專利名稱：聚乙二醇化的AβFAB的制作方法
聚乙二醇化的APFAB本發(fā)明涉及結(jié)合淀粉樣蛋白β (Αβ )肽且共價結(jié)合一個或多個聚乙二醇(PEG)分 子的抗體片段。環(huán)狀的Αβ肽由前體蛋白質(zhì)淀粉樣蛋白前體蛋白質(zhì)(APP)切割產(chǎn)生的39-43個氨 基酸(大部分為40或42個氨基酸)組成。Αβ從可溶形式向具有高β折疊含量的不可 溶形式的轉(zhuǎn)換以及其在腦中作為神經(jīng)炎斑點(diǎn)和腦血管斑點(diǎn)的沉積似乎與許多病癥和疾病 (包括阿爾茨海默氏病、唐氏綜合癥和腦淀粉樣血管病(CAA))相關(guān)。預(yù)防和/或逆轉(zhuǎn)Αβ 的沉積可治療與Αβ肽相關(guān)的病癥。影響A β沉積的治療劑包括針對A β肽的抗體，例如在WO 2001/62801、 W02004/071408 和 Tamura, Y.，等，Neurobiol. of Dis. (2005)20 :541_545 中討論的人源化 抗體和片段。盡管許多抗體及其衍生物可用于診斷和治療，但對于特定應(yīng)用而言常常無法獲得 理想的抗體藥物代謝動力學(xué)。旨在治療與Aβ肽相關(guān)的多種病癥和疾病的治療性抗體通常 為具有完整Fc區(qū)的免疫球蛋白。Fc區(qū)負(fù)責(zé)延長血漿中抗體的半衰期。然而，由于這種延長 阻止了有效清除與靶肽結(jié)合的抗體，導(dǎo)致抗原抗體復(fù)合體在血漿循環(huán)中延時存在，因此該 延長可能是不利的。隨后施用抗體導(dǎo)致血漿中不想要復(fù)合體的進(jìn)一步積累。抗體的Fc部 分可能具有某些不必要的效應(yīng)子作用，因此需要進(jìn)行修飾以去除這種作用。此外，F(xiàn)c部分 向整體治療添加了顯著的大小，所述治療常產(chǎn)生與遞送路徑、遞送裝置和擴(kuò)大制備過程相 關(guān)的問題。已在體內(nèi)研究了包括Fab在內(nèi)的無Fc部分的抗體片段以測定是否此類片段可能 為潛在的治療法。然而，研究提示由于清除率快和半衰期短，所以限制了涉及如Fab的片段 的治療有效性。因此，需要有活性的治療性抗Αβ肽抗體分子，所述抗體分子具有這樣的藥 物代謝動力學(xué)和藥物動力學(xué)，其允許改善給藥方案而避免由血漿中復(fù)合體的形成產(chǎn)生和潛 在的效應(yīng)子作用的潛在副作用。本發(fā)明克服了與可能靶向Αβ肽的治療性抗體或抗體片段相關(guān)的許多問題。本發(fā) 明的化合物包括結(jié)合Αβ且共價結(jié)合一個或多個聚乙二醇(PEG)分子的抗體片段。這些化 合物可在細(xì)菌或酵母細(xì)胞系統(tǒng)中產(chǎn)生，所述細(xì)菌或酵母細(xì)胞系統(tǒng)消除了與哺乳動物細(xì)胞系 中產(chǎn)生抗體相關(guān)的多種問題，例如成本問題、純化問題和污染內(nèi)源產(chǎn)生的抗原問題。此外， 本發(fā)明的化合物可經(jīng)皮下施用并具有理想的藥物代謝動力學(xué)(PK)和藥物動力學(xué)(PD)譜， 同時保持抗體片段對Aβ親和力和選擇性。非常無法預(yù)測且意外地，申請人還發(fā)現(xiàn)共價結(jié)合PEG分子至抗體片段的互補(bǔ)決定 區(qū)(CDR)未改變抗體片段對A β的活性、親和力或選擇性。本發(fā)明提供包含抗體片段的分子，所述抗體片段在第13-28位氨基酸之間特異性 結(jié)合人A β肽，其中抗體片段共價結(jié)合PEG分子。優(yōu)選地，抗體片段為Fab片段。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含抗體片段的分子，所述抗體片段具有重 鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含具有以下氨基酸序列的CDR區(qū) CFRLl SSSQSLIYSDGNAYLH (SEQ ID NO :6)、CDRL2 :KVSNRFS (SEQ ID NO 7)禾口 CDRL3 TQSTHSPffT (SEQ IDNO 8)且其中所述重鏈可變區(qū)包含具有以下氨基酸序列的⑶R區(qū) CDRHl :GYTFSRYSMS(SEQ ID NO :9)、CDRH2 :QINIRGCNTYYPDTVKG(SEQ ID NO: 10)或 QINIRGNNTYYPDTVKG (SEQ ID NO :11)禾口 CDRH3 :GDF (SEQ ID NO : 12)。優(yōu)選地，此類分子具有 共價結(jié)合抗體片段重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)的PEG分子。更優(yōu)選地，此類分子具有共價結(jié) 合CDR的PEG分子。甚至更優(yōu)選地，此類分子具有共價結(jié)合CDR內(nèi)半胱氨酸殘基的PEG分 子。最優(yōu)選地，此類分子具有共價結(jié)合抗體片段重鏈可變區(qū)⑶RH2 :QINIRGCNTYYPDTVKG(SEQ ID NO 10)的 PEG 分子。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含抗體片段的分子，所述抗體片段具有輕鏈可 變區(qū)SEQ ID NO :1和重鏈可變區(qū)SEQ ID NO :2。優(yōu)選地，此類分子具有共價結(jié)合抗體片段 的重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)的PEG分子。更優(yōu)選地，此類分子具有共價結(jié)合抗體片段重鏈 可變區(qū)的CDR的PEG分子。甚至更優(yōu)選地，此類分子具有共價結(jié)合抗體片段的重鏈可變區(qū) 的CDR內(nèi)半胱氨酸殘基的PEG分子。最優(yōu)選地，此類分子具有共價結(jié)合重鏈可變區(qū)SEQ ID NO 2的第56位氨基酸處的半胱氨酸的PEG分子。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含F(xiàn)ab片段或ScFv片段的分子，其中Fab片段 或ScFv片段共價結(jié)合PEG分子并具有輕鏈可變區(qū)SEQ IDNO 1和重鏈可變區(qū)SEQ ID NO :2。 優(yōu)選地，此類分子具有共價結(jié)合重鏈可變區(qū)SEQ ID NO :2的第56位氨基酸處的半胱氨酸的 PEG分子。同樣優(yōu)選地，在此類分子中PEG的分子量約為0. 5kD至30kD，更優(yōu)選為20kD。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含具有輕鏈可變區(qū)SEQ ID NO :1和重鏈可變區(qū) SEQ ID NO 2的抗體片段的分子，其中所述抗體片段在重鏈可變區(qū)SEQ ID NO 2的第56位 處共價結(jié)合20kD的PEG分子。優(yōu)選地，在此類分子中PEG分子經(jīng)馬來酰亞胺鍵進(jìn)行共價結(jié)
I=I O在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含在第13-28位氨基酸間特異結(jié)合人A β肽的 抗體片段的分子，其中所述抗體片段共價結(jié)合PEG分子并具有輕鏈可變區(qū)SEQ ID NO 1和 重鏈可變區(qū)SEQ ID NO :3。優(yōu)選地，此類分子具有共價結(jié)合抗體片段絞鏈區(qū)的PEG分子。更 優(yōu)選地，所述PEG經(jīng)馬來酰亞胺鍵共價結(jié)合絞鏈區(qū)。本發(fā)明還包括包含抗體片段的分子，所述抗體片段優(yōu)選為人源化抗體片段，其中 PEG分子共價結(jié)合抗體片段，所述抗體片段產(chǎn)生具有允許每周給藥方案的藥物代謝動力學(xué) 和藥物動力學(xué)的活性治療分子，同時將可能是由血漿中復(fù)合體形成造成的潛在副作用最小 化且保留或改善抗體片段對Aβ的活性、親和力和選擇性。本發(fā)明還包括治療、預(yù)防或逆轉(zhuǎn)與Αβ肽相關(guān)的病癥和疾病的方法，所述病癥和 疾病包括臨床前和臨床(pre-clinical and clinical)阿爾茨海默氏病、唐氏綜合癥和臨 床前和臨床腦淀粉樣血管病(CAA)認(rèn)知缺陷、中風(fēng)、腦溢血和一般性精神衰弱。這些方法包 含向受試者施用有效量的此處描述和要求保護(hù)的分子。本發(fā)明提供包含在第13-28位氨基酸間特異結(jié)合Αβ肽的抗體片段的分子，其中 所述抗體片段共價結(jié)合PEG分子。我們已發(fā)現(xiàn)PEG分子共價連接結(jié)合A β的抗體片段未負(fù) 面地改變抗體片段對Αβ的活性、親和力或選擇性。更令人驚奇地，我們發(fā)現(xiàn)具有高達(dá)20kD 分子量的PEG分子共價連接結(jié)合A β的抗體片段的CDR也未負(fù)面地改變抗體片段對A β肽 的活性、親和力或選擇性。這些抗體片段可經(jīng)皮下施用且具有用于支持可變通給藥方案的 治療用途的改善的PK/PD譜。此外，這些抗體片段可在細(xì)菌或酵母細(xì)胞系統(tǒng)中產(chǎn)生，所述細(xì)
4菌或酵母細(xì)胞系統(tǒng)消除了與在哺乳動物細(xì)胞中制備全長抗體相關(guān)的多種問題。本發(fā)明的聚 乙二醇化抗體片段提供了在預(yù)防和治療上預(yù)防和治療人中與Aβ肽相關(guān)的病癥的可能性。天然存在的全長抗體為包含四條肽鏈的免疫球蛋白分子，所述四條肽鏈為通過 二硫鍵互相連接的兩條重(H)鏈(全長時約為50-70kDa)和兩條輕(L)鏈(全長時約為 25kDa)。每一條鏈的氨基端部分包括主要負(fù)責(zé)抗原識別的約100-110個或更多個氨基酸的 可變區(qū)。每一條鏈的羧基端部分定義主要負(fù)責(zé)效應(yīng)子作用的恒定區(qū)。輕鏈分為κ或λ且特征為具有特定的恒定區(qū)。每一條輕鏈包含N端輕鏈可變區(qū) (此處為“LCVR”)和包含一個結(jié)構(gòu)域CL的輕鏈恒定區(qū)。重鏈分為Y、μ、α、δ或ε，且 分別將抗體的同種型定義為IgG、IgM、IgA、IgD和IgE，并且這些中的幾種可進(jìn)一步分為亞 類(同種型)例如IgGp IgG2、IgG3、IgG4, IgA1和IgA2。每一種重鏈類型的特征在于特定的 恒定區(qū)。每一重鏈包含N端重鏈可變區(qū)(此處為“HCVR”)和重鏈恒定區(qū)。對IgG、IgD和 IgA而言，重鏈恒定區(qū)包含3個結(jié)構(gòu)域(CH1、CH2和CH3)；而對IgM和IgE而言，重鏈恒定區(qū) 包含4個結(jié)構(gòu)域(CHI、CH2、CH3和CH4)。HCVR區(qū)和LCVR區(qū)可進(jìn)一步細(xì)分為高變區(qū)，命名為互補(bǔ)決定區(qū)(“⑶R”)，其上散 布更保守的命名為框架區(qū)(“FR”)的區(qū)域。每一個HCVR和LCVR由三個⑶R和四個FR組 成，自氨基端向羧基端按如下順序排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。此處重鏈的 3 個 CDR 稱為“CDRHl、CDRH2 和 CDRH3” 并且輕鏈的 3 個 CDR 稱為“CDRLl、CDRL2 和 CDRL3，，。 CDR包含與抗原形成特異性相互作用的大部分殘基。HCVR和LCVR區(qū)內(nèi)的CDR氨基酸殘基 的編號及位置與眾所周知的Kabat編號規(guī)定一致。每一條輕_重鏈對的可變區(qū)形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)。如此處所用，“抗原結(jié)合 部分”或“抗原結(jié)合區(qū)”或“抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域”或“抗原結(jié)合位點(diǎn)”可相互取代地指代抗體分 子的部分，其包含與抗原相互作用且賦予抗體對抗原的特異性和親和力的氨基酸殘基。該 抗體部分包括維持抗原結(jié)合殘基正常構(gòu)象所必需的“框架”氨基酸殘基。優(yōu)選地，本發(fā)明抗 體的框架區(qū)為人起源或基本為人起源(至少為80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%人起源)且遵循Kabat編號?；蛘?，抗原結(jié)合區(qū)可來自人序列。如此處所用，術(shù)語“抗體片段”指保留特異結(jié)合抗原(例如Αβ )能力的抗體的一個 或多個片段。包含在術(shù)語抗體的“抗體片段”中的分子的實(shí)例包括(i)Fab片段，由VL、VH、 CL和CHl結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；(ii)F(ab' )2片段，包含在絞鏈區(qū)由二硫鍵連接的兩個 Fab片段的二價片段；(iii)由VH和CHl結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)由抗體單個臂的VL和 VH 結(jié)構(gòu)域組成的 Fv 片段，和(v)dAb 片段(Ward，等，(1989)Nature341 544-546)，其由 VH 結(jié)構(gòu)域組成。此外，盡管Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域VL和VH由不同基因編碼，但可使用重組方法 通過合成接頭(該接頭使它們形成單條蛋白質(zhì)鏈，其中VL區(qū)和VH區(qū)配對以形成單價分子) 將它們連接起來(稱為單鏈Fv(scFv)；參閱，例如Bird等(1988) Science242 :423_426 和 Huston 等(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA85 :5879_5883)。此類單鏈抗體也旨在包含于 術(shù)語“抗體片段”中。術(shù)語“抗體片段”也包含單鏈抗體的其他形式，例如雙體(diabody)。 雙體是二價雙特異性結(jié)合蛋白質(zhì)，其中VH和VL結(jié)構(gòu)域表達(dá)于單條多肽鏈上，但使用的接頭 太短以至于無法在同一條鏈的兩個結(jié)構(gòu)域之間形成配對，因此迫使該結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的 互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對并形成兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)(參閱，例如HolIiger，P.，等(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :6444_6448 ；Pol jak, R. J.，等(1994) Structure 2 1121-1123)。
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更進(jìn)一步，抗體或其抗體片段可為通過抗體或抗體片段與一種或多種其他蛋白質(zhì) 或肽共價或非共價結(jié)合形成的更大免疫粘著分子的一部分。此類免疫粘著分子的實(shí)例包 括使用鏈霉抗生物素蛋白核心區(qū)以產(chǎn)生四聚體scFv分子(Kipriyanov，S. Μ.，等(1995) Human Antibodies andHybridomas 6 :93_101)，和使用半胱氨酸殘基、標(biāo)記肽和C端多組氨 酸標(biāo)簽以產(chǎn)生二價和生物素化的scFv分子(Kipriyanov, S. Μ.，等(1994)Mol. Immunol. 31 1047-1058)?？墒褂贸Ｒ?guī)技術(shù)如整個抗體的木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化分別從整個抗體中 制備抗體片段，例如Fab和F(ab' )2片段。此外，如本領(lǐng)域中眾所周知，可使用標(biāo)準(zhǔn)重組 DNA技術(shù)獲得抗體、抗體片段和免疫粘著分子?？贵w、抗體片段和免疫粘著分子可為糖基化 或非糖基化的且仍落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。優(yōu)選地，抗體片段為Fab片段。術(shù)語“人源化抗體”指部分或全部由來自人抗體種系的氨基酸序列或重排序列組 成的抗體，其通過改變具有非人CDR的抗體序列獲得。可變區(qū)的框架區(qū)可由對應(yīng)的人框 架區(qū)取代。人框架區(qū)包括基因組框架區(qū)以及包含一個或多個氨基酸取代的那些區(qū)域。具 體而言，此類取代包括其中由來自非人CDR的天然框架相應(yīng)位置的氨基酸取代人框架中 特定位置的氨基酸的突變。例如，具有小鼠CDR的人源化抗體可包含用相應(yīng)的小鼠框架 氨基酸取代特定的人框架氨基酸的一處或多處取代。其他描述參與人源化可能使用的小 鼠抗體的方法的參考是例如Queen等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 =2869,1991 ；美國專 利號 5,693, 761 ；美國專利號 4,816, 397 ；美國專利號 5，225，539 ；在 Levitt, Μ.，J. Mol. Biol. 168 595-620,1983中描述的計(jì)算機(jī)程序ABMOD和ENCAD ；人源化可基本上按Winter 及其同事的方法進(jìn)行(Jones 等，Nature, 321 -.522-525,1986 ；Riechmann 等，Nature, 332 323-327，1988 Verhoeyen 等，Science, 239 1534-1536，1988)。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體為人 源化抗體片段。更優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體是人源化抗體fab片段。本發(fā)明還包括共價結(jié)合一個或多個PEG分子的抗體片段。希望術(shù)語“聚乙二醇” 和“PEG”可相互取代使用且指代本領(lǐng)域中公知的聚乙二醇或其衍生物(參閱，例如美國專 利號5，445，090 ；5，900，461 ；5，932，462 ；6，436，386 ；6，448，369 ；6，437，025 ；6，448，369 ； 6，495，659 ；6, 515，100和6，514，491)。優(yōu)選地，PEG共價結(jié)合抗體片段的一個或多個賴氨 酸或半胱氨酸殘基。更優(yōu)選地，PEG共價結(jié)合抗體片段重鏈可變區(qū)中的一個或多個賴氨酸 或半胱氨酸殘基。甚至更優(yōu)選地，PEG共價結(jié)合抗體片段CDR內(nèi)的一個或多個賴氨酸或半胱 氨酸殘基。最優(yōu)選地，PEG結(jié)合所述重鏈可變區(qū)SEQ ID NO :2的第56位氨基酸的半胱氨酸 殘基?；蛘?，PEG分子可經(jīng)連接抗體片段絞鏈區(qū)的接頭或間隔分子結(jié)合到抗體片段上。向 絞鏈區(qū)添加接頭和間隔分子是本領(lǐng)域眾所周知的。此外，PEG可通過本領(lǐng)域公知的技術(shù)共 價結(jié)合到抗體片段的被修飾非天然氨基酸上。在其一般形式中，“PEG”為具有末端羥基的線性聚合物且具有分子式HO CH2CH2-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH,其中η從約為8至約為4000。端基氫可由保護(hù)基團(tuán)如烷基或 鏈烷醇基團(tuán)(M-PEG取代。優(yōu)選地，PEG具有至少一個羥基，更優(yōu)選地其為末端羥基。優(yōu)選 激活該羥基以與肽反應(yīng)。使用多種化學(xué)修飾來制備具有功能性基團(tuán)(例如活性碳酸鹽、活 性酯、醛、tresylate或使用適合于偶聯(lián)給定靶分子的PEG丙醛)的活性PEG衍生物?；钚?PEG衍生物隨后共價結(jié)合多肽藥物的反應(yīng)性基團(tuán)。有許多用于本發(fā)明的PEG形式。本領(lǐng)域 中存在大量PEG衍生物且均適合在本發(fā)明中使用。共價結(jié)合本發(fā)明抗體片段的PEG分子不 旨在局限于具體類型或大小。PEG分子量優(yōu)選從約0. 5千道爾頓(kD)至約IOOkD,更優(yōu)選
6地從約5kD至約30kD，最優(yōu)選地從約IkD到約20kD。PEG可為線性的或分支的，且本發(fā)明的 抗Αβ肽抗體片段可具有1、2、3、4、5或6個與肽結(jié)合的PEG分子。最優(yōu)選為一個PEG分子 抗體片段；然而，當(dāng)每個肽分子存在多于一個PEG分子時，優(yōu)選為不多于六個。本發(fā)明還涵 蓋PEG分子的兩端均適合與兩個或多個抗A β肽抗體片段分子共同交聯(lián)。將PEG分子結(jié)合 到蛋白質(zhì)、抗體及其片段的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的。如此處所用的術(shù)語“KD”旨在指特定抗體_抗原相互作用的解離常數(shù)。根據(jù)方程 式KD = k。ff/k。n(以M測定)計(jì)算。如此處所用術(shù)語“k。n”旨在指結(jié)合速率常數(shù)，或前者或 復(fù)合體形成反應(yīng)的反應(yīng)比速(specific reactionrate)，以單位=M4SecT1測定。如此處所 用術(shù)語“k。ff”旨在指抗體從抗體/抗原復(fù)合體上解離的解離速率常數(shù)或反應(yīng)比速，以單位 sec—1測定。如此處所用的術(shù)語“特異結(jié)合”指其中特異結(jié)合對中的一個成員不顯著地結(jié)合 除它特異結(jié)合的一個或多個配偶體之外的其他分子的情況。該術(shù)語也適用于例如本發(fā) 明抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)τ谟稍S多抗原攜帶的特定表位是特異的，在這種情況下帶有 抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的特異性抗體將能夠結(jié)合帶有該表位的多種抗原。因此，本發(fā)明的分子 特異結(jié)合Αβ肽，而不特異結(jié)合ΑΡΡ。此外，本發(fā)明的分子在線性、非線性或包含氨基酸 HHQKLVFFAEDVGSNK (13-28) (SEQ ID NO 4)的構(gòu)象 A β 表位間特異地結(jié)合。參考本發(fā)明的分子，術(shù)語“活性”包括但不限于表位/抗原親和力和特異性、在體 內(nèi)或體外中和或拮抗Αβ肽活性的能力、IC5tl、抗體的體內(nèi)穩(wěn)定性和抗體的免疫特性。本領(lǐng) 域中抗體識別的其他可識別的生物學(xué)特性或特征包括例如交叉反應(yīng)性、(即通常與靶肽的 非人同源物、或與其他蛋白質(zhì)或組織的交叉反應(yīng)性)、和在哺乳動物細(xì)胞中保持蛋白質(zhì)高表 達(dá)水平的能力?？墒褂冒ǖ幌抻贓LISA、競爭性ELISA、Biacore或KinExA表面等離 子共振分析、不受限的體外或體內(nèi)中和試驗(yàn)、受體結(jié)合、細(xì)胞因子或生長因子產(chǎn)生和/或分 泌、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和對于來自包括人、靈長類或任何其他來源的不同來源的組織切片的免疫組 織化學(xué)在內(nèi)的領(lǐng)域認(rèn)可的技術(shù)觀察、測定或評估前文提到的特性或特征。此處可互相取代使用的術(shù)語“個體”、“受試者”和“患者”指哺乳動物，優(yōu)選為人。 在特定實(shí)施方案中，受試者特征還在于患有將從Αβ肽活性下降中受益的疾病或障礙或病 癥。如此處所用，表述“宿主細(xì)胞”、“宿主細(xì)胞系”和“宿主細(xì)胞培養(yǎng)物”可互相取代 使用并包括單獨(dú)的細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物，其為本發(fā)明任何分離的多核苷酸或包含編碼HCVR、 LCVR或本發(fā)明單克隆抗體的序列的任何一個或多個重組載體的接受者。宿主細(xì)胞包括單 個宿主細(xì)胞的后代。由于自然的、意外的或有目的性的突變和/或改變，后代可能在形態(tài)或 總DNA補(bǔ)體上與原始親本細(xì)胞不完全一致。宿主細(xì)胞包括用表達(dá)本發(fā)明的抗體片段或其輕 鏈或重鏈的重組載體或多核苷酸轉(zhuǎn)化的、轉(zhuǎn)導(dǎo)的或感染的細(xì)胞。包含本發(fā)明重組載體的宿 主細(xì)胞無論是否穩(wěn)定整合入宿主染色體，也可稱為“重組宿主細(xì)胞”。用于產(chǎn)生本發(fā)明宿主 細(xì)胞的優(yōu)選細(xì)胞為CHO細(xì)胞(例如ATCC CRL-9096) ,NSO細(xì)胞、SP2/0細(xì)胞、COS細(xì)胞(ATCC 例如，CRL-1650、CRL-1651)和HeLa(ATCC CCL-2)。本發(fā)明中使用的另外的宿主細(xì)胞包括植 物細(xì)胞、酵母細(xì)胞、其他哺乳動物細(xì)胞和原核細(xì)胞。更優(yōu)選地，本發(fā)明中使用的細(xì)胞為酵母 或原核細(xì)胞。術(shù)語“涉及Αβ肽的病癥或疾病”或“與具有Αβ活性的疾病相關(guān)的病癥”意指包括所有與以下相關(guān)的病癥、病癥和疾病1)腦中β淀粉樣蛋白斑的發(fā)展，2)Αβ異常形式的 合成，3)Αβ獨(dú)特毒性形式的形成，或4)異常的Αβ合成速率、降解速率或清除速率。已知 或推測如阿爾茨海默氏病、唐氏綜合癥、腦淀粉樣血管病、某些血管性癡呆和輕度認(rèn)知缺損 的病癥和疾病與Αβ具有這樣的關(guān)系。本發(fā)明提供包含在第13-28位氨基酸間特異結(jié)合Αβ肽的抗體片段的分子，其中 所述抗體片段共價結(jié)合到PEG分子上。該抗體片段優(yōu)選為人源化抗體片段，如Fab片段和 /或scFv片段。最優(yōu)選地，該抗體片段為Fab片段。本發(fā)明的分子特異結(jié)合Αβ肽允許所 述分子待用于治療與Αβ肽相關(guān)的疾病和病癥，即從抑制Αβ肽的生物活性中受益的病癥、 疾病或病癥。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，抗體片段具有重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中輕 鏈可變區(qū)包含具有以下氨基酸序列的CDR區(qū)CDRLl :SSSQSLIYSDGNAYLH(SEQ ID NO: 6)、CDRL2 KVSNRFS(SEQ IDNO 7)和 CDRL3 =TQSTHSPffT(SEQ ID NO :8)，禾口 / 或其中重 鏈可變區(qū)包含具有以下氨基酸序列的CDR區(qū)CDRH1 :GYTFSRYSMS(SEQ IDNO 9)、CDRH2 QINIRGCNTYYPDTVKG(SEQ ID NO 10)或 QINIRGNNTYYPDTVKG(SEQ ID NO: 11)，和 CDRH3 ⑶F(SEQ IDNO 12)。優(yōu)選地，本發(fā)明抗體片段的六個⑶R共同存在。包含本發(fā)明⑶R的 組合物通常為抗體重鏈或輕鏈序列或其基本部分，其中CDR位于與Kabat編號一致的位置 上。在框架區(qū)內(nèi)提供由以下化學(xué)式呈現(xiàn)的作為連續(xù)序列的每條重鏈和輕鏈的三個CDR區(qū) FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。當(dāng)以有序狀態(tài)與CDR排列為連續(xù)序列時，重鏈或輕鏈 FRU FR2、FR3和FR4結(jié)合形成抗體片段的完整框架區(qū)。優(yōu)選地，本發(fā)明抗體的框架區(qū)為人 起源或基本為人起源(即超過約80、82、85、87、90、92、95、97% )。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體片段包含LCVR和HCVR，所述LCVR包含以下序列的肽DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCSSSQSLIYSDGNAYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSG SGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCTQSTHSPffTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO 1),所述HCVR包含具有選自以下序列的序列的肽EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGYTFSRYSMSffVRQAPGKGLEffVGQINIRGCNTYYPDTVKGRFT ISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAYYYCTTGDFffGQGTLYTYSS (SEQ ID NO 2)EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGYTFSRYSMSffVRQAPGKGLEffVGQINIRGNNTYYPDTVKGRFT ISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAYYYCTTGDFffGQGTLYTYSS(SEQ ID NO 3)；或者，抗體片段包含LCVR (包含具有由SEQ ID NO 1組成的序列的肽)和HCVR (包 含具有選自SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3的序列的肽)，其中所述HCVR和LCVR共同存在于 抗體片段中。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解本發(fā)明的抗體片段不局限于HCVR和LCVR的特異性序 列，而且還包括這些序列的變體，所述變體當(dāng)在本發(fā)明的分子中存在時，其保持或改善抗原 結(jié)合能力和親本抗體的至少一種其他功能特性，例如表位特異性、與親本抗體競爭結(jié)合A β 肽的能力、結(jié)合A β肽的IC50和/或Kd或k。ff值。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所有可變區(qū)或部分可變區(qū)受限于由SEQID NO 1顯 示的特殊LCVR序列和在SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3中顯示的HCVR，并且進(jìn)一步的特征在 于其在體內(nèi)或體外拮抗或中和至少一種Aβ肽活性。本發(fā)明抗體進(jìn)一步的特征在于其特異 結(jié)合人A β肽但不結(jié)合人ΑΡΡ，所述抗體中所有可變區(qū)或部分可變區(qū)受限于由此處的LCVRSEQID NO :1，禾口 HCVR SEQ ID NO :2 或 SEQ ID NO 3 中顯示的特殊序列。在本發(fā)明的一個方面中，PEG(或其衍生物)共價結(jié)合抗體片段的一個或多個賴氨 酸、半胱氨酸或非天然修飾的氨基酸殘基。優(yōu)選地，PEG分子共價結(jié)合抗體片段的重鏈可變 區(qū)或輕鏈可變區(qū)。更優(yōu)選地，此類分子具有共價結(jié)合到抗體片段重鏈可變區(qū)的CDR上的PEG 分子。最優(yōu)選地，此類分子具有共價結(jié)合重鏈可變區(qū)SEQ ID NO :2的第56位氨基酸處的半 胱氨酸的PEG分子。或者，PEG分子可經(jīng)針對抗體片段絞鏈區(qū)的接頭或間隔分子結(jié)合到抗 A β肽Fab抗體片段上。在本發(fā)明的另一方面中，PEG分子共價結(jié)合本發(fā)明抗體的一個或多個改造的賴氨 酸、半胱氨酸或非天然修飾的氨基酸殘基，以取代抗體分子上存在的糖基化而不顯著影響 抗體片段對Αβ的親和力和選擇性。優(yōu)選地，PEG分子在抗體片段的重鏈可變區(qū)或輕鏈可 變區(qū)上取代糖基化信號。更優(yōu)選地，PEG分子在抗體片段重鏈可變區(qū)的CDR上取代糖基化 信號。最優(yōu)選地，PEG分子在重鏈可變區(qū)SEQ ID NO :2的第56位處取代糖基化信號。在本發(fā)明中共價結(jié)合到抗體上的PEG分子不旨在局限于特定的類型或大小。PEG 分子量優(yōu)選從約0. 5kD至約IOOkD,更優(yōu)選地從約0. 5kD至約30kD，最優(yōu)選地從約IkD到約 20kD?；蛘逷EG分子量可選自約0. 5kD、約lkD、約5kD、約IOkD和約20kD。PEG可為線性 的或分支的，且本發(fā)明的聚乙二醇化的抗Αβ肽抗體可具多于一個結(jié)合到肽上的PEG分子。 優(yōu)選地，每一聚乙二醇化的抗A β肽抗體具有一個PEG分子。更優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體分子包含具有輕鏈可變區(qū)SEQ ID NO :1和重鏈可變區(qū)SEQ ID NO :2的抗體片段，其中所述抗體片段在重鏈可變區(qū)SEQ ID NO :2的第56位處共價結(jié)合 到20kD的PEG分子上。本發(fā)明抗體結(jié)合的抗原性Αβ肽表位是包含氨基酸HHQKLVFFAEDVGSNK(SEQ ID NO 4)的線性、非線性或構(gòu)象表位。結(jié)合所述表位的抗體與它們結(jié)合的APP相比特異且優(yōu) 先結(jié)合Αβ肽。本發(fā)明的單克隆抗體結(jié)合Αβ肽比它結(jié)合人APP高出至少2、5、10、20、30、 40、50、60、70、80、90或100倍(例如更高親和力或更高特異性)；更優(yōu)選地比它結(jié)合APP高 出至少150、200、250、300、350、400、450、500、550或600倍，甚至更優(yōu)選地它在高于如ELISA 試驗(yàn)、競爭性ELISA試驗(yàn)或Biacore或KinExA試驗(yàn)中的Kd值測定的背景水平的水平上不 結(jié)合APP。本發(fā)明的抗體片段結(jié)合氨基酸HQKLVFFAEDVGSNK(SEQ ID NO 5)間的表位比 不包含氨基酸 HQKLVFFAEDVGSNK(SEQ ID NO 5)的表位高出至少 2、5、10、20、30、40、50、 60、70、80、90或100倍(例如更高親和力或更高特異性)。更優(yōu)選地，比不包含氨基酸 HQKLVFFAEDVGSNK (SEQ ID NO 5)的表位高出至少 150、200、250、300、350、400、450、500、550 或600倍，甚至更優(yōu)選地它在高于如ELISA試驗(yàn)、競爭性ELISA試驗(yàn)測定的背景水平的水平 上，或Biacore或KinExA試驗(yàn)中的Kd值不結(jié)合不包含氨基酸HQKLVFFAEDVGSNK (SEQ ID NO: 5)的表位。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抗體片段，所述抗體片段對Αβ肽具有強(qiáng) 親和力，即結(jié)合A β肽或其包含序列HQKLVFFAEDVGSNK (SEQID NO 5)的部分[即與 HQKLVFFAEDVGSNK多肽接觸的抗體]，具有通過KinExA方法測定的對人A β肽低于約 200ρΜ、100ρΜ、50ρΜ、40ρΜ或30ρΜ，優(yōu)選地為低于20ρΜ的結(jié)合親和力(Kd)?；蛘?，對人Αβ 肽的結(jié)合親和力(Kd)介于0. 1ρΜ-200ρΜ之間?？砂聪挛闹袑?shí)施例或本領(lǐng)域可得的其他方法中描述的進(jìn)行測定抗體親和力。本發(fā)明抗體的給藥途徑可為口服、腸胃外、通過吸入或局部。優(yōu)選地，本發(fā)明抗體 可整合入適合腸胃外給藥的藥物組合物中。如此處所用的術(shù)語腸胃外包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮 下、直腸、陰道、腹膜內(nèi)施用。優(yōu)選通過靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)或皮下注射的外周全身給藥。更優(yōu) 選地，本發(fā)明抗體的給藥途徑是經(jīng)皮下注射。用于此類注射的合適載體在本領(lǐng)域是顯而易 見的。本發(fā)明的抗體片段在血漿中較相應(yīng)的抗Αβ肽全長抗體具有更短的半衰期，且較 相應(yīng)的抗Αβ肽全長抗體能更快地被從血漿中清除?；蛘?，本發(fā)明的抗體較相應(yīng)的非共價 結(jié)合PEG分子的抗A β肽Fab片段具有更長的血漿半衰期，且較相應(yīng)的非共價結(jié)合PEG分 子的抗Αβ肽Fab片段能更慢地被從血漿中清除(實(shí)施例1、2和3)。參考如此處所用的抗 體的術(shù)語“相應(yīng)的”指具有相同LCVR和HCVR的抗體。例如，參考具有SEQ ID NO :1的LCVR 和由SEQ ID NO 2組成的HCVR的抗體Fab片段的相應(yīng)全長抗體將具有相同的SEQ ID NO 1的LCVR和由SEQ ID NO 2組成的HCVR，及完整的Fc結(jié)構(gòu)域。在另一方面，本發(fā)明涉及當(dāng)表達(dá)時編碼抗體的重組多核苷酸包含SEQID NO 1的 LCVR和由SEQ ID Ν0:2組成的HCVR。由于密碼子簡并性，其他多核苷酸序列可容易被取代 成這些序列。本發(fā)明特別優(yōu)選的多核苷酸編碼當(dāng)表達(dá)時包含SEQ ID Ν0:6-8的輕鏈⑶R， 和SEQ ID NO :9、10或11和12的重鏈CDR，或SEQ ID NO =I-SEQ ID NO :3的任何可變區(qū)的 抗體。編碼SEQ ID NO 1的LCVR和SEQ ID NO 2的HCVR的多核苷酸序列的實(shí)例分別示于 SEQ ID NO 13 (LCVR)和 SEQ ID NO 14 (HCVR)中。多核苷酸通常還將包括有效連接到人源化免疫球蛋白編碼序列上的表達(dá)控制多 核苷酸，其包含天然結(jié)合的或異源的啟動子區(qū)。優(yōu)選地，表達(dá)控制序列將為在能夠轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn) 染真核細(xì)胞的載體中的真核啟動子系統(tǒng)，但也可使用用于原核細(xì)胞的控制序列。一旦將載 體整合進(jìn)合適的宿主細(xì)胞系中，宿主細(xì)胞在適合表達(dá)核苷酸序列的條件下繁殖，并且如期 望的，可接著收集和純化輕鏈、重鏈、輕/重鏈二聚體或完整抗體、結(jié)合片段或其他免疫球 蛋白形式?？墒褂枚喾N眾所周知的技術(shù)從多種不同多核苷酸(基因組寡核苷酸或cDNA、RNA、 合成寡核苷酸等)和組分(例如V、J、D和C區(qū))形成能夠最終表達(dá)所期望抗體或抗體片段 的本發(fā)明的核酸序列。將合適的基因組序列和合成序列連接起來是制備的常用方法，但也 可利用cDNA序列。可根據(jù)眾所周知的方法從多種人細(xì)胞中分離人恒定區(qū)DNA序列，但優(yōu)選從不凋亡 的B細(xì)胞中分離?？蓮谋绢I(lǐng)域眾所周知的多種來源中獲得用于多核苷酸序列的合適的來源 細(xì)胞和用于免疫球蛋白表達(dá)和分泌的宿主細(xì)胞。除此處特別描述的人源化抗體或抗體片段外，可利用對本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的多 種重組DNA技術(shù)容易地設(shè)計(jì)并制備其他“基本同源的”修飾后抗體。例如，框架區(qū)可通過幾 個氨基酸替代、末端和中部添加和缺失等而在一級結(jié)構(gòu)水平上與天然序列不同。此外，多種 不同的人框架區(qū)可單獨(dú)或組合用作與本發(fā)明人源化抗體的基礎(chǔ)。通常，可通過多種眾所周 知的技術(shù)如定向誘變來容易地完成基因修飾。如前文陳述，當(dāng)序列已有效連接到(即定位以確保功能)表達(dá)控制序列之后多核 苷酸將在宿主中進(jìn)行表達(dá)。這些表達(dá)載體通常作為游離基因或作為宿主染色體DNA的整合
10部分在宿主細(xì)胞中復(fù)制。通常，表達(dá)載體將包含選擇標(biāo)記，例如四環(huán)素或新霉素以允許檢測 那些轉(zhuǎn)化有所期望DNA序列的宿主細(xì)胞。這些細(xì)胞的表達(dá)載體可包括表達(dá)控制序列，如復(fù) 制起始區(qū)、啟動子、增強(qiáng)子和必需的加工信息位點(diǎn)例如核糖體結(jié)合位點(diǎn)、RNA剪切位點(diǎn)、多腺 苷酸化位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止序列。優(yōu)選的表達(dá)控制序列是來自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、 牛乳頭狀瘤病毒、巨細(xì)胞病毒等的啟動子?？赏ㄟ^眾所周知的方法(其根據(jù)細(xì)胞類型而有所不同)將包含目的多核苷酸序列 (例如重鏈和輕鏈編碼序列和表達(dá)控制序列)的載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞?？墒褂帽绢I(lǐng)域周知的 技術(shù)將多種宿主用于表達(dá)本發(fā)明的抗體。優(yōu)選的細(xì)胞系包括C0S、CH0、SP2/0、NS0(可從如 公共保藏處ATCC，美國典型培養(yǎng)物保藏中心Manassas，VA獲得)和酵母細(xì)胞系。優(yōu)選地， 本發(fā)明的宿主細(xì)胞包含一種或多種包含本發(fā)明核酸分子的載體或構(gòu)建體。本發(fā)明的宿主細(xì) 胞是已引入本發(fā)明載體的細(xì)胞，所述載體包含編碼本發(fā)明的LCVR的多核苷酸和/或編碼本 發(fā)明的HCVR的多核苷酸。本發(fā)明也提供已引入本發(fā)明的兩個載體的宿主細(xì)胞；一個載體包 含編碼本發(fā)明抗體的LCVR的多核苷酸，一個載體包含編碼存在于本發(fā)明抗體中的HCVR的 多核苷酸，并且每一載體有效連接啟動子序列。細(xì)胞類型包括哺乳動物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、植 物細(xì)胞和酵母細(xì)胞。優(yōu)選地，細(xì)胞為CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞、SP2/0細(xì)胞、NSO細(xì)胞、酵母細(xì)胞或 任何優(yōu)選細(xì)胞類型的衍生物或后代。本發(fā)明的完整抗體、其二聚體、各個輕鏈和重鏈、或其他免疫球蛋白形式一旦表 達(dá)，可根據(jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法對其進(jìn)行純化，所述方法包括硫酸銨沉淀、離子交換、親和、反 相、疏水性相互作用柱層析、凝膠電泳等。對藥物使用而言，優(yōu)選基本上至少約90%、92%、 94 %或96 %同質(zhì)性的基本純免疫球蛋白，且最優(yōu)選98 %至99 %或更高同質(zhì)性的基本純免 疫球蛋白。肽一旦被部分純化或純化達(dá)到所期望的同質(zhì)性，就可如此處所示在治療上或預(yù) 防上使用。導(dǎo)致認(rèn)知缺陷、中風(fēng)、腦溢血和一般性精神衰弱的許多癥狀似乎與含Αβ肽的腦 中神經(jīng)炎和腦血管斑相關(guān)。這些病癥為臨床前和臨床阿爾茨海默氏病、唐氏綜合癥、和臨 床前和臨床腦淀粉樣血管病(CAA)。淀粉樣蛋白斑形成自Αβ肽。這些肽通常以與脂蛋 白的復(fù)合形式在血液和腦脊液(CSF)中循環(huán)。循環(huán)形式的Αβ肽由從常見前體蛋白質(zhì)， 常命名為APP的淀粉樣前體蛋白質(zhì)剪切獲得的39-43個氨基酸(主要為40或42個氨基 酸)組成?？扇苄訟P的一些形式自身具有神經(jīng)毒性且可決定神經(jīng)變性和/或認(rèn)知衰退的 嚴(yán)重性(McLean，C. Α.，等，Ann. Neturol. (1999)46:860-866 ；Lambert，Μ. P.，等(1998)迪 6448-6453 ；Naslund, J.，J. Am. Med. Assoc. (2000) 283 1571)。因此，包含本發(fā)明分子的藥物組合物可用于治療或預(yù)防這樣的病癥，其中Αβ肽 的存在引起或促進(jìn)不期望的病理學(xué)效果或Αβ肽活性的降低在哺乳動物優(yōu)選人中具有治 療益處，所述病癥包括但不限于臨床或臨床前阿爾茨海默氏病、唐氏綜合癥、臨床或臨床前 淀粉樣蛋白血管病(CAA)、前驅(qū)阿爾茨海默氏病、輕度認(rèn)知缺損(MCI)和認(rèn)知缺陷、中風(fēng)、腦 溢血和一般性精神衰弱，所述病癥似乎與含Αβ肽的腦中神經(jīng)炎和腦血管斑相關(guān)。此處涵 蓋本發(fā)明的分子用于治療或預(yù)防至少一種上述病癥(其中Αβ肽活性是有害的或其從生物 活性Αβ肽水平降低中受益)的用途。此外，涵蓋本發(fā)明分子用于制備治療至少一種上述 病癥的藥物中的用途。如此處所用，術(shù)語“治療(treatment) ”、“治療(treating) ”等指獲得所期望的藥
11理學(xué)和/或生理學(xué)效果。所述效果可以是對疾病和/或歸屬于疾病發(fā)展的不利作用的部分 治療或完全治療。如此處所用，“治療(treatment)”包括尤其是向人施用化合物，且包括 (a)抑制疾病，即停滯其發(fā)展；或(b)緩解疾病，即導(dǎo)致疾病或病癥的復(fù)原或緩和其癥狀或 并發(fā)癥?？烧{(diào)整給藥方案來提供最佳的期望應(yīng)答(例如，治療或預(yù)防應(yīng)答)。例如，可快速 濃注施用，可在一段時間內(nèi)施用幾份分次劑量或根據(jù)治療情況的緊急程度所示按比例減少 或增加劑量。可將本發(fā)明分子摻入適合于向受試者施用的藥物組合物中。本發(fā)明分子可按一 次劑量或多劑量單獨(dú)施用或與可藥用載體、稀釋劑和/或賦形劑組合施用。設(shè)計(jì)用于施用 的藥物組合物以適合選定的施用方式，并在適當(dāng)時使用可藥用稀釋劑、載體和/或賦形劑 如分散劑、緩沖液、表面活性劑、防腐劑、增溶劑、等滲劑、穩(wěn)定劑等(例如見此處的實(shí)施例 14) ο 按照例如 ReminRton, The Science and Practice of Pharmacy,第 19 版,Gennaro 編 著，Mack Publishing Co.，Easton, PA 1995中的常規(guī)技術(shù)設(shè)計(jì)所述組合物，所述文獻(xiàn)提供 了從業(yè)者公知的制備技術(shù)一覽表?？墒褂冒诜㈧o脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、肺部、透皮、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、口腔、舌下或栓劑 施用在內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)施用技術(shù)向具有如此處所述病理學(xué)風(fēng)險或出現(xiàn)如此處所述病理學(xué)的受試 者施用包含本發(fā)明分子的藥物組合物。優(yōu)選地，可通過皮下施用向具有如此處所述病理學(xué) 風(fēng)險或出現(xiàn)如此處所述病理學(xué)的受試者施用本發(fā)明的分子。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選為“治療有效量”或“預(yù)防有效量”的本發(fā)明分子?！爸?療有效量”指在劑量和必需的時間周期上獲得所期望治療結(jié)果的有效量。分子的治療有效 量可根據(jù)如個體的疾病病癥、年齡、性別和體重等因素以及分子在個體中誘導(dǎo)所期望應(yīng)答 的能力而有所變化。治療有效量還是其中治療有益作用大于分子的任何毒害作用或不利作 用的量。“預(yù)防有效量”指在劑量和必需的時間周期上獲得所期望的預(yù)防結(jié)果的有效量。通 常，由于在受試者患病之前或早期使用預(yù)防劑量，預(yù)防有效量將少于治療有效量。治療有效量或預(yù)防有效量是必需給予受試者治療益處的活性物質(zhì)的至少最小劑 量但低于中毒劑量。換言之，治療有效量的本發(fā)明分子在哺乳動物優(yōu)選為人中降低Aβ肽 活性(例如結(jié)合Αβ肽)的量，其中Αβ肽的存在引起或促進(jìn)不想要的病理效應(yīng)或Αβ肽 的降低在哺乳動物優(yōu)選人中引起有益的療效。本發(fā)明分子的給藥途徑可以是口服、腸胃外、通過吸入、或局部給藥。優(yōu)選地，可將 本發(fā)明的抗體摻入到適合腸胃外給藥的藥物組合物中。如此處所用的術(shù)語腸胃外包括靜脈 內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、直腸、陰道、或腹膜內(nèi)施用。優(yōu)選通過靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)或皮下注射的外周全 身給藥。最優(yōu)選皮下注射。用于此類注射的合適載體在本領(lǐng)域中是顯而易見的。藥物組合物通常必須為無菌且在生產(chǎn)和所提供的容器(例如包括密封的管或注 射器)中貯存的條件下是穩(wěn)定的。因此，藥物組合物可在制成后進(jìn)行無菌過濾，或另在微生 物(方面)上制成可接受的。靜脈輸注的典型組合物可以具有多達(dá)250-1000ml液體的體 積(例如無菌的林格氏溶液、生理鹽水、葡萄糖溶液和Hank’ s溶液)和治療有效劑量(例 如1至100mg/ml或更多)的治療劑，以遞送下文列出的典型劑量。劑量可基于疾病的類型 和嚴(yán)重性而變化。如在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域眾所周知的，用于任何一名受試者的劑量取決于許多因素， 所述因素包括患者的大小、體表面積、年齡、待施用的特定化合物、性別、給藥時間和途徑、 一般健康和同時施用的其他藥物。例如，典型劑量可在0. 001至IOOOmg范圍內(nèi)；然而，特別
12是考慮到上文提到的因素時，可考慮低于或高于該示例性范圍的劑量。每日腸胃外劑量方 案可以為每天從約0. lmg/kg至約100mg/kg總體重，優(yōu)選為從約0. 3mg/kg至約10mg/kg且 更優(yōu)選為從約lmg/kg至lmg/kg，甚至更優(yōu)選為從約0. 5至10mg/kg體重?？赏ㄟ^周期評估 來監(jiān)測進(jìn)程。對于在幾天或更長時間的重復(fù)施用，根據(jù)情況重復(fù)治療直至產(chǎn)生期望的疾病 癥狀的抑制。然而，其他劑量方案也是有用的，并不由此未排除在外。根據(jù)從業(yè)人員希望獲 得的藥物代謝動力學(xué)衰減模式(pattern of pharmacokineticdecay)，可通過分子的單次 快速濃注施用、多次濃注施用或連續(xù)輸注施用來遞送所期望的劑量。本發(fā)明分子的這些建議用量受許多治療上的考慮。選擇合適劑量和時間安排上的 關(guān)鍵因素是所獲得的結(jié)果。在該上下文中考慮的因素包括治療的具體病癥、治療的具體哺 乳動物、個別患者的臨床情況、病癥的原因、抗體遞送位點(diǎn)、抗體的具體類型、施用方法、施 用時間安排和醫(yī)療從業(yè)人員公知的其他因素。本發(fā)明的治療劑可冷凍或凍干用于貯存并且在使用之前在合適的無菌載體中重 構(gòu)。凍干和重構(gòu)可能會導(dǎo)致抗體活性不同程度的損失。可能需要調(diào)整劑量來補(bǔ)償。以下實(shí)施例旨在說明而非不限制本發(fā)明。下文的實(shí)施例使用命名為“266” (m266) 的鼠類單克隆抗體(其最初通過用人Αβ肽第13-28位殘基組成的肽免疫制備)和命名為 266(m266-Fab)的鼠類單克隆抗體的Fab片段。確認(rèn)抗體與該肽可以進(jìn)行免疫反應(yīng)。前面已 經(jīng)描述過m266的制備。為將PEG分子共價結(jié)合到m266-Fab上，可在重鏈可變的CDR2 (N56C) 中引入半胱氨酸殘基將Fab突變且以下文顯示的方式將其聚乙二醇化(實(shí)施例4)。如此處 實(shí)施例描述在鼠類系統(tǒng)中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，鼠類單克隆抗體的使用是令人滿意的。然而，在旨在 用于人的本發(fā)明的治療方法中，優(yōu)選本發(fā)明抗體的人源化形式或其片段。在下文的實(shí)施例 中涉及的IAl-Fab是包含SEQ ID NO 1的LCVR和SEQ ID NO 2的HCVR的人源化抗體Fab 片段。實(shí)施例1PDAPP 小鼠中 m266_Fab PEG 皮下 PK/PD 研究使用幼小的(3個月大)轉(zhuǎn)基因PDAPP小鼠以研究抗體和抗體-Αβ復(fù)合體的 藥物代謝動力學(xué)/藥物動力學(xué)血漿反應(yīng)。研究了幾種抗體，包括小鼠Fab(m266-Fab)、 m266-Fab+5KD PEG、m266_Fab+10KD PEG、m266_Fab+20KD PEG 和完整的全長 m266IgG 抗 體。用lmg/kg的抗體通過皮下注射PDAPP+/-小鼠，隨后在以下時間點(diǎn)分離血漿服藥后 1、4、8、24、48、96、168和240小時。由于這部分的快速翻轉(zhuǎn)，所以在額外早的時間點(diǎn)對接受 m266-Fab抗體的動物進(jìn)行分析。用于m266_Fab的時間點(diǎn)如下服藥后1、4、8、12、16、24和 48小時。在每個時間點(diǎn)對每種抗體分析了總共5只動物。通過用連接到ICC注射器上的 23號針頭進(jìn)行心臟穿刺獲得全血，所述ICC注射器先前已經(jīng)用0. 5M EDTA沖洗過。在分離 過程中將血樣在冰上進(jìn)行溫育，并隨后在4°C，冷凍微量離心機(jī)中以14，000轉(zhuǎn)/分鐘離心 15分鐘。將所得血漿樣品等分并儲存在-80°C。Α.用于Fab PK分析的方法學(xué)使用抗原捕獲ELISA測定血漿Fab的濃度。簡言之，在4°C用A β -BSA綴合物過夜 包被平板或在37°C包被1小時，然后用Pierce酪蛋白緩沖液進(jìn)行封閉。向平板中加入標(biāo)準(zhǔn) 樣品、對照樣品和研究樣品，然后在室溫下溫育1小時。山羊抗小鼠HRP用于檢測并用OPD 底物對比色反應(yīng)進(jìn)行顯色。平板在A493的吸光度處進(jìn)行讀數(shù)，參考A700。從標(biāo)準(zhǔn)曲線測定來自血漿樣品的免疫反應(yīng)性的濃度，使用4/5-參數(shù)算法從小鼠血漿中m266 Fab的已知量 制備所述標(biāo)準(zhǔn)曲線。m266 Fab的測定范圍是0. 05到0. 5 μ g/mL。聚乙二醇化的Fab的范 圍是 0. 075 到 0. 8 μ g/mL。從標(biāo)準(zhǔn)曲線測定來自血漿樣品的免疫反應(yīng)性的濃度，使用4/5-參數(shù)算法從小鼠 血漿中m266 Fab的已知量制備所述標(biāo)準(zhǔn)曲線。266 Fab的測定范圍是0. 05到0. 5 μ g/mL。 聚乙二醇化Fab的范圍是0. 075到0. 8 μ g/mL。結(jié)果清晰地證實(shí)，添加PEG分子并增加PEG 分子的大小提高了聚乙二醇化Fab相比于非聚乙二醇化m266-Fab(8小時后為350ng/ml) 在血漿中的停滯(對20K聚乙二醇化m266-Fab而言，8小時后為2545ng/ml)。B. m266A β ELISA 測定為了測定在不存在或存在治療抗體(全長或Fab片段)的情況下血漿Αβ的量，發(fā) 展并使用了 ELISA測定。在這些測定法中測定的Αβ肽是全長Αβ 1-40或Αβ 1-42。用PBS 中10 μ g/ml (每孔100 μ 1)的C端捕獲抗體(對A β 40平板而言為m2G3或?qū) β 42平板 而言為 m21F12)在 4°C過夜包被 96 孔 Immulon 4HBX 96 孔 ELISA 板(ThermoLabsystems)。 在過夜溫育過程中將測試平板密封以防止蒸發(fā)。第二天，去除孔內(nèi)溶液并用Labsystems 96-孔板洗滌器用PBS (每孔400 μ 1)將孔洗滌3次。加入封閉緩沖液(360 μ 1的牛 奶-PBS)并在37°C溫育平板1小時。通過稀釋血漿將樣品制備成樣品稀釋液，以產(chǎn)生以下 20%血漿、0. 5M 胍、5mM Tris pH 8. 0、0. 5X 蛋白酶抑制劑混合物、25 μ g/ml m266 和 PBS。 因存在高水平的Αβ肽，所以在某些時間點(diǎn)上可能需要減少用于測定的血漿體積，并且在 這些情況下，用大鼠血漿調(diào)整剩余的血漿體積(最終百分比體積維持在20%)。在標(biāo)準(zhǔn)稀 釋液(20%大鼠血漿、0. 5Μ胍、5mM Tris pH 8. 0和完全無EDTA的0. 5X蛋白酶抑制劑混合 物(Roche Diagnostics)、25 μ g/ml m266 和 PBS)中產(chǎn)生濃度在 250pg/ml 到 3. 9pg/ml 之 間變化的A β標(biāo)準(zhǔn)物。需要在樣品和標(biāo)準(zhǔn)稀釋液中摻入25 μ g/ml的完整m266，以中和測 定中不同水平的中心結(jié)構(gòu)域抗體可能產(chǎn)生的任何負(fù)干擾。封閉后，用PBS洗滌平板4次。 一式三份來裝載樣品和標(biāo)準(zhǔn)物(每孔100 μ 1)，封閉平板并在4°C溫育過夜。第二天早晨， 用PBS-T(PBS+0. 05% Tween-20)洗滌平板4次，并在室溫下將孔與生物素化的第二抗體 m3D6 (在0. 5% BSA/PBS-T中稀釋的每孔100 μ 1)溫育2小時。用PBS-T洗滌平板4次后， 它們與鏈霉抗生物素蛋白-多聚HRP(在0. 5% BSA/PBS-T中為1 5000)在室溫下溫育 1. 5小時。用PBS-T洗滌平板4次并每孔加入100 μ 1的TMB(Sigma)底物。在15、30和60 分鐘，650nm處監(jiān)測比色反應(yīng)的進(jìn)行。表1.藥物動力學(xué)結(jié)果用于A β 40 (pg/ml)的平均血漿濃度
時間m266m266Fabm266Fabm266Fab完整(h)Fab+5KD+IOKD+20KDm266PEGPEGPEG
權(quán)利要求
包含抗體片段的分子，所述抗體片段在第13 28位氨基酸之間特異結(jié)合人Aβ肽，其中所述抗體片段共價結(jié)合聚乙二醇分子。
2.權(quán)利要求1的分子，其中所述抗體片段為Fab片段。
3.權(quán)利要求1或2的分子，其中所述抗體片段包含輕鏈可變區(qū)SEQIDNO :1和重鏈可 變區(qū) SEQ ID NO :2。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的分子，其中所述聚乙二醇分子共價結(jié)合所述抗體片段的重 鏈可變區(qū)。
5.權(quán)利要求4的分子，其中所述聚乙二醇分子共價結(jié)合所述抗體片段重鏈可變區(qū)的CDR。
6.權(quán)利要求3-5中任一項(xiàng)的分子，其中所述聚乙二醇分子共價結(jié)合所述重鏈可變區(qū) SEQ ID NO 2第56位氨基酸處的半胱氨酸。
7.權(quán)利要求1或2的分子，其包含輕鏈可變區(qū)SEQID NO 1和重鏈可變區(qū)SEQ ID NO 3。
8.權(quán)利要求7的分子，其中所述聚乙二醇分子共價結(jié)合所述抗體片段的絞鏈區(qū)。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的分子，其中所述聚乙二醇分子具有約0.5kD至約30kD的分子量。
10.權(quán)利要求9的分子，其中所述聚乙二醇分子具有約20kD的分子量。
11.由在第13-28位氨基酸之間特異結(jié)合人Αβ肽的抗體片段組成的分子，其中所述抗 體片段共價結(jié)合聚乙二醇分子。
12.包含具有輕鏈可變區(qū)SEQID NO :1和重鏈可變區(qū)SEQ ID NO :2的抗體片段的分子， 其中所述抗體片段在重鏈可變區(qū)SEQ ID NO 2第56位處共價結(jié)合20kD的聚乙二醇分子。
13.組合物，其包含權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的分子。
14.權(quán)利要求13的組合物，其還包含可藥用載體。
15.治療或預(yù)防與Αβ肽活性相關(guān)的病癥的方法，所述方法包括向需要其的人受試者 施用有效量的權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的分子。
16.治療選自臨床或臨床前阿爾茨海默氏病、唐氏綜合癥或臨床或臨床前淀粉樣蛋白 血管病(CAA)、認(rèn)知缺陷、中風(fēng)、腦溢血和一般性精神衰弱的病癥的方法，所述方法包括向人 受試者施用有效量的權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的分子。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的分子用作藥物的用途。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的分子在制備用于治療或預(yù)防與Αβ肽活性相關(guān)的病 癥的藥物中的用途。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的分子在制備用于治療或預(yù)防選自臨床或臨床前阿 爾茨海默氏病、唐氏綜合癥、臨床或臨床前淀粉樣蛋白血管病(CAA)、認(rèn)知缺陷、中風(fēng)、腦溢 血和一般性精神衰弱的病癥的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明描述了在預(yù)防上和治療上治療與Aβ肽活性相關(guān)的病癥的方法。該方法使用在第13-28位氨基酸之間特異結(jié)合人Aβ肽的人源化抗體片段，其中所述抗體片段共價結(jié)合聚乙二醇(PEG)分子。
文檔編號A61K47/48GK101981053SQ200880002621
公開日2011年2月23日 申請日期2008年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月18日
發(fā)明者C-K·喬, J·盧, K·R·貝爾斯, P·C·麥克唐奈, R·B·德馬托斯, R·J·漢森, T·F·布摩爾, U·庫希波特拉 申請人:伊萊利利公司