專利名稱：：成纖維生長因子受體介導(dǎo)的血管靶向脂質(zhì)體載體及制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種成纖維生長因子受體(FGFR)介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體載體及制備方法和用途。
背景技術(shù)：
：納米技術(shù)是20世紀(jì)80年代末期誕生并迅速崛起的新技術(shù)，與信息科學(xué)及生命科學(xué)一起并稱為21世紀(jì)三大支柱科學(xué)。目前，世界許多國家都已將納米研究列入國家重點發(fā)展領(lǐng)域。納米生物技術(shù)是納米技術(shù)的研究熱點之一，我國在"十五"863計劃和科技攻關(guān)計劃及"十一五"863、973計劃期間都已啟動了"納米生物和醫(yī)學(xué)技術(shù)"重大專項項目，在納米藥物制劑方面取得了一系列先進的原創(chuàng)性成果。納米技術(shù)是研究粒徑大小在O.1100nm的物質(zhì)所具有的物理化學(xué)性質(zhì)和功能的科學(xué)，并且通過直接操縱單個原子、分子來組裝和創(chuàng)造特定功能的物質(zhì)的研究領(lǐng)域。而在藥劑學(xué)研究中，一般將納米粒子的粒徑范圍定為l500nm。由于載藥納米微粒體積更小，因此具有很多大粒子不具備的優(yōu)點。納米粒子進入體內(nèi)可以有效地減少人體網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)巨噬細胞的吞噬，并能穿越細胞間隙，可通過人體最小的毛細血管及血腦屏障并被細胞組織吸收載藥納米微粒可以控制藥物在耙點部位控制釋放，減少藥物用量增強藥物療效并降低藥物毒性，同時藥物載體系統(tǒng)可以避免藥物活性喪失有利于藥物的貯藏和運輸，基因納米復(fù)合物可以提高基因轉(zhuǎn)染效率、實現(xiàn)體內(nèi)靶向。由于載藥納米微粒的諸多優(yōu)點使其成為一種很有前途的藥物新劑型。作為納米材料中的重要組成部分的脂質(zhì)體在藥物釋放系統(tǒng)顯示了很好的前景，由于制備脂質(zhì)體材料的生物可降解性，毒性小等特點使其在藥物輸送方面具有許多優(yōu)越性可緩釋藥物，延長藥物作用時間；通過抗體、葉酸等耙向配體修飾可將藥物輸送到耙向器官；可在保證藥物作用的前提下，減少給藥的劑量，減輕或避免毒副作用；提高藥物的穩(wěn)定性，利于儲存；提高難溶藥物的水溶性(如紫杉醇的脂質(zhì)體藥物)。在基因治療中脂質(zhì)體、陽離子聚合物膠束(PEI、PAGA、PEG-PLL、殼聚糖等)由于具有生物安全性較好、穩(wěn)定性好、無免疫原性、導(dǎo)入基因容量大、容易進行靶向性改造、容易放大生產(chǎn)且工藝穩(wěn)定、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點，越來越受到青睞和重視，特別是陽離子脂質(zhì)體(粒經(jīng)SIOOnm)已廣泛用于基因治療的傳遞系統(tǒng)。但普通的陽離子脂質(zhì)體最大問題是轉(zhuǎn)染效率低，靶向性差。其主要原因在于(l)基因?qū)胂到y(tǒng)效率較低，缺乏靶向；(2)—些基因治療載體隨機插入和整合到宿主細胞染色體上，有引起插入突變及細胞惡性轉(zhuǎn)化的潛在危險；(3)對導(dǎo)入的治療基因缺乏有效的調(diào)控等。這些問題的存在，也是發(fā)展有效和安全的基因治療方案的主要制約因素?；蛑委熽P(guān)鍵技術(shù)中的首要問題，是能夠選擇性(或相對特異性)地將治療基因輸送到特定的靶組織(或靶器官)，并使之進入靶細胞?；谝陨显?，本領(lǐng)域急需開發(fā)一種新型的靶向脂質(zhì)體載體，可以用以介導(dǎo)小分子抗腫瘤藥物耙向到目的細胞，降低其對正常組織的毒性；同時，也可高效介導(dǎo)基因治療藥物在耙細胞的表達，提高轉(zhuǎn)染效率。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種新型的具有腫瘤血管靶向性的脂質(zhì)體載體。解決本發(fā)明技術(shù)問題的技術(shù)方案是提供了一種靶向脂質(zhì)體載體。該靶向脂質(zhì)體由下述配比的成分制備而成由下述配比的成分制備而成DOTAP和膽固醇，其配比為摩爾比DOTAP:膽固醇=2:12，還含有tbFGF多肽，tbFGF多肽的重量含量是D0TAP和膽固醇總重量的1080%。優(yōu)選的，上述靶向脂質(zhì)體載體由下述配比的成分制備而成DOTAP:膽固醇=2:12(摩爾比)，tbFGF多肽的重量含量是D0TAP和膽固醇總重量的3070。/0。其中，上述的是指對成纖維生長因子(bFGF)的結(jié)構(gòu)進行改造得到截短的bFGF肽段，保留其bFGF與其受體結(jié)合的片段，而缺失了刺激進一步的信號傳導(dǎo)的活性的肽段的bFGF多肽。主要是缺失部分肝素結(jié)合位點，使其缺乏刺激進一步的信號傳導(dǎo)的活性，不會刺激耙細胞的增殖。優(yōu)選的，上述tbFGF包含bFGF的第30-115氨基酸，其具有如下所示(SeqIDNo.1)的氨基酸序列krlycknggfflrihpdgrvdgvreksdphiklqlqaeergvvsikgvcanrylamkedgrllaskcvtdecffferles皿ynty。僅保留了bFGF與其受體結(jié)合的活性，而缺失了刺激進一步的信號傳導(dǎo)的活性，不會刺激靶細胞增殖，將其與陽離子脂質(zhì)體孵育，制備成靶向脂質(zhì)體。本發(fā)明所要解決的第二個技術(shù)問題是提供了上述靶向脂質(zhì)體載體在制備藥物組合物中的應(yīng)用。本發(fā)明所要解決的第三個技術(shù)問題是提供了一種靶向脂質(zhì)體復(fù)合物。該陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物是以上述的靶向脂質(zhì)體為包封層。進一步的，上述靶向脂質(zhì)體復(fù)合物的包封層內(nèi)包封有基因載體或小分子抗腫瘤藥物。其中，上述基因載體為腺病毒載體，腺相關(guān)病毒載體、質(zhì)粒載體或噬菌體載體中的至少一種。其中，上述腺病毒載體為復(fù)制缺陷型腺病毒載體。其中，上述基因載體上載有并能表達抗腫瘤細胞因子的基因序列。其中，上述的小分子抗腫瘤藥物為紫杉醇、阿霉素或喜樹堿中的至少一種。本發(fā)明所要解決的第四個技術(shù)問題是提供了上述的脂質(zhì)體的制備方法。該方法包括以下步驟a、稱取D0TAP，Chol適量置于旋蒸瓶中，加入氯仿使之完全溶解b、真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得脂質(zhì)體膜，干燥；c、在脂質(zhì)體膜中加入葡萄糖溶液超聲水化得空白脂質(zhì)體溶液；d、將bFGF多肽緩慢加入到空白脂質(zhì)體溶液中，輕微震蕩，孵化過夜，獲得靶向空白脂質(zhì)體。本發(fā)明所要解決的第五個技術(shù)問題是提供了上述靶向脂質(zhì)體復(fù)合物的制備方法。當(dāng)制備基因載體的靶向脂質(zhì)體復(fù)合物時，包括以下步驟a、稱取D0TAP，Chol置于旋蒸瓶中，加入氯仿使之完全溶解；b、真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得脂質(zhì)體膜，干燥；c、在脂質(zhì)體膜中加入5%葡萄糖溶液超聲水化得空白脂質(zhì)體溶液；d、將tbFGF緩慢加入到空白脂質(zhì)體溶液中，輕微震蕩，孵化過夜，獲得靶向空白脂質(zhì)體，再將質(zhì)粒載體或病毒載體等基因載體與靶向脂質(zhì)體在室溫下孵育30分鐘，即得。當(dāng)制備小分子抗腫瘤藥物的耙向脂質(zhì)體復(fù)合物時，該方法包括以下步驟a、稱取D0TAP，Chol置于旋蒸瓶中，加入氯仿使之完全溶解；b、真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得脂質(zhì)體膜，干燥；c、在脂質(zhì)體膜中加入5%葡萄糖溶液超聲水化得空白脂質(zhì)體溶液；d、采用薄膜超聲法或凍融法先將小分子抗腫瘤藥物包裹于空白脂質(zhì)體中，再將tbFGF緩慢加入到脂質(zhì)體溶液中，輕微震蕩，孵育過夜，即得。其中，上述方法還包括步驟e:將孵化后的脂質(zhì)體擠壓通過0.45ym聚碳酸酯膜48次。本發(fā)明所要解決的第六個技術(shù)問題是提供了上述脂質(zhì)體復(fù)合物在制備在抗腫瘤藥物組合物中的應(yīng)用。本發(fā)明所要解決的第七個技術(shù)問題提供了一種靶向性抗腫瘤藥物組合物，它是由上述脂質(zhì)體復(fù)合物添加藥學(xué)上可以接受的輔助性成分制備而成的。根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，為了構(gòu)建好的粒徑穩(wěn)定的FGF蹄巴向脂質(zhì)體，考察了多種脂質(zhì)體配方。為了取得更好的效果，對藥脂比進行了篩選，并對tbFGF多肽加入的量進行了評價，獲得了本發(fā)明中的粒徑和Zeta電位穩(wěn)定的靶向脂質(zhì)體配方。當(dāng)用于包封基因或基因載體等大分子藥物時，tbFGF多肽的加入量較高，如按重量比tbFGF多肽/總脂質(zhì)分子為20。/。80。/0，50%70%左右較佳)。當(dāng)用于包封小分子抗腫瘤藥物時，可以只使用較低的tbFGF多肽，如按重量比tbFGF多肽/總脂質(zhì)分子為2。/。80。/。均可，但210%左右較佳，阿霉素優(yōu)選4%)根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，對制備本發(fā)明FGF蹄巴向脂質(zhì)體復(fù)合物的方法進行了確定和優(yōu)化。在按照通常的工藝參數(shù)制備陽離子脂質(zhì)體的基礎(chǔ)上，采用孵育法復(fù)合tbFGF多肽。另外還對擠壓次數(shù)、孵化溫度等各個工藝參數(shù)進行了優(yōu)化，以提高其包裹基因和小分子藥物的包封率并同時獲得粒徑小于200nm的陽離子脂質(zhì)體。根據(jù)本發(fā)明的再一個方面，本發(fā)明FGF蹄巴向脂質(zhì)體裝載抗腫瘤基因載體或者抗腫瘤小分子藥物可用于腫瘤的治療，并可再添加藥學(xué)上可以接受的輔助性成分制備成抗腫瘤藥物組合物。本發(fā)明的有益效果為由于bFGF及其受體在多種腫瘤細胞及腫瘤新生血管內(nèi)皮細胞上都具有高水平的表達，本發(fā)明將tbFGF多肽與陽離子脂質(zhì)體孵育，制備成tbFGF修飾的納米脂質(zhì)體，它能與質(zhì)粒DNA或病毒載體進行自組裝形成靶向納米脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物，同時又可包裹小分子抗腫瘤藥物。另外，本發(fā)明還對bFGF的結(jié)構(gòu)進行改造得到截短的bFGF肽段(tbFGF)，包含bFGF的第30-115氨基酸，僅保留了bFGF與其受體結(jié)合的活性，而缺失了刺激進一步的信號傳導(dǎo)的活性，不會刺激靶細胞增殖，將其與陽離子脂質(zhì)體孵育，制備成靶向脂質(zhì)體。實驗證明使用該靶向脂質(zhì)體的穩(wěn)定性和包封各種抗腫瘤藥物后的轉(zhuǎn)染效率和穩(wěn)定性均同時得到了提高，具備體內(nèi)靶向性，腫瘤組織藥物分布得到了很大的提高，同時藥物的體內(nèi)清除率大為降低。能很好地有選擇性地把治療基因和小分子藥物輸送到特定的腫瘤組織的效果，且既可包裹小分子抗腫瘤藥物又可包裹基因藥物，還可實現(xiàn)同時包裹小分子抗腫瘤藥物和基因藥物，是一種對腫瘤具有特異靶向性的優(yōu)秀載藥體系。通過攜帶抗腫瘤活性基因survivin，重組survivin腺病毒，阿霉素，紫杉醇等藥物在多種腫瘤如乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤等模型中顯示良好的抗腫瘤效果，抑制了腫瘤的生長，并顯著延長荷瘤小鼠的生存期，為腫瘤的耙向治療產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用提供了新的思路，具有較好的臨床應(yīng)用前景。圖1:tbFGF多肽所采用的表達載體pET-32a(+)。圖2:空脂質(zhì)體復(fù)合tbFGF多肽前后粒徑的變化。圖3:空脂質(zhì)體復(fù)合tbFGF多肽前后Zeta電位的變化。圖4:FGFR靶向脂質(zhì)體-p0RF9-mSurvivinT34A復(fù)合物治療小鼠黑色素瘤(B16)的腫瘤生長曲線。圖5:FGFR靶向脂質(zhì)體-p0RF9-mSurvivinT34A復(fù)合物治療小鼠黑色素瘤(B16)的生存期曲線。圖6:FGFR靶向脂質(zhì)體-阿霉素復(fù)合物治療小鼠前列腺瘤(Tramp-Cl)的腫瘤生長曲線。圖7:FGFR靶向脂質(zhì)體-阿霉素復(fù)合物治療小鼠前列腺瘤(Tramp-Cl)的生存曲線。圖8:FGF蹄巴向脂質(zhì)體-紫杉醇復(fù)合物治療小鼠黑色素瘤(B16)的腫瘤生長曲線。圖9:FGF蹄巴向脂質(zhì)體-紫杉醇復(fù)合物治療小鼠小鼠黑色素瘤(B16)的生存曲線。圖10:藻酸鹽實驗檢測FGF蹄E向脂質(zhì)體抑制新生血管的作用A.生理鹽水組，B.游離紫杉醇組，C.普通陽離子脂質(zhì)體包裹紫杉醇組，D.FGF蹄巴向脂質(zhì)體，E，各組中藻酸鹽球中右旋糖酐熒光強度。具體實施例方式以下通過對本發(fā)明具體實施方式的描述說明但不限制本發(fā)明。實施例一脂質(zhì)體配方的選擇及優(yōu)化材料1，2-二油酰-3-三甲銨基丙烷(D0TAP)購于Avanti公司；膽固醇(Chol)購于Sigma公司；tbFGF為自行構(gòu)建載體、表達制備，純度大于99%。tbFGF的構(gòu)建與表達:分析人bFGF序列，設(shè)計擴增tbFGF(aa.30-115)的引物，上游引物5'端引入限制性內(nèi)切酶Kpn頂每切位點和腸激酶(EK酶)切位點，下游引物5'端引入限制性內(nèi)切酶Hindin酶切位點，由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。上游引物〔Seqmis-o.2):下游引物(SeqEDN。.3〕5,CCCAAGCTTAGTAAGTATTGTAGTTATTAGATTC3,。以pBLAST45-hbFGF(購自美國Invivogen公司)為模板擴增tbFGF片段，將PCR產(chǎn)物KpnI/Hind11I雙酶切后插入表達載體pET-32a(+)(購自美國Novagen公司，結(jié)構(gòu)示意圖見圖l)。鑒定正確后，將重組質(zhì)粒pET32a-tbFGF轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達。結(jié)果表明，pET32a-tbFGF/BL21(DE3)在IPTG誘導(dǎo)下可表達與預(yù)計分子量一致(21kDa左右)的融合蛋白，表達量達到40%以上。破菌上清經(jīng)金屬螯合柱親和層析一步得到純化，融合蛋白Trx-tbFGF純度可達95X以上，產(chǎn)量可達400—500mg/L。經(jīng)Ni柱純化的融合蛋白Trx-tbFGF，EK酶酶切后可得到硫氧還蛋白和分子量為9.lkDa左右的tbFGF多肽，純度可達到99%以上。經(jīng)測定，該多肽的序列為ii'-krlycknggfflrihpdgrvdgvreksdphiklqlqaeergvvsikgvcanrylamkedgrllaskcvtdecffferles皿ynty-C'在體外用NIH-3T3細胞檢測tbFGF的刺激細胞增殖的活性，結(jié)果表明tbFGF的ED50值為500ng/ml，比標(biāo)準(zhǔn)bFGF蛋白的ED50值(〈5ng/ml)高100倍以上。說明該tbFGF多肽刺激靶細胞的活性基本喪失，可以用于以后的耙向?qū)嶒炑芯?。大?guī)模制備該tbFGF多肽用于本發(fā)明具體實施方式中的各項實驗研究。在材料方面，通過預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)使用DOTAP/Chol體系所得的脂質(zhì)體毒性很低，且更有利于復(fù)合tbFGF，故脂質(zhì)分子選用DOTAP和Chol。通過改變DOTAP:Chol的比例(摩爾比)，觀察對tbFGF復(fù)合后粒徑和表面電荷的變化。發(fā)現(xiàn)DOTAP:Chol的比例(摩爾比)為l:l時，可以得到穩(wěn)定的粒徑和電荷，結(jié)果見圖2。在復(fù)合tbFGF的比例上，當(dāng)保持DOTAP:Chol的比例(摩爾比)為l:l時，加入不同比例的tbFGF偶聯(lián)，考察在不同比例的tbFGF基礎(chǔ)上粒徑和表面電位的變化，當(dāng)DOTAP:Chol=l:1(摩爾比)、tbFGF多肽占1080。/。時可以得到穩(wěn)定的粒徑和表面電荷。當(dāng)tbFGF多肽占65呢(重量比)，其復(fù)合的多肽占整個脂質(zhì)體重量比的65%時可以得到穩(wěn)定的粒徑和表面電荷，結(jié)果見圖2。實施例二靶向空白脂質(zhì)體制備工藝條件的進一步優(yōu)化整個工藝過程中，空白脂質(zhì)體與tbFGF多肽的復(fù)合主要依靠陽離子脂質(zhì)體的正電荷與tbFGF多肽所帶的負電荷之間的靜電力來得以實現(xiàn)，通過陽離子脂質(zhì)體與tbFGF多肽的共同孵育可獲得靶向空白脂質(zhì)體。為了獲得穩(wěn)定的靶向空白脂質(zhì)體，我們tbFGF多肽與陽離子脂質(zhì)體的復(fù)合條件進行了優(yōu)化。其中，凍融次數(shù)對tbFGF包封率有較大影響。首先，考察凍融次數(shù)對tbFGF結(jié)合的影響。靶向空白脂質(zhì)體與不同比例tbFGF結(jié)合后，經(jīng)反復(fù)凍融l、2、3、4、5、6次時的包封率變化見表1。數(shù)據(jù)顯示，開始凍融時，凍融次數(shù)的增加有利于脂質(zhì)體與tbFGF的結(jié)合；但是反復(fù)凍融6次之后，其粒徑會變大，且對包封率沒有明顯的變化。凍融2-6次均能基本達到目的，最佳次數(shù)為3次。表i:凍融次數(shù)對復(fù)合率的影響:<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>其次，我們對凍融孵化條件進行優(yōu)化。在孵化條件考察上，分別考察孵化溫度、孵化時間對包封率的影響。孵化溫度上選擇4。C、8°C、10°C，孵化時間上選擇40、60、80、100、120分鐘。結(jié)果表明，孵化溫度對包封率影響不大，應(yīng)保持1(TC以下水浴，4'C最佳；孵化時間上，4080分鐘在得到高包封率上比較滿意，60分鐘最佳。過膜擠壓除菌的考察脂質(zhì)體在經(jīng)過凍融后，得到是一個較寬的粒徑分布而且平均粒徑也偏大，如果通過薄膜擠壓可以得到較窄的粒徑分布以及改善平均粒徑，提高整體性能。同時通過O.2mm膜擠壓還能達到除菌的目的。經(jīng)過上述工藝優(yōu)化，可得到一最佳的靶向FGFR的空白脂質(zhì)體制備工藝按處方精確稱取DOTAP、Chol，置于茄形瓶中，加入氯仿甲醇=1:l的有機溶劑溶解，33。C真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得脂質(zhì)體膜，放入真空干燥箱常溫真空干燥過夜，加入超純水超聲水化(200W，IO分鐘)得空白脂質(zhì)體溶液。將tbFGF(按重量比tbFGF多肽/總脂質(zhì)分子可為20。/。80。/。，65%左右為佳)加入脂質(zhì)體溶液，4攝氏度孵化過夜，再使用擠壓法經(jīng)過O.20mm聚碳酸酯膜除菌，得tbFGF脂質(zhì)體復(fù)合物，即靶向空白脂質(zhì)體。該靶向空白脂質(zhì)體適宜與制備與基因或基因載體的復(fù)合物實施例三、靶向脂質(zhì)體包裹質(zhì)粒DNA或腺病毒的制備工藝靶向脂質(zhì)體基因復(fù)合物的制備則是通過靶向空白脂質(zhì)體與質(zhì)粒DNA或腺病毒合適的比例孵育，自組裝形成的。實施例二得到的靶向空白脂質(zhì)體與質(zhì)粒DNA按1:3比例(重量比)混合，4'C孵育過夜，即可得到靶向脂質(zhì)體質(zhì)粒DNA復(fù)合物。同樣，實施例二得到的靶向空白脂質(zhì)體與重組腺病毒按比例2.5X109VP重組腺病毒/mg陽離子脂質(zhì)體混合，室溫孵育1030分鐘，即可得到靶向脂質(zhì)體腺病毒復(fù)合物。實施例四、靶向脂質(zhì)體包裹小分子抗腫瘤藥物的制備工藝包裹小分子抗腫瘤藥物的制備工藝以阿霉素為例。其優(yōu)選的制備工藝如下參考實施例二的方案，按處方精確稱取一定比例的DOTAP、Chol、阿霉素置于茄形瓶中，加入氯仿甲醇=1:i的有機溶劑溶解，33'c真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得脂質(zhì)體膜，放入真空干燥箱常溫真空干燥過夜，加入超純水超聲水化(200W，IO分鐘)得阿霉素脂質(zhì)體溶液。再將tbFGF加入脂質(zhì)體溶液(按重量比tbFGF多肽/總脂質(zhì)分子可菜用的范圍較大，4%左右較佳)，攝氏4度孵化過夜，再使用擠壓法經(jīng)過O.45mm聚碳酸酯膜，得到靶向脂質(zhì)體阿霉素復(fù)合物。同樣也得到本發(fā)明靶向脂質(zhì)體包封紫杉醇的復(fù)合物。實施例五FGFR靶向脂質(zhì)體包裹pCMV-GFP測定體外轉(zhuǎn)染效率為了驗證FGF蹄巴向脂質(zhì)體包裹基因后的耙向性，我們以幾種高表達FGFR的細胞株和低或不表達FGFR的細胞株進行體外驗證，檢測FGF蹄巴向脂質(zhì)體包裹pCMV-GFP在這幾種細胞株中的轉(zhuǎn)染效率。高表達FGFR的細胞株人肝癌細胞株H印-G2，小鼠前列腺癌細胞株Tramp-cl，人卵巢癌細胞株A2780，人臍靜脈內(nèi)皮細胞株HUVEC。低或不表達FGFR的細胞株小鼠結(jié)腸癌細胞株CT26，小鼠卵巢癌細胞株4T1。質(zhì)粒pCMV-GFP(購自美國Clontech公司)。操作步驟細胞接種于六孔板中(40000個細胞/孔)，待每孔細胞長滿75%時，開始轉(zhuǎn)染實驗。將10ugtbFGF修飾的陽離子脂質(zhì)體緩慢加入到2ygpCMV-GFP(均用無血清培養(yǎng)基稀釋)，室溫下孵化2040分鐘后，加入到六孔板內(nèi)，4小時后，將各孔中的無血清培養(yǎng)基全都換成有血清培養(yǎng)基，24小時后熒光顯微鏡下觀察到細胞內(nèi)有綠色熒光出現(xiàn)，收獲細胞用流式細胞儀檢測各組細胞的熒光強度。對照標(biāo)準(zhǔn)陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000(購自美國Invitrogene公司)的操作按說明書進行。實驗結(jié)果見表2，結(jié)果表明，本發(fā)明的FGFR靶向脂質(zhì)體能特異地提高FGFR高表達細胞株的轉(zhuǎn)染效率，而不影響FGFR低或不表達細胞株的轉(zhuǎn)染效率，具有FGFR耙向性。表2.不同類型的脂質(zhì)體在不同細胞株中的轉(zhuǎn)染效率<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>以下通過試驗例的方式對本發(fā)明的有益效果做進一步詳述。試驗例一、FGFR靶向脂質(zhì)體包裹質(zhì)粒pORF9-mSurvivinT34A治療小鼠黑色素瘤通過測定抑制腫瘤的生長情況來表明本發(fā)明靶向脂質(zhì)體復(fù)合物的體內(nèi)活性。動物8周齡C57小鼠，每只接種2X105B16細胞后分組(每組10只)，待可捫及腫瘤時開始尾靜脈給藥，每周兩次，連續(xù)給藥八次，每三天測定腫瘤體積。考察腫瘤生長和生成期，待停止治療后，取各組織病理切片分析。質(zhì)粒pORF9-mSurvivinT34A(購自美國Invivogen公司)分組FGFR耙向脂質(zhì)體-pORF9-mSurvivinT34A組(25yg質(zhì)粒/只/次)FGFR陽離子脂質(zhì)體-空載組(pORF9)(25yg質(zhì)粒/只/次)普通陽離子脂質(zhì)體-survivin組pORF9-mSurvivinT34A組(25yg質(zhì)粒/只/次)普通陽離子脂質(zhì)體-空載組(pORF9)(25yg質(zhì)粒/只/次)生理鹽水組抑瘤曲線見圖4，結(jié)果表明本發(fā)明的tbFGF耙向脂質(zhì)體-pORF9-mSurvivinT34A復(fù)合物治療小鼠黑色素抑制腫瘤生長率為40.3%，p〈0.001，而FGFR靶向脂質(zhì)體-pORF9-mSurvivinT34A復(fù)合物治療小鼠黑色素的抑制腫瘤生長率為68.3%，p〈0.001，具有顯著性差異。生存期曲線見圖5，結(jié)果表明FGFR靶向脂質(zhì)體-pORF9-mSurvivinT34A復(fù)合物能顯著延長荷瘤小鼠的生存期。試驗例二、tbFGF靶向脂質(zhì)體包裹抗癌藥物阿霉素的抗腫瘤作用的研究分組tbFGF耙向脂質(zhì)體包裹阿霉素組(包裹的阿霉素劑量為100yg/只)普通脂質(zhì)體包裹阿霉素(包裹的阿霉素劑量為100yg/只)空脂質(zhì)體組(脂質(zhì)體劑量為500yg/只)游離阿霉素組(阿霉素劑量為100yg/只)生理鹽水組動物8周齡C57小鼠，接種小鼠前列腺癌細胞株Tramp-Cl細胞后分組(每組10只)，待可捫及腫瘤時開始尾靜脈給藥，每周兩次，連續(xù)給藥八次，每三天測定腫瘤體。考察腫瘤生長和生成期，待停止治療后，取各組織病理切片分析。抑瘤曲線見圖6，結(jié)果表明游離阿霉素的腫瘤抑制率僅為68.2%，而普通陽離子脂質(zhì)體包裹阿霉素腫瘤抑制率并未提高(51.7%)，而FGFR靶向脂質(zhì)體包裹阿霉素治療前列腺癌，其腫瘤抑制率為87.9%，p〈0.001。生存曲線見圖7，結(jié)果表明FGF蹄巴向脂質(zhì)體包裹阿霉素治療前列腺癌后，小鼠的生成率直到90天以后還有30%老鼠存活，而其它幾組老鼠在78天已全部死亡。FGFR靶向脂質(zhì)體包裹阿霉素能顯著延長荷瘤小鼠的生存期。試驗例三、FGF蹄E向脂質(zhì)體包裹抗癌藥物紫杉醇的抗腫瘤作用的研究分組FGF蹄E向脂質(zhì)體包裹紫杉醇組(包裹的紫杉醇劑量為200yg/只)普通脂質(zhì)體包裹紫杉醇(包裹的紫杉醇劑量為200yg/只)空脂質(zhì)體組(脂質(zhì)體劑量為800yg/只)游離紫杉醇組(包裹的紫杉醇劑量為200yg/只)生理鹽水組動物8周齡C57小鼠，接種小鼠黑色素瘤細胞B16后分組(每組10只)，待可捫及腫瘤時開始尾靜脈給藥，每周兩次，連續(xù)給藥八次，每三天測定腫瘤體?？疾炷[瘤生長和生成期，待停止治療后，取各組織病理切片分析。抑瘤曲線見圖8，結(jié)果表明游離紫杉醇對小鼠黑色素瘤的腫瘤抑制率僅為35.7%，普通陽離子脂質(zhì)體包裹紫杉醇的腫瘤抑制率有所提高(49.9%，p〈0.001)，而FGFR靶向脂質(zhì)體包裹紫杉醇治療小鼠黑色素瘤取得很好的抑制腫瘤生長效果，其腫瘤抑制率達到77.7%，p〈0.001。生存曲線見圖9，F(xiàn)GF蹄巴向脂質(zhì)體包裹紫杉醇治療小鼠黑色素瘤，普通陽離子脂質(zhì)體包裹紫杉醇后，小鼠在36天全部死亡，而FGFR靶向脂質(zhì)體包裹紫杉醇組還有50。/。老鼠存活，直到試驗結(jié)束的60天有30%老鼠存活。實驗結(jié)果表明該靶向脂質(zhì)體能顯著延長荷瘤小鼠的生存期。1以上三個試驗例表明，本發(fā)明的FGFR靶向脂質(zhì)體復(fù)合物能有效抑制腫瘤的生長，延長荷瘤小鼠的生存期，具有顯著的抗腫瘤效果。試驗例四、藻酸鹽實驗證明FGF蹄巴向脂質(zhì)體抑制腫瘤血管生成的作用將小鼠結(jié)腸癌細胞CT26重懸于1.6%的藻酸鹽的生理鹽水溶液中，再將其緩慢加入到250mmol/L氯化鈣溶液中，形成藻酸鹽顆粒(1乂105細胞/顆粒)。之后每只BalB/c小鼠背部皮下植入四顆藻酸鹽顆粒，手術(shù)縫合傷口。從第二天開始，每三天給藥一次，并于第12天，每只小鼠尾靜脈注射O.lmLFITC-葡聚糖溶液(100mg/kg)，20分鐘后取出藻酸鹽顆粒，拍照，并用熒光分光光度計檢測每個顆粒中FITC-葡聚糖的含量。實驗結(jié)果見圖IO，經(jīng)bFGF修飾的陽離子脂質(zhì)體包裹紫杉醇治療后在腫瘤組織中的藻酸鹽顆粒幾乎觀察不到腫瘤血管，而在普通陽離子脂質(zhì)體包裹紫杉醇治療組和游離紫杉醇組中仍能觀察到腫瘤血管。而生理鹽水組中大量的腫瘤血管存在。實驗結(jié)果表明，F(xiàn)GFR靶向脂質(zhì)體具有腫瘤血管的耙向性。以上的較優(yōu)的具體實施方式是對本發(fā)明作進一步的舉例說明，但并非對本發(fā)明范圍的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以作出各種變型或改進，只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思及所附上的權(quán)利要求書定義的范圍之內(nèi)。SEQUENCELISTING〈110>四川大學(xué)〈120>成纖維生長因子受體介導(dǎo)的血管靶向脂質(zhì)體載體及制備方法和用途〈130>A080301k〈160>3〈170>Patentlnversion3.4〈210>1〈211>86〈212>PRT〈213>artificial〈220>〈223>artificial〈400>1LysArgLeuTyrCysLysAsnGlyGlyPhePheLeuArglieHisPro151015AspGlyArgValAspGlyValArgGluLysSerAspProHislieLys202530LeuGinLeuGinAlaGluGluArgGlyValValSerlieLysGlyVal354045CysAlaAsnArgTyrLeuAlaMetLysGluAspGlyArgLeuLeuAla505560SerLysCysValThrAspGluCysPhePhePheGluArgLeuGluSer65707580AsnAsnTyrAsnThrTyr85〈210>2〈211>45〈212>DNA〈213>artificial〈220><223>artificial〈400>2ggggtaccgacgacgacgacaagaagcggctgtactgcaaaaacg45〈210>3<211>34<212>DNA〈213>artificial〈220>〈223>artificial〈400>3cccaagctta.gtaagtattgtagtta.tta.ga.ttc3權(quán)利要求1.靶向脂質(zhì)體，其特征在于由下述配比的成分制備而成DOTAP、膽固醇和tbFGF多肽，其配比為DOTAP與膽固醇的摩爾比DOTAP膽固醇＝2:1～2，tbFGF多肽的重量含量是DOTAP和膽固醇總重量的2～80％。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的靶向脂質(zhì)體，其特征在于由下述配比的成分制備而成所述tbFGF多肽的重量含量是DOTAP和膽固醇總重量的37(Fo。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的靶向脂質(zhì)體，其特征在于所述tbFGF多肽片段具有如SEQIDNO.l所示的氨基酸序列。4.權(quán)利要求13任一項所述的靶向脂質(zhì)體在制備藥物組合物中的應(yīng)用。5.一種靶向脂質(zhì)體復(fù)合物，其特征在于以權(quán)利要求13任一項所述的靶向脂質(zhì)體為包封層。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的靶向脂質(zhì)體復(fù)合物，其特征在于所述的包封層內(nèi)包封有基因表達載體或小分子抗腫瘤藥物。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的靶向脂質(zhì)體復(fù)合物，其特征在于所述的基因表達載體為腺病毒載體，腺相關(guān)病毒載體、質(zhì)粒載體或噬菌體載體中的至少一種。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的靶向脂質(zhì)體復(fù)合物，其特征在于所述的腺病毒載體為復(fù)制缺陷型腺病毒載體。9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的靶向脂質(zhì)體復(fù)合物，其特征在于所述的基因表達載體上載有且能表達抗腫瘤細胞因子的基因序列。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的靶向脂質(zhì)體復(fù)合物，其特征在于所述的小分子抗腫瘤藥物為紫杉醇、阿霉素或喜樹堿中的至少一種。11.制備權(quán)利要求13任一項所述的靶向空白脂質(zhì)體的方法，其特征在于包括以下步驟a、稱取D0TAP，Chol適量置于旋蒸瓶中，加入氯仿使之完全溶解b、真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得脂質(zhì)體膜，干燥；C、在脂質(zhì)體膜中加入葡萄糖溶液超聲水化得空白脂質(zhì)體溶液；d、將tbFGF多肽緩慢加入到空白脂質(zhì)體溶液中，輕微震蕩，孵化過夜，獲得靶向空白脂質(zhì)體。12.一種制備權(quán)利要求49任意一項所述的靶向脂質(zhì)體復(fù)合物的方法，其特征在于包括以下步驟a、稱取D0TAP，Chol置于旋蒸瓶中，加入氯仿使之完全溶解；b、真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得脂質(zhì)體膜，干燥；c、在脂質(zhì)體膜中加入5%葡萄糖溶液超聲水化得空白脂質(zhì)體溶液；d、將tbFGF緩慢加入到空白脂質(zhì)體溶液中，輕微震蕩，孵化過夜，獲得靶向空白脂質(zhì)體，再將質(zhì)粒載體或病毒載體等基因載體與靶向脂質(zhì)體在室溫下孵育1(T30分鐘，即得。13.根據(jù)權(quán)利要求4或10所述的制備靶向脂質(zhì)體復(fù)合物的方法，其特征在于包括以下步驟a、稱取DOTAP，Chol置于旋蒸瓶中，加入氯仿使之完全溶解b、真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得脂質(zhì)體膜，干燥；c、在脂質(zhì)體膜中加入5%葡萄糖溶液超聲水化得空白脂質(zhì)體溶液；d、小分子活性藥物則采用薄膜超聲法或凍融法先將小分子抗腫瘤藥物包裹于空白脂質(zhì)體中，再將tbFGF緩慢加入到脂質(zhì)體溶液中，輕微震蕩，孵育過夜，即得。14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的制備靶向脂質(zhì)體小分子抗腫瘤藥物復(fù)合物的方法，其特征在于還包括步驟e:將孵化后的脂質(zhì)體擠壓通過0.45um聚碳酸酯膜48次。15.權(quán)利要求41O任意一項所述的靶向脂質(zhì)體藥物復(fù)合物在制備在抗腫瘤藥物組合物中的應(yīng)用。16.一種靶向性抗腫瘤藥物組合物，是由權(quán)利要求410任意一項所述的靶向脂質(zhì)體藥物復(fù)合物添加藥學(xué)上可以接受的輔助性成分制備而成的。全文摘要本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種成纖維生長因子受體介導(dǎo)的血管靶向脂質(zhì)體載體及制備方法和用途。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種轉(zhuǎn)染效率高且具有腫瘤血管靶向性的陽離子脂質(zhì)體。該靶向脂質(zhì)體由下述配比的成分制備而成DOTAP、膽固醇和tbFGF多肽，其配比為摩爾比DOTAP∶膽固醇＝2∶1～2，tbFGF多肽的重量是DOTAP和膽固醇總重量的10～80％。本發(fā)明脂質(zhì)體能特異性地與腫瘤新生血管細胞表面FGF受體(FGFR)結(jié)合，通過包裹多種小分子抗腫瘤藥物、治療基因、載有治療基因的腺病毒載體等，進而實現(xiàn)腫瘤血管靶向性治療的制備方法和用途。文檔編號A61K31/4745GK101361712SQ20081030473公開日2009年2月11日申請日期2008年9月28日優(yōu)先權(quán)日2008年9月28日發(fā)明者莉楊,霞趙,陳俐娟,魏于全申請人:四川大學(xué)