專利名稱：通過來自胰腺酶原粒的糖蛋白2(gp2)的免疫反應(yīng)檢測體液中抗體的方法用于診斷炎癥性 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過來自胰腺酶原粒的GP2、免疫反應(yīng)性序列或其類似物 (但不包括組織切片)進(jìn)行的免疫反應(yīng)來檢測體液中抗體的方法。
該方法可以用于診斷或治療控制與GP2和類似物質(zhì)的免疫反應(yīng)有關(guān)的疾 病。因此更具體地說，本發(fā)明是針對(duì)GP2、免疫反應(yīng)性序列或其類似物在診斷 或治療控制慢性炎癥或自身免疫性疾病的應(yīng)用，特別是針對(duì)克羅恩氏病 (Crohn's disease, CD)和'f曼性胰腺炎(chronic pancreatitis, CP)的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
本發(fā)明是建立在發(fā)現(xiàn)GP2是炎癥性腸病(inflammatory bowel diseases, IBD),特別是CD和CP的免疫過程中的自身免疫性抗原，從而代表了與疾病 有關(guān)的抗體的表位的基礎(chǔ)上的。
GP2是胰腺的腺泡細(xì)胞的膜糖蛋白，具有78 kDa的表觀分子量。此外， GP2在腸的刷狀邊緣細(xì)胞(brush-border cell)中被檢測到，并作為溶酶體或胰 液中的游離的、未結(jié)合膜的肽的成分。由于GP2組成了全部膜蛋白的30-45。/。， 因此它是酶原粒膜的主要成分。GP2與酶原粒分泌的其它胰蛋白(例如微管成 束蛋白(syncollin)、凝集素ZG16p、小突觸泡蛋白2和其他硫酸基質(zhì)蛋白聚 糖) 一起是顆粒膜的脂筏(lipidraft)的成分，而微管成束蛋白與GP2發(fā)生互 相作用。這些復(fù)合物(還包括其他蛋白質(zhì)，例如ZG46p)形成了部分膜性的基 底(submembranous matrix )。
GP2通過磷脂酰肌醇錨狀物結(jié)合到胰腺腺泡細(xì)胞的酶原粒膜上，并可以通 過例如蠟狀芽孢桿菌(凡ce"w)的磷脂酶C而被除去。酶原粒是胰腺腺泡 細(xì)胞內(nèi)的消化酶(例如，淀粉酶)的儲(chǔ)存器。在腺泡細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)刺激或激素 刺激之后，消化酶被分泌進(jìn)入胰管。GP2不僅僅被局限在酶原粒膜上，還在高 爾基體和胰液腺泡的管腔內(nèi)被結(jié)合到其基質(zhì)上。此外，GP2還被發(fā)現(xiàn)是溶酶體的成分從而參與了細(xì)胞內(nèi)吞作用。
在胰分泌物的刺激過程中，GP2被轉(zhuǎn)移到腺泡細(xì)胞的頂端膜表面，被切割
并釋放進(jìn)入腺泡的管腔中。鑒于胰液中有相當(dāng)多的GP2，猜想存在另一種能分 泌GP2的細(xì)胞池(cellular pool )。與消化酶通過蛋白質(zhì)水解而在腸內(nèi)被活化相 反的是，GP2已經(jīng)通過切割在腺泡細(xì)胞內(nèi)被修飾。據(jù)推測，GP2在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生 順序的蛋白水解對(duì)其功能具有影響。
急性胰腺炎和慢性胰腺炎中增加的GP2血清水平引起了對(duì)GP2作為這種 實(shí)體的血清診斷學(xué)的標(biāo)記物是否合適的討論。在大鼠模型中，已經(jīng)證實(shí)GP2 的血清濃度與炎癥性腸病的嚴(yán)重程度有關(guān)。
對(duì)于人類細(xì)胞系，這種關(guān)系還沒有得到毫無疑問的確定；可以通過自身抗 體檢測到的GP2水平表現(xiàn)出極大的個(gè)體差異性。
盡管有這種不足，大量的用來開發(fā)診斷方法的途徑依賴于針對(duì)抗GP2的 抗體的產(chǎn)生和檢測，從而通過抗體反應(yīng)來確定炎癥性腸病的嚴(yán)重程度。
CD和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC )代表了炎癥性腸病中最重要 的兩種。它們的特征在于慢性的、使消化系統(tǒng)內(nèi)破壞組織的炎癥過程復(fù)發(fā)。迄 今為止，仍然不清楚CD和UC的病因?qū)W和發(fā)病機(jī)理。
雖然UC炎癥主要出現(xiàn)在結(jié)腸和直腸的粘膜和粘膜下層，而CD是以整個(gè) 胃腸道的壁穿透的肉芽腫性的炎癥過程為特征。
基因和環(huán)境因素在IBD的發(fā)展中似乎發(fā)揮了關(guān)鍵作用。在一些分組 (cohort)中認(rèn)為NOD2基因中的突變和CD表觀之間的聯(lián)系是必然確定的。 類似地，認(rèn)為與CD在回腸末端中的表觀有明確的關(guān)聯(lián)。到目前為止，還沒有 在任何的治療方法(包括抗肺瘤壞死因子(anti-TNF)治療)中建立遺傳標(biāo)記 和治療過程之間的關(guān)系。
CD在歐洲的發(fā)生率約為每100000人每年5.6人。CD在德國的患病率已 確定為1/500至1/800。
平均來說，CD的首發(fā)癥狀(first symptoms)相對(duì)早地發(fā)生在30歲。接 下來，由于相應(yīng)的社會(huì)-經(jīng)濟(jì)學(xué)效應(yīng)，CD患者在其工作壽命內(nèi)受到影響。以與 UC相似的方式,隨著克羅恩氏結(jié)腸炎(Crohn's colitis )和病程持續(xù)多年，CD 患者發(fā)生癌癥的幾率增加。臨床現(xiàn)象包括腹痛、腹瀉、吸收不良、膿肺、瘺(fistula )、膽結(jié)石并發(fā)癥、
腎結(jié)石以及與之有關(guān)的并發(fā)癥。
CD患者可以伴隨胰腺炎出現(xiàn)出許多腸外表現(xiàn)(總計(jì)3.5%),在CD患者 中這是相對(duì)罕見的事件。然而，能在8-17%的患者中觀察到不具有急性腸炎癥 狀的高淀粉酶血癥(hyperamylasemia)禾口高月旨肪酶血癥(hyperlipasemia),這 顯示了無癥狀胰腺炎(silent pancreatitis )發(fā)病率的增力。。胰管中發(fā)生的改變以 及對(duì)胰腺功能的限制已經(jīng)在一些病例中進(jìn)行了描述。高淀粉酶血癥和高脂肪酶 血癥的水平與CD活性有關(guān)。在4.6%的CD的患者的膽管和胰管內(nèi)發(fā)現(xiàn)，同 時(shí)發(fā)生了與原發(fā)性硬化性膽管炎(primary sclerosing cholangitis )患者相似方式 的改變。然而，CD患者中的慢性胰腺炎通常與UC患者中的慢性胰腺炎不同， 其中，膽管的參與、體重的減少以及胰管狹窄(pancreatic duct stenoses )更常 見于UC患者中的慢性胰腺炎。已對(duì)與CD有關(guān)的特發(fā)性慢性胰腺炎的存在進(jìn) 行了討論。和與UC有關(guān)的慢性胰腺炎相反的是，CD患者的腸內(nèi)癥狀經(jīng)常表 現(xiàn)先于胰腺癥狀的發(fā)現(xiàn)。常見于CD的胰腺外分泌機(jī)能不全(Exocrine pancreatic insufficiency )能被簡單地歸因于與薄壁組織(parenchyma )中密集的炎性浸潤 (inflammatory infiltrates )有關(guān)的顯著腺泡變性。
雖然多種研究已經(jīng)指出由于5-氨基水楊酸這種活性物質(zhì)僅達(dá)到了有限的 效果或完全沒有效果而存在有顯著不足，但仍推薦使用5-氨基水楊酸進(jìn)行給藥 治療。然而從獲得的數(shù)據(jù)考慮，當(dāng)不發(fā)生效力的情況下及時(shí)地改變治療時(shí)，其 在患者中使發(fā)病的嚴(yán)重程度減輕至適中的使用似乎是有效的。在不發(fā)生并發(fā)癥 的嚴(yán)重發(fā)病的情況下，應(yīng)該考慮給用等量的潑尼松龍(prednisolone )。如果發(fā) 作頻繁(2 2次/年)，可以添加用硫唑噪呤或6-巰基。票呤進(jìn)行給藥。
在德國，CD患者的全部花費(fèi)估計(jì)為每年每病例20000歐元。在德國，CD 患者所花費(fèi)的開銷(包括間接費(fèi)用)估計(jì)為2兆(billion)歐元，而在美國對(duì) 兩種IBD的社會(huì)-經(jīng)濟(jì)花費(fèi)報(bào)道為2.6兆(billion)美元。
抗腫瘤壞死因子a制劑對(duì)CD (包括慢性病的緩和)是有效的。然而，這 些制劑由于它們的副作用仍然是不適宜的，這就是為什么這些制劑僅可能使用 為后備藥(reserve medications)的原因，這取決于臨床表現(xiàn)。只有患有腸外并 發(fā)癥的活躍性脊推關(guān)節(jié)病的CD患者的兩種臨床現(xiàn)象反應(yīng)他們似乎由抗胂瘤壞死因子a療法受益。
清楚的診斷是用于充分治療和隨訪這些患者所必需的。然而，這存在許多
可觀的不足，由于到目前為止還沒有毫無疑義的測試因此必須對(duì)CD的進(jìn)行臨 床診斷，該臨床診斷涉及使用對(duì)回結(jié)腸鏡檢段(ileocolonoscopic segmental)進(jìn) 行活檢作為必要組成，后者也是進(jìn)行選擇性的腸道手術(shù)所需要的。然而，這在 病程中的任何急性癥狀綜合癥中，或在進(jìn)行新的抗炎癥治療之前不是完全必需 的。在診斷基本診斷過程中，在每位病人中應(yīng)該進(jìn)行上部內(nèi)窺鏡檢查診斷。
高度復(fù)雜且相對(duì)成本密集型的粘膜活檢的組織學(xué)研究組成了診斷范圍的 另一個(gè)重要的元素。為此目的，而對(duì)活檢進(jìn)行收集，特別是來自具有宏觀顯著 性和不顯著的區(qū)域。然而，為了有效地利用組織病理學(xué)差異診斷，需要收集來 自從回腸末端和上部胃腸道的整個(gè)結(jié)腸(包括直腸)中至少五個(gè)不同的解剖學(xué) 部分的活斗全。
使用作為成像法的經(jīng)腹超聲作為靈敏度方法來檢測腸壁以及CD患者中 發(fā)生膿腫、瘺和狹窄的炎癥變化。在腸系膜動(dòng)脈和腸壁中可以4企測到的血流的 增加與急性炎癥的存在相關(guān)。已經(jīng)認(rèn)識(shí)到小骨盆的直腸內(nèi)超聲和磁共振體層攝 影術(shù)(magnetic resonance tomography, MRT )是對(duì)膽門直腸瘺和膿腫進(jìn)行診斷 和分類的具有相同靈敏度的方法。
由于不存在毫無疑義的測試，因此收集了大量的CD的實(shí)驗(yàn)室診斷學(xué)參 數(shù)。對(duì)C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein, CRP)、血小板、血紅蛋白(Hb) /紅 細(xì)胞壓積和白細(xì)胞的測定代表了基礎(chǔ)性診斷。其他的參數(shù)，例如另外還使用了 血球分類計(jì)數(shù)(differential blood count)和白蛋白。在急性時(shí)相CD中,許多 患者中的上述參數(shù)(例如CPR 、白細(xì)胞數(shù)目和急性時(shí)相蛋白(acute-phase proteins ))增加，因而這些參數(shù)在隨后(follow up )的病程中是被推薦使用的。
在急性時(shí)相中，腸道通透性、糞便中a-l-抗胰蛋白酶的清除率、和鈣衛(wèi)蛋 白分泌升高。
然而，許多臨床和組織病理學(xué)數(shù)據(jù)無法在CD和UC之間做出明顯區(qū)分。 這一不足經(jīng)常導(dǎo)致做出不確定性大腸炎(indeterminate colitis, IC )的結(jié)論。 此外，腸道感染和功能性疾病可能表現(xiàn)出相似的癥狀，因此更加難以做出鑒別 診斷。在10-15%的舊D患者中，由活檢數(shù)據(jù)而將其劃分為UC或CD是極度困難的，并且這也是由于在結(jié)腸區(qū)域的臨床癥狀上存在一定的重疊所導(dǎo)致的。 其后的外科手術(shù)，似乎IC的患者比UC患者更易于患有長期的并發(fā)癥和吻合
口功能不全(anastomotic insufficiency )。然而，預(yù)后時(shí)期中的IC患者是否將
術(shù)時(shí)間具有重大影響。在疾病病程過程中稍晚的時(shí)間點(diǎn)處，通常僅能基于額外 的臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行確定。例如，CD和UC之間的分化是確定能否在患者內(nèi)進(jìn)行 回腸膽管嚢吻合術(shù)(ileoanal pouch anastomosis )的基礎(chǔ)。在患有顯著的結(jié)腸感 染(克羅恩氏結(jié)腸炎)的患者中對(duì)這種外科手術(shù)幾乎不具有指示性，而UC對(duì) 該方法具有更高的指示性。CD患者的吻合口功能不全幾率要高得多，因此任 何的外科手術(shù)都需要進(jìn)行全面的考慮。
許多與內(nèi)源性抗原和食物抗原反應(yīng)的抗體已經(jīng)在對(duì)IBD診斷進(jìn)行區(qū)分的 內(nèi)容中進(jìn)行了描述。這些抗體的缺點(diǎn)在于，它們似乎不起到任何的致病性作用 并不能反映疾病的活性。盡管如此，血清抗體用作診斷的關(guān)鍵輔助手段，并反 映了治療決定的基礎(chǔ)，特別是對(duì)于不確定性腸炎的情況。
針對(duì)細(xì)胞骨架蛋白的自身抗體已經(jīng)在通過活檢確定的CD患者中得到了 描述(馬耶特等人(Mayet et al., 1990))。已經(jīng)在其他的蛋白中發(fā)現(xiàn)了針對(duì)細(xì) 胞角蛋白18、肌動(dòng)蛋白、波形蛋白、結(jié)蛋白和原肌球蛋白的自身抗體。雖然 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞角蛋白18自身抗體與疾病的活性相關(guān)，但是可能由于它們的低 特異性，它們在IBD常規(guī)診斷中是不被允許的。
對(duì)于CD患者，已經(jīng)將針對(duì)胰腺外分泌組織的自身抗體(PAK)和針對(duì)來 自釀酒酵母(6bcc/w7"w少ce,s cerev^/ae)的甘露聚糖的抗體(ASCA (抗面良酒 酵母抗體))識(shí)別為病癥(斯多克等人，1987 (St6ckeretal" 1987 );梅恩等人， 1988 ( Main etal., 1988 ))。在UC患者中發(fā)現(xiàn)了針對(duì)人中性粒細(xì)胞的自身抗體 (ANCA (抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體))和杯狀細(xì)胞(BAK)。
對(duì)PAK、 ANCA和ASCA的測定被認(rèn)為在診斷IC中是有用的。
然而，即使在今天，由于引起免疫反應(yīng)的自身抗原是未知的，針對(duì)胰腺組 織、杯狀細(xì)胞和人中性粒細(xì)胞的IBD特異性自身抗體仍然利用免疫熒光技術(shù) (IFT)來測定。因此，通過使用上述技術(shù)，已經(jīng)在27-39。/。的在CD患者內(nèi)發(fā) 現(xiàn)了針對(duì)胰腺抗原的自身抗體。超過半數(shù)的患有腸外并發(fā)癥的CD患者(68%)可能具有PAK。然而，在實(shí)踐中，發(fā)現(xiàn)該技術(shù)由于不能被自動(dòng)化從而成本密 集且耗時(shí)而存在不足。
相反地，在酶免疫.分析法(enzyme immunoassay, EIA)中對(duì)同樣特異性 地用于CD的ASCA進(jìn)行檢測的水平增加，這是由于該方法在評(píng)價(jià)上具有較少 的主觀性并且可以被自動(dòng)化。
現(xiàn)在，認(rèn)為分離抗體的測定太不敏感而不能用于cd的血清學(xué)診斷。與不 同抗體特異性進(jìn)行結(jié)合可以高度地改善ibd鑒別診斷的診斷靈敏度或特異性 并且允許對(duì)ic進(jìn)行預(yù)后。
通常的技術(shù)平臺(tái)(例如EIA)在參數(shù)的結(jié)合上格外地具有優(yōu)勢。但是，這 樣的一個(gè)前提是要知道被不同物種的胰腺組織切片的PAK特異性識(shí)別的PAK 自身抗原。
過去發(fā)現(xiàn)了各種方法來識(shí)別CD沖的自身抗原，并且由于以上提及的具有 相對(duì)高靈敏度的PAK，對(duì)此的關(guān)注集中在胰腺抗原上。已經(jīng)通過免疫熒光技 術(shù)(IFT)的方法使用不同物種(人、大鼠、猴子)的組織切片對(duì)PAK進(jìn)行了 檢測。從種系發(fā)生的方面考慮，反映了由PAK識(shí)別的保守表位(conserved epitopes )。弗里克(Fricke)等人已經(jīng)描述了由多個(gè)亞基組成的分子量(m.w.) 大于800 l(Da的蛋白復(fù)合體，該蛋白復(fù)合體與PAK進(jìn)行反應(yīng)(弗里克等人， 1999).然而，作者既不能進(jìn)行測序以識(shí)別相應(yīng)的蛋白質(zhì)也不能識(shí)別免疫印跡 中與PAK反應(yīng)的m.w.為16kDa、 18kDa、 19kDa、 24 kDa、 27 kDa、 29 kDa、 31 kDa和34 kDa的亞基。已經(jīng)假定由PAK識(shí)別的蛋白質(zhì)應(yīng)該是包括大量亞群 的大蛋白復(fù)合體?；谑褂昧烁鞣N不同的糖蛋白的抑制實(shí)驗(yàn)，已經(jīng)排除了 PAK 與公認(rèn)的自身抗原的糖鏈(carbohydrate chains )的反應(yīng)。
賽博(Seibold)等人已經(jīng)描述了 PAK與提純自胰液的m.w.為106Da(1000 kDa)以上的大分子抗原的反應(yīng)性，當(dāng)用胰蛋白進(jìn)行處理時(shí)該大分子抗原喪失 其PAK反應(yīng)性。在使用了各種不同的胰腺蛋白(例如淀粉酶、脂肪酶、磷脂 酶A和磷脂酶C、腸激酶、羧肽酶A和羧肽酶B、糜蛋白酶A和糜蛋白酶B、 糜蛋白酶原、彈性蛋白酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶抑制劑、乳鐵蛋白和調(diào)血管激 素(callecrein)的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)中沒有^企測到與PAK的反應(yīng) 性。雖然根據(jù)許多作者所稱，GP2的水平和IBD的嚴(yán)重程度是相關(guān)的，但其 在生理學(xué)上的因果關(guān)系是未知的。正如在敲除基因的小鼠模型中所證實(shí)的， GP2的缺失既不是胰腺外分泌進(jìn)行分泌所必需的，也不是酶原粒的形成所必需 的。此外，對(duì)GP2的兩種已知亞型的生理功能也不清楚(福岡(Fukuoca， 2000 ))。 除了長度為380個(gè)氨基酸的短亞型p-GP2之外，還存在有長度為530個(gè)氨基 酸的a-GP2。在人胰腺中均能檢測到肽的這兩種亞型，在其他亞型中，小卩-GP2 亞型存在的效價(jià)比大a-GP2要大得多。而且，對(duì)這兩種型在胰腺組織中的轉(zhuǎn) 錄進(jìn)行的4企測反應(yīng)了 (3-GP2與a-GP2相比具有較強(qiáng)的表達(dá)。
還不清楚不同亞型的作用。據(jù)說具有與大a-GP2亞型高度相似的序列的 肽是導(dǎo)致胰腺腫瘤形成的原理。想要將作為分析物和標(biāo)記物的對(duì)GP2的抗體 用于診斷胰腺癌，而將肽及其核酸序列用于癌性胰腺病的免疫治療中(WO 01/94409)。發(fā)現(xiàn)了對(duì)小P-GP2亞型的抗體作為胰腺炎的標(biāo)記物的用途(WO 96/17873 )。據(jù)說f3-GP2濃度的增加指示了該疾病的發(fā)生。
已經(jīng)對(duì)必要的(仍然待發(fā)現(xiàn))胰腺的自身抗體的鑒別做出了詳細(xì)的參考以 闡明自身免疫性過程在CD發(fā)病機(jī)理中的地位，并通過適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)室診斷來支 持對(duì)不清楚的IBD病例進(jìn)行區(qū)分。
從使用隨機(jī)嗟菌體展示文庫(randomized phage display libraries )來得到肽 的現(xiàn)有技術(shù)中已知悉所作出的努力，所述肽已被用于對(duì)CD特異性抗體進(jìn)行4全 測。檢測到四種不同的九聚物，這些九聚物在用于EIA (酶免疫測定)時(shí)，對(duì) 56.5%的CD患者的血清給出陽性檢出。在此病例中對(duì)照組(UC、十二指腸潰 瘍、健康)不產(chǎn)生應(yīng)答或僅產(chǎn)生6%的應(yīng)答。然而，無法從已知的九聚物的肽 序列獲知對(duì)天然的CD自身抗原的結(jié)論。
但是，到目前為止也沒有成功地鑒別相應(yīng)的胰腺抗原(博蘇伊特，2006)。 因此，還不存在用于診斷克羅恩氏病和慢性胰腺炎并將后者與潰瘍性結(jié)腸炎進(jìn) 行區(qū)分的非侵入式、特異性的、定量的、迅速、簡單和廉價(jià)可行的檢測分析方 法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決了上述問題?；贕P2作為CD和相關(guān)的慢性胰腺炎的自身 抗原的令人驚訝的表征，開發(fā)了根據(jù)權(quán)利要求所述的使用GP2來診斷或治療控制IBD的方法，從從屬權(quán)利要求可以推知本發(fā)明的有利的實(shí)施方式。
因此，本發(fā)明涉及一種在自身免疫性疾病的預(yù)防、診斷、治療或病后調(diào)護(hù)
(aftercare)中，通過與GP2、免疫反應(yīng)性序列或其類似物(特別是根據(jù)序列 識(shí)別號(hào)1 ( SEQ ID NO. 1 ))的免疫反應(yīng)對(duì)來自糞便和/或體液(特別是血液和/ 或血清)的抗體進(jìn)行檢測的方法，所迷SEQIDNO. 1為
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根據(jù)本發(fā)明，所述體液的定義還包括人的血液、血清、尿液、純胰液或十二指 腸液。
現(xiàn)有技術(shù)沒有考慮也沒有提及在對(duì)CD或慢性胰腺炎的血清學(xué)診斷中，對(duì) GP2的自身抗體的確定或其作為固相抗原用于EL.ISA的用途。
本發(fā)明做出了 GP2 (特別是與SEQ ID NO. 1 —致的序列)或編碼相同序 列的核苷酸能用于檢測和治療自身免疫性疾病(特別是炎癥性腸病，更優(yōu)選為 克羅恩氏病、慢性胰腺炎和潰瘍性結(jié)腸炎)的令人驚訝的教導(dǎo)。
在另一方面，本發(fā)明涉及一種方法，其中檢測到人免疫球蛋白A (IgA)、 IgM和/或IgG的抗體自身免疫性疾病。根據(jù)本發(fā)明的方法的一種優(yōu)選的實(shí)施方式.中，GP2的來源為人類、動(dòng)物、
重組體或合成物質(zhì)。GP2表示了高度保守的肽，因此只要其序列與根據(jù)本發(fā)明 的序列在功能上相似，任意來源的GP2能被有利地用來進(jìn)行檢測。作為抗原 的GP2和自身抗體之間的高結(jié)合親和性被保持。，
根據(jù)本發(fā)明的方法的另 一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，在免疫測定中對(duì)自身抗體 進(jìn)行檢測，優(yōu)選具有反應(yīng)物與標(biāo)記物質(zhì)直接或間接的結(jié)合。這使本發(fā)明對(duì)不同 的實(shí)驗(yàn)室及其實(shí)驗(yàn)診斷設(shè)備的潛力和要求具有方法的靈活的適應(yīng)性。
在一種有利的實(shí)施方式中，在免疫測定中對(duì)IBD特異性抗體進(jìn)行;險(xiǎn)測， 其中，所述抗體溶解于液相中而存在，優(yōu)選在本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)的緩 沖溶液或未被稀釋的體液中被稀釋。根據(jù)本發(fā)明，使用糞便樣品來進(jìn)行檢測也 能有效果。
在另一種有利的實(shí)施方式中，所述免疫測定用來對(duì)抗體進(jìn)行檢測，預(yù)期在 所述抗體的端部進(jìn)行與SEQ ID NO. 1 —致的GP2抗原與固相的結(jié)合。隨著樣 品溶液的增加，包含其內(nèi)的患者的抗體與GP2抗原結(jié)合。隨后利用標(biāo)記試劑 對(duì)通過例如患者的血清或糞便獲得并與GP2結(jié)合的抗體進(jìn)行檢測和任選的定 量。該方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的"直接測定"，其中，抗原與固相結(jié)合。 因此，根據(jù)本發(fā)明該方法中通過使用根據(jù)公知的ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測 定)技術(shù)的標(biāo)記試劑能實(shí)現(xiàn)對(duì)抗體進(jìn)行檢測。因而根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)記包括酶催 化化學(xué)反應(yīng)，該化學(xué)反應(yīng)能通過光學(xué)方法(特別是通過生色底物(chromogenic substrates )、化學(xué)熒光法或熒光染料的手段)測得。
在另 一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，在放射性免疫測定(radioimmunoassays, RIA)中通過用弱放射性物質(zhì)的標(biāo)記來檢測所述自身抗體，其中，對(duì)所產(chǎn)生的 放射性進(jìn)行測量。
在本發(fā)明的另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，可溶的或固相結(jié)合的GP2分子被 用來與抗體結(jié)合。在第二反應(yīng)步驟中，使用了優(yōu)選選自由抗人類IgA、抗人類 IgM和/或抗人類IgG的抗體所組成的組中的抗人類免疫球蛋白，所述抗人類 免疫球蛋白優(yōu)選可檢測地對(duì)能與任意的常規(guī)的標(biāo)記酶(特別是發(fā)色底物和/或 化學(xué)熒光底物，優(yōu)選與辣根過氧化物酶、堿性確酸酶)進(jìn)行結(jié)合的兩種成分的 結(jié)合物進(jìn)行標(biāo)記。本實(shí)施方式的優(yōu)點(diǎn)在于，ELISA技術(shù)的使用通常在實(shí)驗(yàn)室設(shè)施條件下即可實(shí)現(xiàn)，從而根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行的檢測可以以成本有效的方式來進(jìn) 行。
在本發(fā)明的另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，與GP2結(jié)合的抗體與抗人類免疫 球蛋白反應(yīng)，所述抗人類免疫球蛋白優(yōu)選選自由抗人類IgA、抗人類IgM和/ 或抗人類IgG的抗體所組成的組，且可檢測地與異石危氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate， FITC )偶聯(lián)。與以上描述的ELISA非常相似地，F(xiàn)ITC技術(shù)代 表了在許多地方都可以利用的系統(tǒng)，并從而允許在實(shí)驗(yàn)室路線下順利而低成本 地建立本發(fā)明的一企測。
本發(fā)明還涉及用來治療炎癥性腸病的方法，該方法包括以下步驟
a) 提供其上偶聯(lián)有GP2的柱；
b) 在允許GP2有效地結(jié)合患者血漿內(nèi)的抗體的條件下，使所述患者的 血漿通過所述柱，從而將大量的抗體從所述患者的血漿中除去；以 及
c ) 使由此得到的血漿返回患者。
根據(jù)本發(fā)明的上述方法的優(yōu)選的實(shí)施方式中，與SEQ HDNO. 1 —致的GP2 對(duì)直接針對(duì)腸道組織的抗體進(jìn)行識(shí)別。該實(shí)施方式具有的有益效果是，無須頻 繁介入患者體內(nèi)(這會(huì)使患者產(chǎn)生壓力)而通過體液或糞便就能輕松實(shí)現(xiàn)對(duì) IBD的i貪斷。
本發(fā)明的另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，與SEQIDNO. 1 —致的GP2結(jié)合到 固體相上。能通過間隔物(spacer)將與SEQ ID NO. 1 —致的GP2結(jié)合到固 定相上?？梢允褂盟芯哂杏糜陂g隔物的適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)前提和功能前提的化學(xué)化 合物作為間隔物，只要它們不會(huì)以不利地影響與SEQ ID NO. 1 —致的GP2自 身抗體的結(jié)合的方式改變結(jié)合行為。
本發(fā)明的方法和用途允許對(duì)克羅恩氏病進(jìn)行診斷或治療控制，這是因?yàn)?GP2抗原(優(yōu)選與SEQ ID NO. 1 —致)通過與GP2、免疫反應(yīng)性序列或其類 似物的免疫反應(yīng)，意外地允許對(duì)來自糞便和/或體液的自身抗體進(jìn)行^f全測，不 需要使用動(dòng)物或人組織的組織切片即可進(jìn)行所述免疫反應(yīng)。
在上述檢測方法的一種優(yōu)選的變體中，優(yōu)選利用反應(yīng)物與標(biāo)記物質(zhì)的直接 或間接結(jié)合來對(duì)所述自身抗體進(jìn)行檢測。根據(jù)本發(fā)明，還優(yōu)選在固相上進(jìn)行上述的檢測方法，在該情況下，肽的儲(chǔ) 存能力得到有利地提高，這是GP2抗原與固相之間令人驚訝的穩(wěn)定的連接所 導(dǎo)致的。
本發(fā)明的目的還在于與SEQ ID NO. 1 —致的GP2分子在生產(chǎn)用于自身免 疫性疾病的預(yù)防、診斷、治療和/或病后調(diào)護(hù)的藥物中的用途。在實(shí)踐中，根 據(jù)本發(fā)明的用途具有的有益效果是，許多情況下可以省去更多的基于例如活 檢、實(shí)驗(yàn)室診斷和臨床介入的復(fù)雜且不可靠的過程，或者鑒于前述檢測，上述 測量能在執(zhí)行過程中被極大地最優(yōu)化。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，自身免疫性疾病為選自由炎癥性腸病 (IBD)和/或自身免疫性肝病所組成的組中，能利用GP2自身抗原有利地以
在本發(fā)明的方法的另一種更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述炎癥性腸病為克羅恩 氏病、慢性胰腺炎和/或潰瘍性結(jié)腸炎。迄今為止，僅能以有限的成功率或付 出極大努力才能上述疾病進(jìn)行的檢測或區(qū)分?，F(xiàn)在，上述優(yōu)選的實(shí)施方式能夠 容易地進(jìn)行對(duì)克羅恩氏病和慢性胰腺炎的檢測，甚至通過鑒別診斷的手段與潰 瘍性結(jié)腸炎進(jìn)行區(qū)分。
具體實(shí)施例方式
克羅恩氏病屬于慢性炎癥性腸病組。據(jù)推測，它是可能出現(xiàn)于整個(gè)胃腸道 (即,從口腔下至肛門)的自身攻擊性的(autoaggressive )、慢性肉芽腫性炎 癥。感染主要位于下部小腸(回腸末端，感染率約40%)和結(jié)腸，在食道和口 腔中鮮少發(fā)生?？肆_恩氏病以腸粘膜的不連續(xù)的、分段感染(所謂的"跳躍性 病灶(skip lesions )，，)'為特征，即，該疾病可以同時(shí)存在于被健康部分分隔的 多個(gè)腸道部分中。該疾病的其他名字為局限性腸炎、回腸末端炎、局限性小腸 結(jié)腸炎和硬化性慢性腸炎(sclerosing chronic enteritis )，或縮寫為CD (克羅恩 氏病)和IBD (炎癥性腸病)的通用術(shù)語。因此，克羅恩氏病在本發(fā)明中的意 思是指宏觀地以下列變化為特征的任意的病況
花園膠水管現(xiàn)象(Garden hose phenomenon):由于纖維化導(dǎo)致的分段狹窄。
鵝卵石現(xiàn)象(Cobble stone phenomenon):發(fā)炎的粘膜具有交替的深度潰瘍從而產(chǎn)生像鵝卵石的外觀。
炎癥性礫巖狀腫瘤許多腸道部分發(fā)生彼此粘附。
從組織病理學(xué)上說，這主要是在發(fā)炎的腸道組織的活檢中被識(shí)別的淋巴細(xì) 胞(嗜酸性)、粒細(xì)胞和組織細(xì)胞的積累造成。在其周圍的淋巴結(jié)的大小通常
會(huì)增加。經(jīng)常會(huì)形成肉芽腫，該肉芽腫可以被分化為兩種類型上皮樣細(xì)胞肉 芽胂和微肉芽腫(microgranulomas )(更小且沒有中心性壞死)。
然而，本發(fā)明所指的克羅恩氏病還以診斷的方式為特征。在此情況下，本 發(fā)明所指的克羅恩氏病是可以檢測到至少一種的以下特征的病況
闌尾炎在右下腹處迅速地發(fā)生痛感。在直腸和腋窩之間測得的溫度差
通?！祌c。
憩室炎位于下腹部(通常在左側(cè))的可觸知的腫塊(palpable resistance )、疼痛。
耶爾森氏菌病從糞便或活檢材料檢測到病原體，抗體效價(jià)提高。
腸結(jié)核目前在中歐地區(qū)非常罕見。腸結(jié)核通常具有肺結(jié)核。在活檢材
料中發(fā)現(xiàn)"干酪狀的"上皮樣細(xì)胞肉芽腫。
任何其他的擴(kuò)散傳染性結(jié)腸炎(沙門氏菌腸病、假膜性結(jié)腸炎等) 本發(fā)明所指的胰腺炎是指胰腺的炎癥，該炎癥可以為急性的或者具有慢性病程。
胰腺炎通常由胰酶在器官內(nèi)的活化所引發(fā)。這些酶的作用是消化蛋白質(zhì)和 脂肪從而引起了對(duì)該器官的自身消化。自身消化導(dǎo)致了胰腺的炎癥。在嚴(yán)重的 情況下，可能發(fā)生出血、嚴(yán)重的組織損傷、感染和嚢腫。發(fā)炎的腺體(gland) 可能導(dǎo)致酶進(jìn)入血流進(jìn)而到達(dá)肺、心臟和腎臟，從而可能引起進(jìn)一步的損傷。 當(dāng)胰腺突然發(fā)炎時(shí)產(chǎn)生急性胰腺炎，但是會(huì)恢復(fù)。 一些患者會(huì)多次遭受急性胰 腺炎，但每次都能完全痊愈。急性胰腺炎發(fā)生得突然并且可以是嚴(yán)重的、對(duì)生 命產(chǎn)生威脅的疾病，它導(dǎo)致了大量的并發(fā)癥，但是患者通常能由急性胰腺炎恢 復(fù)。其發(fā)生概率約為每100000位居民中每年約有5-10個(gè)新生病例。
有兩種類型的病程
1、水肺性胰腺炎具有器官肺脹的溫和病程，并且在周圍的脂肪組織中 鮮少發(fā)生壞死。2、出血性壞死胰腺炎胰腺中發(fā)生大規(guī)模的壞死和出血并進(jìn)入周圍區(qū)域； 通常由于其暴發(fā)性癥狀而被稱為胰腺卒中(pancreatic apoplexy )。
當(dāng)使用增強(qiáng)造影劑的計(jì)算機(jī)X射線斷層術(shù)時(shí)，對(duì)胰腺的形態(tài)評(píng)價(jià)，特別 是對(duì)水腫性胰腺炎和壞死性胰腺炎之間進(jìn)行區(qū)別是最成功的。發(fā)現(xiàn)巴爾薩澤評(píng) 分(Balthazar socre ) (0-10分)在嚴(yán)重程度分類中是有利的。
急性胰腺炎具有多種病因。最普遍的是膽石在膽管通向十二指腸的管口 (也是胰管的管口 )發(fā)生臨時(shí)性阻塞或長時(shí)間阻塞(約45%的急性胰腺炎)。 具有相似普遍程度的原因是長期的酒精濫用(約35%)。在約15%的感染個(gè)體 中，沒有檢測到獨(dú)特的觸發(fā)引資，而且這些病例被稱為特發(fā)性起源。此外，存 在例如以下的更罕見的原因
藥物(例如，天門冬酰胺酶、夢u唑噤p令(azathioprin )、呋塞米(furosemide )、 糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids )、 抗生素(四環(huán)素類、磺胺曱嗜'唑 (sulfamethoxazole )、 曱氧千咬(trimethoprim ))、鎮(zhèn)痙劑(2-丙基戊酸鈉、卡 馬西平(carbamazepine )))、異丙酉分(propofol)等的副4乍用。
傳染病，例如腮腺炎、柯薩奇病毒、肝炎、HIV、巨細(xì)胞病毒
升高的血鈣值，例如，在曱狀旁腺功能亢進(jìn)下
劇烈升高的血脂(甘油三酸酯)
經(jīng)內(nèi)鏡逆行胰膽管造影術(shù)(ERCP)中由醫(yī)生治療引起的 遺傳嚢性纖維化
開始時(shí)，急性胰腺炎由位于(整體偏左)的上腹部(胃外區(qū))處的疼痛而 表現(xiàn)出來，該疼痛向胸部發(fā)射并在數(shù)天后蔓延。該疼痛通常是劇烈并有時(shí)候持 續(xù)很長時(shí)間。該疼痛可以是突然而集中的，或始于輕度疼痛，但隨著食物的攝 入這種輕度疼痛將加重(這是合成用于消化食物的胰酶過程中對(duì)胰腺的刺激所 造成的)。腹部可以發(fā)生腫脹并高度敏感。腹部對(duì)觸摸的疼痛和由腹中積氣和 (中度)保衛(wèi)(guarding )造成的被稱為橡皮肚(rubber abdomen )在體格檢查 中被表征。相似地，胸推的下部區(qū)域也能產(chǎn)生疼痛。開始的時(shí)候，這種疼痛與 輕度的腰痛類似，但是隨后越來越發(fā)展為背部向腹側(cè)的胰腺的頂部區(qū)域"被穿 刺"的感覺。
患有急性胰腺炎的患者通常看起來病得很嚴(yán)重并且實(shí)際上具有生病的感覺。其它的癥狀為，例如，惡心、嘔吐、便秘、發(fā)燒、脈搏加速。在嚴(yán)重病例
中，還出現(xiàn)黃疽(黃疽)(jaundice (icterus)(在膽管發(fā)生阻塞的情況下)，腹 部水腫(腹水)(門靜脈系統(tǒng)發(fā)生阻塞的情況下)、胸腔積液、休克和膿毒癥跡 象。
在實(shí)驗(yàn)室診斷中，檢測到增加的白細(xì)胞計(jì)數(shù)(白細(xì)胞增多)和胰酶(例如， 胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶)濃度的增加。而且，血液中的4丐、鎂、鈉、鉀、 碳酸氫鹽、糖或脂肪的值可以升高。
約20%的急性胰腺炎病例是嚴(yán)重的?；颊呖赡馨l(fā)生脫水并發(fā)生低血壓。有 時(shí)候發(fā)生心力衰竭、肺衰竭或腎衰竭。最嚴(yán)重的急性胰腺炎導(dǎo)致出血、休克甚 至有時(shí)候?qū)е滤劳觥?br> 根據(jù)現(xiàn)行的亞特蘭大分類(Atlanta classification )，對(duì)溫和急性胰腺炎和嚴(yán) 重急性胰腺炎做出了分類。
已廢棄的分類將期分為水肺形式(早期)、具有局部或整體出血的出血性 形式和急性壞死性形式。
慢性胰腺炎具有多種病因，但是它們中的70-80%可以被歸因于長期的酒 精濫用。比起女性，慢性胰腺炎更普遍地發(fā)生在男性中，并出現(xiàn)于30-40歲之 間。如果炎癥源頭沒有被消除或者輸出管受到損害，慢性胰腺炎還可以由急性 炎癥所導(dǎo)致。
一些慢性胰腺炎具有遺傳病因。它們建立在由胰島素形成的酶的異常性的 基礎(chǔ)上，并導(dǎo)致了組織損傷。其它形式的疾病是由諸如吸煙等外因造成的。
在胰腺炎的早期階段，內(nèi)科醫(yī)生通常無法確定這是急性形式或慢性形式 的。它們的癥狀可以是相同的。
慢性胰腺炎通常引起長期的疼痛。在一些慢性胰腺炎的病例中，隨著疾病 的發(fā)展疼痛減輕。這也引起胰腺的功能減退，致使體重下降以及消化能力受到 干擾。不充分的消化和吸收導(dǎo)致脂肪和蛋白質(zhì)通過糞便被排泄。如果胰腺內(nèi)的 內(nèi)分泌細(xì)胞(胰島)受損，則會(huì)發(fā)生糖尿病。
難以對(duì)慢性胰腺炎進(jìn)行診斷；然而，可以使用一些高度發(fā)展的醫(yī)療技術(shù)。 胰腺功能驗(yàn)血可以協(xié)助確定胰腺是否能夠產(chǎn)生足夠的消化酶。然而，在實(shí)踐中 它們難以獲得認(rèn)可。也可以通過使用超聲波檢查法、內(nèi)窺鏡逆行胰膽管造影術(shù)(ERCP)和計(jì) 算機(jī)X射線斷層術(shù)來發(fā)現(xiàn)胰腺的異常。
在其中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了糖尿病和吸收障礙的慢性胰腺炎的更高級(jí)的階段，內(nèi)科 醫(yī)生還可以對(duì)血液、尿液和分別進(jìn)行試驗(yàn)以用于診斷。
服用含有胰酶的藥物來減少脂肪和蛋白質(zhì)的損失。這樣的結(jié)果將改善營養(yǎng)攝取 并且體重增加。有時(shí)候也可以開用胰島素或其他藥物處方以控制血糖水平。
在一些慢性胰腺炎的病例中，進(jìn)行手術(shù)來消除擴(kuò)大并充血的胰管處的緊張 從而減輕疼痛。
本發(fā)明的另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用GP2來檢測肝病、原發(fā)性硬化 性膽管炎和/或自身免疫性腸炎(enteritides )。出人意料地，GP2自身抗原不僅 適用于對(duì)IBD的特異性的檢測，還能用于各種肝病的檢測。
本發(fā)明中的膽管炎指的是肝內(nèi)膽管的炎癥。它可以由各種病因引起，包括 (其它事物中的)膽石阻塞膽管、狹窄、肺瘤或受到寄生蟲侵襲。它分為急性 化膿性膽管炎、非化膿性破壞性膽管炎和慢性硬化性膽管炎。
急性化膿性膽管炎急性膽管炎通常由細(xì)菌定植過程中的感染所發(fā)展而來 的，所述細(xì)菌主要為大腸桿菌(&c/ r/c/27》co/〖)、腸道3求菌(& teracoccwsJ 或克雷白氏桿菌(A:/e&zW/a)種。表現(xiàn)癥狀為上腹部的單側(cè)疼痛、發(fā)燒和寒顫。 此外，嚴(yán)重的化膿性膽管炎使休克病況、中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂和腎功能不全發(fā)生。 治療使用了內(nèi)窺鏡介入膽管，例如內(nèi)鏡逆行胰膽管造影術(shù)(endoscopic retrograde cholangiopancreatography ， ERCP ) 或經(jīng)皮肝穿月旦道引術(shù) (percutaneous transhepatic cholangiodrainage, PTCD ),這些方；去十灰復(fù)了月旦'汁i化 動(dòng)并通常具有抗菌作用。
非化膿性破壞性膽管炎這種形式的膽管炎表現(xiàn)為慢性病程，并且也被稱 為原發(fā)性膽汁性肝硬化。95%的受染個(gè)體為女性，并且發(fā)病高峰為40-60歲之 間。診斷方面，在絕大多數(shù)環(huán)中的血液中發(fā)現(xiàn)了抗線粒體抗體 (antimitochondrial antibodies, AMA)，因此推測是自身免疫性起源的。從臨 床上來說，患者以瘙癢、黃痘和血膽脂醇過多為特征。在進(jìn)一步的病程中，僅 能通過肝移植的手段來幫助患者。慢性硬化性膽管炎慢性硬化性膽管炎是最罕見的膽管炎癥，并被分為原 發(fā)性硬化形式和繼發(fā)性硬化形式。原發(fā)形式通過存在已有的基因排列(檢測到
與HLA-B8抗原關(guān)聯(lián))中的感染而發(fā)展產(chǎn)生，并且感染的男性是女性的兩倍。 在高達(dá)90%的病例中發(fā)現(xiàn)了 p-ANCA。繼發(fā)性形式是建立在已有的免疫缺陷綜 合癥的基礎(chǔ)上發(fā)展產(chǎn)生的。與破壞性膽管炎相似地，肝移植在最終階段是必要 的。
本發(fā)明中的自身免疫性腸炎涉及任意形式的腸炎，特別是由慢性炎癥性腸 病導(dǎo)致的。而且，本發(fā)明中的自身免疫性腸炎還涉及那些由沙門氏菌 (salmonella)、大腸桿菌、霍亂或斑滲傷寒病原體、或者由真菌、原生動(dòng)物、 有毒物質(zhì)所引起的，還包括任意的過敏性腸炎或任意形式的光化性腸炎 (actinic enteritis )、耶爾森氏菌腸炎或細(xì)菌性痢疾。
本發(fā)明的另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，GP2肽的至少60%,優(yōu)選70%，更 優(yōu)選80%,特別優(yōu)選90%的氨基酸序列與SEQ ID NO. 1的序列同源。也就是 說，本發(fā)明涉及全部這樣的肽，優(yōu)選所述肽的60%、 70%、 80%的，特別優(yōu)選 90%的序列與SEQ ID NO. 1的序列同源?？梢岳斫獾氖?，這些同源物可以通 過缺失、增加、取代、易位、倒位和/或插入而被修飾。更具體地說，這種修 飾涉及具有功能相似性的同源肽。當(dāng)與上述疾病有關(guān)的自身抗體發(fā)生互相反應(yīng) 時(shí)，本發(fā)明中的肽在功能上相似。
因此，本發(fā)明的目的在于公開了多肽和能以功能類似的方式使用的同源 物?？紤]到同源/功能相似，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的能通過增加、缺失或 取代進(jìn)行修飾而不需要實(shí)質(zhì)性地改變多肽。如果被修飾的氨基酸序列以基本相 似的方式實(shí)現(xiàn)了與SEQIDNO. 1的序列相同的功能，獲得相同的結(jié)果，則被 修飾的氨基酸并沒有發(fā)生實(shí)質(zhì)性的改變。
例如說，在功能上類似的肽可以為SEQ ID NO. 2:VPAIDLARVLDLGPITRRGAQSPGVMNGTPSTAGFLVAWPMVLLTVLLAWLF
或SEQ ID NO. 3:
DPCQNYTLLDEPFRSTENSAGSQGCDKNMSGWYRFVGEGGVRMSETCVQVHRCQTDAP
DLARVLDLGPITRRGAQSPGVMNGTPSTAGFLVAWPMVLLTVLLAWLF
或SEQ ID NO. 4
TAGFLVAWPMVLLTVLLAWLF
或SEQ ID NO. 5LVAWPMVLLTVLLAWLF
更具體地說，上述肽要求用來對(duì)以上描述的免疫疾病進(jìn)行診斷。上述序列
以與SEQ ID NO. 1基本相同的方式實(shí)現(xiàn)了基本相同的功能并且得到了基本相 同的結(jié)果。因此，它們包括在根據(jù)本發(fā)明所給出的教導(dǎo)中，即，GP2分子作為 藥物，特別是在炎癥性腸病的預(yù)防、診斷、治療和/或病后調(diào)護(hù)中的用途。
因此，氨基酸序列(即，本發(fā)明中的肽)可以包括大量的額外的氨基酸、
后者的表位的方式。因此，根據(jù)本發(fā)明的序列不限于與抗體表位相關(guān)的肽，還 指的是特異性地與自身抗體以能夠?qū)ρ装Y性腸病進(jìn)行診斷的方式進(jìn)行特異性 互相作用的分子及其所有片段。因此在優(yōu)選實(shí)施方式中，術(shù)語表位、肽和氨基 酸序列在本發(fā)明的內(nèi)容中意思相同。
各種不同的制備在功能上相似的肽的方法已經(jīng)在現(xiàn)有技術(shù)中公開了 。所設(shè) 計(jì)的肽以本發(fā)明的的肽為起始利用了根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)所包括的方法。比如 說， 一種產(chǎn)生在功能上相似的肽的方式已經(jīng)在美國國家科學(xué)院院刊1998， 10.31,9521, 12179-84(PNAS USA 1998， Oct. 13,9521, 12179-84 ); WO 99/6293 和/或WO 02/38592;上述教導(dǎo)與本發(fā)明的公開內(nèi)容結(jié)合于此。也就是說，當(dāng) 含有使用以上所提及的方法一一以本發(fā)明的肽為起始——而產(chǎn)生的肽的所有 的肽、肽的片段或結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的，且更具體地說，與病原性自身抗 體互相作用時(shí)，它們是根據(jù)本發(fā)明的肽。例如，這些自身抗體可以為竟?fàn)幮宰?身抗體活化受體。
在本發(fā)明的另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述分子包括選自由a-氨基羧酸及 其同質(zhì)低聚體(homooligomer )和異質(zhì)低聚體(heterooligomer )、 a,co-氨基羧 酸及其支鏈化的同質(zhì)低聚體或異質(zhì)低聚體、其它的氨基酸及其直鏈和支鏈的同 質(zhì)低聚體或異質(zhì)低聚體；氨基-寡烷氧基烷基胺(amino-oligoalkoxyalkylamines ); 順丁烯二酰亞胺歡酸(maleinimidocarboxylic acid) 衍生物；烷基胺低聚體；4-烷基苯基衍生物；4-寡烷氧基苯基 (4-oligoalkoxyphenyl)衍生物或4-寡烷氧基笨氧基(4-oligoalkoxyphenoxy ) 衍生物；4-寡烷基巰基苯基(4-oligoalkylmercaptophenyl)衍生物或4-寡烷基 巰基苯氧基(4_oligoalkylmercaptophenoxy )衍生物；4_寡烷基氨基苯基衍生物或4-寡烷基氨基苯氧基衍生物；(寡烷基千基)苯基((oligoalkylbenzyl)phenyl) 衍生物或4-(寡烷基千基)苯氧基衍生物，以及4-(寡烷氧基千基)苯基衍生物或 4-(寡烷氧基節(jié)基)苯氧基衍生物；三苯曱基(trityl)衍生物；芐氧基芳基 (benzyloxyaryl )衍生物或千氧基烷基衍生物；阽噸-3-基氧基烷基 (xanthen-3-yloxyalkyl)衍生物；(4-烷基苯基)鏈烷酸衍生物或co-(4-烷基苯氧 基)鏈烷酸衍生物；寡烷基苯氧基烷基衍生物或寡烷氧基苯氧基烷基衍生物； 氨基曱酸酯衍生物；胺；三烷基曱基硅烷(trialkylsilyl)衍生物或二烷基烷氧 基甲基硅烷(dialkylalkoxysilyl)衍生物；烷基或芳基衍生物，或它們的組合 所組成的組的連4姿體或間隔物。
在本發(fā)明的另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述GP2分子用作可溶的或結(jié)合 固相的抗原，以對(duì)糞便和/或體液(特別是血液和/或血清)中的自身抗原進(jìn)行 檢測，其中，發(fā)現(xiàn)與SEQIDNO. 1 —致的GP2分子特別有利。
在本發(fā)明的另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，根據(jù)本申請(qǐng)的序列，或者由該序列 產(chǎn)生的肽被固定化。更具體地說，固相結(jié)合的與SEQIDNO. 1 —致的GP2分 子與有機(jī)聚合物、無機(jī)聚合物、合成聚合物和/或混合的聚合物(優(yōu)選為瓊脂 糖、纖維素、硅膠、聚酰胺和/或聚乙烯醇)結(jié)合。固定化在本發(fā)明的內(nèi)容中 指的是將肽固定在特定載體上的各種不同的方法和技術(shù)，例如，根據(jù)WO 99/56126或WO 02/26292所記載的。例如，固定化可以起到穩(wěn)定肽的作用， 因此肽的活性不會(huì)降低或由于生物學(xué)接觸、化學(xué)接觸或物理接觸而受到不利的 修飾，特別是在儲(chǔ)存過程中或者以單批使用時(shí)。肽的固定化允許了在技術(shù)或臨 床常規(guī)條件下進(jìn)行重復(fù)使用；此外，樣品(優(yōu)選為血液成分)能以連續(xù)的方式 與至少一種根據(jù)本發(fā)明的肽進(jìn)行反應(yīng)。更具體地說，這可以通過各種不同的固
去，使得相應(yīng)分子(特別是所述的肽)的三維結(jié)構(gòu)(特別是介導(dǎo)與自身抗體的 互相作用的活性中心)不會(huì)被改變。有利的是，這種固定化的結(jié)果是沒有損失 對(duì)患者的自身抗體的特異性。在本發(fā)明的內(nèi)容中，可以使用三種基本方法來進(jìn) 行固定化
i)交聯(lián)法在交聯(lián)法中，肽被彼此固定而不會(huì)對(duì)其活性產(chǎn)生不利影響。 有利的是，這種交聯(lián)的結(jié)果使得它們不再是可溶的。ii) 與截體結(jié)合與載體的結(jié)合通過例如吸附、離子結(jié)合或共價(jià)結(jié)合而進(jìn)
行。這種結(jié)合也可以發(fā)生在微生物細(xì)胞內(nèi)，或脂質(zhì)體或其他膜狀、封閉或開放 的結(jié)構(gòu)中。有利的是，通過這種固定，肽不會(huì)受到不利的影響。比如，多次或 連續(xù)使用結(jié)合載體的肽能具有臨床診斷或治療的優(yōu)勢、
iii) 內(nèi)包法本發(fā)明內(nèi)容中的內(nèi)包法尤其發(fā)生于凝膠、原纖維或纖維形式 的半永久性膜中。有利的是，被封裝的肽以仍然能夠與自身抗體或其片段發(fā)生 相互作用的方式通過半水久性膜與周圍的樣品溶液分離?？梢允褂酶鞣N不同的 方法進(jìn)行固定化，例如吸附在惰性的或帶點(diǎn)的無機(jī)或有機(jī)載體上。例如，這種 載體可以為多孔凝膠、氧化鋁、膨潤土、瓊脂糖、淀粉、尼龍或聚丙烯酰胺。 通過物理約束力進(jìn)行的固定化通常涉及疏水性互相作用和離子結(jié)合。有利的 是，這種方法易于操作并且對(duì)肽的構(gòu)造幾乎不產(chǎn)生影響。有利地，在肽和載體 的帶點(diǎn)基團(tuán)之間的靜電約束力可以提高結(jié)合，例如通過離子交換劑，特別是塞 法戴克斯(Sephadex )。
另一種方法是與載體物質(zhì)共價(jià)結(jié)合。此外，載體可以具有與氨基酸側(cè)鏈形 成同極鍵的反應(yīng)基團(tuán)。肽上合適的基團(tuán)為羧基、羥基和硫基(sulfide gro叩)， 特別是賴氨酸的末端氨基。芳香基提供了重氮偶聯(lián)的可能性。微觀多孔的玻璃
基可以被溴化氰活化并且隨后與肽進(jìn)行偶聯(lián)。有利的是，大量的肽可以直接與 聚丙烯酰胺樹脂共價(jià)結(jié)合。三維網(wǎng)絡(luò)中的內(nèi)包法涉及將肽內(nèi)包進(jìn)離子移變凝膠 (ionotropicgel)或其他本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的結(jié)構(gòu)中。更具體地說，基質(zhì)的 孔是天然的因此肽被保持，允許了與靶分子的互相作用。在交聯(lián)法中，肽通過 與雙功能試劑進(jìn)行交聯(lián)而被轉(zhuǎn)化成聚合物團(tuán)聚體。這種結(jié)構(gòu)式凝膠狀的，易變 形且，特別適用于各種反應(yīng)。通過在交聯(lián)法中加入其它無活性成分(例如凝膠)， 能夠有力的改進(jìn)機(jī)械特性和結(jié)合特性。在微嚢化中，肽的反應(yīng)量受到了膜的限 制。例如，微嚢化可以界面聚合的形式來進(jìn)行。由于微嚢化過程進(jìn)行了固定化， 被固定的肽變得不可溶并因此可以被再利用。在本發(fā)明的內(nèi)容中，固定的肽是 所有處于能夠允許對(duì)其進(jìn)行再利用的條件的肽。通過化學(xué)的、生物學(xué)的或物理 手段來限制肽的移動(dòng)性和溶解性能有力地使工藝成本降低，特別是在從血液成 分中除去自身抗體時(shí)。在本發(fā)明的另 一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，除了使用可溶的或固相結(jié)合的根據(jù)
SEQIDNO. 1的GP2分子之外，還可以使用選自由A蛋白、G蛋白、抗人類 免疫球蛋白或L-色氨酸所組成的組的非特異性的吸附劑分子。'
在本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式中，與SEQIDNO. 1 —致的GP2分子選 自由以下所組成的組
a) 具有充分的與SEQIDNO. 1的GP2分子同源的氨基酸序列的分子以與 其在功能上相似；
b) 根據(jù)所述a)的分子，該分子通過缺失、增加、取代、易位、倒位和/ 或插入而被修飾，并且與根據(jù)所述a)的分子在功能上相似。
驚人的是，同源物和被修飾的與SEQ ID NO. 1 —致的GP2分子的使用產(chǎn) 生了許多優(yōu)勢。實(shí)際上，發(fā)現(xiàn)根據(jù)b)做出的改變允許得到具有提高的穩(wěn)定性 的分子，因此在實(shí)驗(yàn)室日常程序中產(chǎn)生有益效果。
在本發(fā)明的另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述b)描述的分子與所述a)描 述的分子具有至少40%的同源性。在實(shí)驗(yàn)室日常程序中，所述40%的同源物 具有驚人的效果，它不僅比根據(jù)a)的分子能儲(chǔ)存更久，而且具有提高的耐受 溫度波動(dòng)的能力。
在本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述b)描述的分子與所述a)描述 的分子具有至少60%、優(yōu)選70%,更優(yōu)選80%，特別優(yōu)選90%的同源性。考 慮到根據(jù)所述b)的全部分子，這種變體的優(yōu)勢在于完全出人意料的具有最長 的儲(chǔ)存期的特性。
在本發(fā)明的另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，與SEQIDNO. 1 —致的GP2分子 為線性形式或環(huán)狀形式，通過酰胺環(huán)化作用或者當(dāng)存在兩個(gè)半胱氨酸時(shí)通過二 硫橋鍵進(jìn)行肽的環(huán)化或通過這些可能方式的組合而進(jìn)行肽的環(huán)化，所述酰胺環(huán) 化可選#^也通過側(cè)鏈、C末端和N末端進(jìn)行。上述方法中，這種GP2分子的 變體可以提高GP2分子在各種變性緩沖液的存在時(shí)的穩(wěn)定性。
本發(fā)明的另 一方涉及與SEQ ID NO. 1 —致的GP2在制備偶聯(lián)有所述GP2 的用來治療炎癥性腸病，特別是克羅恩氏病、慢性胰腺炎和/或潰瘍性結(jié)腸炎 的柱的過程中的用途，所述治療包括選擇在允許將患者血漿內(nèi)的免疫性球蛋白 有效地結(jié)合GP2的條件下，使所述患者的血漿通過所述柱，從而將大量的免疫性球蛋白從所述患者的血漿中除去，并使由此得到的血漿返回患者。上述用 途具有的有益效果是，能夠非常迅速地從IBD急性病例患者的血液中除去免 疫性球蛋白。
本發(fā)明的另一方面涉及GP2、免疫反應(yīng)性序列或其類似物的免疫原性試劑
在制備用于診斷或治療控制疾病的藥物中的用途，所述疾病與針對(duì)這些物質(zhì)的
免疫反應(yīng)有關(guān)。令人驚奇的是，以上描述的GP2的序列也能生產(chǎn)易于處理的 藥物，患者可以遵照內(nèi)科醫(yī)生知道服用或使用所述藥物，因此住院治療不是必 須的。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的目的在于對(duì)慢性炎癥或自身免疫性疾 病(特別是炎癥性腸病，例如克羅恩氏病、慢性胰腺炎和/或潰瘍性結(jié)腸炎) 進(jìn)行診斷或治療控制中利用上述免疫試劑。這種實(shí)施方式的優(yōu)勢在于，即使這 些幾乎不具有到達(dá)診斷和治療中心的能力的患有自身免疫性炎癥性腸病的患 者能獲得易于處理的醫(yī)療并且在家庭醫(yī)生的監(jiān)督下使用。
在一種優(yōu)選的方式中，使用根據(jù)本申請(qǐng)的GP2,免疫反應(yīng)性序列及其類似 物或片段的SEQ IDNO. 1序列作為醫(yī)療生產(chǎn)中的治療活性物質(zhì)，并應(yīng)用于與 針對(duì)這些物質(zhì)的免疫反應(yīng)有關(guān)的疾病的口服治療中。本發(fā)明內(nèi)容中的用作治療 活性物質(zhì)表示的是將氨基酸序列或可以由該氨基酸序列形成的肽用于整個(gè)醫(yī) 學(xué)領(lǐng)域。有利的是，GP2是足夠穩(wěn)定并且可被吸收的肽，因此它能作為藥物而 向患者給藥，即使是口服途徑。
本發(fā)明還涉及一種藥用組合物，該藥用組合物包括至少 一種與SEQ ID NO. 1一致的GP2分子，任選還包括藥用可接受載體，以治療慢性炎癥或自身免疫 性疾病，特別是炎癥性腸病，例如克羅恩氏病、慢性胰腺炎和/或潰瘍性結(jié)腸 炎。
更具體地，所述藥用組合物可以用作藥物。為此目的，例如，能夠通過環(huán) 化作用或其他本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法對(duì)肽或全部氨基酸序列進(jìn)行修飾，從 而防止通過內(nèi)源性的分解肽的結(jié)構(gòu)(例如，血清蛋白酶)。通過使用根據(jù)本發(fā) 明的肽或蛋白質(zhì)(SEQ IDNO. 1 ),自身抗體能夠在體內(nèi)或離體中性化。在體 內(nèi)中性化過程中，直接向患者給藥，在離體中性化的過程中，將血液導(dǎo)出人體 (例如通過回路，例如以管狀循環(huán)的方式)，隨后與藥物接觸，自身抗體發(fā)生中性化后，將血液循環(huán)回有機(jī)體(即，患者)。本發(fā)明內(nèi)容中的藥物是用于治 療和預(yù)防目的的組合物，和藥用組合物一起可以用作診斷試劑。■
根據(jù)本發(fā)明，藥物或藥用組合物(同義地用于本文)是通過在人體上或體
內(nèi)的應(yīng)用來治愈、減緩或避免疾病、病癥、身體缺陷或病理學(xué)感染的物質(zhì)的組 成和制劑。根據(jù)本發(fā)明，醫(yī)學(xué)佐劑用來制備藥物的活性成分。藥用技術(shù)佐劑起 到穩(wěn)定配制藥物或藥用組合物的作用，并且當(dāng)僅在生產(chǎn)過程中需要時(shí)，它們甚 至可以隨后被除去，或者它們可以為藥用組合物的 一部分作為藥用可接受載 體。藥用可接受載體的實(shí)施例將在下文給出。藥物的配置或藥用組合物的配置 可選擇地受到藥用可接受載體和/或稀釋劑的結(jié)合的影響。合適的藥用可接受 載體的實(shí)施例是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，并且包括例如磷酸緩沖生理鹽水、 水、乳液例如油/水乳液，各種類型的洗滌劑、無菌溶液以及等等。能夠通過 工資的常規(guī)方法配制含有這種載體的藥物或藥用組合物。這些藥物或藥用組合 物可以以合適的劑量向個(gè)體給藥，例如，每位患者lpg至10g的肽或蛋白質(zhì)/ 天。1 mg至1 g的劑量是優(yōu)選的。優(yōu)選情況下，給藥物量數(shù)量上盡可能小和低， 優(yōu)選為單劑量。給藥可以通過各種路徑實(shí)現(xiàn)，例如，靜脈內(nèi)給藥、腹膜內(nèi)給藥、
直腸內(nèi)(intrarectal )給藥、胃腸道內(nèi)(intragastrointestinal )給藥、結(jié)內(nèi)(intranodal) 給藥、肌內(nèi)給藥、局部給藥，還包括在皮膚上或通過粘膜的皮下給藥、皮內(nèi)給 藥。對(duì)編碼根據(jù)本發(fā)明的肽的核算的給藥也能以基因治療的方式進(jìn)行，例如通 過病毒載體。劑量的種類給藥路徑可以由主治內(nèi)科醫(yī)生根據(jù)臨床實(shí)踐來確定。 本領(lǐng)與技術(shù)人員所熟知的，劑量的種類將依賴于各種不同的因素，例如患者的 體積、體表面積、年齡、性別或通常健康狀況，還依賴于所使用的具體的試劑， 實(shí)踐周期和給藥類型，并依賴于可能同時(shí)進(jìn)行給藥的其它藥物。本領(lǐng)域技術(shù)人 員對(duì)以下事實(shí)也是熟悉的，可以首先使用根據(jù)本發(fā)明的肽來診斷自身抗體的濃 度，以確定所需的藥物濃度。
更具體地說，藥用組合物或藥物包括藥理學(xué)物質(zhì)，所述藥理學(xué)物質(zhì)包括為 合適的溶液形式或給藥形式的一種或多種根據(jù)本發(fā)明的肽或蛋白質(zhì)或/和編碼 所述肽或蛋白質(zhì)的核酸分子。對(duì)上述物質(zhì)的給藥可以單獨(dú)進(jìn)行或與適當(dāng)?shù)乃?與藥物或藥用組合物相連系的佐劑一起，或者與 一種或多種佐劑結(jié)合來進(jìn)行， 所述佐劑為例如，QS-21、 GPI-0100或其他皂角苷、水-油乳液例如蒙塔里德佐劑(Montanide adjuvants )、聚賴氨酸、聚絲氨酸化合物、DNA化合物例如 CpG Detox、細(xì)菌疫苗例如傷寒疫苗或BCG疫苗，鹽例如磷酸4丐和/或增強(qiáng)藥 效的其他合適的物質(zhì)，優(yōu)選為免疫刺激性分子例如白介素，例如IL-2、 IL-12、 IL-4和/或生長因子例如粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)。才艮據(jù)公知的方 法將它們與肽或本發(fā)明的識(shí)別分子混合，并以合適的劑型和劑量進(jìn)行給藥。
顯然地，所述藥用組合物或藥物還可以為兩種或兩種以上的本發(fā)明的藥用 組合物或藥物的結(jié)合，以及與其他藥物的組合，例如抗體療法、化學(xué)療法或放 射性療法中同時(shí)或間隔一定時(shí)間地給藥或施用。藥物或藥用組合物的生產(chǎn)根據(jù) 本身公知的方法來進(jìn)行。
如本發(fā)明一種優(yōu)選的實(shí)施方式所設(shè)想的，用于藥用試劑的藥用載體選自由 填料、崩解劑、粘結(jié)劑、保濕劑(h腦ectants)、稀釋劑、緩溶劑(dissolution retarder)、吸收增強(qiáng)劑、潤濕劑(wetting agent )、吸收劑和/或潤滑劑所組成的 組。驚人的是，實(shí)踐中有利地發(fā)現(xiàn)大量的藥用載體適合于GP2從而藥物的給 藥形式可以很大程度地適應(yīng)患者的需要。
本發(fā)明還涉及一種用來檢測自身免疫性疾病的診斷試劑盒，該試劑盒包括 與SEQIDNO. 1—致的GP2分子。所述診斷試劑盒可選擇地包括說明書，該 說明書關(guān)系到將試劑盒的內(nèi)容物進(jìn)行結(jié)合和/或提供用來檢測炎癥性腸病的制 劑，特別是克羅恩氏病、慢性胰腺炎和/或潰瘍性結(jié)腸炎。比如說，說明書可 以為指導(dǎo)性傳單或其他向使用者提供方法類型信息的媒介，其中使用了所提及 的物質(zhì)。顯然地，這種信息不是必須為指導(dǎo)性傳單的形式，并且這種信息可以 通過諸如網(wǎng)絡(luò)的方法傳播。對(duì)于患者而言，這種試劑盒的有益效果是，例如他 或她不需要直接造訪內(nèi)科醫(yī)生(甚至在旅途過程中)就能夠測定疾病的實(shí)際狀 態(tài)，從而能夠據(jù)此可選^^地調(diào)節(jié)飲食和活動(dòng)。
本發(fā)明還涉及一種用于色譜法(特別是用于血漿分離置換法(apheresis)) 的設(shè)備，該設(shè)備包括與SEQIDNO. 1 —致的GP2分子以治療炎癥性腸病，特 別是克羅恩氏病、慢性胰腺炎和/或潰瘍性結(jié)腸炎。通常，傳統(tǒng)的對(duì)急性炎癥 的治療需要使用藥物治療來盡快控制腸內(nèi)炎癥。根據(jù)本發(fā)明的色譜設(shè)備的優(yōu)勢 在于，不需要對(duì)患者進(jìn)行給藥，作為替換地，在血漿分離置換柱上將患者的血 液從抗體中進(jìn)行提純，從而防止了炎癥中心擴(kuò)張從而避免了藥物互相作用和對(duì)器官的損害。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，與SEQIDNO. 1 —致的GP2分子結(jié)合到所述色譜 系統(tǒng)內(nèi)的固相上。GP2分子對(duì)抗體具有驚人的高親和性，并在固相上表現(xiàn)出了 良好的固定性，從而根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備能用來從患者體液中排除抗體或使自身 抗體中性化。該方法是免疫吸附和血漿分離置換治療領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。 在免疫吸附的協(xié)助下，從患者血液中除去了免疫球蛋白。
有利的是，這種免疫吸附治療可以作為住院治療.和流動(dòng)性治療而進(jìn)行?？?以預(yù)計(jì)到的是，該設(shè)備，特別是所謂的吸附器是體外血液循環(huán)的一部分。維持
并通過過濾或離心分離而被分離成單一成分，例如細(xì)胞成分和體液成分。具體 來說，通過此方式獲得的一種必要的血液成分為血漿。有利的是，血漿可以流 經(jīng)本發(fā)明的設(shè)備，并當(dāng)自身抗體被吸附后返回患者，更具體地說，是通過手臂 或腿的另一條靜脈，與先前分離的血液成分(特別是細(xì)胞成分)?？梢灶A(yù)期到 的是所述肽被固定在瓊脂糖基質(zhì)上。所述基質(zhì)可以置于體積為10-400ml的容 器中。隨后，可以使患者的血流流經(jīng)所述基質(zhì)，其中自身抗體將被結(jié)合從而允
許將其從血漿中除去。
本領(lǐng)與技術(shù)人員將熟知提供這種固相固定的肽的各種不同的方式，例如為 以下形式(i)可再生的吸收柱，(ii)雙柱和(iii) 一次性柱。使治療具有高
地進(jìn)行測定。通過提供根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，向本領(lǐng)域技術(shù)人員更具體地公開了 本發(fā)明的肽，在體內(nèi)、離體(ex vivo)和體外使用所述肽的各種方式來對(duì)由感 冒引起的、自身抗原介導(dǎo)的疾病進(jìn)行預(yù)防、診斷、治療和病后調(diào)護(hù)(aftercare )。
-根據(jù)本申請(qǐng)的教導(dǎo)以以下突出的特征性
-與常規(guī)技術(shù)的脫離
-新的問題領(lǐng)域
-存在長期未令人滿意的、緊急的需求來解決由本發(fā)明所解決的問題 -迄今為止本領(lǐng)域中未作出努力
-解決的簡單性表示了本發(fā)明的活躍性，特別是它代替了更多的復(fù)雜技術(shù) -科學(xué)技術(shù)在不同的方向上進(jìn)行發(fā)展-實(shí)現(xiàn)了發(fā)展的成就
-本領(lǐng)域在解決爭論問題上的錯(cuò)誤觀點(diǎn)(偏見)
-技術(shù)的進(jìn)步，例如，提高、性能增強(qiáng)、降低開銷、節(jié)約時(shí)間、材料、公 主步驟、成本或原料難以獲得、增強(qiáng)的可靠性、除去了缺點(diǎn)、更優(yōu)越的質(zhì)量、 維護(hù)自由、更高的效率、更高的產(chǎn)量、技術(shù)領(lǐng)域的擴(kuò)展、其他手段的提供、創(chuàng) 造第二途徑、開拓新領(lǐng)域、第一時(shí)間解決問題、保守裝置、輪替性、實(shí)現(xiàn)、自 動(dòng)化或小型化的范圍，或可用藥物范圍的擴(kuò)大
-幸運(yùn)的選擇(各種可能之外，選擇一個(gè)結(jié)果是不可預(yù)知的，這就使其成 為能作為專利的幸運(yùn)選擇)
-現(xiàn)有技術(shù)文件中的錯(cuò)誤
-新的技術(shù)領(lǐng)域
-發(fā)明的結(jié)合，即，結(jié)合了多種已知要素來實(shí)現(xiàn)意想不到的效果
-許可問題
-本領(lǐng)域的贊揚(yáng)
-經(jīng)濟(jì)上的成功
將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體的解釋，這種解釋不用于限制本發(fā)明。 方法
將GP2從大鼠胰腺中提純 獲得酶原粒(ZG)和對(duì)ZG膜提純
以下所有的工作步驟在冰浴中或者在冷卻至4。C下進(jìn)行。四只成年Wistar 大鼠胰腺(組織約重2.4g)通過機(jī)械方法減小其尺寸在波特(POTTER)均質(zhì) 器(000 rpm下2沖程和1300 rpm下2沖程)內(nèi)的10倍體積的冰-冷的O.3 M 蔗糖溶液中浸漬。將被浸漬的材料隨后在薄紗布上過濾。細(xì)胞碎片和細(xì)胞核通 過進(jìn)行10分鐘的500 g的離心分離而除去。進(jìn)行10分鐘的3000 g的離心分離， 酶原粒(下部，白色固體小球)和線粒體(上覆層，+>散的褐色小球)從上清 液中發(fā)生沉積。用緩沖液A( 10mM的嗎啉基丙磺酸(morpholinopropanesulfonic acid， MOPS), pH6.8)小心地沖洗去線粒體，并使用渦旋機(jī)器將酶原粒重懸浮于2 ml的0.1 M的碳酸鈉溶液和1 mM的二異丙基氟磷酸酯(diisopropyl fluorophosphate, DFP)中。顆粒在冰浴中裂解1個(gè)小時(shí)。將裂解的批次在不 連續(xù)的蔗糖梯度(0.3 M/1 M)上進(jìn)行分層，并在200000 g進(jìn)行離心分離90 分鐘。膜部分累積為密度分界處的帶。該帶被吸收并將得到的溶液至0.3M的 溴化鈉調(diào)整。通過200000 g的離心分離60分鐘將膜進(jìn)4亍沉淀。 GP2的增溶作用
使用超聲將得到的膜小球在0.5 mL的緩沖液B (20 mM的嗎啉基乙基磺 酸(morpholinoethanesulfonic acid, MES, pH 7.0; 80 mM的KC1; 45 g/ml 的皂角苷)進(jìn)行再懸浮，然后加入磷脂酰肌醇特異性的磷脂酶C(蠟狀芽孢桿 菌)后，通過在37。C下孵育1小時(shí)來將GP2從膜中除去。膜通過離心分離 (200,000 g， 60min)被形成丸狀，并將含有可溶的GP2的上清液利用超濾濃 縮至約為1: 5。
酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)以檢測GP2抗體
用在包被緩沖液(100 mM的碳酸鈉，pH 9.6 ) 10 (ig/ml的大鼠GP2在4 。C下以50pd/孔的量對(duì)微量滴定板(麥克斯索伯，能肯，羅斯基勒郡(Maxisorb, Nunc, Roskilde))進(jìn)行包被并放置過夜。用洗滌緩沖液(10 mM的磷酸鈉， 150mM的NaCl， 0.1%的吐溫20 ( Tween 20 ), pH 7.4 )對(duì)微量滴定板進(jìn)行洗 滌后，用300lil的封閉溶液(洗滌緩沖液，1。/。的牛血清白蛋白(BSA)， pH7.4) 在室溫下(RT)對(duì)孔孵育30分鐘。隨后，用洗滌緩沖液對(duì)孔進(jìn)行三次洗滌，、 每孔50 |il的人血清樣品，在稀釋緩沖液(10 mM磷酸鈉，150 mM的NaCl, 1%的鼠血清白蛋白(RSA))中以100稀釋，在室溫(RT)下孵育60分鐘。 用稀釋緩沖液洗滌三次后，將孔填充50 ^的結(jié)合物溶液(抗人類IgG過氧化 物酶，羊，1 |Lig/ml，稀釋溶液)，在RT下孵育30分鐘。隨后再將孔洗滌3次， 并將50 pl的底物溶液(四甲基聯(lián)苯胺)分配到每孔。在RT下孵育10分鐘后， 通過加入50 )il的淬滅溶液(0.3 M的硫酸)中止底物反應(yīng)。微量滴定板在450 nm和620 nm下對(duì)每孔內(nèi)溶液的光密度進(jìn)行兩次色譜測量，接著使用EIAstar 軟件程序進(jìn)行基于計(jì)算機(jī)的分析。
對(duì)于胰腺抗原抗體檢測的間接免疫熒光法(IIF )使用商購得到的猴子胰腺切片(歐蒙，呂貝克(Euroimmun, Lubeck )) 通過IIF的方法來測定胰腺抗原抗體。用稀釋緩沖液將血清樣品-接1: 40、 1: 80和1: 160進(jìn)行稀釋。25 )il的稀釋的血清被吸取在試劑載體的反應(yīng)板上，并 與具有組織切片的顯微鏡載玻片在RT下孵育30分鐘。然后，將載玻片用磷 酸緩沖液清洗1分鐘。將20 的標(biāo)記的抗血清(抗人類IgG FITC )吸取在清 洗過的試劑載體的各個(gè)板上，并與載玻片上的組織切片在RT下孵育30分鐘。 用磷酸緩沖液再清洗1分鐘后，在封固劑(mounting medium)的協(xié)助下將蓋 玻片置于載玻片上。使用熒光顯微法進(jìn)行熒光評(píng)價(jià)。參考文獻(xiàn)
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權(quán)利要求
1.一種對(duì)抗體進(jìn)行檢測的方法，該抗體來自糞便和/或體液，特別是血液和/或血清，該方法通過與GP2、免疫反應(yīng)性序列或其類似物的免疫反應(yīng)來進(jìn)行。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，對(duì)人類IgA抗體、IgM抗 體和/或IgG抗體進(jìn)行4企測。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述GP2的來源為人 類、動(dòng)物、重組體或合成物質(zhì)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述檢測在 免疫測定中進(jìn)行，優(yōu)選具有反應(yīng)物與標(biāo)記物質(zhì)直接或間接的偶聯(lián)。
5. —種治療炎癥性腸病的方法，該方法包括以下步驟 a)提供其上偶聯(lián)有GP2的柱；b ) 在允許GP2有效地結(jié)合患者血漿內(nèi)的抗體的條件下，使所述患者的 血漿通過所述柱，從而將大量的抗體從所述患者的血漿中除去；以 及c)使由此得到的血漿返回患者。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的治療炎癥性腸病的方法，其中，與SEQIDNO. 1 一致的GP2識(shí)別直接針對(duì)腸道組織的自身抗體。
7. —種用于治療自身免疫性疾病的方法，該方法通過使用固相結(jié)合的與 SEQIDNO.l —致的GP2分子來結(jié)合和/或除去自身抗體。
8. —種用于診斷或治療控制克羅恩氏病的方法，其特征在于，通過與GP2、來自血液和/或血清的與SEQIDNO. 1 —致的GP2抗體，進(jìn)行所述免疫反應(yīng)不 利用動(dòng)物或人組織的組織切片。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述檢測在免疫測定中進(jìn) 行，優(yōu)選利用了反應(yīng)物與標(biāo)記物質(zhì)直接或間接的偶聯(lián)，但不包括基于組織切片 的免疫熒光測試。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述檢測在固相上進(jìn)行。
11. 與序列SEQIDNO. 1 —致的GP2分子在制備用于自身免疫性疾病的 預(yù)防、診斷、治療和/或病后調(diào)護(hù)中的藥物中的用途。
12. 前迷GP2分子的用途， 其特征在于所述自身免疫性疾病選自由炎癥性腸病(IBD )和/或自身免疫性肝病所組 成的組中。
13. 根據(jù)權(quán)利要求11或2所述的GP2分子的用途， 其特征在于所述炎癥性腸病為克羅恩氏病、慢性胰腺炎和/或潰瘍性結(jié)腸炎。
14. 根據(jù)權(quán)利要求11-13中任意一項(xiàng)所述的GP2分子的用途， 其特征在于，所述肝病為原發(fā)性硬化性膽管炎和/或自身免疫性腸炎。
15. 根據(jù)權(quán)利要求11-14中任意一項(xiàng)所述的GP2分子的用途， 其特征在于，所述GP2分子包括連接體和/或間隔物，所述連接體和/或間隔物選自由ct-氨基羧酸及其同質(zhì)低聚體和異質(zhì)低聚體、a,co-氨基羧酸及其支鏈化的同質(zhì)低聚 體或異質(zhì)低聚體；其它的氨基酸及其直鏈和支鏈的同質(zhì)低聚體或異質(zhì)低聚體； 氨基-寡烷氧基烷基胺；順丁烯二酰亞胺羧酸衍生物；烷基胺低聚體；4-烷基 苯基衍生物；4-寡烷氧基苯基衍生物或4-寡烷氧基苯氧基衍生物；4-寡烷基巰 基苯基衍生物或4-寡烷基巰基苯氧基衍生物；4-寡烷基氨基笨基衍生物或4-寡烷基氨基苯氧基衍生物；(寡烷基芐基)笨基衍生物或4-(寡烷基芐基)苯氧基 衍生物，以及4-(寡烷氧基千基)苯基衍生物或4-(寡烷氧基芐基)苯氧基衍生物； 三苯甲基衍生物；千氧基芳基衍生物或節(jié)氧基烷基衍生物；n占噸—3—基氧基烷 基衍生物；(4-烷基苯基)烷酸衍生物或co-(4-烷基苯氧基)烷酸衍生物；寡烷基 苯氧基烷基衍生物或寡烷氧基苯氧基烷基衍生物；氨基曱酸酯衍生物；胺；三 烷基曱基硅烷衍生物或二烷基烷氧基甲基硅烷衍生物；烷基或芳基衍生物，和 /或它們的組合所組成的組中。
16. 根據(jù)權(quán)利要求11-15中任意一項(xiàng)所述的GP2分子的用途，其特征在于，所述GP2分子以可溶形式或與固相結(jié)合用于在糞便和/或體液，特別是血 液和/或血清中對(duì)自身抗體直接或間接檢測。
17. 根據(jù)權(quán)利要求11-16中任意一項(xiàng)所述的GP2分子的用途， 其特征在于，所述GP2分子以可溶形式或與固相結(jié)合用于在糞便和/或體液，特別是血 液和/或血清中對(duì)自身抗體直接或間接的檢測。
18. 根據(jù)權(quán)利要求11-17中任意一項(xiàng)所述的GP2分子的用途， 其特征在于，所述固相結(jié)合的與SEQIDNO. 1 —致的GP2分子與有機(jī)聚合物、無機(jī)聚 合物、合成聚合物和/或混合的聚合物結(jié)合，優(yōu)選為瓊脂糖、纖維素、硅膠、 聚酰胺和/或聚乙烯醇。
19. 根據(jù)權(quán)利要求11-18中任意一項(xiàng)所述的GP2分子的用途， 其特征在于，除了使用所述可溶的或固相結(jié)合的GP2分子之外，還使用選自由A蛋白、 G蛋白、抗人類免疫球蛋白和/或L-色氨酸所組成的組中的非特異性的吸附劑 分子。
20. 根據(jù)權(quán)利要求11-19中任意一項(xiàng)所述的GP2分子的用途， 其特征在于，所述GP2分子選自由以下所組成的組a) —種分子，其具有與所述GP2分子充分同源的氨基酸序列以至于與 GP2分子在功能上相似；b) 通過缺失、增加、取代、易位、倒位和/或插入得到已經(jīng)修飾的所述a) 的分子，并且與所述a)的分子在功能上相似。
21. 根據(jù)權(quán)利要求11-20中任意一項(xiàng)所述的GP2分子的用途， 其特征在于，所述b)描述的分子與所述a)描述的分子具有至少40%的同源性。
22. 根據(jù)權(quán)利要求11-21中任意一項(xiàng)所述的GP2分子的用途， 其特征在于，所述b)描述的分子與所述a)描述的分子具有至少60%、優(yōu)選70%,更 優(yōu)選80%,特別優(yōu)選卯％的同源性。
23. 根據(jù)權(quán)利要求11-22中任意一項(xiàng)所述的GP2分子的用途， 其特征在于，所述GP2分子為線性形式或環(huán)狀形式，通過酰胺環(huán)化作用或者當(dāng)存在兩 個(gè)半胱氨酸時(shí)通過二硫橋鍵進(jìn)行肽的環(huán)化或通過這些可能方式的組合而進(jìn)行 肽的環(huán)化，所述酰胺環(huán)化可選^f地通過側(cè)鏈、C末端和N末端進(jìn)行。
24. GP2在制備偶聯(lián)有所述GP2的用來治療炎癥性腸病，特別是克羅恩 氏病、慢性胰腺炎和/或潰瘍性結(jié)腸炎的柱的過程中的用途，所述治療包括選 擇在允許GP2有效地結(jié)合患者血漿內(nèi)的免疫性球蛋白的條件下，使所述患者 的血漿通過所述柱，從而將大量的免疫性球蛋白從所述患者的血漿中除去，使 將由此得到的血漿返回患者，所述GP2優(yōu)選為SEQIDNO. 1。
25. GP2、免疫反應(yīng)性序列或其類似物在制備用于診斷或治療控制疾病的 藥物中的用途，所述疾病與針對(duì)這些物質(zhì)的免疫反應(yīng)有關(guān)，所述GP2優(yōu)選與 SEQ ID NO. 1 —致。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25的用途，用于診斷或治療控制慢性炎癥或自身免疫 性疾病中，特別是炎癥性腸病，例如克羅恩氏病、慢性胰腺炎和/或潰瘍性結(jié) 腸炎。
27. 根據(jù)權(quán)利要求25或26中的任意一項(xiàng)的用途，用于診斷或治療控制克 羅恩氏病中。
28. GP2、免疫反應(yīng)性序列或其類似物在制備用于對(duì)疾病進(jìn)行口服治療的 藥物中的使用，所述疾病與針對(duì)上述物質(zhì)的免疫反應(yīng)相關(guān)，所述GP2優(yōu)選與 SEQIDNO. 1 —致。
29. —種藥用組合物，該藥用組合物包括至少一種GP2分子，任選還包 括藥用可接受載體，以治療慢性炎癥或自身免疫性疾病，特別是炎癥性腸病， 例如克羅恩氏病、慢性胰腺炎和/或潰瘍性結(jié)腸炎，所述GP2優(yōu)選與SEQ ID NO. 1 一致。
30. 根據(jù)前述權(quán)利要求的藥用產(chǎn)品， 其特征在于所述藥用載體選自選自由填料、崩解劑、粘結(jié)劑、保濕劑、稀釋劑、緩溶 劑、吸收增強(qiáng)劑、潤濕劑、吸收劑和/或潤滑劑所組成的組。
31. —種用于測定自身免疫性疾病的診斷試劑盒，該試劑盒包括GP2分 子，所述診斷試劑盒可選擇地同時(shí)包括說明書，該說明書涉及到將試劑盒的內(nèi) 容物進(jìn)行結(jié)合和/或提供用來檢測炎癥性腸病的制劑，特別是用來檢測克羅恩 氏病、慢性胰腺炎和/或潰瘍性結(jié)腸炎的制劑，所述GP2優(yōu)選與SEQIDNO. 1 一致。
32. —種用于色譜法的設(shè)備，該設(shè)備包括與SEQ ID NO. 1 —致的GP2分子以治療炎癥性腸病，特別是克羅恩氏病、慢性胰腺炎和/或潰瘍性結(jié)腸炎， 所述設(shè)備為特別是用于進(jìn)行血漿分離置換的設(shè)備。
33. 根據(jù)前述權(quán)利要求所述的設(shè)備， 其特征在于，所述與SEQ ID NO. 1 —致的GP2分子與固相結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過與來自胰腺酶原粒的GP2、免疫反應(yīng)性序列或其類似物(但不包括組織切片)進(jìn)行的免疫反應(yīng)來檢測體液中抗體的方法。
文檔編號(hào)A61K38/17GK101611320SQ200880003049
公開日2009年12月23日 申請(qǐng)日期2008年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月26日
發(fā)明者迪爾克·羅根比克 申請(qǐng)人:Ga通用檢測有限責(zé)任公司