專利名稱：：使用受控剪切力從卵囊中釋放孢子被的方法
技術領域：
：本發(fā)明一般涉及卵嚢，并更具體地而言，涉及從卵嚢中釋放孢子被的方法。
背景技術：
：家禽的球蟲病是由艾美球蟲屬的原生寄生蟲引起的疾病。艾美球蟲種的卯嚢在環(huán)境中普遍存在，并且可以在家禽糞便中持續(xù)存在多月。吞食卵嚢會以物種特異性的方式在腸道內(nèi)導致多處感染。這種生物可以在腸道內(nèi)繁殖長達幾天，導致在糞便中分泌下一代卵嚢。多個循環(huán)的感染會產(chǎn)生免疫力，并且當感染幼年家禽群并在家禽群中感染劑量一致時，經(jīng)過幾個循環(huán)的接觸后發(fā)展得到的免疫力非常強。相反，當鳥類感染的方式不一致時，就會出現(xiàn)這樣的情況幼鳥受到突然而且大量的感染，導致飼料轉(zhuǎn)化和體重增加的性能較差，并且有較高的二次感染的風險。目前，用于控制家禽業(yè)中球蟲病的最常見的方法不是"^妄種疫苗，而是在詞料中施用抗球蟲病的藥物。較低的疫苗使用率經(jīng)常是因為在生長區(qū)通過飼料或水或者在將化時通過噴霧櫥接種疫苗(這些是給藥的傳統(tǒng)途徑)給藥時不確定的劑量一致性。對于提高孵化時施用期間疫苗輸送的一致性從而在家禽群中提供更一致的保護，在這方面的興趣日益增加。近來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)胚胎疫苗接種技術適用于基于活卵嚢球蟲病的疫苗的施用(參見,例如，美國專利6,500,438;美國專利6,495,146;和美國專利6,627,205;所有上述專利都屬于Pfizer,Inc.)。胚胎施用途徑為向每個胚胎在其尚在蛋中時輸送一致劑量的疫苗提供了方便的方法。目前美國每年生產(chǎn)的90億肉禽中，約85%使用了鳥類疫苗胚胎輸送，并且美國之外每年生產(chǎn)的210億肉禽中使用鳥類疫苗胚胎輸送的比例也正在增加(參見，例如，美國專利4，458，630,所述專利屬于美國政府)。因此，向活胚胎輸送的球蟲病疫苗的潛在市場比目前孵化后輸送的球蟲病疫苗的市場大得多。艾美球蟲卵嚢在防護性卵嚢壁中包含四個孢子被。孢子被可以用于多種目的，包括疫苗、活性測試、孢子體產(chǎn)生等。破裂卵嚢和釋放孢子被的傳統(tǒng)方法使用玻璃珠。卵嚢與玻璃珠一起震蕩，導致卵嚢壁破裂，并釋放其中的孢子被。然而，要使較高百分比的卵嚢破裂，通常需要相當程度的震蕩，并且持續(xù)的震蕩可能降解原先釋放的孢子被。其他傳統(tǒng)的釋放孢子被的方法存在類似問題，比如使用組織研磨器釋放孢子被時。持續(xù)進行研磨過程能破壞于過程早期釋放的孢子被。從卵嚢中釋放孢子被的其他常規(guī)方法涉及從卵嚢中化學釋放孢子被。通常，將卵嚢懸浮于包含例如C02氣體的緩沖液中。也可以包含半胱氨酸鹽酸鹽。這個過程可以減少卵嚢卵孔區(qū)中的二石克4建。最終，可以通過松開的卵孔蓋釋放孢子被。遺憾的是，單獨的化學釋放通常不是孢子被釋放的有效方法。如上所述，從產(chǎn)孢卵囊中釋放孢子被的常規(guī)方法不夠有效，僅得到潛在的活孢子被中的一部分。因此，需要從卵嚢中釋放孢子被的改進方法，其可以克服常規(guī)方法中的相關問題。
發(fā)明內(nèi)容根據(jù)上述討論，提供從卵嚢中釋放孢子被的方法，其中使卵嚢溶液經(jīng)受足以使卵嚢壁破裂并從中釋放活孢子被的受控剪切力。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，在腔室直徑、腔室的幾何規(guī)格和壓力受到限定的條件下，將卵嚢的水溶液通過一個或多個微射流均質(zhì)機處理器腔室。卵嚢撞擊腔室壁，并經(jīng)受受控高剪切力，撕開卵嚢壁并釋放完整的孢子被。這個方法對于釋放孢子被特別有效，因為較高百分比的卵嚢壁能破裂，使得可以回收較高百分比的孢子被。此外，對釋放的孢子被傷害很小，使得較高百分比的回收孢子被保持存活。在一些實施方式中，在使溶液經(jīng)受受控剪切力之前，處理卵嚢并削弱其壁。例如，可以對卵嚢進行熱處理，化學處理，酶處理，或者可以對卵嚢進行熱、化學和酶處理的多種組合。在一些實施方式中，將回收的孢子被凍存用于保存。在一些實施方使用回收的孢子被制備疫苗和/或診斷試驗。在一些實施方式中，使孢子體從回收的孢子被中脫嚢。這些孢子體可以用于制備疫苗和/或診斷試驗。根據(jù)本發(fā)明，可以從中回收孢子被的示例卵嚢，是艾美球蟲(五/men'a)卵嚢，比如選自下組的艾美球蟲卯嚢巨型艾美球蟲(五.w欲^a)卵嚢、和緩艾美球蟲(Em"/》卵嚢、柔嫩艾美球蟲(Efe"e〃a)卯嚢、堆型艾美球蟲(五.acerw""a)卵嚢、布氏艾美球蟲CE.&""￡的)卵嚢、毒害艾美球蟲(五.weca化/x)卵嚢、早熟艾美球蟲(五.praecox)卯嚢、變位艾美球蟲(￡.m/v加')卵嚢及其任何組合；選自下組的艾美球蟲卵嚢火雞和緩艾美球蟲(Ewe/^gWm/to)卵嚢、腺艾美球蟲(E^/e"o"ofes)卵嚢、火雞孔雀艾美球蟲(Ega〃o;avw^)卵嚢、分散艾美球蟲(五.^fopewa)卵嚢、無害艾美球蟲(￡./""ocwa)卵嚢和近圓艾美球蟲(￡.5w^y/m"^)卯嚢及其任何組合；選自下組的艾美球蟲卵嚢邱氏艾美球蟲(五.zwerm7)卵嚢、牛艾美球蟲(五.Zwv&)卵嚢及其任何組合；選自下組的艾美球蟲卵嚢阿撒他艾美球蟲(五.a/joyata)卵嚢、巴庫艾美球蟲(Ekdwm^)卵嚢、槌形艾美球蟲CE.cra"cfa〃/力卵嚢、浮氏艾美球蟲(E/awe/)卵嚢、顆粒艾美球蟲(￡.gra"w/o^)卵嚢、錯亂艾美球蟲(五./"Acato)卵嚢、馬爾西卡艾美球蟲CE.)卵嚢、類綿羊艾美球蟲(五.ov/wW"fc)卵嚢、蒼白艾美球蟲(五./a〃/^3)卵嚢、小艾美球蟲CE.parva)卵嚢、溫布里吉艾美球蟲(五.wej6/^gm^)卵嚢及其任何組合；和選自下組的艾美球蟲卵嚢腸艾美球蟲(E/wfe幼'"a/^)卵嚢、維氏艾美球蟲(Eveycfov4y/)卵嚢、梨形艾美球蟲(Ep/n/o，/力卵嚢、盲腸艾美球蟲(Ecoec/co/a)卯嚢、無殘艾美球蟲(五.z>ray/^fl)卯嚢、黃艾美球蟲(Ey/m^cmy)卵嚢、小型艾美球蟲(五.ex/gwo)卵嚢、大型艾美球蟲(Em^wa)卵嚢、穿孔艾美球蟲(E;^/orara)卵嚢、中型艾美球蟲(Ewe^0卯嚢、斯氏艾美球蟲(￡.幼'e^H')卵嚢及其任何組合。在一些實施方式中，提供從卵嚢中釋放孢子體的方法，其中使卵囊溶液經(jīng)受足以使卵嚢壁破裂并從中釋放孢子體的受控剪切力。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，在腔室直徑、腔室?guī)缀我?guī)格和壓力受到限定的條件下，使卵嚢的水溶液通過一個或多個微射流均質(zhì)機處理器腔室。卵嚢撞擊腔室壁，并經(jīng)受受控高剪切力，撕開卵嚢壁并釋放完整的孢子體。本發(fā)明的實施方式相比常規(guī)方法具有優(yōu)勢。例如，本發(fā)明的實施方式可實現(xiàn)重復性的一致孢子被收率。相反，常規(guī)的玻璃珠和組織研磨方法可能由8于操作者的操作方式而發(fā)生變化，可能導致孢子被收率的不一致。此外，本發(fā)明的實施方式可以放大規(guī)模，從而大規(guī)模經(jīng)濟生產(chǎn)孢子被。相反，常規(guī)的玻璃珠和組織研磨方法不易由大規(guī)模生產(chǎn)采用。圖1-2是根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式從卵嚢中釋放孢子被的操作流程圖。圖3是根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式的微射流均質(zhì)機處理器的結(jié)構圖。圖4是根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式處理釋放的孢子被的操作流程圖。圖5是根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式處理釋放的孢子被并從釋放的孢子被中將孢子體脫嚢的操作流程圖。具體實施例方式在下文參考附圖更完整地描述本發(fā)明，所述附圖中表明了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。然而，本發(fā)明可以以很多不同的形式具體表達，并且不應解釋為限定在本文所提出的實施方式內(nèi)；較為合適地是，提供這些實施方式使本公開徹底而完整，并且能向本領域的技術人員完整傳達本發(fā)明的范疇。全文中相似的數(shù)字表示相似的部件。在圖中，為清晰起見，可以將某些線、層、組分、元件或特征的厚度放大。本文提及的所有公開出版物、專利申請、專利和其他文獻通過引用全部并入本文。本文所用術語僅為描述具體的實施方式，不意欲限定本發(fā)明。如本文所使用的，單數(shù)形式意欲也包括復數(shù)形式，除非上下文清楚地表明并非如此。還應理解的是，術語"包括"當用于本說明時，說明存在所述特征、步驟、操作、元件和/或組分，但是不排除存在或加入一種或多種其他特征、步驟、操作、元件、組分，和/或其組別。如本文所使用的，術語"和/或"包括列出的相關條款中的任何一項和一項或多項的全部組合。如本文所使用的，短語如"在X和Y之間"和"在約X和Y之間"應該解釋為包括X和Y。如本文所使用的，短語如"在約X和Y之間"表示"在約X和約Y之間"。如本文所使用的，短語如"從約X至Y"表示"從約X至約Y"。除非特別定義，本文使用的所有項(包括技術和科學項)與本發(fā)明所屬領域中一名普通技術人員通常理解的意義相同。還應理解的是，這些項如在常用字典中定義的那些，應該解釋為與本說明的上下文和相關領域中的意義一致，并且不應以理想化或具有過于表面化意義的方式解釋，除非本文清楚地如此定義。為簡潔和/或清晰，可以不詳細描述熟知的功能或構造。操作順序(或步驟)不限于權利要求或圖中提出的順序，除非特別說明。本發(fā)明的實施方式適于為醫(yī)藥和獸醫(yī)用途以及診斷和/或研究目的而,人卵嚢中釋放孢子被。卵嚢可以來自能感染任何動物受試對象的原生動物，所述動物受試對象包括哺乳動物和鳥類受試對象。術語"動物"和"動物受試對象"包括但不限于哺乳動物和/或鳥類受試對象。合適的哺乳動物受試對象包括但不限于靈長類動物受試對象(例如，人類受試對象和非人類靈長類動物受試對象如猿)、豬科動物、?？苿游?例如，家牛)、山羊、馬科動物、貓科動物、綿羊、犬科動物、鼠科動物(例如，小鼠、大鼠)和兔科動物受試對象。如本文所使用的，術語"鳥類"和"鳥類受試對象"(即，"鳥"和"鳥受試對象，，)意欲包括任何鳥類的雄性和雌性，但是主要意欲包含商業(yè)飼養(yǎng)用于產(chǎn)蛋、肉或作為寵物的家禽。因此，術語"鳥類"和"鳥類受試對象"特別意欲包含但不限于雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉、野雞、長尾小鸚鵡、鸚鵡、美冠鸚鵡、澳洲鸚鵡、鴕鳥、鴯鵲等。在具體的實施方式中，鳥類受試對象是雞或火雞受試對象。如本文所使用的，"鳥類，，或"鳥類受試對象，，可以指鳥類胚胎或孵化后的鳥類。本發(fā)明領域的技術人員能很好地理解術語"凍存"，所述術語指通過在非常低的溫度冷凍并保存的方式保存細胞和其他材料。本發(fā)明通常涉及從原生動物卵嚢中釋放孢子被的方法。這些方法可以用于例如制造疫苗的方法中。很多原生動物形成名為"卵嚢"的生命階段。能夠?qū)嵤┍景l(fā)明，從包含孢子被的任何種類原生動物的卵嚢中釋放孢子被，所述原生動物包括但不限于艾美球蟲、環(huán)孢球蟲(Qvc/owora)、弓形蟲(roxo//asw")、殺斤孑包J求蟲(A^osporaf)禾口等孑包3求蟲(Zyospor")。本發(fā)明還可以涉及從原生動物卵囊中釋放孢子體的方法。一些原生動物形成名為"卯嚢，，的生命階段，但是可以在卯囊中包含孢子體而不產(chǎn)生孢子被。這樣的方法可以用于例如從卵嚢釋放孢子體的方法中，所述方法包括但不限于細胞系感染、感染試驗、制造疫苗或診斷試驗?？梢詫嵤┍景l(fā)明，從在卵嚢中包含孢子體的任何種類寄生蟲的卯嚢中釋放孢子體，所述寄生蟲包4舌{旦不卩艮于隱孑包子蟲(07Pto/cW(i/Mm)禾口原形體(尸/wmc^^m)。在本領域中，術語"原生動物"、"卵嚢"、"孢子被"、"孢子體"和"裂殖子"具有已被廣為接受的含義。除非特別說明，盡管本領域技術人員理解應該使用已殺死的原生動物、卵嚢、孢子被、孢子體和裂殖子配制疫苗，但是這些術語意欲表示活的原生動物、卵嚢、孢子被、孢子體和裂殖子，包括減毒形式。本領域技術人員應理解的是，已殺死的疫苗通常通過首先純化活生物體而制備。本文還包含基因改造的原生動物、卵嚢、孢子被、孢子體和裂殖子。術語"艾美球蟲"表示艾美球蟲屬的一個或多個種類。術語"艾美球蟲"包括^S不限于可以感染鳥(例如，雞、火雞)或哺乳動物(例如，牛、羊或兔)種類的艾美球蟲的菌林或種。這樣的艾美球蟲種包括在雞中發(fā)現(xiàn)的那些，包括但不限于，柔嫩艾美球蟲、堆型艾美球蟲、巨型艾美球蟲、毒害艾美球蟲、和緩艾美球蟲、早熟艾美球蟲、變位艾美球蟲和布氏艾美球蟲；還有在火雞中發(fā)現(xiàn)的那些，包括但不限于，火雞和緩艾美球蟲、腺艾美球蟲、火雞孔雀艾美球蟲、分散艾美球蟲、無害艾美球蟲和近圓艾美球蟲；以及那些可以感染牛的艾美球蟲，比如但不限于，牛艾美球蟲和邱氏艾美球蟲；可以感染羊的艾美球蟲，比如但不限于，阿撒他艾美球蟲、巴庫艾美球蟲、槌形艾美球蟲、浮氏艾美球蟲、顆粒艾美球蟲、錯亂艾美球蟲、馬爾西卡艾美球蟲、類綿羊艾美球蟲、蒼白艾美球蟲、小型艾美球蟲、溫布里吉艾美球蟲；以及能感染兔的艾美球蟲種，包括但不限于，腸艾美球蟲、維氏艾美球蟲、梨形艾美球蟲、盲腸艾美球蟲、無殘艾美球蟲、黃艾美球蟲、小型艾美球蟲、大型艾美球蟲、穿孔艾美球蟲、中型艾美球蟲和斯氏艾美球蟲。此外，術語"艾美球蟲"包括前述艾美球蟲種的所有菌林，包括但不限于，野生型菌抹、早熟或特別篩選的菌抹、減毒菌抹，和已經(jīng)減毒的卵嚢，例如，通過輻射、化學處理等。此外，術語"艾美球蟲"還包括任何新發(fā)現(xiàn)的艾美球蟲菌抹或種。最后，術語"艾美球蟲"包含活的和已殺死的艾美球蟲，雖然除非特別說明意欲表示的則是活的艾美球蟲。包含艾美球蟲卵嚢的組合物可以用于使鳥對抗球蟲病免疫的方法中。為鳥接種疫苗抗球蟲病的方法在本領域中已知，并且包括胚胎(例如，美國專利6,500,438;美國專利6，495，146;和美國專利6,627,205;PfizerInc.)和孵化后(例如，屬于AuburnResearchFoundation的美國專利3,147,186;美國專利5，055，292禾口美國專利4,438,097,兩者均屬于NationalResearchDevelopmentCorporation)疫苗接種方法。術語"原生動物"包括野生型菌抹，早熟或特別篩選的菌林、減毒菌林，和已經(jīng)減毒的卵嚢，例如，通過輻射、化學處理等。此外，術語"原生動物"還包括任何新發(fā)現(xiàn)的原生動物菌株或種。最后，術語"原生動物"包含活的和已殺死的原生動物，雖然除非特別說明意欲的則是表示活的原生動物。術語"產(chǎn)生"或卵嚢的"產(chǎn)生，，等通常指從動物中收獲卵嚢并從糞便材料中純化卵嚢的過程。產(chǎn)生卵嚢如艾美球蟲卵嚢的方法在本領域中已知(參見，例如，屬于AubumResearchFoundation的美國專利3,147,186;術i吾InternationaleOctrooiMaatschappij，，Octropa，，B.V.的美國專利4,544,548;屬于UnileverPatentHoldings的美國專利4,863,731;屬于Pfizer,Inc.的國際專利7>開WO00/50072;屬于Embrex，Inc.的WO03/020917;和屬于NovusInternational,Inc.的WO02/37961;Hammond等，(1944)Amer.J.Vet.Res.5:70;Hill等，(1961)J.Parasit.47:357;Jackson,(1964)Parasitology54:87;Lotze等，(1961)J.Parasit.47:588;Schmatz等，(1984)丄Protozool.31:181;Whitlock,(1959)Aust.Vet.J.35:310;Kowalik等，(1999)Parasitol.Res.85:496-499.)。參考圖1-2，現(xiàn)在將討論根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式從產(chǎn)孢卵嚢中釋放孢子被的方法。起初，可以用熱和/或化學和/或酶預處理產(chǎn)孢卵嚢，削弱卵嚢的壁(框100)。由熱、化學和/或酶處理導致的削弱使卵嚢壁容易通過之后施加的剪切力而破裂。示例性的熱處理包括但不限于，將卵嚢加熱至37°C和41。C之間0.5小時至2小時。示例性的化學處理包括但不限于，次氯酸鹽溶液或包含溶解的二氧化碳和半胱氨酸鹽酸鹽的水溶液，以及牛磺脫氧膽酸。示例性的酶處理包括但不限于，例如，胃蛋白酶和多種磷脂酶。熱、化學和/或酶預處理產(chǎn)孢卵嚢是可選的，不是本發(fā)明的實施方式所必需。此外，特定類型的產(chǎn)孢卵嚢可以不需要預處理來削弱其壁。可以使用熱、化學和/或酶處理的多種組合。制備包含懸浮于其中的產(chǎn)孢卵嚢的水溶液(框110)。示例性的水溶液包括但不限于，Hank's平衡鹽溶液(HBSS)、磷酸緩沖鹽(PBS)、RPMI培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基，或與蛋白質(zhì)如酪蛋白或蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物如酪蛋白水解產(chǎn)物或大豆蛋白水解產(chǎn)物組合的上述溶液。然后使水溶液經(jīng)受足以使卵嚢壁破裂并從中釋放孢子被的剪切力(框120)。從水溶液中回收所釋放的孢子被(框130)?？梢詫厥盏逆咦颖贿M行后續(xù)處理(框140)和/或可以凍存(框150)。參考圖2，根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，通過在壓力下(例如，在約2,000psi和約6,000psi之間)使水溶液通過微射流均質(zhì)機處理器腔室(框122),使水溶液經(jīng)受足以使卵嚢壁破裂并從中釋放孢子被的剪切力(框120X可從MicrofluidicsCorporation,30OssipeeRoad,Newton,MA獲得微射流均質(zhì)機(Microfluidizer⑧)處理器。微射流均質(zhì)機允許高壓溶液流以超高速在精確設定的微通道或腔室中撞擊。(可以使用的其他細胞破裂設備包括但不限于，由ConstantSystemLtd.,Daventry，Northants，NN114SD，England,UK生產(chǎn)的ConstantCellDisruptionSystem)。本發(fā)明的實施方式不限于使用微射流均質(zhì)積j處理器腔室。微射流均質(zhì)機處理器腔室對流過其中的溶液施加剪切和撞擊的組合力。每個腔室設計有固定的幾何規(guī)格，并且經(jīng)過配置使產(chǎn)物流加速至高速。固定幾何規(guī)格的構造允許對施加的剪切力進行精確的控制與監(jiān)控。通過使用腔室?guī)缀我?guī)格、腔室直徑和施加壓力的有限組合，可以實現(xiàn)對剪切力的控制。受控過程的其他方面包括使用溶液的性質(zhì)和配制，包括參數(shù)如粘度、比重、化學組成、滲透壓、pH和溫度。可以由本領域技術人員使用常規(guī)過程確定最優(yōu)條件。通過在僅使用緩沖液的有限條件下進行測試實驗和測定流速，可以確保過程的一致性。通過這樣的測試在一^:時間內(nèi)追蹤流速可以得到設備中磨損情況或系統(tǒng)中其他錯誤的指示跡象，并且可以采取修正措施使系統(tǒng)恢復標準操作條件。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式可以使用的示例性微射流均質(zhì)機處理器腔室包括具有"Y-型"和"Z-型"構造的腔室。Y-型腔室包括兩個交匯于一點的進料流道和作為單獨流道的出口。Z-型腔室具有Z-型的單一流道。用于孢子被最優(yōu)回收的腔室構造可以因物種而異。因此，對于不同類型的卵嚢可以選擇不同的腔室構造。此外，可以串聯(lián)安放微射流均質(zhì)機處理器腔室。此外，微射流均質(zhì)機處理器腔室可以具有不同的直徑。例如，可以采用在約75微米(iiim)和約500jLim之間的直徑。不同直徑的微射流均質(zhì)機處理器腔室也可以串聯(lián)安放。申請人發(fā)現(xiàn)，直徑與溶液中卵嚢直徑基本相等或大于卵嚢直徑的腔室特別有效。例如，對于巨型艾美i^蟲卵嚢，其直徑通常約20pm至40優(yōu)選直徑約300pm的反應腔室。然而，也可以使用從約75pm至約400jam范圍中的直徑。通常，使用的流道是Z構造，盡管也可以使用Y構造和其他構造。流速通常在從約每分鐘500mL至約每分鐘2000mL的范圍中，壓力在從1000至5000psi的范圍中。從巨型艾美球蟲卵嚢釋放孢子被通常需要的剪切力的量從約每分鐘3.00xl05sec"至約每分鐘1.50x106sec"。對于柔嫩艾美球蟲卵嚢，其直徑通常為約15nm至25pm，和堆型艾美球蟲，其直徑通常為約10nm至15pm，優(yōu)選直徑為100pm的微射流均質(zhì)機處理器反應腔室。然而，也可以使用從約75pm至約400pm的直徑。通常，使用的流道為Z構造，盡管也可以使用Y構造或其他構造。流速通常在從約每分鐘100mL至約每分鐘250mL的范圍中，壓力在從1000至4000psi的范圍中。從卵嚢釋放柔嫩艾美球蟲或堆型艾美球蟲孢子被通常需要的剪切力的量/人約每分鐘1.00x106sec"至約每分4中3.00xl06sec-1。對于任何種艾美球蟲卵嚢，可以使用產(chǎn)生更低剪切力的條件從卵嚢釋放孢子被，特別是當卵嚢已經(jīng)進行了熱、化學或酶預處理時。盡管可以多次通過腔室，但是優(yōu)選一次通過。本發(fā)明的實施方式不為特定卵嚢限定特定的腔室直徑。本發(fā)明的實施方式可以利用具有所有類型構造和直徑的腔室。參考圖3，其中描述了微射流均質(zhì)機處理器200。所描述的微射流均質(zhì)機處理器200包括入口儲罐202,其中盛有產(chǎn)孢卵嚢的水溶液。通過泵204(例如，常壓增強泵等)對水溶液加壓并泵出^f吏其通過腔室206(例如，Y-型、Z-型腔室等)。在腔室206中對加壓水溶液中的卵嚢施加剪切力和碰撞力，從卵嚢壁釋放孢子被。在出口儲罐208中收集包含所釋放的孢子被的水溶液?；仡檲D1,根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，可以確定從卵嚢釋放和回收的孢子被的百分比(即，孢子被得率)(框160)?？梢酝ㄟ^，例如，顯微鏡評價孢子被收率。由顯微鏡認定回收的孢子被可以是活的或死的或其混合物。然而，僅通過顯微鏡不能確定存活狀態(tài)。因此，還可以進行測定，確定釋放的孢子被中活孢子被的百分比(即，活性收率)。確定活性收率需要體內(nèi)過程。適當?shù)捏w內(nèi)過程可以包括通過經(jīng)口喂食向鳥類受試對象施用孢子被制備物并將得到的卵嚢產(chǎn)出結(jié)果與通過施用相當數(shù)量的完整卵嚢獲得的結(jié)果相比較。參考圖4，可以以多種方法和為多種目的處理回收的孢子被。例如，可以從回收的孢子被制備疫苗(框141)并凍存以保存(框142)。參考圖5,根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，可以處理回收的孢子被，從中釋放(即，脫嚢)孢子體(框143)?？梢允褂冕尫诺逆咦芋w制備疫苗(框144)或者可以用于一些其他目的。從脫嚢孢子體制備的疫苗可以凍存以保存(框145)。根據(jù)本發(fā)明的實施方式，可以處理任何類型的卵嚢。特別合適的卵嚢是艾美球蟲卵嚢，包括但不限于，巨型艾美球蟲卵嚢、和緩艾美球蟲卵嚢、柔嫩艾美球蟲卵嚢、堆型艾美球蟲卵嚢、布氏艾美球蟲卵嚢、毒害艾美球蟲卵嚢、早熟艾美球蟲卵嚢、變位艾美球蟲卵嚢及其任何組合，火雞和緩艾美球蟲卵嚢、腺艾美球蟲卵嚢、火雞孔雀艾美球蟲卵嚢、分散艾美球蟲卵嚢、無害艾美球蟲卵嚢和近圓艾美球蟲卵嚢及其任何組合，邱氏艾美球蟲卵嚢、牛艾美球蟲卵嚢及其任何組合，阿撒他艾美球蟲卵嚢、巴庫艾美球蟲卵嚢、槌形艾美球蟲卵嚢、浮氏艾美球蟲卵嚢、顆粒艾美球蟲卵嚢、錯亂艾美球蟲卵嚢、馬爾西卡艾美球蟲卵嚢、類綿羊艾美球蟲卵嚢、蒼白艾美球蟲卵嚢、小型艾美球蟲卵嚢、溫布里吉艾美球蟲卵嚢及其任何組合，腸艾美球蟲卵嚢、維氏艾美球蟲卵嚢、梨形艾美球蟲卵嚢、盲腸艾美球蟲卵嚢、無殘艾美球蟲卵嚢、黃艾美球蟲卵嚢、小型艾美球蟲卵嚢、大型艾美球蟲卵嚢、穿孔艾美球蟲卵嚢、中型艾美球蟲卵嚢、斯氏艾美球蟲卵囊及其任何組合。已經(jīng)描述了本發(fā)明，同樣的內(nèi)容將以下述實施例更詳細地解釋，所述實施例僅為說明目的包括于本文中，不意欲限定本發(fā)明。實施例實施例1進行了一系列實驗旨在較寬參數(shù)值范圍內(nèi)的孢子被回收和卵嚢破裂。每個實驗使用500mLHBSS中的總數(shù)約2xl08的產(chǎn)孢卵嚢(每mL4xl05產(chǎn)孢卵嚢)；在微射流均質(zhì)機處理器處理之前取部分樣品計數(shù)。待測試的腔室直徑根據(jù)物種而不同l)巨型艾美J求蟲200、300、40(H效米直徑腔室；2)柔嫩艾美球蟲200、300微米直徑腔室；3)堆型艾美球蟲125微米腔室。使用一次通過模式。使用從2,000psig至6,000psig的壓力，具體取決于研究。在通過微射流均質(zhì)機處理器之后，用HBSS將總體積調(diào)至1L，混合樣品，并取部分樣品計數(shù)。通常地，使用每種條件進行三次重復實驗。使用血球計確定每次實驗中回收的孢子被百分比和破裂的卵嚢百分比。理想地，孢子被回收百分比和卵嚢破裂百分比均為100%。使用微射流均質(zhì)機處理器釋放堆型艾美球蟲孢子被<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>堆型艾美球蟲1微射流均質(zhì)機實驗的結(jié)論1)觀察到堆型艾美球蟲破裂卵嚢的百分比隨著使用125微米腔室的壓力的增力口而i曾力口。2)使用125微米腔室在5000psig獲得孢子被回收的最佳結(jié)果(54。/?；厥章?。使用微射流均質(zhì)機處理器釋放巨型艾美球蟲l孢子被<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>數(shù)值為單次通過實驗的至少三次重復的平均值。巨型型艾美球蟲1微射流均質(zhì)機實驗的結(jié)論1)孢子被釋放過程幾乎對所有腔室直徑和測試壓力的組合都運行得相當好。2)300微米腔室和3000psig壓力的組合提供合適的初始標準條件，用于使用微射流均質(zhì)機處理器產(chǎn)生巨型艾美球蟲l孢子被。使用微射流均質(zhì)機處理器釋放巨型艾美球蟲2孢子被<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>數(shù)值為單次通過實驗的至少三次重復的平均值。巨型型艾美球蟲2微射流均質(zhì)機實驗的結(jié)論1)孢子被釋放過程幾乎對所有腔室直徑和測試壓力的組合都運行得相當好。2)300孩i米腔室和3000psig壓力的組合^皮認為是最佳的。使用微射流均質(zhì)機處理器釋放柔嫩艾美球蟲l孢子被<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>數(shù)值為單次通過實驗的至少三次重復的平均值。柔嫩艾美球蟲1微射流均質(zhì)機實驗的結(jié)論1)正如預期，對于測試的兩種腔室，觀察到柔嫩艾美球蟲孢子被回收和破裂卯囊的百分比均隨著壓力的增加而增加。2)使用125微米腔室，在4000psig壓力獲得最佳結(jié)果。本發(fā)明的實施方式為孢子被的回收提供超越常規(guī)組織研磨、玻璃珠和化學釋放方法的，可重復，可規(guī)?；奶娲椒?。提供了從巨型艾美球蟲1和巨型艾美球蟲2基本定量地回收孢子被。觀察到了柔嫩孢子被的接近定量回收。堆型艾美球蟲卵嚢的回收率約為40-50%。實施例2使用細胞破裂設備釋放孢子被需要優(yōu)化釋放條件，確保釋放的孢子被的活性。通過對鳥提供一定劑量的孢子被，并且通過計數(shù)由于感染而產(chǎn)生的相關卵囊，可以評價活性。在細胞破裂設備腔室?guī)缀我?guī)格和壓力不同的多種條件下，可能在無活性狀態(tài)從卵嚢有效釋放孢子被。即，與使用通過傳統(tǒng)方法如玻璃珠而釋放的孢子被而實現(xiàn)的感染相比，由于施用孢子4皮而在鳥中產(chǎn)生的感染可以減輕。必須認真評價腔室?guī)缀我?guī)格和壓力條件，確保產(chǎn)生活的孢子被。使用玻璃珠或結(jié)構為100Z腔室的微射流均質(zhì)機處理器，在2000psi或5000psi，從堆型艾美球蟲卵嚢釋放孢子被。然后使用每劑量1000、3000和5000孢子被，以劑量響應模型對雞施用由每種方法釋放的孢子被。每種處理采用三次重復實驗，每次重復實驗包含九只鳥。測試中還包括代表5000個孢子被的、濃度為每劑量1250個產(chǎn)孢卵嚢的卵嚢對照。從填喂后4至7天將卵嚢收集到10%檸檬酸、0.75%過氧化氫和0.25丙酸的水溶液中。使用水使包含卵囊的糞便的體積一致，混合并從中取樣。使用McMaster的方法計數(shù)卵嚢。結(jié)果示于下表中壓力對堆型艾美球蟲孢子被的活性的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>在接受處理的孢子被之間進行統(tǒng)計學比較。通常不同字母代表p=.05的顯著差異。結(jié)果表明，在每一劑量，使用微射流均質(zhì)機在2000psi產(chǎn)生的孢子被和使用傳統(tǒng)玻璃珠方法產(chǎn)生的孢子被的活性相同，而使用微射流均質(zhì)機處理器在5000psi產(chǎn)生的孢子被活性顯著低于每一劑量使用玻璃珠產(chǎn)生的活性。因此必須通過實驗確定獲得活孢子被的壓力范圍。實施例3觀察到，與更大的巨型艾美球蟲種(長約40微米)相比，更小的艾美球蟲種，包括堆型艾美球蟲(長約12微米)和柔嫩艾美球蟲(長約20微米)更不易受剪切影響。對于任何物種，通過在微射流均質(zhì)機系統(tǒng)中增加壓力而產(chǎn)生更高水平的剪切能促進從卵嚢獲得孢子被的顯微鏡收率，但是更小的物種特別需要有效的釋放；然而，增加壓力還能降低活性。降低壓力來提高活性本質(zhì)上會犧牲收率。已經(jīng)開發(fā)了預處理來調(diào)節(jié)卵嚢壁，同時提供改進的顯微鏡收率和改進的活性。進行研究了解使用膽汁鹽(牛磺脫氧膽酸(TDCA))、厭氧環(huán)境(鼓泡二氧化碳)和溫暖的溫度(于37°C達1小時)的組合預處理卵嚢的效果。研究的目的是確定釋放的孢子被的體外回收率(通過顯微鏡)和體內(nèi)活性(通過產(chǎn)生的卵嚢)。建立下述處理組(l)堆型艾美球蟲產(chǎn)孢卵囊對照；每劑1000個已產(chǎn)孢子的卵嚢；(2)玻璃珠產(chǎn)生的孢子被對照；每劑4000個孢子被；(3)微射流均質(zhì)才幾產(chǎn)生的未加預處理的；包子,皮對照；100ixm腔室；2,000psi;4000孢子凈皮；(4)微射流均質(zhì)機產(chǎn)生的進行了預處理的孢子被，所述預處理包括0.75%?；敲撗跄懰?TDCA)和于37。C鼓泡二氧化碳1小時；100iam腔室；2,000psi;每劑4000孢子被；(5)微射流均質(zhì)機產(chǎn)生的進行了預處理的孢子被，所述預處理包括0.75%TDCA和于37°C鼓泡二氧化碳1小時；100pm腔室；3,000psi;每劑4000孢子被；(6)微射流均質(zhì)機產(chǎn)生的進行了預處理的孢子被，所述預處理包括0.75%TDCA和于37°C鼓泡二氧化碳1小時；100(im腔室；4,000psi;每劑4000孢子被。使用Percoll從孢子被制備物中去除殘余的完整卵嚢和卵嚢殼。將孢子被以每劑4,000個孢子被的劑量輸送給鳥，提供相當于每劑l，OOO個卵嚢的對照的劑量，因為每個卵嚢包含四個孢子被。用顯微鏡評價從卵嚢回收孢子被的回收率。微射流均質(zhì)機產(chǎn)生的材料的結(jié)果總結(jié)于下面的表中使用預處理的堆型艾美球蟲孢子被的顯微鏡回收率處理預處理微射流均質(zhì)機壓力(psi)回收的孢子被(％)無20005.424有200033.70有300054.906有400065.48在2000psi，預處理將孢子被回收率提高了約六倍，并且隨著壓力的增力口，觀察到顯微鏡回收率的進一步提高。為了進行體內(nèi)評價，每種處理使用5次重復實驗，每次九只鳥。通過口19服填喂進行處理。填喂后4至7天，將糞便收集在10%檸檬酸、0.75%過氧化氬和0.25。/。丙酸的水溶液中。使包含卵嚢的糞便體積一致、混合并從中取樣。使用McMaster方法計數(shù)卵嚢。通過比較每只鳥產(chǎn)生的卵嚢，相對于玻璃珠產(chǎn)生的孢子被對照，評價使用所述釋放方法產(chǎn)生的孢子被活性。在下表中總結(jié)了結(jié)果從預處理的卵嚢中釋放的堆型艾美球蟲孢子被的活性<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>對于每只鳥平均產(chǎn)生的卵嚢，各組處理之間沒有顯著差異(p、05)。在較寬范圍的壓力下，預處理使釋放的卵嚢活性增加。在某些情況下，通過微射流均質(zhì)機方法從預處理的卵嚢釋放的孢子被活性在數(shù)值上高于玻璃珠釋放的孢子被。因此預處理的總體效果為兩倍，既在釋放步驟中提高從卵嚢的回收率，還提高活性。前述為對本發(fā)明的說明，不應理解為對其的限定。盡管已經(jīng)描述了本發(fā)明的一些示例性實施方式，但是本領域的技術人員應了解的是，在不實質(zhì)背離本發(fā)明的教導和優(yōu)勢的情況下，實例實施方式中很多修正都是可能的。因此，所有這些修正意欲包括在如權利要求所定義的本發(fā)明的范疇中。本發(fā)明通過下述權利要求定義，本文包括權利要求的同義內(nèi)容。權利要求1.從卵囊中釋放孢子被的方法，所述方法包括制備包含懸浮于其中的卵囊的溶液；使所述溶液經(jīng)受足以使卵囊壁破裂的受控剪切力并從中釋放活孢子被；和從所述溶液中回收釋放的活孢子被。2.如權利要求l所述的方法，其中所述的使所述溶液經(jīng)受足以使卵嚢壁破裂的受控剪切力并從中釋放活孢子被包括在壓力下將溶液一次或多次通過微射流均質(zhì)機處理器腔室。3.如權利要求l所述的方法，其中所述溶液包括水溶液。4.如權利要求3所述的方法，其中所述水溶液包括選自下組的溶液Hank's平衡鹽溶液HBSS、磷酸鹽緩沖鹽PBS、RPMI培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基。5.如權利要求l所述的方法，其中用于從巨型艾美球蟲卵嚢中釋放孢子被的剪切力的量為約每分鐘3.00x105sec"至約每分鐘1.50x106sec"。6.如權利要求l所述的方法，其中用于從卵嚢中釋放柔嫩艾美球蟲或堆型艾美球蟲孢子被的剪切力的量為約每分鐘l.OOxlO6sec-1至約每分鐘3.00xl06sec-1。7.如權利要求2所述的方法，其中通過微射流均質(zhì)機處理器腔室的溶液^皮力口壓到約1,000psi至約6,000psi。8.如權利要求7所述的方法，其中所述微射流均質(zhì)機處理器腔室的直徑為約75微米至約400微米，并且其中所述溶液的流速為約100mL至約2,000mL。9.如權利要求l所述的方法，其中所述微射流均質(zhì)機處理器腔室具有Z型結(jié)構。10.如權利要求1所述的方法，其中所述微射流均質(zhì)機處理器腔室具有Y型結(jié)構。11.如權利要求1所述的方法，其中所述微射流均質(zhì)機處理器包括多個腔室，還包括選擇其直徑與卵嚢的直徑基本相等或大于卵嚢直徑的腔室，并且使溶液在壓力下通過所選^^的腔室。12.如權利要求1所述的方法，其中所述孩i射流均質(zhì)機處理器包括多個串聯(lián)腔室，每個腔室具有各自不同的直徑，還包括選擇直徑與卵嚢的直徑基本相等或大于印囊直徑的腔室，并且使溶液在壓力下通過所選擇的腔室。13.如權利要求1所述的方法，其包括在使溶液經(jīng)受受控剪切力之前對卵嚢進行熱處理，以削弱卵嚢壁。14.如權利要求1所述的方法，其包括在使溶液經(jīng)受受控剪切力之前對卵嚢進行化學處理，以削弱印嚢壁。15.如權利要求1所述的方法，其包括在使溶液經(jīng)受受控剪切力之前對卵嚢進行酶處理，以削弱卵嚢壁。16.如權利要求1所述的方法，其包括在使溶液經(jīng)受受控剪切力之前使用熱、化學或酶處理的組合處理卵嚢，以削弱卵嚢壁。17.如權利要求l所述的方法，其進一步包括將回收的孢子被凍存。18.如權利要求1所述的方法，其進一步包括使用回收的孢子被進行疫苗制備和/或診斷試驗。19.如權利要求1所述的方法，中脫嚢。20.如權利要求19所述的方法，苗。21.如權利要求1所述的方法，被的百分比。22.如權利要求1所述的方法，分比。其進一步包括將孢子體從回收的孢子被其進一步包括使用脫嚢的孢子體制備疫其進一步包括測定從卵嚢中釋放的孢子其進一步包括測定釋放的活孢子被的百23.如權利要求l所述的方法，其中所述卯嚢是艾美球蟲卵嚢。24.如權利要求23所述的方法，其中艾美球蟲卵嚢選自巨型艾美球蟲卵嚢、和緩艾美球蟲卵嚢、柔嫩艾美球蟲卵嚢、堆型艾美球蟲卵嚢、布氏艾美球蟲卵嚢、毒害艾美球蟲卵嚢、早熟艾美球蟲卵嚢、變位艾美球蟲卵嚢及其任何組合。25.如權利要求23所述的方法，其中所述艾美球蟲卵嚢選自火雞和緩艾美球蟲卵嚢、腺艾美球蟲卵嚢、火雞孔雀艾美球蟲卵嚢、分散艾美球蟲卵嚢、無害艾美球蟲卵嚢和近圓艾美球蟲卵嚢及其任何組合。26.如權利要求23所述的方法，其中所述艾美球蟲卵嚢選自邱氏艾美球蟲卵嚢、牛艾美球蟲卵嚢及其任何組合。27.如權利要求23所述的方法，其中所述艾美球蟲卵囊選自阿撒他艾美球蟲卵嚢、巴庫艾美球蟲卯嚢、槌形艾美球蟲卯嚢、浮氏艾美球蟲卵嚢、顆粒艾美球蟲卵嚢、錯亂艾美球蟲卵嚢、馬爾西卡艾美球蟲卵嚢、類綿羊艾美球蟲卯嚢、蒼白艾美球蟲卵嚢、小艾美球蟲卵嚢、溫布里吉艾美球蟲卵嚢及其任何組合。28.如權利要求23所述的方法，其中所述艾美球蟲卵嚢選自腸艾美球蟲卵嚢、維氏艾美球蟲卵嚢、梨形艾美球蟲卵囊、盲腸艾美球蟲卵嚢、無殘艾美球蟲卵嚢、黃艾美球蟲卵嚢、小型艾美球蟲卵嚢、大型艾美球蟲卵嚢、穿孔艾美球蟲卵囊、中型艾美球蟲卵嚢、斯氏艾美球蟲卵嚢及其任何組合。29.從卯嚢中釋放孢子體的方法，所述方法包括制備包含懸浮于其中的卵嚢的溶液，；使所述溶液經(jīng)受足以使卵嚢壁破裂的受控剪切力并從中釋放活孢子體;和從所述溶液中回收釋放的活孢子體。30.如權利要求29所述的方法，其中所述的使所述溶液經(jīng)受足以使卵嚢壁破裂的受控剪切力并從中釋放活孢子體是包括在壓力下將溶液一次或多次通過微射流均質(zhì)機處理器腔室。31.如權利要求29所述的方法，其中所述溶液包括水溶液。32.如權利要求29所述的方法，其包括在使溶液經(jīng)受受控剪切力之前處理卵嚢以削弱其壁。33.如權利要求29所述的方法，其進一步包括將回收的孢子體凍存。34.如權利要求29所述的方法，其進一步包括使用回收的孢子體進行疫苗制備和/或診斷試驗。全文摘要本發(fā)明提供了從卵囊中釋放孢子被/孢子體的方法，其中使卵囊溶液經(jīng)受足以使卵囊壁破裂的受控剪切力，并從中釋放孢子被/孢子體。在腔室直徑、腔室?guī)缀我?guī)格和壓力受到限定的條件下，使卵囊溶液通過微射流均質(zhì)機處理器腔室單元。卵囊撞擊腔室壁，并經(jīng)受受控高剪切力，撕開卵囊壁并釋放完整的孢子被/孢子體。文檔編號A61K39/42GK101622011SQ200880004548公開日2010年1月6日申請日期2008年1月29日優(yōu)先權日2007年2月8日發(fā)明者克里安妮·威爾遜,凱利·M·哈里斯,安杰拉·哈特曼,詹姆斯·E·哈欽斯申請人:恩布里克斯公司