用于TGF-β的受控釋放的纖維蛋白凝膠及其應用的制作方法

文檔序號：1142294閱讀：347來源：國知局

專利名稱：用于TGF-β的受控釋放的纖維蛋白凝膠及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明總的來說涉及纖維蛋白密封材料，其中含有用于在原位受控釋放的轉化生長因子13 (TGF-e)，以用于治療性應用，包括肌肉骨骼和心血管疾病。

背景技術：
纖維蛋白密封材料是用人類血液凝固蛋白制成的一類外科"膠"，一般在外科手術過程中用于控制出血。在使用過程中，這些密封材料中的成分相互作用，形成了由血液蛋白纖維蛋白構成的穩(wěn)定的凝塊。目前，在外科手術中，纖維蛋白密封材料的使用是出于幾種不同的目的在外科醫(yī)生做手術的區(qū)域中控制出血，加速傷口愈合，密封中空的身體器官或覆蓋由標準的縫合產生的孔洞，為外科手術中暴露的組織提供緩釋性藥物遞送。
纖維蛋白密封材料一般含有兩種來自人類血漿的成分(a)高度濃縮的纖維蛋白原復合物(FC)，主要由纖維蛋白原和纖連蛋白以及催化量的因子XIII和血纖維溶酶原組成，以及(b)高效凝血酶。纖維蛋白密封材料也可以包含抑蛋白酶肽。通過凝血酶的作用， (可溶性)纖維蛋白原首先被轉化成纖維蛋白單體，它們自發(fā)凝集并形成所謂的纖維蛋白凝塊。同時，在存在鈣離子的情況下，溶液中存在的因子XIII(FXIII)被凝血酶活化成因子 XlIIa。凝集的纖維蛋白單體以及可能存在的任何剩余的纖連蛋白交聯，通過形成新的肽鍵形成了高分子聚合物。通過這種交聯反應，形成的凝塊的強度顯著增加。一般來說，凝塊與傷口和組織表面粘附得很好，這導致了附著和止血效應(美國專利7， 241,603)。因此，纖維蛋白粘附劑通常被用作雙組分粘附劑，其中含有纖維蛋白原復合物(FC)組分和凝血酶組分，此外還含有鈣離子。纖維蛋白密封材料的特殊的優(yōu)點在于粘附劑/凝膠不像外來物體那樣保留在施加的位點，而是像在傷口自然愈合中那樣完全被再吸收，并被新形成的組織代替。各種細胞例如巨噬細胞以及隨后的成纖維細胞遷移到凝膠中，裂解并重新吸附凝膠物質，形成了新的組織。纖維蛋白密封材料已被用于在原位形成纖維蛋白凝膠，這些纖維蛋白凝膠已被用于遞送細胞和生長因子(Cox等，Tissue Eng 10(5-6) :942-954， 2004 ;Wong等，Thromb Haemost 89:573-582,2003)。對于組織修復來說，希望將生長因子和細胞定位于基質例如纖維蛋白凝膠中。例如，纖維蛋白基質已經被用于將TGF-I3遞送到各種不同的復雜的混合物中，包括胎牛血清、珊瑚顆粒和脂質體(Fortier等，Am J Vet Res 58(1) :66-70， 1997 ;Arnaud等， Chirurgie PlastiqueEsthetique 39(4) :491-498，1994 ;Arnaud等，Calcif Tissue Int 54 :493_498， 1994 ;Gi靈oni等，Biotechnology and Bioengineering 83(1) :121_123， 2003)。將生長因子從纖維蛋白凝膠遞送的可選方法包括含有與生長因子結合的谷氨酰胺轉移酶底物、抗體和VEGF片段的結合物(參見例如美國專利Nos. 6， 506， 365、US 6， 713， 453 和美國專利公開2003/0012818，在此以其全文引為參考)。此外，纖維蛋白凝膠已經被顯示出誘導細胞的生長(例如人類間充質干細胞(HMSC))和增殖，以及在某種程度上誘導骨形成的分化，這依賴于基質中FC和凝血酶的濃度(Catelas等，Tissue Eng 12(8): 2385-2396,2006)。纖維蛋白密封材料將生長因子遞送到身體中特定位點的能力是有益的，但是組織的適合的重新生長通常需要連續(xù)/穩(wěn)定地提供生長因子或細胞因子，以特定的速度遞送到位點處，以便確保適合的治療。如果治療性蛋白在體內的半衰期短的話，尤其會這樣。目前使用的纖維蛋白密封材料對于包含的(seeded)藥物或藥劑來說提供了一定的延遲釋放，但是能夠延長藥劑在密封材料中的壽命，將改進體內的長期組織修復。因此，在本技術領域中，對于開發(fā)體內遞送生長因子以治療各種病癥和疾病的有效方法、開發(fā)用于生長因子從纖維蛋白凝膠受控釋放的改進的方法，仍然存在著需求。
發(fā)明簡述本發(fā)明提供了含有轉化生長因子13 (TGF-P)的纖維蛋白密封材料的組合物，用于生長因子在體外和體內的受控釋放。本發(fā)明還提供了通過調節(jié)用于配制密封材料的纖維蛋白原復合物組分的含量，來調節(jié)TGF-P蛋白從纖維蛋白密封材料中的釋放的方法。為了治療病癥或疾病，考慮到了 TGF-P —旦從纖維蛋白密封材料中釋放出來后，保持其生物學活性，以便TGF-P可以在體外或體內介導其預期的生物學活性。 —方面，本發(fā)明提供了用于調節(jié)轉化生長因子13 (TGF-P)蛋白從纖維蛋白密封材料中的釋放的方法，所述蛋白選自TGF-P 1、TGF-|3 2和TGF-P 3，其中纖維蛋白密封材料通過將纖維蛋白原復合物組分、凝血酶組分和TGF-P組分相混合來生產，該方法包括a) 確定從具有已知的TGF-P起始量和已知的纖維蛋白原復合物終濃度的第一種纖維蛋白密封材料釋放的TGF-P的量，以及b)調節(jié)在步驟(a)中的第一種纖維蛋白密封材料中使用的已知的纖維蛋白原復合物的終濃度以產生第二種纖維蛋白密封材料，其中在第二種密封材料中與第一種密封材料中已知的纖維蛋白原復合物終濃度相比纖維蛋白原復合物濃度的增加，與TGF-P從步驟(a)的第一種密封材料中的釋放相比，降低了TGF-I3從第二種密
封材料中釋放的速度，其中第二種密封材料具有與步驟(a)中的第一種密封材料相同的起始TGF-P量。在相關情況下，本發(fā)明提供了用于調節(jié)TGF-I3蛋白從纖維蛋白密封材料中的釋放的方法，所述蛋白選自TGF-P 1、 TGF-P2和TGF-P 3，其中纖維蛋白密封材料通過將纖維蛋白原復合物組分、凝血酶組分和TGF-I3組分相混合來生產，該方法包括a)確定從具有已知的TGF-P起始量和已知的纖維蛋白原復合物終濃度的第一種纖維蛋白密封材料釋放的TGF-P的量，以及b)調節(jié)在步驟(a)中的第一種纖維蛋白密封材料中使用的已知的纖維蛋白原復合物的終濃度以產生第二種纖維蛋白密封材料，其中在第二種密封材料中與第一種密封材料中已知的纖維蛋白原復合物終濃度相比纖維蛋白原復合物濃度的降低，與 TGF-P從步驟(a)的第一種密封材料中的釋放相比，增加了TGF-I3從第二種密封材料中釋放的速度，其中第二種密封材料具有與步驟(a)中的第一種密封材料相同的起始TGF-e 在一個實施方案中，在第一種或第二種密封材料中纖維蛋白原復合物的終濃度在大約lmg/ml到大約150mg/ml的范圍內。在相關的實施方案中，第一種或第二種密封材料中纖維蛋白原復合物的終濃度在大約5mg/ml到大約75mg/ml的范圍內。
在另一個實施方案中，考慮到了在第一種纖維蛋白密封材料中纖維蛋白原復合物的終濃度與第二種密封材料中纖維蛋白原復合物的終濃度的差別為大約lmg/ml到大約149mg/ml。在另一個實施方案中，第一種纖維蛋白密封材料中纖維蛋白原復合物的終濃度與第二種密封材料中纖維蛋白原復合物的終濃度的差別為大約5mg/ml到大約75mg/ml。在另一個實施方案中，第一種纖維蛋白密封材料中纖維蛋白原復合物的終濃度與第二種密封材料中纖維蛋白原復合物的終濃度的差別為大約10mg/ml到大約60mg/ml。
在某些實施方案中，考慮到了第一種或第二種密封材料中凝血酶組分的終濃度在大約1IU/ml到250IU/ml的范圍內。在另一個實施方案中，在第一種或第二種密封材料中TGF-P的終濃度在大約lng/ml到大約lmg/ml的范圍內。另一方面，本發(fā)明考慮到了用于在需要TGF-P蛋白的患者中受控釋放TGF-P蛋白的方法，所述蛋白選自TGF-13 1、 TGF-13 2和TGF- P 3，包括給該患者施用含有TGF- P的纖維蛋白密封材料，其中至少25%的TGF-P在纖維蛋白密封材料中保留至少3天。
在相關的情況下，本發(fā)明提供了用于在需要TGF-I3蛋白的患者中受控釋放TGF-P蛋白的方法，所述蛋白選自TGF-P 1、 TGF-P2和TGF-I3 3，包括給該患者施用含有TGF-P的纖維蛋白密封材料，其中至少20X的TGF-I3在纖維蛋白密封材料中保留至少10天。考慮到了從纖維蛋白密封材料釋放的TGF-I3是有生物學活性的。
在某些實施方案中，至少35X到90X的TGF-I3保留至少3天。在相關的實施方案中，至少45X到75X的TGF-I3在纖維蛋白密封材料中保留至少3天。在另一個實施方案中，至少60%的TGF-13在纖維蛋白密封材料中保留至少3天。在另一個實施方案中，至少25%到75X的TGF-I3在纖維蛋白密封材料中保留至少10天。在相關的實施方案中，至少45X到55X的所述TGF-I3在纖維蛋白密封材料中保留至少10天。在相關的實施方案中，考慮到了纖維蛋白密封材料可以具有高于3天或10天中任何一個或兩者的范圍的釋放動力學。在一個實施方案中，纖維蛋白密封材料通過將纖維蛋白原復合物(FC)組分和凝血酶組分在混合物中合并來生產。在另一個實施方案中，TGF-P在將FC組分與凝血酶組分混合之前加入到FC組分中。在另一個實施方案中，TGF-P被加入到凝血酶組分中。在另一個實施方案中，TGF-13被加入到FC和凝血酶的混合物中，然后允許組分形成纖維蛋白凝膠。在相關的實施方案中，考慮到了TGF-I3的釋放可以每天降低一定的量。例如，纖維蛋白密封材料中TGF-13的量可以每天減少大約1 % 、每天大約2 % 、每天大約3 % 、每天大約4 % 、每天大約5 % 、每天大約6 % 、每天大約7 % 、每天大約8 % 、每天大約9 %或每天大約10%，或者可以根據用于配制纖維蛋白密封材料的纖維蛋白原復合物的濃度或凝血酶的濃度來調整所需的釋放量。本發(fā)明考慮到了密封材料中纖維蛋白原復合物組分的終濃度在大約lmg/m到大約150mg/ml的范圍內。在某些實施方案中，還考慮到了密封材料中凝血酶組分的終濃度在大約1IU/ml到250IU/ml的范圍內。在一個實施方案中，纖維蛋白原復合物的終濃度是大約5mg/ml、大約10mg/ml、大約20mg/ml或大約40mg/ml，凝血酶的終濃度是大約2IU/ml。
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在一個實施方案中，密封材料中TGF- 13的終濃度為大約lng/ml到大約lmg/ml。
在另一個實施方案中，考慮到了TGF-I3是TGF-P 1。在一個實施方案中，當TGF-I3 是TGF-P 1時，至少60%的該TGF-13 1在該纖維蛋白密封材料中保留至少3天，其中至少 25%的該TGF-13 1在該纖維蛋白密封材料中保留至少10天。在相關的實施方案中，考慮到了TGF-I3是TGF-P2。在一個實施方案中，當TGF-I3 是TGF-13 2時，至少25%的該TGF-13 2在該纖維蛋白密封材料中保留至少3天。
在另一個實施方案中，考慮到了TGF-I3是TGF-P3。在一個實施方案中，當TGF-I3 是TGF-P 3時，至少55%的該TGF-13 3在該纖維蛋白密封材料中保留至少3天，其中至少 25%的該TGF-13 3在該纖維蛋白密封材料中保留至少10天。另一方面，本發(fā)明考慮到了用于治療患有將得益于轉化生長因子13 (TGF-e)蛋白的原位受控釋放的紊亂或疾病的患者的方法，該蛋白選自TGF-P 1、TGF-|3 2和TGF_|3 3，該方法包括給該患者施用含有TGF-I3蛋白的纖維蛋白密封材料，其中纖維蛋白密封材料提供了TGF-P的受控釋放，其中至少25X的TGF-I3在纖維蛋白密封材料中保留至少3天，并且該TGF-P以有效治療該紊亂或疾病的速度釋放。另一方面，本發(fā)明考慮到了用于治療患有將得益于生物活性轉化生長因子 13 (TGF-P)蛋白的原位受控釋放的紊亂或疾病的患者的方法，該蛋白選自TGF-Pl、 TGF-13 2和TGF- P 3，該方法包括給該患者施用含有TGF- P蛋白的纖維蛋白密封材料，其中纖維蛋白密封材料提供了TGF-I3的受控釋放，其中至少20X的TGF-I3在纖維蛋白密封材料中保留至少10天，并且該TGF-I3以能夠有效治療該紊亂或疾病的速度釋放。
本發(fā)明還提供了含有選自TGF-13 1、 TGF- P 2和TGF- P 3的TGF- P蛋白的纖維蛋白密封材料在制造藥物中的應用，該藥物用于治療患有將得益于轉化生長因子13 (TGF-P) 蛋白的原位受控釋放的紊亂或疾病的患者，其中纖維蛋白密封材料提供了如上所述的 TGF-13的受控釋放。本發(fā)明考慮到了上面描述的釋放動力學適用于治療得益于TGF-I3蛋白的原位受
控釋放的患者的方法，或適用于將纖維蛋白密封材料用于治療該患者的藥物的制造。 —種情況下，患者患有對于本技術領域的普通技術人員來說顯然將得益于TGF-e
在體內的受控釋放的疾病。在一個實施方案中，疾病或紊亂選自肌肉骨骼疾病或紊亂、軟組
織疾病或紊亂和心血管疾病。在一個實施方案中，肌肉骨骼紊亂是骨骼疾病或骨骼紊亂。在
相關的實施方案中，肌肉骨骼紊亂是軟骨疾病或軟骨紊亂。在一個實施方案中，使用本技術領域熟知的方法將纖維蛋白密封材料施用于患者，例如注射、噴霧、內視鏡用藥或預制凝膠，可以自身單獨施用或與其它物質組合施用，也可以使用本技術領域的普通技術人員已知的其它方法。本發(fā)明還提供了用于制備含有生物活性轉化生長因子13 (TGF-P )蛋白的纖維蛋白密封材料的試劑盒，所述蛋白選自TGF-13 1、TGF-P 2和TGF-P 3，所述纖維蛋白密封材料具有所需的TGF-P釋放速度，試劑盒含有a)含有纖維蛋白原復合物組分的第一個小瓶或第一個儲存容器，其中小瓶任選含有TGF-I3組分，以及b)具有凝血酶組分的第二個小瓶或第二個儲存容器，當該第一個小瓶或第一個儲存容器不包含TGF-I3組分時，該試劑盒任選含有具有TGF-P組分的第三個小瓶或第三個容器，該試劑盒還含有使用它的說明書。試劑盒也可以含有纖維蛋白密封材料在體外或體內使用或用藥的說明書。
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從下面的詳細描述中，本發(fā)明的其它特點和優(yōu)點將變得明顯。但是，應該理解，給出的詳細描述和特定的實施例，盡管指明了本發(fā)明的特定實施方案，但僅僅是說明性的，因為對于本技術領域的專業(yè)人員來說，根據本詳細描述，在本發(fā)明的精神和范圍內的各種不同的變化和修改將是顯而易見的。

圖1顯示了 TGF-P 1的量對它從TISSEEL VHTM([FC] = 25mg/ml，[凝血酶]=2IU/ ml)制成的纖維蛋白凝膠中每日釋放的影響。圖2顯示了 TGF-P 1的量對它從TISSEEL VHTM([FC] = 25mg/ml，[凝血酶]=2IU/ ml)制成的纖維蛋白凝膠中累積釋放的影響。圖3顯示了 FC濃度對TGF-P 1從TISSEEL VH ([凝血酶]=2IU/ml)制成的纖維蛋白凝膠中每日釋放的影響。圖4顯示了 FC濃度對TGF-P 1從TISSEEL VH ([凝血酶]=2IU/ml)制成的纖維蛋白凝膠中累積釋放的影響。圖5顯示了 FC濃度對TGF-P 1從TISSEEL VH S/D ([凝血酶]=2IU/ml)制成的纖維蛋白凝膠中每日釋放的影響。圖6顯示了 FC濃度對TGF-P 1從TISSEEL VH S/D ([凝血酶]=2IU/ml)制成的纖維蛋白凝膠中累積釋放的影響。圖7顯示了凝血酶濃度對TGF-P 1從TISSEEL VHTM([FC] = 25mg/ml)制成的纖維蛋白凝膠中每日釋放的影響。圖8顯示了凝血酶濃度對TGF-P 1從TISSEEL VHTM([FC] = 25mg/ml)制成的纖維蛋白凝膠中累積釋放的影響。圖9顯示了 TISSEEL VtfM批次號對TGF-P 1從纖維蛋白凝膠([FC] = 20mg/ml， [凝血酶]=2IU/ml)中累積釋放的影響。圖10顯示了 TISSEEL VH S/t)TM批次號對TGF-P 1從纖維蛋白凝膠([FC] = 20mg/ ml，[凝血酶]=2IU/ml)中累積釋放的影響。圖ll(釋放的TGF-Pl的生物學活性)顯示了在用來自第3天時添加或不添加 TGF-P 1的TISSEEL VH 纖維蛋白凝膠的培養(yǎng)基上清液、或用新鮮制備的添加有2ng(lng/ ml)TGF-P 1的培養(yǎng)基(陽性對照)培養(yǎng)的單層人類間充質干細胞(HMSC)的增殖。結果按照第1天的值歸一化。圖12 (釋放的TGF- P 1的生物學活性)顯示了在來自添加有TGF_ P 1的TISSEEL VHTM纖維蛋白凝膠的培養(yǎng)基上清液中(即含有釋放的TGF-13 1的培養(yǎng)基中)培養(yǎng)的HMSC中堿性磷酸酶(ALP)的活性，與來自沒有添加TGF-I3 1的纖維蛋白凝膠的培養(yǎng)基上清液中培養(yǎng)的HMSC中ALP的活性、以及在含有新鮮添加的TGF-P 1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的HMSC中ALP 的活性(陽性對照)的比較。結果(首先被計算成IU/ml)按照增殖進行歸一化。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了治療性應用中含有TGF-I3的用于原位受控釋放的纖維蛋白凝膠，所述治療性應用包括治療肌肉骨骼疾病例如骨骼和軟骨紊亂，軟組織紊亂和心血管疾病。本發(fā)明考慮到了從凝膠中釋放的TGF-I3保留其生物學活性，以便在體內或體外從纖維蛋白密封材料中的釋放調節(jié)了所需的生物學活性。本發(fā)明還提供了確定可用于配制纖維蛋白密封材料的FC組分或凝血酶組分的濃度的方法，以獲得所需的TGF-13釋放動力學。
除非被特別定義，本文使用的所有技術和科學術語具有與本發(fā)明所屬技術領域中普通專業(yè)人員通常理解的相同的意義。下面的參考文獻為本領域技術人員提供了許多在本發(fā)明中使用的術語的通用定義Singleton等，《微生物學和分子生物學詞典》(第二版)， (DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULARBIOLOGY) (2d ed. 1994);《劍橋科學技術詞典》，(THECAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY) (Walker主編，1988);《遺傳學詞匯》(第五版)，(THE GLOSSARYOF GENETICS) ， 5TH ED. ， R. Rieger等主編，Springer Verlag(1991);以及Hale和Marham，《HARPER COLLINS生物學詞典》，(THEHARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY)(1991)。本文中引用的每個出版物、專利申請、專利和其它參考文獻在與本公開的內容一致的程度上以其全文引為參考。應該注意，在本說明書和隨附的權利要求中使用的單數形式的表達方式包括了復數的指稱，除非上下文明確表明不是這樣。當用于本文時，除非特別指明，下面的術語具有歸屬于它們的意義
本文中使用的術語"纖維蛋白密封材料"、"纖維蛋白凝膠"、"纖維蛋白粘附劑"、 "纖維蛋白凝塊"或"纖維蛋白基質"可以互換使用，是指至少含有纖維蛋白原復合物(FC) 組分和凝血酶組分的三維網絡，可以起到細胞生長的支架的作用，并隨時間釋放生物活性物質。本文中使用的術語"受控釋放"和"延遲釋放"具有同樣的意義，是指藥劑(例如生長因子)持留在纖維蛋白凝膠中。受控釋放不僅是由于生長因子通過擴散或結合的生長因子通過解離然后從凝膠中擴散而緩慢并穩(wěn)定地分泌/釋放，而且還由于基質的分解和酶促裂解。本文中使用的"在原位形成"是指在生理溫度下在身體中注射的位點形成，或纖維蛋白密封材料在適合的體外條件下形成。該術語一般被用于描述纖維蛋白密封材料中前體分子之間共價鍵的形成，它們在給藥前或給藥時基本上是不交聯的。本文中使用的"纖維蛋白原復合物組分"是指纖維蛋白/纖維蛋白原溶液，它們與凝血酶混合導致形成凝塊狀纖維蛋白密封材料。纖維蛋白原復合物(FC)主要由纖維蛋白原和纖連蛋白組成，也可以含有催化量的FXIII和血纖維溶酶原。纖維蛋白原復合物組分也可以被稱為密封蛋白(Sealer Protein)。本文使用的"凝血酶組分"是指凝血酶溶液，它們與纖維蛋白原復合物組分混合，導致形成凝塊狀纖維蛋白密封材料。本文使用的"轉化生長因子13組分"或"TGF-P組分"是指將生長因子溶液加入到液體形式的纖維蛋白密封材料中。TGF-P組分、FC復合物組分和凝血酶組分中的每個可以被分別加入以形成含有TGF-I3的纖維蛋白密封材料。或者，TGF-P組分可以在與凝血酶組分混合之前加入到液體FC復合物組分中。本文使用的"重組人類TGF-13 "是指通過重組DNA技術獲得的重組人類轉化生長
因子-P (rh TGF-P)。它可以通過本技術領域任何已知的方法來生產。本文使用的術語"生物活性"或"生物學活性"是指生物學性質，其中溶液或纖維
11蛋白密封材料中的蛋白例如TGF-P蛋白，當與天然表達(即當重組或體內表達時)的蛋白相比時，表現出同樣的或相似的生物學活性。本文使用的"可檢測基團"、"可檢測標記物"或"標記物"是指可以通過光譜學、光
化學、生物化學、免疫化學或化學手段檢測的成分。例如，有用的標記物包括"P、^S、熒光染
料、電子密度高的試劑、酶(例如在ELISA中常用的)、生物素-鏈親和素、地高辛、其抗血清
或單克隆抗體可以獲得的半抗原和蛋白、或具有與靶互補的序列的核酸分子?？蓹z測基團
通常產生可測量的信號，例如放射性、生色或熒光信號，可用于對樣品中結合的可檢測基團
的量進行定量。纖維蛋白密封材料可以獲得許多形式的纖維蛋白用作纖維蛋白密封材料。纖維蛋白凝膠可以從自體血漿、冷凍沉淀的血漿(例如可商購的纖維蛋白膠試劑盒)、從血漿純化的纖維蛋白原以及重組的纖維蛋白原和因子XIIIa合成。這些材料中的每種都提供了基本上相似的基質，在生物化學組成上略有不同。Sierra DH， J Biomater A卯l， 7， 309-352 (1993)。這些材料之間在具體的酶的生物活性和總的愈合反應方面都存在相似性。可用于本發(fā)明的纖維蛋白凝膠從纖維蛋白密封材料形成，密封材料含有兩種主要組分纖維蛋白原復合物(FC)和凝血酶。FC主要由纖維蛋白原和纖連蛋白組成，也可以含有催化量的FXIII和血纖維溶酶原。FC和凝血酶組分一般來自于人類血漿，但是也可以通過重組/遺傳工程技術生產。纖維蛋白密封材料的例子描述在US 5， 716， 645、 US5， 962， 405、 US 6,579,537中，包括TISSEEL VH 和TISSEEL VH S/DTM(Baxter Healthcare, Deerfield， IU 。為了形成纖維蛋白凝膠，首先將FC復溶、融解或按照包裝說明制備，按照需要使用稀釋緩沖液進一步稀釋，并將治療性藥劑加入到液體FC中。大多數可商購的纖維蛋白密封材料含有凝膠裂解抑制劑例如抑蛋白酶肽，它可以由用戶斟酌加入到FC中。對抑蛋白酶肽和其它凝膠裂解抑制劑的描述提供在WO 99/11301中。凝血酶組分也使用CaCl2溶液復溶成為液體形式，按照需要使用稀釋緩沖液進一步稀釋?？紤]到了將凝血酶組分與含有 TGF-13的FC組分混合以形成纖維蛋白凝膠。還已經設計了缺少抑蛋白酶肽成分的纖維蛋白密封材料(EVICEL , Ethicon， Inc， New Jersey)。其它用于生產含有纖維蛋白原的、可用作組織粘附劑的制備物的方法包括從冷凍沉淀物生產，可選地用乙醇、硫酸銨、聚乙二醇、甘氨酸或e-丙氨酸進一步清洗和沉淀，以及在已知的血漿分級方法的范圍內分別從血漿生產(參見例如《血漿蛋白分級方法》，〃 Methods ofplasma protein fractionation 〃，1980， ed. :Curling， Academic Press, pp. 3-15， 33-36和57-74，或Blomb ck B.和M.，《人類和牛纖維蛋白原的純化》，〃 Purification of human and bovine fibrinogen 〃， Arkiv Kemi 10,1959， p.415f.)。纖維蛋白密封材料也可以使用患者自己的血漿制造。例如，CRYOSEAL⑧ (The擺genesis Corp. ， Rancho Cordova, CA)或 VIVOSTAT (Vivolution A/S， Denmark)纖維蛋白密封材料系統(tǒng)能夠從患者的血槳生產自體的纖維蛋白密封材料組分?？?以獲得冷凍干燥、深凍液體或液體形式的纖維蛋白密封材料組分。以適合的濃度加入纖維蛋白凝膠組分以提供所需的受控釋放類型?？梢砸圆煌?的農度加入FC組分，包括f旦不限于5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml、50mg/ml，最多為150mg/ml (在凝膠中的終濃度)，或者在所需的中間濃度。此外，FC組分的濃度可以與任何適合的凝血酶組分濃度相組合，包括但不限于 lIU/ml、2IU/ml、5IU/ml、7IU/ml、10IU/ml、15IU/ml、20IU/ml、25IU/ml、30IU/ml、35IU/ml、 40IU/ml、 50IU/ml、60IU/ml、 70IU/ml、80IU/ml、90IU/ml、lOOIU/ml、120IU/ml、140IU/ml、 150IU/ml、175IU/ml、200IU/ml、225IU/ml和250IU/ml。考慮到了將第二種藥劑例如TGF-P加入到纖維蛋白密封材料組合物中，以制成用于治療性藥劑的受控釋放系統(tǒng)。TGF-P可以以任何提供足夠的延遲釋放制劑的濃度加入，該濃度在lng/ml到lmg/mLTGF-P的范圍內。纖維蛋白密封材料中TGF-P的示例的濃度包括但不限于lng/ml 、 5ng/ml 、 10ng/ml 、 15ng/ml 、 20ng/ml 、40ng/ml 、 50ngml 、 lOOng/ ml、250ng/ml、500ng/ml、1u g/ml、5 u g/ml、10 u g/ml、25 u g/ml、50 u g/ml、100 u g/ml、 250 u g/ml 、 500 u g/ml 、 750 u g/ml禾口 lmg/ml 。考慮到了在纖維蛋白密封材料中使用的FC或凝血酶的濃度可以使加入到纖維蛋白凝膠中的TGF-P在幾天到幾周的時間內以治療有效的量釋放。在一種情況下，TGF-I3從纖維蛋白凝膠中釋放1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13 天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天或更長的時間。 TGF-P從纖維蛋白密封材料中以受控或延遲釋放的方式釋放，使得TGF-P可以在一段持續(xù)的時間間期中在原位獲得?？紤]到了TGF-P的釋放可能以每天一定的量減少，例如，TGF-P的水平可能每天降低大約1%、每天大約2%、每天大約3%、每天大約4%、每天大約5 % 、每天大約6 % 、每天大約7 % 、每天大約8 % 、每天大約9 %或每天大約10 %或以上。在相關的實施方案中，考慮到了至少25X的TGF-I3在纖維蛋白凝膠中保留至少3天。在另一個實施方案中，至少35 %到90 % 、至少45 %到75 % 、或至少60 %的TGF- P在纖維蛋白凝膠中保留至少3天。還考慮到了至少25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、 33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41 %、42%、43%、44%、45%、46%、47%、 48%、49%、50%、51 %、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61 %、62%、 63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71 %、72%、73%、74%、75%、76%、77%、 78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%或90%的TGF-P在纖維蛋白凝膠中保留至少3天。在另一個實施方案中，至少20%的TGF-P在纖維蛋白凝膠中保留至少10天。在另一個實施方案中，至少25X到75X或45X到55X的TGF-I3保留至少10天。進一步考慮到了至少20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、 33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41 %、42%、43%、44%、45%、46%、47%、 48%、49%、50%、51 %、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61 %、62%、 63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%或75 %的TGF-P在纖維蛋白凝膠中保留至少10天。本發(fā)明提供了通過調節(jié)纖維蛋白密封材料組分的濃度來配制具有所需釋放動力學的纖維蛋白密封材料的方法。在一種情況下，方法考慮到了確定從具有已知的TGF-I3起始量和已知的纖維蛋白原復合物終濃度的第一種纖維蛋白密封材料釋放的TGF-P的量，調節(jié)在步驟(a)中的第一種纖維蛋白密封材料中使用的已知的纖維蛋白原復合物的終濃度以產生第二種纖維蛋白密封材料，其中在第二種密封材料中與第一種密封材料中已知的纖維蛋白原復合物終濃度相比纖維蛋白原復合物濃度的增加或降低，與TGF-13從步驟的第一種密封材料中的釋放相比，調節(jié)了 TGF-P從第二種密封材料中釋放的速度，其中第二種密封材料具有與步驟中的第一種密封材料相同的起始TGF-P量。在一個實施方案中，第一或第二種密封材料中纖維蛋白原復合物的終濃度在大約lmg/ml到大約150mg/ml的范圍內。在權利要求1或2的方法中，第一或第二種密封材料中纖維蛋白原復合物的終濃度如上述所設定。在相關的實施方案中，第一種纖維蛋白密封材料的FC濃度與第二種纖維蛋白密封材料的FC的終濃度的差別為大約lmg/ml到大約 149mg/ml、大約5mg/ml到大約75mg/ml、或大約10mg/ml到大約60mg/ml。在另一個實施方案中，第一種纖維蛋白密封材料的FC濃度與第二種纖維蛋白密封材料中FC的終濃度的差別為大約2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、 35mg/ml 、40mg/ml 、45mg/ml 、50mg/ml或這些濃度之間的任何值，最多為大約149mg/ml 。
考慮到了本發(fā)明中使用的纖維蛋白密封材料可以與其它目的是體外或體內使用的材料或試劑組合。這樣的試劑包括其它的治療性藥劑，包括但不限于生長因子、細胞因子、趨化因子、血凝因子、酶、趨化因子、可溶性細胞表面受體、細胞粘附分子、抗體、激素、細胞骨架蛋白、基質蛋白、伴侶蛋白、結構蛋白、代謝蛋白以及本技術領域已知的其它因子。參見例如Physicians Desk Reference, 62ndEdition， 2008， Thomson Healthcare, Montvale， NJ。其它可用于纖維蛋白密封材料的物質包括可以與用于骨骼或軟骨疾病的、可以是承載材料的密封材料混合的物質，包括但不限于聚合物、珊瑚、陶瓷、玻璃、金屬、源自骨骼的材料、羥基磷灰石、合成的支架材料、這些材料的組合，以及其它本技術領域已知的材料。參見例如Guehennec等(European Cells and Materials, 8 :1-11， 2004)、美國專利 7， 122， 057和美國專利6， 696， 073。在一個實施方案中，纖維蛋白凝膠可以用作載體系統(tǒng)，在反向結合后并通過調整 FC和凝血酶的濃度以受控的方式遞送生物活性的TGF-P 。在本發(fā)明的一個實施方案中，當纖維蛋白凝膠使用25mg/ml的FC和2IU/ml的凝血酶(在凝膠中的終濃度)由蒸汽加熱的TISSEEL(TISSEEL VHTM)制成時，3天后至少有大約80X加入的TGF-I3保留在凝膠中，10天后有至少大約48X加入的TGF-I3保留在凝膠中。TGF-13的釋放量與凝膠中加入的生長因子的量成正比。在本發(fā)明的另一個實施方案中，當纖維蛋白凝膠使用5mg/ml的FC和2IU/ml的凝血酶(在凝膠中的終濃度)由TISSEEL VHTM制成時，3天后至少有大約60^加入的TGF-e 保留在凝膠中，10天后有至少大約25X加入的TGF-I3保留在凝膠中。在本發(fā)明的另一個實施方案中，當纖維蛋白凝膠使用5mg/ml的FC和2IU/ml的凝血酶(在凝膠中的終濃度) 由蒸汽加熱的溶劑/去污劑TISSEEL(TISSEEL VH S/D )制成時，3天后至少有大約35%加入的TGF-ei保留在凝膠中，10天后有少于7^保留在凝膠中(即幾乎完全釋放)。因此，當使用TISSEEL VtfM或TISSEELVH S/D 制成的纖維蛋白凝膠時，持留隨著FC濃度的升高而增加。在本發(fā)明的另一個實施方案中，從使用2、 10和50IU/ml凝血酶(使用25mg/ml的 FC，為凝膠中的終濃度)的TISSEEL VHTM制成的纖維蛋白凝膠釋放的TGF-I3 1是相同的，表明凝血酶的濃度比FC的濃度對TGF-P 1釋放的影響小。只有在使用最高的凝血酶濃度時(250IU/ml，為凝膠中的終濃度)，TGF-13 1的釋放才顯著升高，表明了具有更不均質結構的凝膠結構的影響。在本發(fā)明的另一個實施方案中，當纖維蛋白凝膠使用20mg/ml的FC和2IU/ml的凝血酶(在凝膠中的終濃度)由不同批次號的TISSEELVHTM制成時，10天后有至少67X的 TGF-13 1保留在來自一個批次的凝膠中，另一個批次為39% ，第三個批次沒有。這些批次之間的一個差異是因子XIII的含量(分別為42. 2U/ml、33. 9U/ml和< lU/ml)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，當纖維蛋白凝膠使用20mg/ml的FC和2IU/ml的凝血酶(在凝膠中的終濃度)由不同批次號的TISSEEL VHS/D 制成時，10天后有至少20%的TGF-P 1保留在來自一個批次的凝膠中，其它兩個批次沒有。這些批次的因子XIII含量都低于3U/ml。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，當TGF-P 2被加入到使用5mg/ml的FC和2IU/ml 的凝血酶(在凝膠中的終濃度)由TISSEEL VHTM制成的纖維蛋白凝膠中時，3天后有至少大約25%加入的TGF-13 2保留在凝膠中。保留隨著FC的濃度而增加。當TGF-P 3被加入到使用5mg/ml的FC和2IU/ml的凝血酶(在凝膠中的終濃度)由TISSEEL VH 制成的纖維蛋白凝膠中時，3天后有至少55%加入的TGF-13 3保留在凝膠中，10天后有25%保留。
本技術領域的普通專業(yè)人員將會理解，上面提出的實施方案是TGF-I3從商購的
纖維蛋白密封材料中釋放的示例性實施方案，不意味著以任何方式限制本發(fā)明。
TGF-P蛋白 TGF-P至少以5種同工型存在，被稱為TGF-P 1、 TGF-P 2、 TGF-P 3、 TGF-P 4、 TGF-P5。它們的氨基酸序列顯示出70-80 %量級的同源性。TGF-P 1是最常見的形式，被發(fā)現幾乎是普遍存在，而其它的同工型在相對更受限的細胞和組織范圍內表達。 TGF- P 1 、 TGF- P 2和TGF- P3在骨骼形態(tài)發(fā)生中表現出具有不同的功能(Fagenholz 等，J CraniofacialSurg. 12 :183-190,2001) 。 TGF-P 1的三維結構描述在Hinck等， Biochemistry 35 :8517-8534， 1996中。TGF-P 2的三維結構描述在Daopin等，Science 257 :369-373， 1992中。TGF-P 3的三維結構描述在Mittl等，Protein Sci 5:1261-1271， 1996中。在本發(fā)明的另一個實施方案中，測試了從纖維蛋白凝膠釋放的TGF-P 1的生物學活性。人類間充質干細胞(HMSC)當在來自添加了 TGF-P 1的凝膠的培養(yǎng)基上清液中(即含有釋放的TGF-P 1的培養(yǎng)基中)培養(yǎng)到單層后，其形態(tài)變化成更加方形到多邊形，表明了細胞的分化，并伴隨有表現出與在來自未添加TGF-P 1的凝膠的培養(yǎng)基上清液中培養(yǎng)的細胞相比更低的增殖的傾向。在來自添加了 TGF-P 1的凝膠的培養(yǎng)基上清液中(即含有釋放的TGF-P 1的培養(yǎng)基中)培養(yǎng)的細胞的阿爾辛藍(Alcian blue)陽性染色，表明HMSC開始經歷軟骨形成。早期和晚期骨形成分化的標記物、即分別為堿性磷酸酶(ALP)活性和茜素紅(Alizarin Red)染色，仍然為陰性。這些在細胞形態(tài)學、增殖和軟骨形成分化中的變化，證實了 TGF-P 1在從凝膠中釋放后仍然是有生物活性的。用于本發(fā)明的TGF-P分子包括全長蛋白、蛋白的前體、蛋白的亞基或片段及其功能衍生物。指稱TGF-P意味著包括了所有這些蛋白形式，包括自然衍生的蛋白制備物。
按照本發(fā)明，術語重組TGF-P沒有特定的限制，可以包括任何通過重組DNA技術獲得的異源的或天然存在的TGF-P ，或其生物活性衍生物。在某些實施方案中，該術語包含了蛋白和核酸，例如基因、mRNA前體、mRNA、和多肽、多態(tài)性變異體、等位基因、突變體以及
15種間同源物，它們(1)具有的氨基酸序列與參比核酸編碼的TGF-13 1、 TGF-P 2或TGF_|3 3 多肽或本文描述的氨基酸序列，在至少大約25、50、100、200、300、400個或以上的氨基酸的區(qū)域中，具有大于大約60%的氨基酸序列同一性，65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或以上的氨基酸序列同一性；(2)與針對含有本文描述的參比氨基酸序列的免疫原、其免疫活性片段和其保守修飾的變異體產生的抗體、例如多克隆抗體特異性結合；(3)在嚴緊的雜交條件下，與編碼本文描述的參比氨基酸序列及其保守修飾的變異體的核酸特異性雜交；(4)具有的核酸序列與本文描述的參比核酸序列，在至少大約25、50、100、150、200、250、500、1000個或以上的核苷酸(最多為成熟蛋白的1218個核苷酸的全長序列)的區(qū)域中，具有大于大約95%、大于大約96%、97%、 98%、99%或以上的核苷酸序列同一性。典型情況下，多核苷酸或多肽序列來自哺乳動物，包括但不限于靈長動物例如人類，嚙齒動物例如大鼠、小鼠、倉鼠，奶牛、豬、馬、綿羊或任何其它哺乳動物。本發(fā)明的核酸和蛋白可以是重組分子(例如異源的并編碼野生型序列或其變異體，或非天然發(fā)生的)。對于人類TGF-P的結構，參考國立生物技術信息中心(NCBI)維持的Genbank數據庫人類 TGF P -1， Genbank登記號No. NP 000651 ;人類TGF-P 2， Genbank登記號No. NP 003229 ; TGF-P 3， Genbank登記號No. NP003230。 TGF-13的生產可以包括本技術領域中任何已知的方法，這些方法用于(i)通過遺傳工程生產重組DNA，例如通過RNA的反轉錄和/或DNA的擴增，(ii)通過轉染將重組DNA 導入原核或真核細胞，例如通過電轉化或微注射，(iii)培養(yǎng)所述轉化的細胞，例如以連續(xù) 或分批的方式，(iv)表達TGF-P ，例如組成性的或在誘導之后，以及(v)分離該TGF-P ，例如從培養(yǎng)基中或通過收獲轉化的細胞，以便獲得純化的TGF-P ，例如通過陰離子交換層析或親和層析。 TGF-P可以通過在產生藥理學可接受的TGF-P分子的適合的原核或真核宿主系統(tǒng)中進行表達來生產。常用的宿主細胞包括原核細胞例如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細菌，即大腸桿菌、芽孢桿菌、鏈霉菌、酵母菌、沙門氏菌等的任何菌株。真核細胞的例子是昆蟲細胞例如D. Mel-2、 Sf4、 Sf5、 Sf9和Sf21和High 5 ;植物細胞和各種酵母細胞例如酵母菌屬 (Saccharomyces)和畢赤酵母(Pichia);哺乳動物細胞例如CHO(中華倉鼠卵巢)細胞，幼倉鼠腎臟(BHK)細胞，人類腎臟293細胞，COS-7細胞，HEK293， SK-H印和H印G2，以及其它本技術領域已知的細胞。根據本發(fā)明，對用于生產或分離TGF-P的試劑或條件沒有限制，可以使用本技術領域已知的或可商購的任何系統(tǒng)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，TGF-I3通過在技術現狀中描述的方法獲得。有廣泛不同的載體可用于制備TGF-13 ，它們可以從本技術領域眾所周知的真核和原核表達載體中選擇。用于原核表達的載體的例子包括但不限于質粒例如pRSET、 pET、 pBAD等，其中在原核表達載體中使用的啟動子包括lac、 trc、 trp、 recA、 araBAD等。用于真核表達的載體的例子包括但不限于(i)用于在酵母中表達的載體例如pAO、pPIC、pYES、 pMET，使用啟動子例如A0X1、 GAP、 GAL1、 AUG1等；(ii)用于在昆蟲細胞中表達的載體例如 pMT、 pAc5、 pIB、 pMIB、 pBAC等，使用啟動子例如PH、 p10、 MT、 Ac5、 OpIE2、 gp64、 polh等，以及(iii)用于在哺乳動物細胞中表達的載體例如pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3、pBPV等，以及源自于病毒系統(tǒng)例如牛痘病毒、腺相關病毒、皰疹病毒、反轉錄病毒等的載體，使用啟動子例如CMV、 SV40、 EF-1、 UbC、 RSV、 ADV、 BPV禾P P -肌動蛋白。將含有編碼多肽的DNA或RNA的宿主細胞在適合于細胞的生長和DNA或RNA的表達的條件下培養(yǎng)?？梢允褂靡阎姆椒ㄨb定那些表達多肽的細胞，并使用已知的方法分離和純化重組蛋白，多肽的生產可以被擴大也可以不擴大。鑒定可以通過例如篩選表現出指示DNA或RNA編碼的蛋白的存在的表現型的遺傳修飾的哺乳動物細胞來進行，例如PCR篩選、通過Southern印跡分析篩選、或篩選蛋白的表達。整合了編碼蛋白的DNA的細胞的選擇，可以通過在DNA構建物中包含可選擇標記物、并在只適合于表達可選擇標記物基因的細胞存活的條件下培養(yǎng)含有可選擇標記物基因的轉染的或感染的細胞來進行。導入的DNA 構建物的進一步擴增可以通過將遺傳修飾的細胞在適合于擴增的條件下進行培養(yǎng)來實現 (例如將含有可擴增的標記物基因的遺傳修飾的細胞在存在一定藥物濃度的情況下培養(yǎng)，其中在該藥物濃度只有含有多個可擴增標記物基因的拷貝的細胞可以存活)。
在樣品中測定蛋白濃度的方法治療性蛋白通常在血清樣品中難以檢測，因為它們與內源產生的、天然存在的蛋白相似。但是，確定已經給藥的治療性多肽、其片段、變異體或類似物的量，以評估治療性蛋白是否表現出了所需的特性例如較大的溶解度或穩(wěn)定性、對酶消化的抗性、改進的生物學半衰期以及本技術領域的專業(yè)人員已知的其它特征，通常是有益的。該方法也允許檢測可能受到知識產權保護的治療性蛋白的授權使用。本發(fā)明提供了檢測TGF-P從含有TGF-P的纖維蛋白凝膠中的釋放以及確定蛋白的釋放動力學的方法。這些對使用不同濃度的纖維蛋白原復合物組分制造的纖維蛋白密封材料中的釋放動力學的比較，可以幫助測定用于治療性目的的所需的釋放速度。隨著時間鑒定從纖維蛋白密封材料釋放的蛋白的量的能力，可以幫助根據半衰期、吸附性、穩(wěn)定性等確定最適的治療。檢測分析方法可以是酶聯免疫吸附分析(ELISA)、放射性免疫分析 (RIA)、閃爍臨近測定法(SPA)、表面等離子體共振(SPR)或其它本技術領域已知的結合分析方法。 —般來說，為了檢測樣品中TGF-13的存在，將TGF- P與TGF- P結合試劑例如抗體、可溶性受體或其它結合TGF-P的蛋白或試劑相結合。對于檢測步驟來說，可以將TGF-I3蛋白連接到可檢測的基團或可檢測標記物上。可檢測基團或標記物是指可以通過光譜學、光化學、生物化學、免疫化學或化學手段檢測的成分?？蓹z測的基團通常產生可測量的信號，例如放射活性、生色或熒光信號，可用于對樣品中結合的可檢測基團的量進行定量。可檢測基團可以共價地、或通過離子鍵、范德華力或氫鍵摻入或連接到蛋白上，例如摻入放射活性核苷酸或可以被鏈親和素識別的生物素標記的核苷酸?？蓹z測基團可以是直接或間接可檢測的。間接檢測可以包括將第二種直接或間接可檢測的基團與可檢測基團相結合。例如，可檢測基團可以是結合配偶體的配體，例如生物素，它是鏈親和素的結合配偶體。結合配偶體本身可以可被直接檢測的，例如，抗體可以用熒光分子標記。對信號定量的方法的選擇通過例如閃爍計數、光密度測定法或流式細胞術來進行。適合用于本發(fā)明的分析方法的標記物的例子包括放射活性標記物、熒光團、電子密度高的試劑、酶(例如在ELISA中常用的)、生物素、地高辛，或可以被制造成可檢測的半抗原以及蛋白，例如通過將放射標記物摻入半抗原或肽，或用于檢測與半抗原或肽特異性
17反應的抗體。還考慮到了其抗血清或單克隆抗體可以獲得的蛋白，或具有與靶互補的序列的核酸分子、納米標簽、分子質量珠、磁性試劑、含有熒光染料的納米或微珠、量子點、量子珠、熒光蛋白、帶有熒光標記物的樹枝狀化合物、微型轉發(fā)器、電子供體分子或分子結構、或光反射顆粒。其它被考慮到用于本發(fā)明的標記物包括但不限于熒光染料(例如熒光素異硫氰酸酯、德克薩斯紅、羅丹明等)、放射性標記物(例如3H、125I、35S、14C或32P)、酶(例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶和其它在ELISA中常用的酶)、以及比色標記物例如膠體金、有色玻璃或塑料珠(例如聚苯乙烯、聚丙烯、膠乳等)，以及發(fā)光或化學發(fā)光標記物(例如銪(Eu)、 MSD Sulfo-標簽)。標記物可以按照本技術領域熟知的方法直接或間接與所需的分析組分結合。在特定的實施方案中，使用異氰酸酯或N-羥基琥珀酰亞胺酯試劑將標記物共價結合到組分上，以結合本發(fā)明的活性藥劑。在本發(fā)明的一種情況下，使用了雙功能的異氰酸酯試劑將標記物結合到生物聚合物上，形成了其上沒有結合活性藥劑的標記物生物聚合物結合物。標記物生物聚合物結合物可以用作中間體合成本發(fā)明的標記的結合物，或可用于檢測生物聚合物結合物。正如上面指出的，可以使用廣泛的各種不同的標記物，標記物的選擇依賴于所需的靈敏度、與所需分析組分結合的容易性、穩(wěn)定性要求、可用的儀器設備以及廢棄處理措施。非放射活性標記物通常通過間接的方式結合。一般來說，配體分子(例如生物素)被共價結合到分子上。然后將配體與另一個分子(例如鏈親和素)結合，該分子或者是本身可檢測的，或者與信號系統(tǒng)共價結合，例如可檢測的酶、熒光化合物或化學發(fā)光化合物。
用于本發(fā)明的方法的化合物也可以直接與產生信號的化合物結合，例如通過與酶或熒光團結合。適合用作標記物的酶包括但不限于水解酶、特別是磷酸酶、酯酶和糖苷酶，或氧化酶、特別是過氧化物酶。適合用作標記物的熒光化合物包括但不限于上面列出的那些以及熒光素衍生物、羅丹明及其衍生物、丹磺酰、7_羥基香豆素(umbel 1 iferone)、曙紅、 TRITC-胺、奎寧、熒光素W、吖啶黃、麗絲胺羅丹明、B磺酰氯、erythroscein、釕(三、二吡啶)、銪、德克薩斯紅、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、黃素腺嘌呤二核苷酸等。適合用作標記物的化學發(fā)光化合物包括但不限于MSD Sulfa-TAG、銪(Eu)、釤(Sm)、螢光素和2， 3-二氫酞嗪二酮例如魯米諾。對于可用于本發(fā)明的方法的各種不同的標記或信號產生系統(tǒng)的綜述，參見美國專利No. 4， 391， 904。用于檢測標記物的方法對于本技術領域的專業(yè)人員來說是熟知的，由被檢測的標記物的類型所決定。因此，例如，當標記物是具有放射性時，檢測的裝置包括閃爍計數器 (例如放射免疫分析、閃爍臨近測定法)(Pitas等，Drug Metab Dispos. 34 :906-12,2006) 或照相膠巻，例如在放射自顯影中。當標記物是熒光標記物時，它可以通過用適當波長的光激發(fā)熒光色素并檢測產生的熒光來檢測(例如ELISA、流式細胞術或本技術領域已知的其它方法)。熒光可以目測、使用電子檢測器例如電荷耦合器件(CCDs)或光電倍增管等來檢測。類似地，酶法標記物可以通過提供適當的酶的底物并檢測產生的反應產物來檢測。比色或化學發(fā)光標記物可以簡單地通過觀察與標記物相關的顏色來檢測。其它適合用于本發(fā) 明的方法的標記和檢測系統(tǒng)對于本技術領域的專業(yè)人員來說將是顯而易見的。這樣的標記介導物和配體可用于診斷疾病或健康狀況。方法任選包含至少一個或多個清洗步驟，其中在測量結合的蛋白之前對結合的TGF-13組合物進行清洗，以降低由未結合的多肽引起的背景測量值。在多肽組合物溫育之后和檢測TGF-P之前，在適合的緩沖液加上去污劑中進行TGF-I3的清洗。適合的去污劑包括但不限于烷基二甲基胺氧化物、烷基葡萄糖苷、烷基麥芽糖苷、烷基硫酸鹽(例如十二烷基硫酸鈉(SDS)) 、 NP-40、烷基硫代葡萄糖苷、甜菜堿、膽酸、CHAP系列、毛地黃皂苷、葡萄糖酰胺、卵磷脂/溶血卵磷脂、非離子性的基于聚氧乙烯的去污劑包括TRITON-X、聚山梨醇酯例如TWEEN⑧20和TWEEN⑧80、BRIJ⑧、GENAPOL⑧和THESIT⑧、季銨化合物等。也參見《蛋白科學現代方法》的附錄IB (Current Protocolsin Protein Science, Appendix 1B， S聊l. 11,1998， John Wiley and Sons, Hoboken， NJ)。適合的去污劑可以使用常規(guī)的實驗來確定(參見Neugebauer， J.，《去污劑在生物學和生物化學中的性質和使用指南》， (A Guide to the Properties and Use of Detergents in Biology andBiochemistry)， Calbiochem-Novabiochem Corp. ， La Jolla， Calif. ，1988)。
給藥纖維蛋白密封材料的方法考慮到了可用于本發(fā)明的纖維蛋白密封材料可以使用本技術領域熟知的技術給藥于對象，例如通過注射或噴霧在所需位點、通過內視鏡、使用海綿狀的載體、預制的密封材料或本技術領域中已知的其它方法。在一個實施方案中，密封材料被注射或噴霧，并允許在原位形成凝膠。這些纖維蛋白密封材料被考慮到給藥于將得益于TGF-P在體內的持續(xù)/受控釋放的對象，正如對于本技術領域的普通專業(yè)人員來說顯而易見的那樣，包括但不限于下面提出的病癥。在一個實施方案中，患者患有肌肉骨骼疾病，包括但不限于肌肉、相關的韌帶、其它的結締組織以及骨骼和軟骨的疾病；軟組織疾病或紊亂，包括但不限于影響肌肉、纖維組織、脂肪、血管和滑液組織的紊亂；或心血管疾病。在一個實施方案中，纖維蛋白密封材料用作骨骼移植物的替代物，因此可用于許多同樣的指征中，包括但不限于脊柱融合支架(cages)、骨不連缺陷的愈合、骨質增加、骨折修復加速、骨組織重建和牙齒再生。此外，在其它實施方案中，密封材料可用于植入物整合。在植入物整合中，植入物可以包被有纖維蛋白密封材料，誘導鄰近的骨骼區(qū)域生長到植入物的表面中，并防止松散和其它相關的問題。在另一個實施方案中，富集生長因子的基質可用于治愈皮膚中的慢性傷口。其它的骨骼或軟骨紊亂或病癥包括但不限于骨關節(jié)炎、骨質疏松癥、骨營養(yǎng)不良、
軟骨病、骨軟化、McC騰-Albright綜合癥、Albers-Schonberg病、Paget' s病、風濕性關
節(jié)炎、骨關節(jié)炎、軟骨損傷、假體周圍骨溶解、成骨不全、轉移性骨病、骨軟骨瘤、骨生成、骨
髓炎、骨病、骨石化病、骨硬化、多軟骨炎、關節(jié)軟骨損傷、軟骨鈣質沉著病、軟骨發(fā)育不全、
髕骨軟化癥、軟骨肉瘤、肋軟骨炎、內生軟骨瘤、拇強直、半月板受傷、髖臼上唇撕裂、分離性
骨軟骨炎(ocd)、復發(fā)性多軟骨炎或任何得益于骨或軟骨形成的剌激的病癥。其它的結締組織紊亂包括但不限于Ehlers-Danlos綜合癥、Marfan綜合癥、硬皮
病、皮膚松弛癥、Dupuytren' s病、局限性硬皮病、混合型結締組織病、Stickler綜合癥和
其它結締組織疾病。含有TGF蛋白的纖維蛋白密封材料也可用于治療軟組織疾病或病癥，包括但不限于腱炎、滑液囊炎、肌筋膜綜合癥、影響軟組織的風濕性疾病、Tietze' s綜合癥、肋軟骨炎、筋膜炎、止點炎(enthesitis)、結構性紊亂、肉瘤和其它影響軟組織的病癥。
含有TGF蛋白的纖維蛋白密封材料也可用于治療心血管疾病或病癥，包括但不限于局部缺血/再灌注、心肌梗塞、充血性心力衰竭、動脈粥樣硬化、高血壓、再狹窄、動脈炎癥、冠狀動脈病(CAD)、中風、血管或心臟鈣化、血栓形成、外周血管病、血管壁重塑、心室重塑、快速心室起搏、冠狀動脈微栓塞、心動過速、心動過緩、壓力超負荷、主動脈彎曲、冠狀動脈結扎、血管性心臟病，瓣膜疾病，包括但不限于由鈣化引起的瓣膜退化、風濕性心臟病、心內膜炎或人工瓣膜的并發(fā)癥，心房纖顫、長QT綜合癥、竇房結功能障礙、心絞痛、心力衰竭、高血壓、心房纖顫、心房撲動，心包疾病、包括但不限于心包積液和心包炎；心肌疾病、心臟肥大或心血管發(fā)育紊亂。
試劑盒在本發(fā)明的范圍內也考慮到了試劑盒。典型的試劑盒可以包含含有FC和凝血酶組分的纖維蛋白密封材料。在一個實施方案中，試劑盒還含有整合在纖維蛋白密封材料中的TGF-P蛋白。在一種情況下，每種組分可以包含在它自己的分開的儲存容器、小管或器皿中。在相關的情況下，TGF-P可以與FC組分混合，凝血酶組分可以在分開的儲存容器中。在相關的實施方案中，儲存容器是小管、瓶子、包、儲液器、管、泡罩、小囊、小片等。制劑的一種或多種組分可以是真空凍干的、冷凍干燥的、噴霧冷凍干燥的或任何其它可以復溶的形式。如果需要，還可以提供各種不同的復溶的介質。試劑盒的成分可以是冷凍的、液體的或凍干的形式。還考慮到了試劑盒含有適合的用于將纖維蛋白凝膠給藥于對象的裝置。在其它實施方案中，試劑盒還含有用于制備和給藥纖維蛋白密封材料的說明書。從下面的實施例中，本發(fā)明的其它特點和細節(jié)將變得明顯，這些實施例的目的是
說明性的，而不是限制性的。實施例實施例1 材料與方法使用分別為5-40mg/ml和2_250IU/ml的不同濃度的FC和凝血酶(凝膠中的終濃度)制備了 8種不同配方的纖維蛋白凝膠((TISSEELVtfM或VH S/D ) (S/D是添加的病毒失活步驟，以提供附加的安全性)，Baxter AG， Vie皿a， Austria)。纖維蛋白凝膠(總共 0. 3ml)被制備在24孔培養(yǎng)板中。FC組分中含有3000KIU/ml的纖維蛋白溶解抑制劑抑蛋白酶肽。將5到40ng/0. 3ml凝膠的重組人類(rh) TGF- P 1 (R&D Systems)、或15ng/0. 3ml 凝膠的rh TGF-P2(R&D Systems,Minne即olis，MN)、或15ng/0. 3ml凝膠的rh TGF-P3(R&D Systems)，在制備凝膠的時候被加入到FC組分中。所有凝膠與標準的HMSC生長培養(yǎng)基(XonzaWalkersville Inc，以前的C咖brex Bio Science Walkersville Inc.， Walkersville，MD)在37"下，在5% C02中溫育最多10天。培養(yǎng)基每天更換。將培養(yǎng)基樣品冷凍，直到通過酶聯免疫吸附分析(ELISA) (R&D Systems)測試TGF-P的量。為了證實最初添加的TGF-13 1的完全回收，在溫育10天后將一些凝膠用尿激酶溶解，將上清液也用 ELISA測試。進行了不同的釋放動力學分析 1.使用由TISSEEL VH 制成的單一纖維蛋白凝膠制劑(FC濃度為25mg/ml，凝血
20酶濃度為2IU/ml，均為凝膠中的終濃度)，分析了 TGF-13 1的量對釋放動力學的影響。
2.使用4種不同FC濃度的TISSEEL VH ，分析了固定凝血酶濃度(2IU/ml，凝膠中的終濃度)條件下FC濃度對TGF-P 1釋放動力學的影響。 3.使用4種不同FC濃度的TISSEEL VH S/D ，分析了固定凝血酶濃度(2IU/ml，凝膠中的終濃度)條件下FC濃度對TGF-P 1釋放動力學的影響。 4.使用4種不同FC濃度的TISSEEL VH ，分析了固定FC濃度(25mg/ml ，凝膠中的終濃度)條件下凝血酶濃度對TGF-P 1釋放動力學的影響。 5.使用單一纖維蛋白凝膠制劑(FC濃度為20mg/ml，凝血酶濃度為2IU/ml，均為凝膠中的終濃度)，分析了 TISSEEL VH 或TISSEELVH S/D 的不同批次號對TGF- P 1釋放動力學的影響。 6.使用4種不同FC濃度的TISSEEL VH ，分析了固定凝血酶濃度(2IU/ml，凝膠中的終濃度)條件下FC濃度對TGF-13 2釋放動力學的影響。 7.使用4種不同FC濃度的TISSEEL VH ，分析了固定凝血酶濃度(2IU/ml，凝膠中的終濃度)條件下FC濃度對TGF-13 3釋放動力學的影響。通過熒光顯微術分析了纖維蛋白凝膠中添加的TGF-P 1 (15ng/0. 3ml凝膠)對接種在凝膠表面上的HMSC的影響。在FC中未添加TGF- P 1的凝膠被用作對照。將大約10， 000 個HMSC(Lonza Walkersville Inc.)接種在凝膠的頂部，凝膠使用5-40mg/ml的FC濃度和2-250IU/ml的凝血酶濃度(凝膠中的終濃度)在24孔板中制備。在第1、4、7和10天時，將帶有細胞的凝膠用鈣黃綠素/溴化乙錠染料染色，以便觀察在存在或不存在添加的 TGF-P 1的情況下細胞在凝膠中的形態(tài)和遷移。為了測試釋放的TGF-13 1的生物學活性，將來自第3天的凝膠(最初未添加 TGF- P 1 (對照)或含有添加的15ng TGF- P 1/0. 3ml凝膠，用20mg/ml FC和2IU/ml凝血酶(凝膠中的終濃度)制備)的培養(yǎng)基上清液用作HMSC單層細胞的培養(yǎng)基。在含有新鮮添加的TGF-P 1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞被用作陽性對照。在用鈣黃綠素染料染色后，通過光學和熒光顯微術分析了直到第7天的細胞形態(tài)的變化。在用鈣黃綠素染料染色后，還通過測量細胞單層的總的熒光強度(通過光密度測量)分析了細胞增殖。結果根據第l天進行歸一化。通過用于顯示甘油氨基聚糖(用于軟骨形成)和堿性磷酸酶(ALP)活性的阿利辛藍染色，以及茜素紅染色(用于骨生成)來分析細胞的分化。ALP活性的結果(首先計算成IU/ml)根據增殖進行歸一化。某些凝膠在不添加TGF-P 1的情況下制備，作為對照樣品，以確保從添加了 TGF-P 1的凝膠的培養(yǎng)基上清液中觀察到的任何變化事實上都是由釋放的TGF-P 1誘導的，而不是由可能從凝膠自身釋放的某些其它生物活性成分誘導的。
最后，為了分析TGF-13 1對接種在纖維蛋白凝膠中的HMSC和接種在凝膠表面上的人類臍帶血管內皮細胞(HUVEC， Lonza Walkersvillelnc.)的行為的影響，使用單一培養(yǎng) 的細胞(HMSC或HUVEC)或HMSC : HUVEC比率為4 : 1的共培養(yǎng)細胞制備了含有l(wèi)Omg/ml FC和2IU/ml凝血酶(凝膠中的終濃度)的凝膠。在制備凝膠時，在一半的共培養(yǎng)凝膠中，在FC中添加了重組人類TGF-P 1 (5ng/0. 3ml凝膠，R&DSystems)。使用具有血清添加物的標準內皮細胞生長培養(yǎng)基(LonzaWalkersville Inc.)將凝膠在37"下、5% C02中溫育最多21天。在第1、7、14和21天進行細胞形態(tài)和增殖、以及骨形成分化的分析。細胞形態(tài)學包括HUVEC重新組織成相互連接的細胞_細胞網絡(血管生成分化的早期事件)，在用鈣黃綠素染料染色后通過熒光顯微術觀察。細胞增殖通過將纖維蛋白凝膠溶解在純化的、濃縮的牛胰蛋白酶溶液中后細胞懸浮液的熒光強度來測量。最后，測量了 ALP活性作為骨形成分化的早期標記物。統(tǒng)計學分析使用ANOVA檢驗來進行，以5%作為顯著性水平。
實施例2、以不同量添加在纖維蛋白凝膠中的TGF-13 1的釋放動力學
使用由TISSEEL VHTM制成的單一纖維蛋白凝膠制劑(FC濃度為25mg/ml，凝血酶濃度為2IU/ml，均為凝膠中的終濃度)，分析了 TGF-13 1的量對其從纖維蛋白凝膠中釋放的動力學的影響。對TGF-P1的量對每日(圖l)和累積(圖2)的TGF-ei從凝膠中釋放的影響的分析，顯示出TGF-I3 1釋放的水平與最初添加到FC組分中的生長因子的量成正比?？?的來說，使用該纖維蛋白凝膠制劑得到的結果顯示，在10天后只有大約45%到52%的最初添加的TGF-P 1被釋放(圖2)。換句話說，大約48 %到55%的最初添加的TGF-P 1在10 天后保留在纖維蛋白凝膠中。如果只考慮在3天后TGF-P 1的累積釋放，最小保持率是大約80%。實施例3、 TGF-13 1從使用不同濃度的FC或凝血酶的纖維蛋白凝膠中釋放的動力學在固定凝血酶濃度(2IU/ml) (TISSEEL VH)條件下FC濃度對TGF- P 1釋放動力學的影響為了確定當使用TISSEEL VHTM纖維蛋白密封材料時FC濃度對TGF-P l釋放動力學的影響，使用具有固定的凝血酶濃度(2IU/ml)和4種不同FC濃度(5、10、20和40mg/ml，凝膠中的終濃度)的TISSEEL VH凝膠對釋放進行了分析。通過ELISA進行的每日TGF- P 1釋放分析顯示出，對于所有被分析的FC濃度，在第1天時有峰值的釋放，并且釋放逐漸降低直到第10天(圖3)。含有較低FC濃度的凝膠的釋放明顯較高，表明了 FC濃度對釋放動力學的影響，以及TGF-P 1與纖維蛋白凝膠的FC 組分蛋白的可能的結合親和性。到第10天為止累積釋放的TGF-P 1也低于最初加入的生長因子的量(15ng)，累積釋放的最大百分率是大約75X (使用5mg/ml的FC)，最小是大約 25% (使用40mg/ml的FC)(圖4)。因此，這些結果顯示，10天后的最小保持率為大約25% (使用5mg/ml的FC)，最大保持率為大約75X (使用40mg/ml的FC)。如果只考慮3天后的 TGF-P 1累積釋放，最小保持率是大約60% (使用5mg/ml的FC)，最大保持率是大約90% (使用40mg/ml的FC)。在固定凝血酶濃度(2IU/ml) (TISSEEL VH SD )條件下FC濃度對TGF-P 1釋放動力學的影響為了確定當使用TISSEEL VH SDTM纖維蛋白密封材料時FC濃度對TGF-P 1 釋放動力學的影響，使用具有固定的凝血酶濃度(2IU/ml)和4種不同FC濃度(5U0、20和 40mg/ml，凝膠中的終濃度)的TISSEEL VH SD 凝膠對釋放進行了分析。
通過ELISA進行的每日TGF- P 1釋放分析顯示出，對于所有被分析的FC濃度，在第1天時有峰值的釋放，并且釋放逐漸降低直到第10天(圖5)。含有較低FC濃度的凝膠的釋放明顯較高，表明了 FC濃度對釋放動力學的影B向，以及TGF-P 1與纖維蛋白凝膠的FC 組分蛋白的可能的結合親和性。到第10天為止，TGF-P 1的累積釋放達到了大約70% (使用40mg/ml的FC)到使用兩種最低FC濃度(5mg/ml和10mg/ml ，凝膠中的終濃度)時的幾乎100% (高于93% )(圖6)。因此，10天后的最大保持率為大約30% (使用40mg/ml的 FC)。如果只考慮3天后的TGF-P1累積釋放，最小保持率是大約35X (使用5mg/ml的 FC)，最大保持率是大約75% (使用40mg/ml的FC)。
在固定FC濃度(25mg/ml) (TISSEEL VHTM)條件下凝血酶濃度對TGF- P 1釋放的影響為了確定凝血酶濃度對TGF-P l釋放動力學的影響，使用具有固定的FC濃度(25mg/ml)和4種不同的凝血酶濃度(2、10、50、250IU/ml，凝膠中的終濃度)的TISSEEL VH凝膠對釋放進行了分析。通過ELISA進行的每日TGF-P l釋放分析顯示出，對于所有被分析的凝血酶濃度，在第1天時有峰值的釋放，并且釋放逐漸降低直到第10天(圖7)。使用2、 10和50IU/ml的凝血酶的釋放是相似的(3天后釋放大約15% (即保持率85% ) ， 10天后釋放大約35%(即保持率65% )，表明凝血酶濃度對TGF-P 1釋放的影響比FC濃度的影響低。只有在使用最高的凝血酶濃度(250IU/ml)時TGF-P 1的釋放才明顯較高，最可能是因為使用這種高凝血酶濃度時凝膠結構的更不均質性。與FC的影響類似，到第IO天為止，TGF-P 1的累積釋放低于最初加入的生長因子的量(圖8)。不同的TISSEEL VH 或TISSEEL VH S/D 批次號對TGF- P 1釋放的影響使用單一纖維蛋白凝膠制劑(FC濃度為20mg/ml ，凝血酶濃度為2IU/ml ，均為凝膠中的終濃度)，分析了 TISSEEL VtfM或TISSEEL VH S/D 的不同批次號對TGF-P 1釋放動力學的影響。
對TISSEEL VH 的不同FC批次號的影響的分析顯示，在IO天后，依賴于批次號，累積釋放從大約32%到完全釋放(圖9)。換句話說，結果顯示，在10天后，依賴于批次號，保持率從可忽略的保持到最大保持率68%。這些結果證實了這些不同批次中的因子XIII含量，最低的釋放百分率(最高的保持率)是使用含有最高量的因子XIII的批次獲得的(批次1含有< 1U/ml的因子XIII，批次2含有33.9U/ml，批次3含有42. 2U/ml)。如果僅考慮3天后TGF-P 1的累積釋放，最小保持率是大約43% (使用批次1)，最大保持率是大約85% (使用批次3)。對TISSEEL VH S/D 的不同FC批次號的影響的分析顯示，在10天后，依賴于批次號，累積釋放從大約80%到完全釋放(圖10)。因此，結果顯示，在10天后，依賴于批次號，保持率從可忽略的保持到最大保持率20%。這些批次中因子XIII的含量低于3U/ml。如果僅考慮3天后TGF-P 1的累積釋放，最小保持率是大約57% (使用批次1)，最大保持率是大約67% (使用批次3)。實施例4、 TGF- P的其它同工型(TGF- P 2和TGF- P 3)的釋放動力學
TGF-P 2的釋放動力學使用具有固定的凝血酶濃度(2IU/ml)和4種不同FC濃度(5、 10、20和40mg/ml，凝膠中的終濃度)的TISSEELVH 凝膠，分析了 FC濃度對TGF- P 2從TISSEEL VH 纖維蛋白密封材料中釋放的動力學的影響。 ELISA結果顯示，使用含有較低FC濃度的凝膠時，TGF-P 2的累積釋放明顯較高，至少在早期的時間點上，這表明了 FC濃度對TGF-P 2釋放動力學的影響，以及TGF-P 2與纖維蛋白凝膠的FC組分蛋白的可能的結合親和性。到第10天為止，釋放達到了85% (使用40mg/ml的FC)到使用含有較低FC濃度的其它劑型時的100%。換句話說，這些結果顯示出在10天后的最大保持率為大約15% (使用40mg/ml的FC)。如果只考慮3天后的TGF-P 2累積釋放，最小的保持率是大約25% (使用5mg/ml的FC)，最大的保持率是大約70% (使用40mg/ml的FC)。 TGF-P 3的釋放動力學使用具有固定的凝血酶濃度(2IU/ml)和4種不同FC濃度(5、 10、20和40mg/ml，凝膠中的終濃度)的TISSEELVH 凝膠，分析了 FC濃度對TGF- P 3從TISSEEL VH 纖維蛋白密封材料中釋放的動力學的影響。 ELISA結果顯示，使用含有較低FC濃度的凝膠時，TGF-P3的累積釋放明顯較高，這表明了 FC濃度對TGF-13 3釋放動力學的影響，以及TGF- P 3與纖維蛋白凝膠的FC組分蛋白的可能的結合親和性。到第10天為止，TGF-P 3的累積釋放也低于最初添加的生長因子的量，最大的累積釋放百分率為大約75% (使用5mg/ml的FC)，最小為大約30% (使用40mg/ml的FC)。換句話說，這些結果顯示出在10天后最小保持率為大約25% (使用5mg/ml的FC)，最大保持率為大約70% (使用40mg/ml的FC)。如果僅考慮3天后TGF- P 3的累積釋放，最小保持率為大約55% (使用5mg/ml的FC)，最大保持率為大約90X (使用40mg/ml的FC)。實施例5、 TGF-13 1對接種在纖維蛋白凝膠表面上的HMSC的影響
人類間充質干細胞(HMSC)是多能祖細胞，可以分化成不同的特化的組織細胞類型，包括軟骨細胞、成骨細胞、脂肪細胞和肌細胞(C即lan AI， J Orthop Res 9:641-650，1991)。這些細胞的定型(commitment)和分化受到多種因素的調節(jié)，包括細胞相互作用，也包括特定的生長因子。TGF-P家族的生長因子的成員已經被鑒定為MSC成熟的調節(jié)劑。具體來說，TGF-P 1參與了軟骨和骨骼發(fā)育，最可能是通過誘導MSC分化成分化成軟骨形成或骨形成株系(Centrella等，Endocrine Rev， 15 :27-39， 1994)。此夕卜，TGF-P 1是重要的血管形成因子，參與骨骼生長過程中的關鍵過程——血管形成的不同方面。許多研究已經報道了 TGF-P信號轉導途徑在血管形成和血管重塑中的重要性(Bertolino等，Chest 128 :6,2005)。最后，TGF-P已經顯示出在毛細血管形態(tài)發(fā)生和血管壁完整性的維持中發(fā)揮了重要作用(P印per MS. Cytokine & Growth Factor Reviews 8(1) :21—43,1997)。
通過熒光顯微術分析了添加到纖維蛋白凝膠中的TGF-P 1 (15ng/0. 3ml凝膠)對接種在凝膠表面上的HMSC的影響。在FC中沒有添加TGF-Pl的凝膠被用作對照。將大約10， 000個HMSC (LonzaWalkersvilie Inc.)接種在凝膠的頂部，凝膠使用5_40mg/ml的FC濃度和2-250IU/ml的凝血酶濃度(凝膠中的終濃度)在24孔板中制備。在第1、4、7和10天時，將帶有細胞的凝膠用鈣黃綠素/溴化乙錠染料染色，以便觀察在存在或不存在添加的TGF-P 1的情況下細胞在凝膠中的形態(tài)和遷移。對在凝膠表面上接種有HMSC的凝膠的熒光顯微術分析顯示，對于所有分析的凝膠制劑來說，無論是否在凝膠中添加了 TGF-13 1 ， HMSC增殖良好，早在第7天就形成了單層。結果還顯示出，在纖維蛋白凝膠中添加的TGF-I3 1影響了培養(yǎng)在凝膠表面上的HMSC的形態(tài)學和向凝膠中的遷移。事實上，細胞在不添加TGF-P l制備的凝膠上表現為細長的形狀，但是當接種在添加TGF-P 1制備的凝膠的表面上時具有更方形到多邊形的形狀。在凝膠中存在添加的TGF-P 1的情況下MSC的更方形到多邊形的形狀，表明它們分化成了骨形成和/或軟骨形成表現型。此外，某些細胞遷移到了不添加TGF-I3 l制備的凝膠內部，但是它們大多數保留在添加TGF-P 1制備的凝膠的表面上。細胞不遷移到添加TGF-P 1制備的凝膠的內部，表明了纖維蛋白凝膠將TGF-P 1遞送給接種在凝膠上的細胞的能力。利用本發(fā)明的纖維蛋白凝膠，可以在體內情況下將TGF-P 1遞送給周圍區(qū)域中的細胞。實施例6、在體外HMSC單層上釋放的TGF- P 1的生物學活性為了測試釋放的TGF-Pl的生物學活性，將來自第3天的凝膠(最初不含有添加
24的TGF- P 1 (對照)或含有添加的15ng TGF- P 1/0. 3ml凝膠，用20mg/ml的FC和2IU/ml的凝血酶制備，濃度為凝膠中的終濃度)的培養(yǎng)基上清液用作HMSC單層的培養(yǎng)基。在含有新鮮添加的TGF-P1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞被用作陽性對照。在用鈣黃綠素染料染色后，通過光學和熒光顯微術分析了直到第7天的細胞形態(tài)的變化。在用鈣黃綠素染料染色后，還通過測量細胞單層的總的熒光強度(通過光密度測量)分析了細胞增殖。結果根據第l天進行歸一化。通過用于顯示甘油氨基聚糖(用于軟骨形成)和堿性磷酸酶(ALP)活性的阿利辛藍染色，以及茜素紅染色(用于骨生成)來分析細胞的分化。ALP活性的結果(首先計算成IU/ml)根據增殖進行歸一化。某些凝膠在不添加TGF-P 1的情況下制備，作為對照樣品，以確保從添加了 TGF-P 1的凝膠的培養(yǎng)基上清液中觀察到的任何變化事實上都是由釋放的TGF-P 1誘導的，而不是由可能從凝膠自身釋放的某些其它生物活性成分誘導的。
在第3天的來自添加了 TGF-Pl的凝膠的培養(yǎng)基上清液中(即含有釋放的TGF-13 1的培養(yǎng)基中)培養(yǎng)的HMSC單層細胞，早在第4天就顯示出形態(tài)學的變化，在第7天時甚至更加顯著。與在來自未添加TGF-P 1的凝膠的培養(yǎng)基上清液中培養(yǎng)的細胞相比，它們具有更方形到多邊形的形狀，與在含有新鮮添加的TGF-P 1的培養(yǎng)基(陽性對照)中培養(yǎng)的細胞具有類似的形狀。根據第l天的增殖(基線)對第4和7天的細胞增殖進行了歸一化。在來自添加了 TGF-P 1的凝膠的培養(yǎng)基上清液中(即含有釋放的TGF-P 1的培養(yǎng)基中)培養(yǎng)的細胞的增殖，傾向于低于在來自未添加TGF-Pl的凝膠的培養(yǎng)基上清液中培養(yǎng)的細胞的增殖，與在含有新鮮添加的TGF-P 1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞的增殖類似(圖11)。
在來自添加了 TGF-P 1的凝膠的培養(yǎng)基上清液中(即含有釋放的TGF-P 1的培養(yǎng)基中)培養(yǎng)至單層后，HMSC的形態(tài)學變化成更方形到多邊形的形狀，表明了細胞的分化，并伴隨有表現出與在來自未添加TGF-P 1的凝膠的培養(yǎng)基上清液中培養(yǎng)的細胞相比更低的增殖的傾向。通過阿利辛藍染色(用于軟骨形成)和ALP活性以及茜素紅染色(用于骨生成)，評估了細胞分化成軟骨形成或骨形成表現型。在來自添加了 TGF-P 1的凝膠的培養(yǎng)基上清液中(即含有釋放的TGF-P 1的培養(yǎng)基中)培養(yǎng)的HMSC中，阿利辛藍染色隨著時間而增加，到第7天時，染色量明顯高于在來自未添加TGF-P 1的凝膠的培養(yǎng)基上清液中培養(yǎng)的HMSC中的染色，與在含有新鮮添加的TGF-P 1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的HMSC中的染色類似。在所有樣品中，茜素紅染色保持陰性。在來自添加了 TGF-P 1的凝膠的培養(yǎng)基上清液中培養(yǎng)的HMSC中，在第4天到第7天之間，ALP活性降低了 (圖12)。早在第4天，它就明顯低于在來自未添加TGF-P 1的凝膠的培養(yǎng)基上清液中培養(yǎng)的HMSC中檢測到的水平(在第4天p = 0. 005，在第7天p = 3E-06)，并且與在具有新鮮添加的TGF- P 1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的HMSC中的水平相似。在細胞形態(tài)學、增殖和軟骨形成分化中的變化，證明了 TGF-13 1在從凝膠中釋放后，仍然是有生物學活性的。實施例7、 TGF-13 1對接種在纖維蛋白凝膠內部的HMSC和接種在纖維蛋白凝膠表面上的HUVEC的影響為了分析TGF-P l對接種在纖維蛋白凝膠內部的HMSC和接種在凝膠表面上的人類臍帶血管內皮細胞(HUVEC，Lonza Walkersvillelnc.)的行為的影響，使用單一培養(yǎng)的細胞(HMSC或HUVEC)或HMSC : HUVEC比率為4 : 1的共培養(yǎng)細胞制備了含有10mg/ml FC和2IU/ml凝血酶(凝膠中的終濃度)的凝膠。在制備凝膠時，在一半的共培養(yǎng)物凝膠中，在FC中添加了重組人類TGF-13 1 (5ng/0. 3ml凝膠)。使用具有血清添加物的標準內皮細胞生長培養(yǎng)基(Lonza Walkersvillelnc.)將凝膠在37"下、5% C02中溫育最多21天。在第1、7、14和21天進行細胞形態(tài)和增殖、以及骨形成分化的分析。細胞形態(tài)學包括HUVEC重新組織成相互連接的細胞-細胞網絡(血管生成分化的早期事件)，在用鈣黃綠素染料染色后通過熒光顯微術觀察。細胞增殖通過將纖維蛋白凝膠溶解在純化的、濃縮的牛胰蛋白酶溶液中后細胞懸浮液的熒光強度來測量。最后，進行了標準的堿性磷酸酶(ALP)分析，作為骨生成分化的早期標記物。熒光顯微術分析顯示，當接種在添加有TGF-P 1的單一培養(yǎng)物凝膠或共培養(yǎng)物凝膠中時，HMSC分散得更均勻，并具有更細長的形狀。在未添加TGF-Pl的共培養(yǎng)物凝膠中，HSMC較小，并傾向于遷移到凝膠的底部。在含有TGF-Pl的單一培養(yǎng)物凝膠和共培養(yǎng)物凝膠中，與不添加TGF-P 1的共培養(yǎng)物凝膠中相比，HUVEC重新組織成相互連接的細胞_細胞網絡(血管生成分化的早期事件)開始得更早，發(fā)生的程度更大。細胞的增殖隨著時間而增加。在添加和未添加TGF-13 1的凝膠之間沒有觀察到明顯的差別。對于所有含有HMSC的條件來說，ALP活性隨著時間而增加。在添加了 TGF-P 1的凝膠中，與未添加TGF-ei的凝膠中相比，它的水平傾向于較高，除了第7天之外。這表明在添加了 TGF-P 1的凝膠中14天后，早期骨生成分化中的增加，但是這可能也反映了在存在TGF-P 1的情況下HMSC的可能的較高的數量。因為所進行的增殖分析在兩種細胞類型之間沒有差異，ALP活性水平可能不與HMSC的總數直接相關。對于本技術領域的專業(yè)人員來說，可以預料到對上面的說明性實施例中提出的本發(fā)明進行大量的修改和變化。因此，本發(fā)明僅僅受到在隨附的權利要求書中表明的限制。
2權利要求
用于調節(jié)轉化生長因子β(TGF-β)蛋白從纖維蛋白密封材料中的釋放的方法，所述蛋白選自TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，其中纖維蛋白密封材料通過將纖維蛋白原復合物組分、凝血酶組分和TGF-β組分相混合來生產，該方法包括a)確定從具有已知的TGF-β起始量和已知的纖維蛋白原復合物終濃度的第一種纖維蛋白密封材料釋放的TGF-β的量，以及b)調節(jié)在步驟(a)的第一種纖維蛋白密封材料中使用的已知的纖維蛋白原復合物的終濃度以產生第二種纖維蛋白密封材料，其中與第一種密封材料中已知的纖維蛋白原復合物終濃度相比在第二種密封材料中纖維蛋白原復合物濃度的增加，與TGF-β從步驟(a)的第一種密封材料中的釋放相比，降低了TGF-β從第二種密封材料中釋放的速度，其中第二種密封材料具有與步驟(a)中的第一種密封材料相同的起始TGF-β量。
2. 用于調節(jié)轉化生長因子13 (TGF-P)蛋白從纖維蛋白密封材料中的釋放的方法，所述蛋白選自TGF-P 1、 TGF-P2和TGF-P 3，其中纖維蛋白密封材料通過將纖維蛋白原復合物組分、凝血酶組分和TGF-P組分相混合來生產，該方法包括a) 確定從具有已知的TGF-P起始量和已知的纖維蛋白原復合物終濃度的第一種纖維蛋白密封材料釋放的TGF-P的量，b) 調節(jié)在步驟(a)中的第一種纖維蛋白密封材料中使用的已知的纖維蛋白原復合物的終濃度以產生第二種纖維蛋白密封材料，其中與第一種密封材料中已知的纖維蛋白原復合物終濃度相比在第二種密封材料中纖維蛋白原復合物濃度的降低，與TGF-I3從步驟(a) 的第一種密封材料中的釋放相比，增加了 TGF-P從第二種密封材料中釋放的速度，其中第二種密封材料具有與步驟(a)中的第一種密封材料相同的起始TGF-I3量。
3. 權利要求1或2的方法，其中第一種或第二種密封材料中纖維蛋白原復合物的終濃度在大約lmg/ml到大約150mg/ml的范圍內。
4. 權利要求3的方法，其中第一種或第二種密封材料中纖維蛋白原復合物的終濃度在大約5mg/ml到大約75mg/ml的范圍內。
5. 權利要求1或2的方法，其中第一種纖維蛋白密封材料中纖維蛋白原復合物的終濃度與第二種密封材料中纖維蛋白原復合物的終濃度的差別為大約lmg/ml到大約149mg/ ml。
6. 權利要求1或2的方法，其中第一種纖維蛋白密封材料中纖維蛋白原復合物的終濃度與第二種密封材料中纖維蛋白原復合物的濃度的差別為大約5mg/ml到大約75mg/ml。
7. 權利要求1或2的方法，其中第一種纖維蛋白密封材料中纖維蛋白原復合物的終濃度與第二種密封材料中纖維蛋白原復合物的濃度的差別為大約10mg/ml到大約60mg/ml。
8. 權利要求1或2的方法，其中第一種或第二種密封材料中凝血酶組分的終濃度在大約1IU/ml到250IU/ml的范圍內。
9. 權利要求1或2的方法，其中TGF-P的終濃度在大約lng/ml到大約lmg/ml的范圍內。
10. 用于在需要轉化生長因子13 (TGF-P)蛋白的患者中受控釋放TGF-P蛋白的方法，所述蛋白選自TGF-13 1、TGF-13 2和TGF- P 3，包括給所述患者施用含有TGF- P的纖維蛋白密封材料，其中至少25%的TGF-P在纖維蛋白密封材料中保留至少3天。
11. 權利要求10的方法，其中纖維蛋白密封材料通過將纖維蛋白原復合物(FC)組分與凝血酶組分組合在混合物中來生產。
12. 權利要求11的方法，其中TGF-13在將FC組分與凝血酶組分混合之前加入到FC組分中。
13. 權利要求10或11的方法，其中至少35%到90%的TGF-13保留至少3天。
14. 權利要求10或11的方法，其中至少45X到75X的TGF-I3在纖維蛋白密封材料中保留至少3天。
15. 權利要求10或11的方法，其中至少60%的TGF-13在纖維蛋白密封材料中保留至少3天
16. 權利要求10或11的方法，其中釋放的TGF-13是有生物學活性的。
17. 用于在需要轉化生長因子13 (TGF-e)蛋白的患者中受控釋放TGF-P蛋白的方法，所述蛋白選自TGF-13 1、TGF-13 2和TGF- P 3，包括給所述患者施用含有TGF- P的纖維蛋白密封材料，其中至少20X的TGF-I3在纖維蛋白密封材料中保留至少10天。
18. 權利要求17的方法，其中纖維蛋白密封材料通過將纖維蛋白原復合物(FC)組分與凝血酶組分組合在混合物中來生產。
19. 權利要求18的方法，其中TGF-13在將FC組分與凝血酶組分混合之前加入到FC組分中。
20. 權利要求17或18的方法，其中至少25%到75%的TGF_|3保留至少10天。
21. 權利要求17或18的方法，其中至少45X到55X的所述TGF-I3在纖維蛋白密封材料中保留至少10天。
22. 權利要求17或18的方法，其中釋放的TGF-13是有生物學活性的。
23. 權利要求11或18的方法，其中密封材料中纖維蛋白原復合物的終濃度在大約 lmg/ml到大約150mg/ml的范圍內。
24. 權利要求11或18的方法，其中密封材料中凝血酶的終濃度在大約1IU/ml到 250IU/ml的范圍內。
25. 權利要求11或18的方法，其中纖維蛋白原復合物的終濃度是40mg/ml，凝血酶的終濃度是大約2IU/ml 。
26. 權利要求10或17的方法，其中密封材料中TGF-P的終濃度是大約lng/ml到大約 lmg/ml。
27. 權利要求10或17的方法，其中TGF-P是TGF-P 1。
28. 權利要求27的方法，其中至少60%的所述TGF- P 1在所述纖維蛋白密封材料中保留至少3天，其中至少25%的所述TGF-P 1在所述纖維蛋白密封材料中保留至少10天。
29. 權利要求10或17的方法，其中TGF-P是TGF-P 2。
30. 權利要求29的方法，其中至少25%的所述TGF- P 2在所述纖維蛋白密封材料中保留至少3天。
31. 權利要求IO或17的方法，其中TGF-P是TGF-P3。
32. 權利要求31的方法，其中至少55X的所述TGF-I3 3在所述纖維蛋白密封材料中保留至少3天，其中至少25%的所述TGF-13 3在所述纖維蛋白密封材料中保留至少10天。
33. 權利要求10或17的方法，其中患者患有選自肌肉骨骼疾病或紊亂、軟組織疾病或紊亂和心血管疾病的疾病。
34. 權利要求33的方法，其中肌肉骨骼紊亂是骨骼疾病或骨骼紊亂。
35. 權利要求33的方法，其中肌肉骨骼紊亂是軟骨疾病或軟骨紊亂。
36. 權利要求33的方法，其中患者患有心血管疾病。
37. 用于治療患有將得益于轉化生長因子13 (TGF-e)蛋白的原位受控釋放的紊亂或疾病的患者的方法，所述蛋白選自TGF-P 1、TGF-P 2和TGF-P 3，所述方法包括給所述患者施用含有TGF-P蛋白的纖維蛋白密封材料，其中纖維蛋白密封材料提供了TGF-I3的受控釋放，其中至少25X的TGF-I3在纖維蛋白密封材料中保留至少3天，或其中至少20%的TGF-P在纖維蛋白密封材料中保留至少 10天，并且所述TGF-13以有效治療所述紊亂或疾病的速度釋放。
38. 權利要求37的方法，其中纖維蛋白密封材料通過將纖維蛋白原復合物(FC)組分與凝血酶組分組合在混合物中來生產。
39. 權利要求38的方法，其中TGF- P在將FC組分與凝血酶組分混合之前加入到FC組分中。
40. 權利要求37或38的方法，其中至少35X到90X的TGF-I3在纖維蛋白密封材料中保留至少3天。
41. 權利要求37或38的方法，其中至少45X到75X的TGF-I3在纖維蛋白密封材料中保留至少3天。
42. 權利要求37或38的方法，其中至少60X的TGF-I3在纖維蛋白密封材料中保留至少3天。
43. 權利要求37或38的方法，其中至少20%的所述TGF-P在纖維蛋白密封材料中保留至少10天。
44. 權利要求37或38的方法，其中至少25%到75%的TGF-P保留至少10天。
45. 權利要求37或38的方法，其中至少45X到55X的所述TGF-I3在纖維蛋白密封材料中保留至少10天。
46. 權利要求37或38的方法，其中釋放的TGF-P是有生物學活性的。
47. 權利要求38的方法，其中密封材料中FC的終濃度在大約lmg/ml到大約150mg/ml 的范圍內。
48. 權利要求38的方法，其中密封材料中凝血酶的終濃度在大約1IU/ml到250IU/ml 的范圍內。
49. 權利要求38的方法，其中纖維蛋白原復合物的終濃度是大約40mg/ml，凝血酶的終濃度是大約2IU/ml。
50. 權利要求37的方法，其中密封材料中TGF-P的終濃度是大約lng/ml到大約lmg/ml。
51. 權利要求37的方法，其中TGF-P是TGF-P 1。
52. 權利要求37的方法，其中至少60%的所述TGF- P 1在所述纖維蛋白密封材料中保留至少3天，其中至少25%的所述TGF-P 1在所述纖維蛋白密封材料中保留至少10天。
53. 權利要求37的方法，其中TGF-P是TGF-P 2。
54. 權利要求53的方法，其中至少25%的所述TGF- P 2在所述纖維蛋白密封材料中保留至少3天。
55. 權利要求37的方法，其中TGF-P是TGF_P 3。
56. 權利要求55的方法，其中至少55%的所述TGF- P 3在所述纖維蛋白密封材料中保留至少3天，其中至少25%的所述TGF-P 3在所述纖維蛋白密封材料中保留至少10天。
57. 權利要求37的方法，其中患者患有選自肌肉骨骼疾病或紊亂、軟組織紊亂和心血管疾病的疾病。
58. 權利要求57的方法，其中肌肉骨骼紊亂是骨骼疾病或骨骼紊亂。
59. 權利要求57的方法，其中肌肉骨骼紊亂是軟骨疾病或軟骨紊亂。
60. 權利要求57的方法，其中患者患有心血管疾病。
61. 用于制備含有轉化生長因子13 (TGF-e)蛋白的纖維蛋白密封材料的試劑盒，所述蛋白選自TGF-13 1 、TGF-13 2和TGF- P 3，所述纖維蛋白密封材料具有所需的TGF- P釋放速度，所述試劑盒含有a)含有纖維蛋白原復合物組分的第一個小瓶或第一個儲存容器，其中小瓶任選含有 TGF-P組分，以及b)具有凝血酶組分的第二個小瓶或第二個儲存容器，當所述第一個小瓶或第一個儲存容器不包含TGF-P組分時，所述試劑盒任選含有具有TGF-I3組分的第三個小瓶或第三個儲存容器，所述試劑盒還含有使用其的說明書。
全文摘要
本發(fā)明總的來說涉及纖維蛋白密封材料，其中含有用于在原位受控釋放的轉化生長因子β(TGF-β)，以用于治療性應用，包括肌肉骨骼疾病、例如骨和軟骨疾病、軟組織疾病和心血管疾病。
文檔編號A61P21/00GK101730539SQ200880002625
公開日2010年6月9日申請日期2008年1月18日優(yōu)先權日2007年1月18日
發(fā)明者伊莎貝爾·卡特拉斯, 薩姆·L·海爾格森申請人:巴克斯特國際公司;巴克斯特醫(yī)療保健股份有限公司

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