柱，調(diào)整蛋白質(zhì)濃度1545g/L、p朋.7士0.3，上樣，流速40120cm/h，使FII溶液流穿過層析柱，收集IgG。上樣結(jié)束后，用磷酸鹽緩沖液洗滌層析柱上的殘余IgG，與流穿液合并轉(zhuǎn)入下工序。用l2mol/L氯化鈉溶液洗脫吸附在層析柱上的雜蛋白，用0.2lmol/L氫氧化鈉溶液再生。填充料滿載時，再生使用不超過400個循環(huán)。7、層析后超濾，調(diào)整蛋白質(zhì)濃度15士5g/L、pH4.8士0.1、電導(dǎo)率不超過350uS/cm后輸入巴氏滅活罐。8、制品在60士0.5"C水浴中連續(xù)加溫10小時，以滅活可能殘留的污染病毒。9、滅活后再次超濾，調(diào)整pH3.84.4、HBsAb效價不低于50IU/ml，除菌過濾，將制品于2325i:，放置21天，進行低pH孵放滅活病毒。滅活結(jié)束將制品轉(zhuǎn)入28i:冷庫存放。原液經(jīng)純化、超濾、除菌過濾后即為免疫球蛋白原液。10、按成品規(guī)格配制，使成品中IgG含量不低于50g/L、HBsAB效價不低于50IU/ml，并補加入麥芽糖至10%。11、在萬級局部一百級潔凈間進行分裝，每瓶分裝2000IU(50IU/ml，40ml)/瓶，含人血來源HBsAb抗體2000IU，效價不低于50IU/ml，裝量40ml。試驗例l靜脈注射用乙型肝炎人免疫球蛋白的病毒滅活方法驗證1.驗證樣品實施例l制備的靜注乙肝人免疫球蛋白，蛋白含量12-13g/L、pH4.9，批號20050602、20050603、20050604。2.指示病毒及其培養(yǎng)2.1水皰性口炎病毒(VSV)滴度8.38LgTCID5Q/0.lml、培養(yǎng)用細胞Vero細胞、滴定方法96孔細胞病變法。2.2新德比斯病毒(Sindbis)滴度7.24LgPFU/ml、培養(yǎng)用細胞BHK-21細胞、滴定方法6孔盤噬斑法。2.3脊髓灰質(zhì)炎病毒(Polio-l)滴度9.25LgTCID5()/0.lml、培養(yǎng)用細胞H印-2細胞、滴定方法96孔細胞病變法。3.病毒滅活驗證步驟3.l.預(yù)測酸性樣本調(diào)至中性條件5.5ml酸性樣本加入16.5微升濃度為lM的NaOH，調(diào)至中性。3.2樣品除菌過濾。3.3取樣3.3.l三批樣品各取36ml，分別加入病毒液，混勻。3.3.2將樣品-病毒混合液分裝7支試管，每管5.5ml，留取l管作為零時樣品。其余進行59.8-60.0。C恒溫水浴加熱處理，分別于15、30分、1、2、4、IO小時取樣。3.3.3各樣品取出后立刻以lMo1NaOH調(diào)整至中性，分裝，冷凍于-7(TC備測。4.病毒滴定方法96孔細胞病變法，按Karber法計算。每批樣品須至少重復(fù)測定2次。5.驗證結(jié)果5.l判斷標準巴氏方法滅活指示病毒數(shù)量均》4個對數(shù)，判定該方法有效。病毒滅活結(jié)果見表l。表lHBIG巴氏滅活病毒結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>5.2巴氏方法滅活指示病毒的動力曲線見附圖1。從表l和圖1可以看出本發(fā)明方法中采用的病毒滅活方法的病毒滅活效果很好。試驗例2靜脈注射用乙型肝炎人免疫球蛋白的質(zhì)量檢測及結(jié)果靜脈注射用乙型肝炎人免疫球蛋白，規(guī)格2000IU(50IU/ml，40ml)/瓶，產(chǎn)品批號200804001，代表數(shù)量7841瓶，抽檢數(shù)量26瓶，檢驗依據(jù)國家注冊標準YBS00102008。注射用乙型肝炎人免疫球蛋白的質(zhì)量檢測及結(jié)果見表2。表2注射用乙型肝炎人免疫球蛋白的質(zhì)量檢測及結(jié)杲<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>結(jié)論本批產(chǎn)品按國家注冊標準YBS001Ce008檢驗，結(jié)杲符合規(guī)定權(quán)利要求1.靜脈注射用乙型肝炎人免疫球蛋白的制備方法，包括如下步驟a、融化血漿將乙型肝炎表面抗體效價≥8IU/ml的原料血漿于0～4℃融化；b、組分分離用質(zhì)量百分含量為0.9％的氯化鈉溶液稀釋血漿至蛋白質(zhì)含量為45～55g/L，調(diào)節(jié)pH值至7.0±0.4，加入95％乙醇至反應(yīng)液乙醇濃度為8％，反應(yīng)過程溫度控制在-2.5±0.5℃，離心分離上清液，即得FI反應(yīng)液；c、過濾將FI反應(yīng)液調(diào)節(jié)pH值至6.80±0.10，加入95％乙醇至乙醇終濃度為20％，將反應(yīng)液溫度控制在5.0±0.5℃，加入硅藻土吸附雜質(zhì)，攪拌、靜置、過濾，所得沉淀即為FII+III沉淀；d、沉淀溶解將FII+III沉淀用0.01mol/L的氯化鈉溶液溶解，調(diào)節(jié)溶液pH值至5.10±0.05，調(diào)節(jié)溶液離子強度為0.01，加入95％乙醇至溶液中乙醇濃度為17％，控制溶液溫度為-4.5±0.5℃，攪拌、靜置、過濾，所得濾液即為FII濾液；e、濾液沉淀FII濾液中加入氯化鈉溶液，調(diào)節(jié)溶液離子強度為0.05，調(diào)節(jié)溶液pH值至6.90±0.05，加入95％乙醇至溶液中乙醇濃度為25％，每升乙醇補加1mol/L氯化鈉溶液0.05L，控制最終反應(yīng)液溫度為-7.5±0.5℃，攪拌、靜置、過濾，即得FII沉淀；f、層析FII沉淀用注射用水溶解后過濾，濾液用注射用水透析脫醇，然后用陰離子交換凝膠層析純化，得到IgG溶液；g、超濾將IgG溶液超濾，所得超濾液4倍濃縮，然后用注射用水調(diào)節(jié)超濾液中蛋白濃度為15±5g/L，用0.5mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)超濾液pH值至4.8±0.1、電導(dǎo)率不超過350uS/cm；h、巴氏滅活病毒將g步驟所得溶液于60±0.5℃水浴中連續(xù)加溫10小時；i低pH孵放滅活病毒將h步驟滅活病毒后的蛋白溶液過濾、澄清、再次超濾，然后用0.5mol/L的鹽酸調(diào)整蛋白溶液pH值為3.8～4.4、乙型肝炎表面抗體效價≥50IU/ml，補加麥芽糖至麥芽糖質(zhì)量濃度為10％，過濾除菌，然后于23～25℃放置21天；j成品分裝按所需規(guī)格分裝、即得。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的靜脈注射用乙型肝炎人免疫球蛋白的制備方法，其特征在于b、c、d步驟中調(diào)節(jié)pH值所用的pH值調(diào)節(jié)劑為pH4.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液3根據(jù)權(quán)利要求l所述的靜脈注射用乙型肝炎人免疫球蛋白的制備方法，其特征在于c步驟中硅藻土的加入量為每升溶液18g。4根據(jù)權(quán)利要求l所述的靜脈注射用乙型肝炎人免疫球蛋白的制備方法，其特征在于d步驟沉淀溶解是用6-12倍W/V的0.01mol/L氯化鈉溶液溶解。5根據(jù)權(quán)利要求l所述的靜脈注射用乙型肝炎人免疫球蛋白的制備方法，其特征在于e步驟中調(diào)節(jié)pH值所用的pH值調(diào)節(jié)劑為lmol/L的WaHC"溶液。6根據(jù)權(quán)利要求l所述的靜脈注射用乙型肝炎人免疫球蛋白的制備方法，其特征在于f步驟透析脫醇所用透析袋的截留分子量為30KD。7根據(jù)權(quán)利要求6所述的靜脈注射用乙型肝炎人免疫球蛋白的制備方法，其特征在于f步驟陰離子交換凝膠層析所用凝膠柱為PS370型。8根據(jù)權(quán)利要求l所述的靜脈注射用乙型肝炎人免疫球蛋白的制備方法，其特征在于i步驟中所述的再次超濾所用的超濾膜截留分子量為10KD。9根據(jù)權(quán)利要求l所述的靜脈注射用乙型肝炎人免疫球蛋白的制備方法，其特征在于j步驟所述的規(guī)格為50IU/ml，40ml。全文摘要本發(fā)明涉及靜脈注射用乙型肝炎人免疫球蛋白的制備方法，屬于血液制品領(lǐng)域。本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是提供了一種靜脈注射用乙型肝炎人免疫球蛋白的制備方法。該方法包括融化血漿、組分分離、過濾、沉淀溶解、濾液沉淀、層析、超濾、病毒滅活、成品配制及分裝等步驟。本發(fā)明方法制備的注射用乙型肝炎人免疫球蛋白的質(zhì)量好、收率與純度高(對生產(chǎn)的10批產(chǎn)品進行檢測，IgG的純度均≥99％，IgG單體與二聚體的含量≥97％)、病毒安全性高，具有廣闊的應(yīng)用前景。文檔編號A61K39/395GK101306200SQ20081030253公開日2008年11月19日申請日期2008年7月4日優(yōu)先權(quán)日2008年7月4日發(fā)明者劉文芳,沈中陽,肖黃根,蔣德席,蹇遠勇,魏憲義申請人:四川遠大蜀陽藥業(yè)股份有限公司;蔣德席;沈中陽