專利名稱：用于治療軟骨疾病的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含獸醫(yī)用等的用于軟骨再生或用于治療軟骨疾病的組合物等。
背景技術(shù)：
例如關(guān)節(jié)軟骨是透明軟骨，含有少量的細胞、膠原性的胞外基質(zhì)，較多的蛋白聚糖 和水。骨骼中存在血管或神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，具有自身修復能力，因此即使骨折時，骨折部分大多可 以充分修復。但是，關(guān)節(jié)軟骨中不存在血管和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。因此幾乎沒有自身修復能力，特別 是形成了大的軟骨缺損部位時，軟骨缺損部位無法充分修復，即使有被修復的部分，也形成 與透明軟骨力學特性不同的纖維軟骨。因此，如果形成了軟骨缺損，則導致關(guān)節(jié)痛以及關(guān)節(jié) 功能的喪失，常進展為骨關(guān)節(jié)炎。另外，由于老齡或關(guān)節(jié)的過度使用，病狀由關(guān)節(jié)軟骨表面 開始磨損的骨關(guān)節(jié)炎的初期階段逐步進展，結(jié)果導致大范圍的軟骨缺損。如上所述，關(guān)節(jié)軟骨的自身修復能力不足，因此必須進行自體骨軟骨鑲嵌移植術(shù) (Mosaicplasty)、用鉆打孔的方法(微骨折術(shù)microfracture)、鉆孔術(shù)(drilling)、用棒 削除軟骨下骨的方法(磨削術(shù)abrasion法)、以及切除損傷軟骨(清創(chuàng)術(shù)debridement) 等治療軟骨損傷的外科處置。其中，微骨折術(shù)、鉆孔術(shù)、磨削術(shù)被稱為骨髓刺激法(marrow stimulation technique)，促進骨髓出血，誘導來自骨髓的軟骨前體細胞，期待其分化成軟 骨。但是，它們對于大范圍的軟骨缺損是有極限的，通過該方法再生的是與透明軟骨力學特 性不同的纖維軟骨。Peterson等人以及Grande等人于1984年在兔的關(guān)節(jié)軟骨的非完全層中試驗了自 體軟骨細胞移植(ACI)法。ACI法是由自身的正常軟骨中采集組織并培養(yǎng)、在將培養(yǎng)的細 胞懸浮于培養(yǎng)基中的狀態(tài)下移植到患部、用骨膜覆蓋軟骨缺損部位、使細胞不漏出的方法。 ACI法最早于1994年應用于臨床，目前已超過15年。目前為止臨床已有幾例成功病例的報 告。但是，在最近的臨床試驗中，也有報告指出對于關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復，與其它手術(shù)相比， ACI法并未顯示顯著優(yōu)異的結(jié)果。上述ACI法并不優(yōu)異的結(jié)果有兩個主要的原因。一是細胞和支架與關(guān)節(jié)缺損部位 的固定、以及骨膜瓣的覆蓋有技術(shù)性困難。ACI法中，是將細胞懸浮液用骨膜瓣覆蓋并縫合， 因此必須通過關(guān)節(jié)切開使關(guān)節(jié)較大幅度露出。并且也報道了包含骨膜肥厚、缺損形成、關(guān)節(jié) 內(nèi)粘連的骨膜瓣相關(guān)的幾種復雜的問題。另一個理由是軟骨細胞的應用是有極限的。軟骨 細胞由于單層培養(yǎng)而急速地喪失其分化表型，轉(zhuǎn)化為成纖維細胞。還有另一問題，ACI法必 須是從患部關(guān)節(jié)的不負荷重量的部位采集軟骨，但是供應部位由于被采集了軟骨細胞而保 持有問題的狀態(tài)。另一方面，將膠原、殼聚糖、瓊脂糖、褐藻酸等天然聚合物利用于關(guān)節(jié)軟骨的再 生醫(yī)療的嘗試正在取得進展。其中，褐藻酸是由空莖昆布(Ecklonia cava)、褐藻羽葉藻 (Eisenia bicyclis)、海帶(Laminaria)等褐藻類提取的多糖類，具有加入鈣等2價金屬 離子則形成交聯(lián)的性質(zhì)，人們嘗試利用該性質(zhì)，將軟骨細胞等細胞、生長因子等包埋到凝膠 中，應用于損傷部位(例如參照文獻1、文獻2、3、4、5等)。
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例如，文獻1中公開了將可溶性褐藻酸鹽與不溶性褐藻酸鹽/凝膠混合而成的褐 藻酸凝膠，文獻2、3、4中公開了褐藻酸微球的應用。文獻2中認為，褐藻酸可作為不會對損 傷部位有任何不利影響的載體使用，褐藻酸本身不具有任何治療效果。文獻4中公開了包 埋在褐藻酸微球中的軟骨細胞在移植到兔軟骨缺損部位后未見與宿主組織的融合。另外， 褐藻酸微球必須按壓在缺損部位上應用，必須制成適合缺損部位的大小，這在實際臨床應 用時存在技術(shù)性困難。文獻5中公開在將軟骨細胞懸浮于褐藻酸鈉溶液中注射到兔軟骨 缺損部位后、用CaCl2溶液使表面固化的移植物中，形成了正常的軟骨組織，但是，在不含有 細胞而只將褐藻酸應用于軟骨缺損部位時，則形成了纖維軟骨。作為將間葉系干細胞應用于軟骨再生醫(yī)療的嘗試，例如對于將膠原海綿等作為細 胞的支架等的研究取得了進展。有在機體外分化成軟骨細胞然后移植的方法；和不分化成 軟骨細胞即進行移植的方法，對于哪種利用方法最佳尚有爭論(文獻6)。骨關(guān)節(jié)炎(OA)中的軟骨缺損是在廣泛且負荷區(qū)域內(nèi)發(fā)生，因此難以通過移植或 再生醫(yī)療進行修復。上述的可通過細胞移植成為軟骨再生對象的主要限于由于運動或外傷 等產(chǎn)生的部分軟骨缺損。骨關(guān)節(jié)炎的治療主要著眼于消除患部的疼痛或炎癥，國外的主流 方法是給予非類固醇性抗炎癥藥。但是老年患者腎功能降低，從安全性的角度考慮，難以連 續(xù)口服給予非類固醇性抗炎癥藥。將軟骨關(guān)節(jié)液的成分之一透明質(zhì)酸制成制劑得到的產(chǎn)品 通過給予關(guān)節(jié)腔內(nèi)，具有改善關(guān)節(jié)的潤滑功能、并且抑制疼痛的作用，因此大多作為骨關(guān)節(jié) 炎中關(guān)節(jié)功能改善藥使用。但是，對于軟骨損傷進一步進展形成的重度骨關(guān)節(jié)炎，最終除了 進行人工關(guān)節(jié)置換以外別無它法，人們期待有新型的治療藥物的開發(fā)。[文獻]1.國際公開2006/044342號小冊子2.Cay M. Mierisch 等 人.,"Transforming Growth Factor-β inCalcium Alginate Beads for the Treatment of Articular Cartilage Defectsin the Rabbit 酸鈣微球中的TGF-β用于治療兔的關(guān)節(jié)軟骨缺損)”，The Journal of Arthroscopic and Related Surgery, 18 卷，No. 8 (10 月)，2002 892 900 頁3. David R. Diduch ^A · , "Marrow Stromal Cells Embedded inAlginate for Repair of Osteochondral Defects (包埋有骨髓間充質(zhì)干細胞的藻酸鹽用于修復骨軟骨 缺損)，，，The Journal of Arthroscopic andRelated Surgery, 16 卷，No. 6 (9 月)，2000 571 577頁4.David R. Diduch 等 人.,"Chondrocyte Transplantation intoArticular Cartilage Defects with Use of Calcium Alginate (將軟骨細胞和藻酸鈣一起移植到關(guān) 節(jié)軟骨缺損部位):The Fate of the Cells”，J BoneJoint Surg. Am. 85 :2003，1757 1767 頁5. Ε. Fragonas 等 人.,"Articular Cartilage Repair in Rabbits by UsingSuspensions of Allogenic Chondrocytes in Alginate ( i^^M^^MWi^^fk 的藻酸鹽修復兔的關(guān)節(jié)軟骨)”，Biomaterials，21卷，2000 795 801頁6. Life Science Report No. 4，2005 (編輯東京醫(yī)科齒科大學知識產(chǎn)權(quán)部，發(fā)行 丸善株式會社)，235 243頁，編輯助理關(guān)矢一郎

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題如上所述，在軟骨缺損部位的再生醫(yī)療中，在考慮到實際臨床應用時，從細胞毒性 的問題、與機體的親和性、容易采用的程度、治療效果等角度考慮并不適合實際應用。即，人 們希望能夠開發(fā)無需采取ACI法等過度的外科方法、手術(shù)方法簡便、對機體沒有軟骨細胞 或骨膜采集等產(chǎn)生過度的負擔、可有效促進軟骨再生、對于各種形態(tài)的軟骨損傷部位無需 選擇適用條件均可廣泛利用、可降低施加到軟骨損傷部位的交聯(lián)劑等的負面影響、與機體 親和性優(yōu)異的、可克服上述軟骨再生醫(yī)療領(lǐng)域課題、實際應用性優(yōu)異的用于軟骨再生或用 于治療軟骨疾病的組合物，以及使用該組合物的治療方法。特別是，不包埋細胞而只用聚合 物即可以再生透明軟骨的組合物目前尚不存在。骨關(guān)節(jié)炎是由于老齡或關(guān)節(jié)的過度使用使關(guān)節(jié)軟骨磨損減少的退行性疾病，認為 這并不只是磨損等力學原因，滑膜細胞或軟骨細胞生成炎癥性細胞因子、炎癥性細胞因子 誘導發(fā)痛物質(zhì)或蛋白質(zhì)分解酶等的局部炎癥反應也參與了關(guān)節(jié)破壞。即，伴隨關(guān)節(jié)軟骨的 磨損(機械損傷)，在關(guān)節(jié)組織內(nèi)弓I發(fā)炎癥反應，炎癥反應使自身破壞性軟骨損傷進展，關(guān) 節(jié)功能降低，由此使機械損傷進一步進展，由于該惡性循環(huán)使病態(tài)惡化。因此，對于骨關(guān)節(jié) 炎的治療藥物，需求兼具在磨損中保護軟骨的效果、抑制磨損或炎癥導致的軟骨退行性改 變的效果、修復軟骨損傷部位的效果、抑制炎癥或疼痛的效果等復合性的效果。如果可獲得 可抑制關(guān)節(jié)的炎癥、可抑制疼痛的藥物，也可以應用于肩周炎的治療或慢性風濕性關(guān)節(jié)炎 中的關(guān)節(jié)痛的抑制。透明質(zhì)酸原本是關(guān)節(jié)液的主要成分之一，通過補充該成分可改善關(guān)節(jié) 機能。目前，對軟骨組織具有復合性的治療效果的藥物除透明質(zhì)酸外并無其它藥物。透明 質(zhì)酸制劑是由動物組織提取或通過發(fā)酵方法制備的，人們需求制備更容易、安全性更高的 新型材料。另外，透明質(zhì)酸制劑必須是初期每周給藥一次、連續(xù)給藥五次，和之后的持續(xù)給 藥，為了減少對膝關(guān)節(jié)的注射次數(shù)，人們需求持續(xù)時間更長、治療效果更高的新型組合物。解決課題的方法本發(fā)明人等為解決上述課題進行了深入的研究。通過將含有使內(nèi)毒素水平降低至 實質(zhì)上不會引發(fā)炎癥或發(fā)熱的程度的褐藻酸的1價金屬鹽、粘度為400 20000mPa · s的 具流動性的組合物應用于軟骨損傷部位，得知無需過度的外科方法，通過簡便的方法即可 促進軟骨再生。將上述組合物應用于關(guān)節(jié)軟骨的缺損部位，在其表面應用CaCl2溶液，則該組合物 不會從所應用的位置上移動。令人驚訝的結(jié)果是它可應用于如關(guān)節(jié)軟骨這樣的有負荷、活 動劇烈的嚴酷條件的部位。通過使本發(fā)明的組合物的粘度為約2000mPa 以上，即使在損 傷面朝向下方的姿勢下也可應用。本發(fā)明的組合物在包埋有骨髓間充質(zhì)干細胞或間質(zhì)細胞時，獲得了明顯優(yōu)異的軟 骨再生。還發(fā)現(xiàn)，在不包埋這些細胞時，本發(fā)明的組合物也獲得了透明軟骨細胞帶來的良好 的透明軟骨再生，從而完成了本發(fā)明。另外，將含有使內(nèi)毒素水平降低至實質(zhì)上不會引發(fā)炎癥或發(fā)熱的程度的褐藻酸的 1價金屬鹽的組合物應用于骨關(guān)節(jié)炎模型的軟骨損傷部位，發(fā)現(xiàn)可抑制軟骨退行性改變、獲 得保護軟骨的效果。并且，在試驗性關(guān)節(jié)炎疼痛模型中，發(fā)現(xiàn)該組合物具有抑制關(guān)節(jié)炎引起 的疼痛的效果，從而完成了本發(fā)明。
關(guān)節(jié)液的主要成分-透明質(zhì)酸以外的物質(zhì)對上述軟骨組織具有復合性的效果，這 首次得到證實。來自海藻的聚合物、在動物體內(nèi)原本不存在的褐藻酸具有上述效果，這是另 人驚訝的。S卩，本發(fā)明提供應用于軟骨損傷部位的、以下的用于軟骨再生的組合物。(1-1)用于軟骨再生的組合物，該組合物應用于軟骨損傷部位而在患部固化，該組 合物含有低內(nèi)毒素褐藻酸的1價金屬鹽、粘度為400mPa · s 20000mPa · s、具有流動性。(1-2)上述(1-1)所述的組合物，其中，上述褐藻酸的1價金屬鹽為褐藻酸鈉。(1-3)上述(1-2)所述的組合物，其中，上述褐藻酸鈉是通過凝膠過濾色譜測得的 重均分子量為50萬以上的褐藻酸鈉。(1-4)上述(1-1) (1-3)中任一項所述的組合物，其中，對上述軟骨損傷部位的 應用為以下任意形式a)應用于軟骨缺損部位、b)在軟骨損傷部位或軟骨缺損部位形成一 個以上的孔，應用于該形成的孔。(1-5)上述(1-1) (1-4)中任一項所述的組合物，其特征在于該組合物中不含 有用于軟骨組織再生的細胞。(1-6)上述(1-1) (1-4)中任一項所述的組合物，其中，該組合物中包埋有用于 軟骨組織再生的細胞。(1-7)上述(1-6)所述的組合物，其中，上述含有包埋了細胞的褐藻酸的1價金屬 鹽的組合物在應用于軟骨損傷部位之前，包埋體外培養(yǎng)至選自下述的1種以上的狀態(tài)的細 胞a)細胞數(shù)為IXlO6個/mL以上的狀態(tài)、b)通過番紅0染色或H-E染色檢測出透明軟 骨組織的狀態(tài)、c)通過抗膠原II型抗體或基因分析檢測出II型膠原的狀態(tài)、d)通過抗糖 苷配基抗體或基因分析檢測出糖苷配基的狀態(tài)、e)分泌胞外基質(zhì)(膠原、透明質(zhì)酸、蛋白聚 糖)的狀態(tài)。(1-8)上述(1-6)或(1-7)所述的組合物，其中，用于上述軟骨組織再生的細胞包 含骨髓間充質(zhì)干細胞。(1-9)上述(1-1) (1-8)中任一項所述的組合物，其中，在將上述組合物應用于 上述軟骨缺損部位的開口部、或者在上述軟骨損傷部位或軟骨缺損部位上形成的孔的開口 部傾斜的、或者是朝向下方的狀態(tài)的軟骨損傷部位時，至少在損傷部位附著5秒以上。(1-10)上述(1-1) (1-9)中任一項所述的組合物，其中，該組合物可用16G的注 射針應用于軟骨損傷部位。(1-11)上述(1-1) (1-10)中任一項所述的組合物，其中，將上述組合物應用于 軟骨損傷部位，并在該組合物的表面應用交聯(lián)劑。(1-12)上述(1-11)所述的組合物，其中，上述交聯(lián)劑是CaCl2溶液。(1-13)上述(1-1) (1-12)中任一項所述的組合物，其中，上述軟骨損傷部位是 關(guān)節(jié)軟骨的損傷部位。(1-14)上述(1-1) (1-13)中任一項所述的組合物，其中，上述軟骨的再生是以 透明軟骨的再生為目的。本發(fā)明還提供可通過向軟骨疾病患者的關(guān)節(jié)內(nèi)注入給藥來獲得治療效果的組合 物。(2-1)用于治療軟骨疾病的組合物，該組合物關(guān)節(jié)內(nèi)注入給藥，其特征在于含有
6低內(nèi)毒素褐藻酸的1價金屬鹽作為有效成分。(2-2)用于抑制軟骨退行性改變的組合物，該組合物關(guān)節(jié)內(nèi)注入給藥，其特征在 于含有低內(nèi)毒素褐藻酸的1價金屬鹽作為有效成分。(2-3)用于保護軟骨的組合物，該組合物關(guān)節(jié)內(nèi)注入給藥，其特征在于含有低內(nèi) 毒素褐藻酸的1價金屬鹽作為有效成分。(2-4)用于修復軟骨的組合物，該組合物關(guān)節(jié)內(nèi)注入給藥，其特征在于含有低內(nèi) 毒素褐藻酸的1價金屬鹽作為有效成分。(2-5)用于抑制關(guān)節(jié)疼痛的組合物，該組合物關(guān)節(jié)內(nèi)注入給藥，其特征在于含有 低內(nèi)毒素褐藻酸的1價金屬鹽作為有效成分。(2-6)用于抑制關(guān)節(jié)炎癥的組合物，該組合物關(guān)節(jié)內(nèi)注入給藥，其特征在于含有 低內(nèi)毒素褐藻酸的1價金屬鹽作為有效成分。(2-7)用于改善關(guān)節(jié)機能的組合物，該組合物關(guān)節(jié)內(nèi)注入給藥，其特征在于含有 低內(nèi)毒素褐藻酸的1價金屬鹽作為有效成分。(2-8)用于治療骨關(guān)節(jié)炎的組合物，該組合物關(guān)節(jié)內(nèi)注入給藥，其特征在于含有 低內(nèi)毒素褐藻酸的1價金屬鹽作為有效成分。(2-9)用于治療肩周炎的組合物，該組合物關(guān)節(jié)內(nèi)注入給藥，其特征在于含有低 內(nèi)毒素褐藻酸的1價金屬鹽作為有效成分。(2-10)用于抑制風濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)痛的組合物，該組合物關(guān)節(jié)內(nèi)注入給藥，其 特征在于含有低內(nèi)毒素褐藻酸的1價金屬鹽作為有效成分。(2-11)用于關(guān)節(jié)內(nèi)注入的組合物，該組合物具有緩解、改善或治愈與軟骨疾病相 關(guān)的病態(tài)的效果，其特征在于含有低內(nèi)毒素褐藻酸的1價金屬鹽作為有效成分。(2-12) (2-11)所述的組合物，其中，上述的緩解、改善或治愈與軟骨疾病相關(guān)的病 態(tài)的效果選自抑制軟骨退行性改變、保護軟骨、修復軟骨、抑制關(guān)節(jié)痛、抑制關(guān)節(jié)炎癥和改 善關(guān)節(jié)機能的至少一種。(2-13)上述(2-1) (2_12)中任一項所述的組合物，其中，上述褐藻酸的1價金 屬鹽為褐藻酸鈉。(2-14)上述(2-13)所述的組合物，其中，上述褐藻酸鈉是凝膠過濾色譜測得的重 均分子量為50萬以上的褐藻酸鈉。(2-15)用于治療軟骨疾病的組合物，該組合物關(guān)節(jié)內(nèi)注入給藥，其特征在于含 有凝膠過濾色譜測得的重均分子量為50萬以上的低內(nèi)毒素褐藻酸鈉作為有效成分。本發(fā)明進一步提供以下的軟骨損傷部位的治療方法和用于該治療方法的組合物。(3-1)軟骨損傷部位的治療方法，該方法是將組合物應用于軟骨損傷部位，所述組 合物含有低內(nèi)毒素褐藻酸的1價金屬鹽、粘度為400mPa · s 20000mPa · s、具有流動性。(3-2)上述(3-1)所述的方法，該方法是將含有上述褐藻酸的1價金屬鹽的組合物 應用于軟骨損傷部位，并在該組合物的表面應用交聯(lián)劑，使其固化。(3-3)上述(3-1)或(3-2)所述的方法，該方法是在上述含有褐藻酸的1價金屬鹽 的組合物中包埋用于軟骨組織再生的細胞，并將其應用于軟骨損傷部位。(3-4)上述(3-1) (3-3)中任一項所述的方法，該方法是在上述含有褐藻酸的1 價金屬鹽的組合物中包埋用于軟骨組織再生的細胞，在體外培養(yǎng)至選自下述的1種以上的狀態(tài)，然后應用于軟骨損傷部位a)細胞數(shù)為1 X IO6個/mL以上的狀態(tài)、b)通過番紅0染 色或H-E染色檢測出透明軟骨組織的狀態(tài)、c)通過抗膠原II型抗體或基因分析檢測出II 型膠原的狀態(tài)、d)通過抗糖苷配基抗體或基因分析檢測出糖苷配基的狀態(tài)、e)分泌胞外基 質(zhì)(膠原、透明質(zhì)酸、蛋白聚糖)的狀態(tài)。(3-5)上述(3-2) (3_4)中任一項所述的方法，其中，上述交聯(lián)劑是CaCl2溶液。(3-6)上述(3-1) (3-5)中任一項所述的方法，其中，上述應用于軟骨損傷部位 是下述的任意一種應用a)應用于軟骨缺損部位、b)進一步在上述軟骨損傷部位或軟骨缺 損部位形成一個以上的孔，應用于該形成的孔。(3-7)組合物，其特征在于將該組合物應用于上述(3-1) (3-6)中任一項所述 的方法，所述組合物含有低內(nèi)毒素褐藻酸的1價金屬鹽，粘度為400mPa 20000mPa *s， 具有流動性。(3-8)上述(3-7)所述的組合物，其中，含有褐藻酸的1價金屬鹽的組合物中含有 用于軟骨組織再生的細胞。(3-9)上述(3-7)或(3_8)所述的組合物，其中，上述褐藻酸的1價金屬鹽是褐藻 酸鈉。(3-10)用于治療軟骨損傷部位的組合物，其特征在于該組合物含有使內(nèi)毒素水 平降低至實質(zhì)上不會引發(fā)炎癥或發(fā)熱的程度的褐藻酸的1價金屬鹽，粘度為400mPa · s 20000mPa*S，具有流動性，將所述組合物應用于預先在關(guān)節(jié)鏡下經(jīng)清洗并干燥的、作為軟骨 損傷部位應用部位的患部的孔洞，使組合物充分填滿孔洞容積，并在該應用的組合物的表 面應用CaCl2溶液，然后除去殘留在該應用的組合物的表面的CaCl2溶液，使該組合物在患 部固化。本發(fā)明進一步提供軟骨疾病以及相關(guān)的病態(tài)的治療方法。(4-1)治療軟骨疾病的方法，該方法是將組合物關(guān)節(jié)內(nèi)注入給藥，其中，所述組合 物的特征在于含有低內(nèi)毒素褐藻酸的1價金屬鹽作為有效成分。(4-2)抑制軟骨退行性改變的方法，該方法是將組合物關(guān)節(jié)內(nèi)注入給藥，其中，所 述組合物的特征在于含有低內(nèi)毒素褐藻酸的1價金屬鹽作為有效成分。(4-3)保護軟骨的方法，該方法是將組合物關(guān)節(jié)內(nèi)注入給藥，其中，所述組合物的 特征在于含有低內(nèi)毒素褐藻酸的1價金屬鹽作為有效成分。(4-4)修復軟骨的方法，該方法是將組合物關(guān)節(jié)內(nèi)注入給藥，其中，所述組合物的 特征在于含有低內(nèi)毒素褐藻酸的1價金屬鹽作為有效成分。(4-5)抑制關(guān)節(jié)痛的方法，該方法是將組合物關(guān)節(jié)內(nèi)注入給藥，其中，所述組合物 的特征在于含有低內(nèi)毒素褐藻酸的1價金屬鹽作為有效成分。(4-6)抑制關(guān)節(jié)炎癥的方法，該方法是將組合物關(guān)節(jié)內(nèi)注入給藥，其中，所述組合 物的特征在于含有低內(nèi)毒素褐藻酸的1價金屬鹽作為有效成分。(4-7)改善關(guān)節(jié)機能的方法，該方法是將組合物關(guān)節(jié)內(nèi)注入給藥，其中，所述組合 物的特征在于含有低內(nèi)毒素褐藻酸的1價金屬鹽作為有效成分。(4-8)治療骨關(guān)節(jié)炎的方法，該方法是將組合物關(guān)節(jié)內(nèi)注入給藥，其中，所述組合 物的特征在于含有低內(nèi)毒素褐藻酸的1價金屬鹽作為有效成分。(4-9)治療肩周炎的方法，該方法是將組合物關(guān)節(jié)內(nèi)注入給藥，其中，所述組合物的特征在于含有低內(nèi)毒素褐藻酸的1價金屬鹽作為有效成分。(4-10)抑制風濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)痛的方法，該方法是將組合物關(guān)節(jié)內(nèi)注入給藥， 其中，所述組合物的特征在于含有低內(nèi)毒素褐藻酸的1價金屬鹽作為有效成分。(4-11)上述(4-1) (4-10)中任一項所述的方法，其中，上述褐藻酸的1價金屬 鹽是褐藻酸鈉。(4-12)上述(4-11)所述的方法，其中，上述褐藻酸鈉是凝膠過濾色譜測得的重均 分子量為50萬以上的褐藻酸鈉。(4-13)治療軟骨疾病的方法，該方法是將組合物關(guān)節(jié)內(nèi)注入給藥，該組合物的特 征在于含有凝膠過濾色譜測得的重均分子量為50萬以上的低內(nèi)毒素褐藻酸鈉作為有效 成分。發(fā)明效果本發(fā)明的用于軟骨再生的組合物無需采用過度的外科方法即可以注入到軟骨損 傷部位，因此手術(shù)方法簡便。在可以不會對機體施加軟骨細胞采集、骨膜采集等過度的負擔 的情形下有效地促進軟骨再生、特別是透明軟骨再生。本發(fā)明的用于軟骨再生的組合物通過在患部與Ca離子接觸，而具有凝膠固化性。 利用該性質(zhì)使表面固化，由此可以使組合物停留在患部。本發(fā)明的組合物中包埋有用于軟 骨組織再生的細胞時，細胞容易在固化的凝膠中分散?？衫糜诟鞣N形式的軟骨損傷部位， 也可對應于各種應用條件。本發(fā)明的用于治療軟骨疾病的組合物通過以液體狀態(tài)注入到關(guān)節(jié)內(nèi)，可對于廣范 的軟骨損傷部位發(fā)揮治療效果。可在老齡、外傷或骨關(guān)節(jié)炎、椎間盤損傷、半月板損傷、剝脫 性骨軟骨炎等中所見的軟骨損傷部位發(fā)揮修復軟骨、抑制軟骨的退行性改變、以及保護軟 骨的至少一種效果。另外，本發(fā)明的用于治療軟骨疾病的組合物具有抑制關(guān)節(jié)的炎癥和伴隨炎癥的疼 痛的效果?？梢种乒顷P(guān)節(jié)炎、肩周炎、風濕性關(guān)節(jié)炎等中的關(guān)節(jié)的炎癥反應，而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。本發(fā)明的用于治療軟骨疾病的組合物在發(fā)揮對軟骨的機械損傷進行修復、保護、 抑制變性的效果的同時，通過抑制關(guān)節(jié)組織內(nèi)的炎癥反應和疼痛，可抑制軟骨疾病的進展， 緩解或治愈癥狀。特別是對于骨關(guān)節(jié)炎的治療、肩周炎的治療、風濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)痛的緩 解有效。


圖1是表示在各種濃度的CaCl2溶液下的細胞存活率的圖表(實施例4)。圖2是表示純化和食品級的各褐藻酸微球中的細胞存活率的比較結(jié)果的圖表(實 施例5)。圖3是表示實施例6的體外培養(yǎng)中的RT-PCR分析結(jié)果的圖表。圖4是表示實施例6的體外培養(yǎng)中的染色結(jié)果的照片。(A)純化褐藻酸鈉，培養(yǎng) 21天；(B)純化褐藻酸鈉，培養(yǎng)28天；(C)食品級褐藻酸鈉，培養(yǎng)21天；(D)食品級褐藻酸 鈉，培養(yǎng)28天。由左至右依次為用H-E、番紅-0、抗I型、抗II型、抗X型的抗膠原抗體進 行的染色。
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圖5是表示實施例7的兔軟骨修復模型在手術(shù)時的情形的照片。圖6是表示實施例7的兔軟骨修復模型的全體觀察評分標準的圖。圖7是表示實施例7的兔軟骨修復模型的染色評分標準的圖。圖8是實施例7的兔軟骨修復模型中、A)對照組(空白)的組織染色照片。(A) 表示4周后，(B)表示12周后。至左向右依次為H-E染色、番紅0染色、I型膠原、II型膠 原免疫染色的結(jié)果。圖9是實施例7的兔軟骨修復模型中、C)食品級褐藻酸+細胞的組的染色照片。 (A)表示4周后，(B)表示12周后，染色方法與圖8相同。圖10是實施例7的兔軟骨修復模型中、D)純化褐藻酸組(無細胞)的染色照片。 (A)為4周后，⑶為12周后，染色方法與圖8相同。圖11是實施例7的兔軟骨修復模型中、E)純化褐藻酸+細胞的組的染色照片。 (A)表示4周后，(B)表示12周后，染色方法與圖8相同。圖12是表示實施例7的兔軟骨修復模型中的全體觀察和染色的評分結(jié)果的圖。圖13是實施例7的兔軟骨修復模型中、對純化褐藻酸組的D)組、E)組的機械強 度測定結(jié)果的圖。圖14是表示實施例8的尸體模型試驗的情形的照片。圖15是表示各種褐藻酸鈉的濃度(％ )與附著時間(秒)的關(guān)系的圖表。圖16是表示褐藻酸鈉水溶液的粘度(mPa · s)與附著時間(秒)的關(guān)系的圖表。圖17是表示實施例12的兔骨關(guān)節(jié)炎模型中的膝關(guān)節(jié)外觀的照片。圖18是表示實施例12的兔骨關(guān)節(jié)炎模型中的膝關(guān)節(jié)組織的染色照片。圖19是表示對實施例13的兔骨關(guān)節(jié)炎模型中的膝關(guān)節(jié)進行墨汁染色后的外觀的 照片。圖中，用圓圈圈起的部分表示通過墨汁著色的軟骨損傷部位和正常軟骨的邊界。A) 對照組，B) 透明質(zhì)酸鈉給藥組，C)2%褐藻酸鈉給藥組(分子量40萬)，D)2%褐藻酸鈉 給藥組(分子量100萬)，E)2%褐藻酸鈉給藥組(分子量170萬)。照片是多個標本中的 一例。圖20是實施例13的兔骨關(guān)節(jié)炎模型中、對墨汁染色的膝關(guān)節(jié)進行肉眼評分的 結(jié)果。NS、HA、AL40、AL100和AL170分別與A) E)(與圖19相同)對應。1級表示無 墨夕十染色以及無損傷的表面(nouptake of India ink, indicating intact surface)。2 級表示墨汁局部染色以及表面有輕微損傷(minimal focal uptake of India ink, mild surfaceirregularity)。3級表示墨汁的大而清晰的染色以及明顯的原纖化形成(evident large focal dark patches of India ink, overt fibrillation)。 4a 級表不低于 2mm 的 軟骨損傷(erosion of cartilage < 2mm)。4b 級表不 2mm 5mm 的軟骨損傷(erosion of cartilage 2 5mm)。4c 級表不超過 5mm 的軟骨損傷(erosion of cartilage > 5mm)。圖21是實施例13的兔骨關(guān)節(jié)炎模型中的膝關(guān)節(jié)組織的番紅0染色的照片。A) E)與圖19相同。照片是多個標本中的一例。圖22是對實施例13的兔骨關(guān)節(jié)炎模型的病理組織綜合評價進行評分的結(jié)果。NS、 HA、AL40、AL100和AL170分別與A) E)(與圖19相同)對應。圖23是表示實施例15的大鼠實驗性關(guān)節(jié)炎疼痛模型的步行狀態(tài)評分隨時間變化 的圖。A)對照組(NS)，B) 透明質(zhì)酸鈉給藥組(1% HA)，C) 2%褐藻酸鈉給藥組(分子量100萬)(2% AL100)，D)1%褐藻酸鈉給藥組(分子量170萬)(1 % AL170)，E) 2%褐藻酸鈉 給藥組(分子量 170 萬)(2% AL170)。* :p < 0. 05 對 NS序列表的自由文本
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SEQIDNO.9 ；合成DNA
SEQIDNO.10合成DNA
具體實施例方式以下詳細說明本發(fā)明，以下的實施方式是為了說明本發(fā)明而舉例，本發(fā)明只要不 脫離其宗旨即可，可以以各種方式實施。1.概要“軟骨”在關(guān)節(jié)、胸壁、椎間盤、半月板、或者喉頭、呼吸道、耳等管狀結(jié)構(gòu)中可見，可 分類為透明軟骨、彈性軟骨、纖維軟骨三種。例如關(guān)節(jié)軟骨是透明軟骨，含有軟骨細胞、膠原 性的胞外基質(zhì)、蛋白聚糖和水，沒有血管分布。透明軟骨富含II型膠原，具有可被抗II型 膠原抗體染色、被可染色蛋白聚糖的番紅0染色成紅色等特征?！败浌菗p傷”是指由于老齡 或外傷、其它各種因素使軟骨受到障礙的狀態(tài)，例如包含由于某種原因，軟骨的獨特的粘彈 性(施加負荷時緩慢收縮，撤去負荷時緩慢復原)降低；雖然保持可活動性，但支撐負荷方 面產(chǎn)生問題等軟骨功能降低的狀態(tài)。在骨關(guān)節(jié)炎、風濕性關(guān)節(jié)炎等疾病中也可見軟骨損傷。 本發(fā)明涉及可適用于該軟骨損傷部位的、用于軟骨再生的固化性組合物?！败浌侨睋p部位” 是指軟骨損傷部位中，有一部分缺損、消失的部分，是指軟骨組織的空洞部位、以及形成該 空洞部位的周邊的組織。本發(fā)明的組合物優(yōu)選用于“軟骨缺損部位”的治療。更具體地說，本發(fā)明是應用于軟骨損傷部位的用于軟骨再生的組合物，含有使 內(nèi)毒素水平降低至實質(zhì)上不會引發(fā)炎癥或發(fā)熱的程度的褐藻酸的1價金屬鹽，粘度為 400mPa · s 20000mPa · s。因此，本發(fā)明的組合物可以有效促進患部的軟骨再生，而且與軟骨損傷部位的附 著性良好，并且可應用注射器等，因此容易應用于軟骨損傷部位。本發(fā)明中，“軟骨再生”或“軟骨組織再生”是指對已出現(xiàn)功能障礙或功能不全的軟 骨損傷部位謀求功能的再生。本發(fā)明中，功能的再生不一定要完全的功能再生，只要是與應 用本組合物之前的軟骨損傷部位的狀態(tài)相比較，其功能有所恢復即可。當將受到損傷之前 的正常軟骨的狀態(tài)看作100%、應用本組合物之前的軟骨損傷部位的狀態(tài)看作0%時，優(yōu)選 軟骨功能恢復至30%以上的再生，更優(yōu)選50%以上，進一步優(yōu)選80%以上，尤其優(yōu)選幾乎 恢復至損傷前的狀態(tài)。優(yōu)選再生軟骨中除透明軟骨之外的軟骨、例如纖維軟骨等所產(chǎn)生的比例少。另外，“軟骨損傷部位的治療”或“軟骨缺損部位的治療”是指通過在老齡或外傷、 骨關(guān)節(jié)炎、椎間盤損傷、半月板損傷、剝脫性骨軟骨炎等中所見的軟骨損傷部位或軟骨缺損 部位使軟骨再生，由此緩解或治愈這些癥狀。另外，“應用于軟骨損傷部位”是指將用于軟骨再生的組合物等與軟骨損傷部位接 觸而進行的使用，優(yōu)選向軟骨缺損部位注入本發(fā)明的組合物，包埋該缺損部而進行的使用。 或者可以在軟骨損傷部位、優(yōu)選軟骨缺損部位進一步形成一個以上的較小的孔，向該孔注 入本發(fā)明的組合物，包埋孔而進行的使用。對軟骨損傷部位的應用優(yōu)選將患部的空洞容積 充分注滿。在應用本組合物之前，優(yōu)選對患部實施必要的前處置，如果有需要，可清洗患部。 “清洗患部”是指例如用生理鹽水等清除要應用本發(fā)明的組合物的部位的血液成分、其它不 需要的組織等。優(yōu)選患部在清洗后可通過擦去殘留的不需要的液體成分等進行干燥，然后 應用本發(fā)明的組合物。本發(fā)明中，“軟骨疾病”是指軟骨、軟骨組織和/或關(guān)節(jié)組織(滑膜、關(guān)節(jié)囊、軟骨下 骨等)由于機械刺激或炎癥反應受到傷害而產(chǎn)生的疾病?！败浌羌膊≈委煛笔侵妇徑狻⒏纳?和/或治愈由于機械刺激或炎癥反應而產(chǎn)生傷害的組織的各種病態(tài)。例如，在骨關(guān)節(jié)炎中， 關(guān)節(jié)軟骨的磨損、軟骨組織的變性、滑膜的炎癥、伴隨炎癥的疼痛等病態(tài)復合性發(fā)生。而肩 周炎中，滑膜或關(guān)節(jié)囊的炎癥以及伴隨該炎癥的疼痛為主流，有未見軟骨的磨損或變性的 情形。盡管風濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病基理尚未清楚，但可以認為由于自身免疫反應產(chǎn)生的炎癥 性細胞因子破壞了滑膜組織或軟骨組織。如上所述，軟骨疾病是呈現(xiàn)復合性病態(tài)的疾病，其 治療藥物要求兼具在磨損中保護軟骨的效果、抑制磨損或炎癥導致的軟骨退行性改變的效 果、修復軟骨損傷部位的效果、抑制炎癥或疼痛的效果等復合性的效果。本發(fā)明的“含有低 內(nèi)毒素褐藻酸的1價金屬鹽的組合物”兼具通過機械刺激保護軟骨的效果、抑制磨損或炎癥 導致的軟骨退行性改變的效果、修復軟骨損傷部位的效果、以及抑制關(guān)節(jié)組織的炎癥或疼 痛的效果。由此可抑制軟骨疾病的進展，緩解、改善和/或治愈癥狀。特別是對于骨關(guān)節(jié)炎 的治療、肩周炎的治療、風濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)痛的緩解有效?！瓣P(guān)節(jié)內(nèi)注入給藥”是指將具有流動性的液狀組合物注入到關(guān)節(jié)腔內(nèi)、滑膜囊內(nèi)、 腱鞘內(nèi)等。在用于治療骨關(guān)節(jié)炎時，優(yōu)選將組合物注入關(guān)節(jié)腔內(nèi)。另外，骨關(guān)節(jié)炎可在膝、 肩、髖、腰、踝、腕、指等身體各關(guān)節(jié)處發(fā)生，本發(fā)明的組合物對任何關(guān)節(jié)均適用。2.褐藻酸的1價金屬鹽本發(fā)明的用于軟骨再生或用于治療軟骨疾病的組合物中所含的“褐藻酸的1價金 屬鹽”是通過將褐藻酸的6位羧酸的氫原子與Na+或K+等1價金屬離子進行離子交換而形 成的水溶性鹽。褐藻酸的1價金屬鹽具體例子有褐藻酸鈉、褐藻酸鉀等，特別優(yōu)選可由市 售商品獲得的褐藻酸鈉。褐藻酸的1價金屬鹽的溶液在與交聯(lián)劑混合時形成凝膠。本發(fā)明中使用的“褐藻酸”是生物降解性的高分子多糖類，是D-甘露糖醛酸(M)和 L-葡萄糖醛酸(G) (L-gluronic acid)兩種糖醛酸聚合成直鏈狀所得的聚合物。更具體地 說，是D-甘露糖醛酸的均聚物組分(MM組分)、L-葡萄糖醛酸的均聚物組分(GG組分)、以 及D-甘露糖醛酸和L-葡萄糖醛酸無規(guī)排列而成的組分(MG組分)任意結(jié)合而成的嵌段共 聚物。褐藻酸的D-甘露糖醛酸和L-葡萄糖醛酸的構(gòu)成比(M/G比)主要根據(jù)海藻等的來 源生物的種類而不同，還受該生物生長發(fā)育場所或季節(jié)的影響，M/G比在約0. 4的高G型至 M/G比為約5的高M型的高范圍內(nèi)。
褐藻酸的1價金屬鹽是高分子多糖類，較難準確確定分子量，通常重均分子量為 1萬 1000萬、優(yōu)選為5萬 300萬的范圍。若分子量低，則軟骨損傷部位的軟骨再生效 果、特別是透明軟骨再生效果差，因此，本發(fā)明中使用的褐藻酸的1價金屬鹽優(yōu)選重均分子 量為50萬以上。特別是重均分子量為50萬以上的高分子量褐藻酸鈉在沒有包埋細胞的狀 態(tài)下也具有可以再生透明軟骨這樣另人驚訝的效果，適合用作用于軟骨再生的組合物。另 外，該軟骨再生效果對于軟骨疾病中軟骨損傷的修復也有利，因此適合作為用于治療軟骨 疾病的組合物使用。實際上，在兔OA模型中，相比低分子量的褐藻酸，高分子量的褐藻酸可 見優(yōu)異的治療效果。凝膠過濾色譜測得的重均分子量為100萬和170萬的褐藻酸鈉與分子 量41萬的褐藻酸鈉相比，其抑制軟骨退行性改變的效果、保護軟骨的效果和修復軟骨的效 果優(yōu)異。通常，通過凝膠過濾色譜計算高分子多糖類的分子量時可能產(chǎn)生10 20%的測 定誤差。例如，如果是40萬則可能在32 48萬，如果是50萬則可能在40 60萬，如果 是100萬則可能在80 120萬左右的范圍內(nèi)發(fā)生值的變動。因此，對于褐藻酸的1價金屬 鹽，對軟骨的效果特別優(yōu)異的、最佳的重均分子量范圍至少為50萬以上，更優(yōu)選65萬以上， 進一步優(yōu)選80萬以上。分子量過高則制備困難，同時，制成水溶液時產(chǎn)生粘度過高、溶解性 降低的問題，因此優(yōu)選重均分子量為500萬以下，更優(yōu)選300萬以下。通常來自天然產(chǎn)物的高分子物質(zhì)并不具有單一的分子量，而是具有各種分子量的 分子集合體，因此，以具有一定幅度的分子量分布的形式測定。代表性的測定方法是凝膠過 濾色譜法。作為通過凝膠過濾色譜測得的分子量分布的代表性的信息例如有重均分子量 (Mw)、數(shù)均分子量(Mn)、分散比(Mw/Mn)。如果關(guān)注分子量大的高分子對平均分子量的貢獻，則以重均分子量表示，用下式 表不。Mw = Σ (WiMi)/W = Σ (HiMi)/ Σ (Hi)數(shù)均分子量是高分子的總重量除以高分子的總數(shù)計算得出的。Mn = W/Σ Ni= Σ (MiNi)/ Σ Ni = Σ (I Ii)/ Σ (I li/Mi)其中，W為高分子的總重量，Wi為第i個高分子的重量，Mi為第i個洗脫時間下的 分子量，Ni為分子量Mi的個數(shù)，Hi為第i個洗脫時間下的高度?？梢哉J為軟骨損傷部位的軟骨再生效果(特別是透明軟骨再生效果)、軟骨疾病 治療中的修復軟骨的效果、抑制軟骨退行性改變的效果和/或保護軟骨的效果是分子量大 的分子種類的貢獻大，因此分子量的指標可使用重均分子量。已知在來自天然產(chǎn)物的高分子物質(zhì)的分子量測定中，測定方法產(chǎn)生值的差異(透 明質(zhì)酸的例子Chikako Yomota 等人.，Bull. Natl. HealthSci.，117 卷，135 139 頁 (1999)，Chikako Yomota 等人.，Bull. Natl. Health Sci.，121 卷，30 33 頁(2003))。 關(guān)于褐藻酸鹽的分子量測定，有記載了由特性粘度計算的方法、通過SEC-MALLS(尺寸排 阻層析與多角度激光散射檢測聯(lián)用)計算的方法的文獻(ASTM F2064-00 (2006)，ASTM International發(fā)行)。該文獻中，在通過尺寸排阻層析(=凝膠過濾色譜)測定分子量時， 只憑使用普魯蘭作為標準物質(zhì)的校正曲線計算是不足夠的，推薦結(jié)合使用多角度激光散射 檢測器(MALLS) ( = SEC-MALLS測定)。還有將通過SEC-MALLS測得的分子量作為褐藻酸鹽 的產(chǎn)品目錄上的規(guī)格值使用的例子(FMC Biopolymer公司、PR0N0VA 褐藻酸鈉規(guī)格目錄)。本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)對于分子量不同的褐藻酸鈉，在OA模型等中的治療效果有差
13異，對這些褐藻酸進行了凝膠過濾色譜的分子量測定和SEC-MALLS的分子量測定。結(jié)果得 知，凝膠過濾色譜測得的分子量與褐藻酸鹽的粘度或治療效果的相關(guān)性高。即，我們最新發(fā) 現(xiàn)作為用于軟骨再生或用于治療軟骨疾病的組合物中使用的褐藻酸鹽的確定最佳分子量 范圍的參數(shù)，與通常推薦的SEC-MALLS測定相比，凝膠過濾色譜測得的分子量更為適合。因 此，本說明書中，在確定褐藻酸鹽的分子量時，如沒有特別說明，是指通過凝膠過濾色譜計 算得出的重均分子量。 凝膠過濾色譜的優(yōu)選條件如實施例。代表性的條件是使用以普魯蘭作為標準物質(zhì) 的校正曲線。作為標準物質(zhì)使用的普魯蘭的分子量優(yōu)選至少使用160萬、78. 8萬、40. 4萬、 21. 2萬和11. 2萬的作為標準物質(zhì)。除此之外，還可以確定洗脫液(200mM硝酸鈉溶液)、柱 條件等。柱條件優(yōu)選使用聚甲基丙烯酸酯樹脂系填充劑，使用至少一根排除極限分子量為 1000萬以上的柱。代表性的柱是TSK gel GMPWxl (直徑7. 8mmX 300mm) (Tosoh株式會社制褐藻酸的1價金屬鹽盡管在從褐藻類中提取的初期時，分子量大，粘度高，但在熱 干燥、冷凍干燥、純化等過程中，分子量變小，粘度降低。因此，通過在制備的各步驟中進行 適當?shù)臏囟裙芾恚梢灾苽浞肿恿坎煌暮衷逅岬?價金屬鹽。通過使制備的各步驟中的 溫度低，可獲得分子量大的褐藻酸的1價金屬鹽，溫度越高則可獲得分子量越小的褐藻酸 的1價金屬鹽。另外，通過適當選擇作為原料的褐藻類、或在制備步驟中根據(jù)分子量進行分 組等方法，可制備分子量不同的褐藻酸的1價金屬鹽。并且，對于以各種方法制備的褐藻酸 的1價金屬鹽，在測定分子量或粘度之后通過與具有不同分子量或粘度的其它批次的褐藻 酸的1價金屬鹽混合，可以制成具有目標分子量的褐藻酸的1價金屬鹽。本發(fā)明中使用的褐藻酸可以來自天然也可以是合成物，優(yōu)選來自天然的褐藻 酸。來自天然的褐藻酸例如有由褐藻類提取的褐藻酸。含有褐藻酸的褐藻類在世界沿 海區(qū)域繁茂生長，但實際上可作為褐藻酸原料使用的海藻是有限定的，其代表性的例子 有南美的褐藻屬(Lessonia species)、北美的巨藻屬(Macrocystis species)、歐洲 的海帶屬(Laminaria species)或泡葉藻屬(Ascophyllum species)、澳大利亞的南極 冰河海藻屬(Durvillea)等。作為褐藻酸原料的褐藻類例如有褐藻(Lessonia)屬、 巨藻(Macrocystis)屬、海帶(Laminaria)屬、泡葉藻(Ascophyllum)屬、南極冰河海藻 (Durvillea)屬、羽葉藻(Eisenia)屬、昆布(Ecklonia)屬等。3.低內(nèi)毒素處理本發(fā)明的用于軟骨再生或用于治療軟骨疾病的組合物中所含的褐藻酸的1價金 屬鹽是低內(nèi)毒素褐藻酸的1價金屬鹽。低內(nèi)毒素是指內(nèi)毒素水平降低至實質(zhì)上不會引發(fā)炎 癥或發(fā)熱的程度。即，供給進行低內(nèi)毒素處理。另人驚異的是，通過低內(nèi)毒素處理，將組合 物應用于軟骨損傷部位時，可更加提高軟骨再生作用，并且促進軟骨下骨的再生，可提高患 部的機械強度。即，本發(fā)明的組合物中，通過使用低內(nèi)毒素褐藻酸，可以制成周圍軟骨的變 性或炎癥反應少、機體親和性高的組合物。低內(nèi)毒素處理可按照公知的方法或與其近似的方法進行。例如可通過菅等人的純 化透明質(zhì)酸鈉的方法(例如參照日本特開平9-324001號公報等)；吉田等人的純化β-1， 3_葡聚糖的方法(例如參照日本特開平8-269102號公報等)；William等人的純化褐藻酸 鹽、胞外多糖膠(gellangum)等生物體高分子鹽的方法(例如參照日本特表2002-530440號公報等)James等人的純化多糖的方法(例如參照國際公開第93/13136號小冊子等)； Lewis等人的方法(例如參照美國專利第5589591號說明書等)；Hermanfranck等人的純 化褐藻酸鹽的方法(例如參照ApplMicrobiol Biotechnol (1994)40 638 643等)或與 其近似的方法來實施。本發(fā)明的低內(nèi)毒素處理并不限于此，可通過洗滌、濾器(除去內(nèi)毒素 的濾器或帶電的濾器等)過濾、超濾、使用柱(吸附內(nèi)毒素的親和柱、凝膠過濾柱、離子交換 樹脂柱等)的純化、與疏水性物質(zhì)、樹脂或活性碳等的吸附、有機溶劑處理(有機溶劑萃取、 添加有機溶劑進行的析出、沉淀等)；表面活性劑處理(例如參照日本特開2005-036036號 公報等)等公知的方法或者將它們組合來實施。這些處理步驟中可以適當組合離心等公知 的方法。優(yōu)選結(jié)合褐藻酸的種類進行適當選擇。內(nèi)毒素水平可按照公知的方法確認，例如可通過鱟試劑(LAL)的方法、使用 Endospecy (注冊商標)ES-24S試劑盒(生化學工業(yè)株式會社)的方法等進行測定。對 本發(fā)明的組合物中所含有的褐藻酸的內(nèi)毒素處理方法沒有特別限定，作為其結(jié)果，褐藻酸 的1價金屬鹽的內(nèi)毒素含量在通過鱟試劑(LAL)進行的內(nèi)毒素測定時，優(yōu)選為500內(nèi)毒素 單位(EU)/g以下，進一步優(yōu)選100EU/g以下，尤其優(yōu)選50EU/g以下，特別優(yōu)選30EU/g以 下。經(jīng)低內(nèi)毒素處理過的褐藻酸鈉例如可通過SeaMatrix(滅菌)((株)Kimica(株)持田 International)、PR0N0VA UPLVG(FMC)等市售品獲得。4.制備褐藻酸的1價金屬鹽的溶液本發(fā)明的用于軟骨再生或用于治療軟骨疾病的組合物可以使用褐藻酸的1價金 屬鹽的溶液來制備。褐藻酸的1價金屬鹽的溶液可按照公知方法或與其近似的方法制備。 即，本發(fā)明中使用的褐藻酸的1價金屬鹽可使用上述褐藻類，通過酸法、鈣法等公知的方法 來制備。具體來說，例如可使用碳酸鈉水溶液等堿水溶液，由這些褐藻類中提取，然后添加 酸(例如鹽酸、硫酸等)，以獲得褐藻酸，可通過褐藻酸的離子交換獲得褐藻酸的鹽。如上 所述，進行低內(nèi)毒素處理。褐藻酸的鹽的溶劑只要是可應用于生物體的溶劑即可，沒有特別 限定，例如有純凈水、蒸餾水、離子交換水、Milli-Q水、生理鹽水、磷酸緩沖生理鹽水(PBS) 等。優(yōu)選將它們進行滅菌，優(yōu)選經(jīng)低內(nèi)毒素處理。例如，可以將Milli-Q水過濾滅菌后使用。 本發(fā)明的用于軟骨再生或用于治療軟骨疾病的組合物無需將褐藻酸的1價金屬鹽溶解于 上述溶劑中，例如可通過在含有細胞的培養(yǎng)基中混合褐藻酸的1價金屬鹽等來獲得。另外， 為獲得本發(fā)明的組合物而進行的操作優(yōu)選完全在低內(nèi)毒素水平、以及細菌水平低的環(huán)境下 進行。例如，優(yōu)選操作是在潔凈工作臺上、使用滅菌器具進行，可以將要使用的器具用市售 的內(nèi)毒素清除劑進行處理。使用純化至顯示優(yōu)選的內(nèi)毒素水平的褐藻酸的1價鹽制備上述組合物時，組合物 的內(nèi)毒素含量通常為500EU/g以下，進一步優(yōu)選為300EU/g以下，尤其優(yōu)選為150EU/g以 下。5.用于軟骨再生或用于治療軟骨疾病的組合物的粘度本發(fā)明的用于軟骨再生的組合物的粘度只要可獲得本發(fā)明的效果即可，沒有特別 限定，優(yōu)選為400mPa · s 20000mPa · s。例如使用上述溶劑等可制備成適當?shù)恼扯?。?果是在上述粘度范圍內(nèi)，則與軟骨損傷部位的附著性良好，還可通過注射器等注入到關(guān)節(jié) 腔內(nèi)或軟骨損傷部位。另外，本發(fā)明的用于軟骨再生的組合物的粘度如果為約2000mPa · s 以上，則與軟骨缺損部位的附著性進一步提高，特別是如果粘度為約5000mPa · s以上，則
15例如在關(guān)節(jié)鏡下對人的股骨關(guān)節(jié)面的軟骨損傷進行操作時等，即使軟骨缺損部位的開口部 是朝向下方的狀態(tài)，通過對缺損部位注入本發(fā)明的組合物，也可以使本發(fā)明的組合物與軟 骨損傷面接觸，在沒有固定的狀態(tài)下也可以至少附著1分鐘以上。在附著期間，可根據(jù)需 要使組合物的表面固定。與損傷部位的附著性隨著粘度的升高而進一步提高，例如粘度為 IOOOOmPa-S時，與粘度為5000mPa ·s相比，可以以不固定的狀態(tài)在患部附著更長時間。因 此，本發(fā)明的組合物在應用于軟骨缺損部位的開口部、或者在軟骨損傷部位或軟骨缺損部 位形成的孔的開口部傾斜時或朝向下方的狀態(tài)的軟骨損傷部位時，在不施加固定手段的狀 態(tài)下優(yōu)選在損傷部位至少附著5秒以上，還優(yōu)選10秒以上，更優(yōu)選30秒以上，尤其優(yōu)選附 著1分鐘以上。本發(fā)明的組合物通過調(diào)節(jié)粘度，可以確保在組合物的表面上實施固定手段 所需的時間。其中，“附著在損傷部位”是指本發(fā)明的組合物不會從損傷部位上脫落，可停留 在損傷部位上。這樣，本發(fā)明的組合物通過調(diào)節(jié)粘度，即使是手術(shù)時患部朝向下方這樣的對 于手術(shù)人員來說難以治療的體位，也可以通過注入這樣簡便的方法進行治療。另一方面，粘度為約20000mPa 以下時，通過注射器等的注入更加容易。例如粘 度為20000mPa · s左右時也可以通過注射器等注入，但是粘度高、注入困難時，還可使用其 它手段將本發(fā)明的組合物應用于軟骨損傷面。從注射器操作的容易程度的角度考慮，本發(fā) 明的組合物的粘度優(yōu)選為20000mPa · s以下，更優(yōu)選為15000mPa · s以下。因此，從附著性 的角度考慮，適合應用于軟骨缺損部位的開口部、或者在軟骨損傷部位或軟骨缺損部位上 形成的孔的開口部傾斜時或者朝向下方的狀態(tài)的軟骨損傷部位的本發(fā)明的組合物的粘度 優(yōu)選為2000mPa · s左右以上；從組合物的使用容易程度的角度考慮，優(yōu)選為20000mPa · s 左右以下，還優(yōu)選為3000mPa · s 15000mPa · s，更優(yōu)選為4000mPa · s IOOOOmPa · s，尤 其優(yōu)選為 5000mPa · s 6000mPa · s。如果本發(fā)明的組合物的粘度為400mPa*s左右以上，則應用于軟骨損傷部位，可充 分發(fā)揮本發(fā)明的效果。例如，可在軟骨缺損部位的開口部一側(cè)朝向上方的狀態(tài)下實施手術(shù) 時，將本發(fā)明的組合物注入到缺損部位，使本發(fā)明的組合物與軟骨損傷面接觸，然后使組合 物的表面固定化。組合物的粘度低，因此通過注射器等的注入更為容易進行。例如，在粘度 為5000mPa · s左右的情況下、軟骨損傷部位上殘留有軟骨情況下等，也可以通過在損傷部 位上形成1個以上的極小的孔，而將組合物應用于損傷部位全體。將本發(fā)明的用于治療軟骨疾病的組合物注入到關(guān)節(jié)內(nèi)時的粘度只要可獲得治療 軟骨疾病的效果即可，沒有特別限定，優(yōu)選為IOOmPa 20000mPa .s。優(yōu)選為200mPa .s 15000mPa · s，更優(yōu)選為 400mPa · s IOOOOmPa · s，尤其優(yōu)選為 IOOOmPa · s 6000mPa · s。 通過使用適當?shù)恼扯龋€可以發(fā)揮補充關(guān)節(jié)液的作為緩沖的功能的效果，可在分散于關(guān)節(jié) 液中的狀態(tài)下發(fā)揮治療軟骨疾病的效果。用于軟骨再生或用于治療軟骨疾病的組合物的粘度例如可通過控制褐藻酸的1 價金屬鹽溶液中的褐藻酸濃度、褐藻酸的分子量等來調(diào)節(jié)。關(guān)于褐藻酸的1價金屬鹽的溶液粘度，溶液中褐藻酸的濃度高時則高，溶液中褐 藻酸的濃度低時則低。褐藻酸的1價金屬鹽溶液中的優(yōu)選的褐藻酸濃度受分子量的影響， 因此不能一概而論，大約為w/v 5% w/v左右，進一步優(yōu)選1. 5% w/v 3% w/v左右， 尤其優(yōu)選2% w/v 2. 5% w/v0褐藻酸的1價金屬鹽即使是恒定的濃度，在從褐藻類中提取的最初時，分子量大，
16粘度高，但是在熱干燥、冷凍干燥、純化等過程中，分子量變小，濃度降低。同樣是由褐藻類 提取的褐藻酸，其粘度也常有變動。粘度的測定值根據(jù)測定儀器、測定條件而變動。因此， 與損傷部的附著性優(yōu)異、內(nèi)毒素水平降低的褐藻酸的1價金屬鹽溶液均包含在本發(fā)明的范 圍內(nèi)。為了通過低濃度的褐藻酸的1價金屬鹽溶液獲得與患部的附著性優(yōu)異、高粘度的 組合物，可以選擇分子量高的褐藻酸的1價金屬鹽。褐藻酸的1價金屬鹽的溶液的粘度受M/G比的影響，因此，例如可根據(jù)溶液的粘度 等適當選擇具有更為優(yōu)選的M/G比的褐藻酸。本發(fā)明中使用的褐藻酸的M/G比約為0. 4 4. 0，優(yōu)選約為0. 8 3. 0，更優(yōu)選約為1. 0 1. 6。如上所述，M/G比主要由海藻的種類決定，因此，作為原料使用的褐藻類的種類對 褐藻酸的1價金屬鹽溶液的粘度有影響。本發(fā)明使用的褐藻酸優(yōu)選來自褐藻屬、巨藻屬、海 帶屬、泡葉藻屬、南極冰河海藻屬的褐藻，更優(yōu)選來自褐藻屬的褐藻，特別優(yōu)選來自褐海藻 (Lessonia nigrescens)0組合物的粘度還可根據(jù)褐藻酸的1價金屬鹽溶液中的包埋細胞(參照下述)的量 等進行調(diào)節(jié)。本發(fā)明的組合物在包埋細胞時，本發(fā)明的組合物的粘度優(yōu)選基于包埋細胞后 的粘度進行調(diào)節(jié)。但是，在實際臨床中，使用包埋細胞的組合物時，包埋細胞之后難以進行 調(diào)節(jié)粘度的步驟。因此，本發(fā)明的組合物在包埋細胞時，可以將包埋細胞之前的組合物的粘 度作為本發(fā)明的組合物的粘度。本發(fā)明的組合物的方式之一是在含有使內(nèi)毒素水平降低至實質(zhì)上不會引發(fā)炎癥 或發(fā)熱的程度的褐藻酸的1價金屬鹽、粘度為400mPa · s 20000mPa · s的具有流動性的 組合物中包埋骨髓間充質(zhì)干細胞和/或骨髓間葉系間質(zhì)細胞的、應用于軟骨損傷部位的用 于軟骨再生的組合物。6.包埋細胞本發(fā)明的用于軟骨再生或用于治療軟骨疾病的組合物可以制成在含有褐藻酸的1 價金屬鹽的組合物中包埋用于軟骨組織再生的細胞所得的組合物，優(yōu)選制成在褐藻酸的1 價金屬鹽的溶液中包埋用于軟骨組織再生的細胞所得的組合物。本發(fā)明中的“包埋”是指 將用于軟骨組織再生的細胞懸浮于含有褐藻酸的1價金屬鹽的組合物、優(yōu)選懸浮于褐藻酸 的1價金屬鹽的溶液中。由此，可以更加有效地促進軟骨的再生，還可以更提高應用了本發(fā) 明的組合物的軟骨的強度。優(yōu)選細胞分散存在于本發(fā)明的組合物中。上述細胞例如有干 細胞、間質(zhì)細胞等，對其來源沒有特別限定，可以是骨髓、脂肪細胞、臍帶血等。優(yōu)選為骨髓 間充質(zhì)干細胞或骨髓間葉系間質(zhì)細胞。除此之外還有軟骨前體細胞、軟骨細胞、滑膜細胞、 紅細胞系干細胞、ES細胞等細胞?？梢园襁@些細胞的一種以上。其中，“干細胞”是具有 自我再生能力和多向分化能力的細胞，將干細胞應用于軟骨再生，由此可以再生機械強度 或組織學上優(yōu)異的軟骨。干細胞有胚胎干細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞等，特別是骨髓間充質(zhì)干 細胞可以使用來自成人的自身組織的細胞，因此容易獲得，適合用于軟骨再生。此外，骨髓 間充質(zhì)干細胞可分化成骨，也可分化成軟骨，因此，例如損傷除軟骨之外還涉及骨時，可以 在骨的部位再生骨、在軟骨部位再生軟骨。將骨髓間充質(zhì)干細胞懸浮于褐藻酸的1價金屬 鹽的溶液中，通過關(guān)節(jié)內(nèi)注入給藥，可以用于治療軟骨疾病。因此，本發(fā)明中使用的細胞優(yōu) 選骨髓間充質(zhì)干細胞的比例高，但難以完全分離，因此優(yōu)選骨髓間充質(zhì)干細胞在本發(fā)明的用于軟骨組織再生的細胞中含有30%以上，更優(yōu)選含有50%以上，進一步優(yōu)選含有70%以 上，尤其優(yōu)選含有90%以上。本發(fā)明的組合物的方式之一是將骨髓間充質(zhì)干細胞和/或骨 髓間葉系間質(zhì)細胞用于軟骨再生或用于治療軟骨疾病的組合物。要包埋的細胞可以使用自體的或異種的，特別是從可預防排斥反應的角度考慮， 優(yōu)選采集自體細胞使用。采集的細胞優(yōu)選通過細胞培養(yǎng)使其增殖后使用。此時，可以預先 將細胞包埋在褐藻酸的1價金屬鹽的溶液中，在該狀態(tài)下培養(yǎng)，也可以用培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞， 然后包埋在褐藻酸的1價金屬鹽的溶液中。培養(yǎng)細胞的方法可按照常規(guī)方法進行，可以在將細胞包埋在褐藻酸的1價金屬鹽 的溶液中的狀態(tài)下進行，或者也可以在不包埋在褐藻酸的1價金屬鹽的溶液中的狀態(tài)下進 行。培養(yǎng)基優(yōu)選可以高效地進行包埋在褐藻酸的1價金屬鹽溶液中的細胞或未包埋的細胞 的培養(yǎng)的培養(yǎng)基，可以從本領(lǐng)域所公知的培養(yǎng)基中適當選擇。例如，培養(yǎng)基可使用DMEM培養(yǎng)基(Virology，8卷，396 (1959))、MEM培養(yǎng)基 (Science，122 卷，501 (1952))、RPMI1640 培養(yǎng)基(TheJournal of the American Medical Association, 199卷，519 (1967))、F12等培養(yǎng)基，根據(jù)需要可以添加血清、氨基酸、葡萄糖、 抗生素等。pH值優(yōu)選約為6 8。培養(yǎng)通常在約30°C 40°C下進行5 120小時、優(yōu)選 5 100小時左右。還可根據(jù)需要進行培養(yǎng)基的更換、通氣、攪拌。本發(fā)明的一個方式中，組合物是將用于軟骨組織再生的細胞特別是骨髓間充質(zhì)干 細胞、或者骨髓間葉系間質(zhì)細胞與褐藻酸的1價金屬鹽的溶液混合所得的組合物，不含有 TGF-β等生長因子。另外，也不一定必須在體外誘導這些細胞的分化。這種情況下，例如從 具有軟骨損傷的患者的髂骨前緣等采集骨髓液，立即由骨髓液中提取骨髓間充質(zhì)干細胞， 獲得一定數(shù)量以上的細胞數(shù)之后，則可以作為本發(fā)明的組合物立即應用于患者。無需將采 集的細胞進行體外培養(yǎng)、分化等處理的麻煩，對于手術(shù)人員來說是很大的優(yōu)點，也可以降低 成本，還可以減輕對患者的負擔。為骨髓間充質(zhì)干細胞時，由于免疫原性低，因此可以毫無問題地應用異種細胞，因 此實用性優(yōu)異。另一方面，上述包埋有細胞的褐藻酸的1價金屬鹽溶液在應用于軟骨損傷部位之 前可以制成包埋有體外培養(yǎng)至選自下述任意狀態(tài)的細胞的組合物，所述狀態(tài)有a)細胞數(shù) 為1 X IO6個/mL以上的狀態(tài)、b)通過番紅0染色或H-E染色檢測出透明軟骨組織的狀態(tài)、 c)通過抗膠原II型抗體或基因分析檢測出II型膠原的狀態(tài)、d)通過抗糖苷配基抗體或基 因分析檢測出糖苷配基的狀態(tài)、e)分泌胞外基質(zhì)(膠原、透明質(zhì)酸、蛋白聚糖)的狀態(tài)。可 結(jié)合損傷部位的狀態(tài)、患者的狀態(tài)而進行適當選擇。對要包埋的細胞的量沒有特別限定，例如可以是1. 0 X IO6 3. 0 X IO7個細胞/mL， 優(yōu)選為2. OX IO7 3. OX IO7個細胞/mL。通過使細胞數(shù)為該程度的數(shù)目，可以更加促進軟 骨的再生。另一方面，為了手術(shù)方法的簡便，以及不會對機體施加軟骨細胞、骨膜采集、骨髓 采集等過度的負擔，減輕來自機體的或來自培養(yǎng)步驟的病毒等的感染的危險，優(yōu)選制成不 含有細胞的組合物。上述組合物的優(yōu)選例子是以含有凝膠過濾色譜測得的重均分子量為 50萬以上的低內(nèi)毒素褐藻酸鈉、不含有細胞為特征的、粘度 為400mPa · s 20000mPa · s、 具有流動性、可應用于軟骨損傷部位并在患部固化的用于軟骨再生的組合物。另外，本發(fā)明的用于治療軟骨疾病的組合物是以低內(nèi)毒素褐藻酸的1價金屬鹽作為有效成分的組合物， 發(fā)現(xiàn)了褐藻酸本身具有治療軟骨疾病的效果。優(yōu)選的用于治療的組合物的例子是以含有 凝膠過濾色譜測得的重均分子量為50萬以上的低內(nèi)毒素褐藻酸鈉作為有效成分、不含有 細胞為特征的、關(guān)節(jié)內(nèi)注入給藥的用于治療軟骨疾病的組合物，該組合物可發(fā)揮比以往所 使用的透明質(zhì)酸制劑更為優(yōu)異的治療效果。7.組合物表面的凝膠化本發(fā)明中，可以將含有褐藻酸的1價金屬鹽的溶液的組合物應用于軟骨損傷部 位，并在該組合物的表面應用交聯(lián)劑。使組合物表面進行凝膠化，以使表面凝固，由此可有 效地防止組合物由軟骨損傷部位漏出。上述交聯(lián)劑只要可通過將褐藻酸的1價金屬鹽溶液交聯(lián)，使其表面固定即可， 沒有特別限定，例如可例舉Ca2+、Mg2+、Ba2+、Sr2+等2價以上的金屬離子化合物、分子內(nèi)具 有2 4個氨基的交聯(lián)性試劑等。更具體地說，2價以上的金屬離子化合物包含CaCl2、 MgCl2, CaSO4, MaCl2等分子內(nèi)具有2 4個氨基的交聯(lián)性試劑包含在氮原子上具有賴氨酰 基(-COCH(NH2)-(CH2)4-NH2)的二氨基鏈烷烴，即二氨基鏈烷烴及其氨基被賴氨?；〈?形成賴氨?；被难苌铮唧w有二氨基乙烷、二氨基丙烷、N-(賴氨?；?-二氨基乙 烷等，從容易獲得和凝膠強度等角度考慮，特別優(yōu)選制成CaCl2溶液。對組合物的表面加入2價以上金屬離子的方法沒有特別限定，例如可通過注射 器、噴射器(噴霧器)等，在組合物的表面施加2價以上金屬離子的溶液的方法等。在本發(fā) 明的組合物的表面應用交聯(lián)劑的時間可以是在缺損部位應用了本發(fā)明的組合物之后，也可 以同時。交聯(lián)劑的使用量優(yōu)選結(jié)合應用了本發(fā)明組合物的缺損部位的大小適當調(diào)節(jié)。交聯(lián) 劑是由所應用的組合物的表面緩慢滲透到內(nèi)部，進行交聯(lián)。為了不使交聯(lián)劑對本發(fā)明的組 合物與損傷面的接觸部分有較大影響，可調(diào)節(jié)交聯(lián)劑的使用量、不要過量使用。2價以上金 屬離子的使用量只要是可以使含有褐藻酸的1價金屬鹽的組合物表面凝固的量即可，沒有 特別限定。不過，例如加入IOOmM的CaCl2溶液時，當為直徑5mm、深度2mm左右的缺損時， 所加入的量優(yōu)選為0. 3 0. 6mL左右，可以與患部的表面積成比例地確定給藥量。例如，如 寬窄(IOmmX 20mm)、深度5mm左右的缺損時，優(yōu)選為1 12mL左右、更優(yōu)選為2 IOmL左 右?？梢贿呌^察損傷部位的狀態(tài)一邊適當增減。其應用例如可以是緩慢地、持續(xù)數(shù)秒 數(shù) 十秒加到含有褐藻酸的1價金屬鹽的組合物的表面。通過在本發(fā)明的組合物中含有其凝膠化隨時間差、溫度差或與機體內(nèi)鈣離子的接 觸等環(huán)境的變化而進展的交聯(lián)劑，可以得到在給藥前保持液體狀態(tài)、在給予機體后形成自 身凝膠化的組合物。這樣的交聯(lián)劑例如有葡糖酸鈣、CaSO4、褐藻酸鈣等。其中，已知交聯(lián)劑中含有鈣時，鈣離子的濃度高則凝膠化快，可以形成更硬的凝 膠。但是，鈣具有細胞毒性，因此濃度過高則可能對本發(fā)明的用于軟骨再生或用于治療軟骨 疾病的組合物的軟骨再生作用產(chǎn)生不良影響。因此，為了使含有褐藻酸的1價金屬鹽的組 合物表面凝固，例如使用CaCl2溶液時，優(yōu)選為25mM 200mM、更優(yōu)選為50mM IOOmM的濃 度。其中，褐藻酸微球如下形成例如將褐藻酸鈉溶液滴加到CaCl2溶液中從而形成凝 膠。已知在該褐藻酸微球中包埋細胞，將其用于軟骨再生(例如參照文獻2、3)。但是，褐藻
19酸微球必須通過按壓應用到軟骨缺損部位，因為必須制成符合缺損部位的大小，在實際臨 床中使用時有技術(shù)性困難。另外，使用CaCl2溶液作為交聯(lián)劑時，微球表面的Ca離子與軟 骨損傷面接觸，因此還有鈣的細胞毒性問題。與此相對，本發(fā)明的組合物是溶液狀，因此可 以容易地應用于各種形狀的缺損部位，還可以用本組合物覆蓋損傷部位的全體，與軟骨缺 損部位的貼合性良好。本組合物與軟骨損傷面接觸的部分可以保持較低的鈣濃度，鈣的細 胞毒性的問題也少。本發(fā)明的組合物與軟骨損傷部位接觸的面上，受到交聯(lián)劑的影響小，因 此本發(fā)明的組合物可以容易地與機體的損傷部位的細胞或組織接觸。本發(fā)明的組合物應用 于損傷部位之后，經(jīng)過約4周即可以在應用部位與機體組織融合至無法識別的狀態(tài)，與機 體的親和性高。將本發(fā)明的組合物應用于軟骨損傷部位時，若通過交聯(lián)劑使表面凝膠化，或者預 先與交聯(lián)劑混合、實現(xiàn)全體的凝膠化，則本發(fā)明的組合物在患部固化，可以以與應用的軟骨 損傷部位緊密貼合的狀態(tài)局部存在。由此，在包埋細胞等時，可以使細胞等成分局部存在于 患部。除此之外，本發(fā)明的組合物與軟骨損傷部位緊密貼合，由此可以更強烈地發(fā)揮本發(fā)明 的組合物的軟骨再生效果、特別是透明軟骨再生效果。8.含褐藻酸的1價金屬鹽的用于軟骨再生或用于治療軟骨疾病的組合物的制劑 化和應用本發(fā)明的用于軟骨再生或用于治療軟骨疾病的組合物通過應用于人或人以外的 生物例如牛、猴、雞、貓、小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、豬、狗、兔、綿羊、馬等非人哺乳動物的軟骨 損傷部位，以用于促進軟骨再生，或者通過注入到關(guān)節(jié)內(nèi)、以用于進行軟骨疾病的治療。本發(fā)明的用于軟骨再生或用于治療軟骨疾病的組合物的形態(tài)優(yōu)選具有流動性的 液體狀，即溶液狀。本發(fā)明中，“具有流動性”是指具有使其形態(tài)無定形變化的性質(zhì)，例如如 溶液，無需總是具有流動的性質(zhì)。優(yōu)選具有例如將組合物封入注射器等中、可注入到患部的 流動性。為溶液狀的本發(fā)明的組合物可通過注射器、凝膠用移液管、專用注射器等容易地應 用于軟骨損傷部位或關(guān)節(jié)內(nèi)。另外，還適合于各種形狀的損傷部位或缺損部位的形狀，可以 填充或接觸缺損部位全體。本發(fā)明的用于軟骨再生的組合物、例如在作為透明軟骨的關(guān)節(jié)軟骨的軟骨缺損部 位顯示優(yōu)異的軟骨再生作用。另外，本發(fā)明的用于治療軟骨疾病的組合物在骨關(guān)節(jié)炎等軟 骨疾病中具有修復軟骨的效果、抑制軟骨退行性改變的效果、保護軟骨的效果、抑制關(guān)節(jié)組 織的炎癥的效果和/或抑制關(guān)節(jié)組織炎癥產(chǎn)生的疼痛的效果，而發(fā)揮治療軟骨疾病的效果。本發(fā)明的用于軟骨再生的組合物的方式之一是用于透明軟骨再生的組合物。透明 軟骨再生是指以再生透明軟骨的比例高于纖維軟骨比例的軟骨為目的，實現(xiàn)富含II型膠 原或蛋白聚糖的軟骨組織的再生。本發(fā)明的治療軟骨疾病的組合物的方式之一是用于治療骨關(guān)節(jié)炎的組合物。如骨 關(guān)節(jié)炎，當軟骨損傷涉及關(guān)節(jié)軟骨的廣泛范圍時，或者要對雖然沒有產(chǎn)生明顯的軟骨缺損 但軟骨表面的平滑性變得混亂、開始退行性改變等的較初期的骨關(guān)節(jié)炎中常見類型的軟骨 損傷進行治療時，優(yōu)選將本發(fā)明的組合物注入到關(guān)節(jié)腔內(nèi)，使其遍及關(guān)節(jié)液內(nèi)。通過將褐藻 酸的1價金屬鹽與軟骨損傷部位接觸，可以促進軟骨損傷部位的關(guān)節(jié)的修復、抑制炎癥或 磨損導致的軟骨退行性改變、以保護軟骨。另外，作為有效成分的褐藻酸的1價金屬鹽遍及關(guān)節(jié)液內(nèi)，由此可以抑制包含滑膜組織的周邊組織的炎癥反應，以發(fā)揮抑制疼痛的效果。同 時，通過在關(guān)節(jié)液內(nèi)存在褐藻酸的1價金屬鹽，可以發(fā)揮補充作為緩沖和潤滑油的關(guān)節(jié)液 的功能的作用。本發(fā)明的治療軟骨疾病的組合物的另一方式之一是用于治療肩周炎的組合物。肩 周炎中，以滑膜或關(guān)節(jié)囊的炎癥以及伴隨該炎癥的疼痛為主，有未見軟骨的磨損或變性的 情形。褐藻酸的1價金屬鹽通過抑制包含滑膜組織的周邊組織的炎癥反應而發(fā)揮抑制疼痛 的效果，因此，通過將本發(fā)明的組合物給予肩關(guān)節(jié)腔內(nèi)、肩峰下滑液囊內(nèi)、或肱二頭肌長頭 腱腱鞘內(nèi)等，可以治療肩周炎。本發(fā)明的治療軟骨疾病的組合物的又一方式之一是抑制關(guān)節(jié)疼痛的組合物。關(guān)節(jié) 疼痛除上述的骨關(guān)節(jié)炎、肩周炎等之外，在風濕性關(guān)節(jié)炎中也常成為問題。本發(fā)明的優(yōu)選方 式之一是用于治療風濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)痛的組合物，特別優(yōu)選用于抑制慢性風濕性關(guān)節(jié)炎 的膝關(guān)節(jié)痛的組合物。風濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機理尚未闡明，可能是由于自身免疫反應產(chǎn)生 的炎癥性細胞因子破壞了滑膜組織或軟骨組織。褐藻酸的1價金屬鹽通過抑制包含滑膜組 織的周邊組織的炎癥反應，而發(fā)揮抑制疼痛的效果，因此通過將本發(fā)明的組合物給予罹患 了風濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)內(nèi)，可以抑制炎癥反應及其伴隨該炎癥反應的疼痛。另一方面，為了 根本性地治療類風濕性關(guān)節(jié)炎，必須抑制自身免疫反應，褐藻酸的1價金屬鹽在風濕性關(guān) 節(jié)炎的患部中是否具有免疫抑制性作用，這目前尚未闡明。本發(fā)明的治療軟骨疾病的組合物的又一方式之一是緩解、改善和/或治愈伴隨軟 骨疾病的各種病態(tài)的組合物。軟骨疾病中，軟骨、軟骨組織和/或關(guān)節(jié)組織(滑膜、關(guān)節(jié)囊、 軟骨下骨等)由于機械刺激或炎癥反應而受到傷害，關(guān)節(jié)軟骨的磨損、機械刺激或炎癥反 應導致的軟骨組織的退行性改變、滑膜等關(guān)節(jié)組織的炎癥、伴隨炎癥的關(guān)節(jié)疼痛等的病態(tài) 復合性發(fā)生。本發(fā)明的組合物含有低內(nèi)毒素褐藻酸的1價金屬鹽作為有效成分，兼具通過 機械刺激保護軟骨的效果、抑制磨損或炎癥導致的軟骨退行性改變的效果、修復軟骨損傷 部位的效果、以及抑制關(guān)節(jié)組織的炎癥或疼痛的效果。由此，可抑制軟骨疾病的進展，緩解、 改善和/或治愈癥狀。另外，本發(fā)明的治療軟骨疾病的組合物經(jīng)過對這些病態(tài)的緩解、改善 和/或治愈而具有改善關(guān)節(jié)機能的效果。關(guān)節(jié)機能的改善意味著關(guān)節(jié)可活動區(qū)域的改善、 曰常生活動作的改善等。將本發(fā)明的用于軟骨再生的組合物以填充到軟骨缺損部位的形式應用時，如果粘 度高則難以使用注射器，因此可使用加壓型或電動型等注射器。即使不使用注射器等，例如 也可將板、棒等應用于軟骨損傷部位。用注射器注入時，例如優(yōu)選使用16 18G的針。將 本發(fā)明的用于治療軟骨疾病的組合物注入到關(guān)節(jié)內(nèi)進行應用時，優(yōu)選使用18G 27G的針。本發(fā)明的用于軟骨再生的組合物的應用量可根據(jù)所應用的軟骨缺損部位、在損傷 部位制作的孔的大小來決定，沒有特別限定，直接注入到軟骨缺損部位時，例如為0. 05 10mL，更優(yōu)選為0. 1 2mL。應用于軟骨損傷部位時，優(yōu)選將患部的空洞容積充分注滿。將 本發(fā)明的用于治療軟骨疾病的組合物應用于關(guān)節(jié)內(nèi)時，給藥量可根據(jù)作為給藥對象的關(guān)節(jié) 的關(guān)節(jié)液等的量來適當決定，沒有特別限定，給予人膝關(guān)節(jié)或肩關(guān)節(jié)時，通常為1 5mL，更 優(yōu)選為2 3mL。給予例如可每周連續(xù)給藥5次，然后在2 4周內(nèi)繼續(xù)給予一次的方法。 并不限于這些方法，可根據(jù)癥狀和效果適當增減。例如，可采取將2周一次或每月一次的給 藥適當持續(xù)的方法。褐藻酸是動物體內(nèi)原本不存在的物質(zhì)，因此動物不具有特異性分解褐藻酸的酶。褐藻酸在動物體內(nèi)通常通過水解被緩慢地分解，但與透明質(zhì)酸等聚合物相比，體 內(nèi)的分解緩慢，給予關(guān)節(jié)內(nèi)時可期待長時間的持續(xù)效果。本發(fā)明的用于軟骨再生或用于治療軟骨疾病的組合物的特征在于含有低內(nèi)毒素 褐藻酸的1價金屬鹽作為有效成分。本發(fā)明人等首次發(fā)現(xiàn)在將褐藻酸給予機體的關(guān)節(jié)內(nèi) 時，褐藻酸本身發(fā)揮了對軟骨組織和關(guān)節(jié)組織的再生、治療效果。作為有效成分含有，是指 將褐藻酸應用于患部時，以可發(fā)揮對軟骨組織和關(guān)節(jié)組織的再生、治療效果的量含有，至少 優(yōu)選為占組合物全體的0. 1% w/v以上。更優(yōu)選為0. 5% w/v以上，特別優(yōu)選為1 3% W/
Vo本發(fā)明的用于軟骨再生或用于治療軟骨疾病的組合物中可以根據(jù)需要含有其它 藥物活性成分、或常用的穩(wěn)定劑、乳化劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、緩沖劑、等滲劑、防腐劑、止痛劑、 著色劑等通常藥物中使用的成分。本發(fā)明的一個方式中，本發(fā)明的組合物除低內(nèi)毒素褐藻酸的1價金屬鹽之外，不 含有對軟骨或關(guān)節(jié)組織發(fā)揮藥理作用的成分。只含有低內(nèi)毒素褐藻酸的1價金屬鹽作為有 效成分的組合物也可發(fā)揮充分的軟骨再生或治療軟骨疾病的效果。另外，本發(fā)明的用于軟骨再生或用于治療軟骨疾病的組合物可含有促進細胞生長 的因子。上述因子例如有BMP、FGF、VEGF、HGF、TGF-β、IGF-1、PDGF、CDMP、CSF、ΕΡ0、IL 和 IF等。這些因子可通過重組法進行制備，或由蛋白組合物中純化而獲得。本發(fā)明的一個方式中，本發(fā)明的組合物不含有這些生長因子。不含有生長因子時 軟骨的再生也十分良好，并且與主動地促進細胞生長的情形相比安全性也高。9.治療方法本發(fā)明進一步提供使用上述本發(fā)明的用于軟骨再生或用于治療軟骨疾病的組合 物的軟骨損傷部位的治療方法和軟骨疾病的治療方法?！败浌菗p傷部位的治療”或“軟骨疾病的治療”如“ 1.概要”項目中所述。對在軟骨損傷部位應用本發(fā)明的用于軟骨再生的組合物的方法沒有特別限定，例 如可在關(guān)節(jié)鏡下、內(nèi)窺鏡下，通過注射器、凝膠用移液管、專用填充器等直接注入到軟骨缺 損部位?；蛘?，例如通過髕旁內(nèi)側(cè)入路等關(guān)節(jié)切開術(shù)等公知的外科方法使患部暴露，然后用 注射器、凝膠用移液管、專用填充器等直接注入到軟骨缺損部位。另外，將本發(fā)明的組合物應用于軟骨損傷部位 前或同時或之后，可以給予鏈霉 素、青霉素、妥布霉素、阿米卡星、慶大霉素、新霉素和兩性霉素B等抗生素，阿司匹林、非類 固醇性解熱鎮(zhèn)痛劑(NSAIDs)、乙酰氨基酚等抗炎癥藥物等的聯(lián)合用藥。這些藥物可以通過 混入在本發(fā)明的組合物中的方式來使用。還可以在軟骨損傷部位形成一個以上的孔，將本發(fā)明的組合物注入到形成的孔 中。并且軟骨缺損部位也可以形成一個以上的孔，以同樣的方式進行使用。例如，通過外科方法使患部暴露的方法中，在注入本發(fā)明的組合物之前可以使用 電鉆、鋼線等，例如以直徑1. 5mm左右的較小的直徑在具有殘留軟骨的軟骨缺損部位上制 作多個深達軟骨下骨的缺損(全層缺損)，向其中注入組合物。通過形成全層缺損，骨髓出 血，骨髓中的軟骨前體細胞游離到軟骨缺損部位。通過游離的軟骨前體細胞和本發(fā)明的組 合物的效果，促進軟骨再生，可改善軟骨全體的功能?；蛘?，可以在殘留軟骨的軟骨缺損部位，以例如直徑1. 5mm左右的較小的直徑制作未達軟骨下骨的部分缺損，對其應用組合物。制作部分缺損時，缺損部位沒有來自骨髓的 出血，沒有骨髓中的軟骨前體細胞的滲出。即使在這種情況下，通過在小直徑的孔中應用組 合物，也可發(fā)揮本發(fā)明的組合物的效果，軟骨的再生良好，可改善軟骨全體的功能。這些方 法是對于軟骨損傷部位、殘留有損傷的軟骨的情形為有效的方法。10.用于軟骨再生或用于治療軟骨疾病的試劑盒本發(fā)明進一步提供用于軟骨再生或用于治療軟骨疾病的試劑盒。試劑盒中可含 有上述本發(fā)明的用于軟骨再生或用于治療軟骨疾病的組合物、交聯(lián)劑、注射器、凝膠用移液 管、專用填充器、使用說明書等。試劑盒的優(yōu)選的具體例子是具備以下構(gòu)成的試劑盒在一 體成型、含有通過間隔區(qū)分的兩個空間的注射器的一個空間中密封褐藻酸的1價金屬鹽、 另一空間中密封作為溶解液的生理鹽水或作為交聯(lián)劑的CaCl2等含有鈣離子的溶液，可以 在使用時將兩個空間的間隔容易地連通；使用時將兩者混合、溶解。作為另外一個例子，是 可以將褐藻酸的1價金屬鹽溶液封入預灌封注射器中、在使用時無需制備操作可直接給藥 的試劑盒。作為另外一個例子，是將褐藻酸溶液與交聯(lián)劑分別封入不同的注射器、裝入一個 包裝內(nèi)的試劑盒。關(guān)于“用于軟骨再生或用于治療軟骨疾病的組合物”、“交聯(lián)劑”、“注射器” 如上所述。而且，在含有褐藻酸的1價金屬鹽的組合物中可以如上所述包埋細胞。并且試 劑盒中還可以含有鏈霉素、青霉素、妥布霉素、阿米卡星、慶大霉素、新霉素和兩性霉素B等 抗生素，阿司匹林、非類固醇性解熱鎮(zhèn)痛劑(NSAIDs)、乙酰氨基酚等抗炎癥藥物等的聯(lián)合用 藥。通過使用本試劑盒，可以順利地進行軟骨再生治療、軟骨疾病治療。需要說明的是，對于本說明書中引用的所有的公開發(fā)行物、例如現(xiàn)有技術(shù)文獻和 公開公報、專利公報等其它專利文獻，其全體內(nèi)容均在本說明書中作為參照引用。而且本說 明書包含作為本申請優(yōu)先權(quán)主張基礎(chǔ)的日本國特許出愿-日本特愿2007-41520號說明書 和日本特愿2007-277005號說明書的內(nèi)容。以下，通過實施例具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受這些實施例的限定。實施例1褐藻酸鈉溶液的制備本實施例中，使用純化褐藻酸鈉((株)Kimica、(株)持田International, Sea Matrix (滅菌)，生產(chǎn)型號B5Y01)、和未純化的食品級褐藻酸鈉(也稱為商品級褐藻酸鈉) (和光純藥工業(yè)(株)，褐藻酸鈉500，199-09961)兩種。純化褐藻酸鈉是滅菌的冷凍干燥 品。食品級的褐藻酸鈉通過孔徑0. 22 μ m的濾器過濾滅菌。當利用市售的LAL測定試劑盒(Limulus Color KY Test Wako, Wako日本)測定 內(nèi)毒素水平時，純化褐藻酸鈉的內(nèi)毒素水平為5. 76EU(內(nèi)毒素單位)/g，食品級褐藻酸鈉的 內(nèi)毒素水平為75950 EU/g，純化褐藻酸鈉的內(nèi)毒素水平與食品級褐藻酸鈉的內(nèi)毒素水平相 比極低。即，純化褐藻酸鈉是經(jīng)過了低內(nèi)毒素處理的褐藻酸鈉。另外，純化褐藻酸鈉的重金 屬含量為20ppm以下，硫酸鉛為0. 98%以下，砷為2ppm以下。另外，將各褐藻酸鈉用過濾滅菌的Mi 11 i-Q水制備成1、2 % w/v的各濃度的褐藻酸 鈉溶液。利用旋轉(zhuǎn)粘度測定儀(小型)(TVE-20LT, TOKI SANGYO CO.，LTD.日本)，在20°C 下測定各濃度的褐藻酸鈉溶液的粘度。關(guān)于轉(zhuǎn)數(shù)，測定褐藻酸鈉溶液時為lrpm，測定 2%褐藻酸鈉溶液時為0. 5rpm ；關(guān)于測定范圍，測定褐藻酸鈉溶液時為MjBUS 2%褐藻
23酸鈉溶液時為5M。結(jié)果如下述表1所示。(表 1)
褐藻酸粘度mPa-s取度(％)第1次第2次第3次平均標準偏差食品級1533.5537.0531.5534.02.27食品級25377.05336.05325.05346.022.38純化1435.4434.1429.3432.92.62純化25359.05496.05488.05447.762.78如表1所示，純化褐藻酸鈉在w/v下約為430mPa *s，在2%下約為5400mPa .S。 食品級中，在w/v下約為530mPa · s，在2%下約為5300mPa · s。由兩組的結(jié)果可知，本 實施例中使用的純化褐藻酸鈉和食品級褐藻酸鈉的各溶液的粘度在 Λ下約為400 600mPa · s、在2%下約為5000 6000mPa · s左右的粘度。對于1、2、3% w/v的各濃度的純化和食品級的褐藻酸鈉溶液進行性狀確認。將各 濃度的褐藻酸鈉溶液自下向翻轉(zhuǎn)的塑料盤中滴加數(shù)滴，此時， Λ褐藻酸鈉溶液(粘度 約400 600mPa 的大部分不堪重力而在數(shù)秒內(nèi)從盤中滴下，但盤底部會粘有一些褐藻 酸鈉。由此顯示，含有褐藻酸的1價金屬鹽的組合物如果粘度約為400 600mPa · s左右 以上，則可得到具有附著性、可停留在患部的性質(zhì)，顯示得到了本發(fā)明的效果。與此相對，對 于2% w/v的褐藻酸鈉溶液(粘度約5000 6000mPa ，不會滴下，至少可在盤上附著約 1分鐘以上。從盤上滴下后仍有較多的褐藻酸鈉附著在盤的底部。濃度為3% w/v的褐藻 酸鈉溶液在上述盤的試驗中，比2% w/v的褐藻酸鈉溶液附著于盤上的時間更長。另一方面，關(guān)于組合物的操作的容易程度，對于3% w/v的褐藻酸鈉溶液，溶解于 Milli-Q水需要稍長時間，填充到移液管或注射器時操作稍有難處，但是是可以進行移液管 和注射器的操作的。對于上述的1、2% w/v的褐藻酸鈉溶液則容易操作。其中，可以認為此時所使用的褐藻酸鈉與實施例10中使用的濃度的粘度為 570mPa-s的褐藻酸鈉接近，由此可知3% w/v的褐藻酸鈉溶液的粘度大約為20000mPa ·8。 因此，從移液管或注射器等的操作容易的角度考慮，含有褐藻酸的1價金屬鹽的組合物優(yōu) 選使粘度約為20000mPa · s以下。由以上結(jié)果顯示，將褐藻酸鈉溶液的粘度制成5000mPa · s 6000mPa · s時，制備 和手術(shù)最為容易，適合作為用于軟骨再生或用于治療軟骨疾病的組合物。在臨床上，例如 在關(guān)節(jié)鏡下操作股骨關(guān)節(jié)面的軟骨缺損的情形等，損傷部位大多朝向下方或側(cè)方。本發(fā)明 的組合物顯示即使對于上述手術(shù)困難的損傷部位，通過調(diào)節(jié)組合物的粘度，也可以對各種 形態(tài)的軟骨損傷部位廣泛應用。另外，為本實施例中使用的純化褐藻酸鈉時，為了使粘度為 5000mPa · s 6000mPa · s，可使用Milli-Q水等將濃度制備成2% w/v左右。實施例2移棺細胞的制備為了制備移植細胞，分離骨髓間葉系間質(zhì)細胞(BMSC)并培養(yǎng)。BMSC中除了骨 髓間充質(zhì)干細胞之外，還含有紅細胞系細胞等。由4月齡的日本白兔的脛骨采集IOmL骨
24髓，用無Ca-Mg的PBS (GibcoBRL Lab.)清洗2次，然后懸浮于DMEM-高葡萄糖(DMED-HG， SigmaChemical，圣路易斯，密蘇里州)。用孔徑70 μ m的細胞過濾網(wǎng)(FalconCo. Ltd)除 去血液凝塊。將細胞在 DMEM-HG、10 % 胎牛血清(FBS, Gibco, Life Technology, Grand Island，紐約)、1%抗生素(青霉素-鏈霉素-兩性霉素IOOX濃縮，Cambrex Biosciences, ffalkersville, MD)的培養(yǎng)基中、在IOOmm的培養(yǎng)皿中、在37°C、5% CO2、加濕下進行溫育。 每隔3天更換1次培養(yǎng)基，除去未粘附的細胞。將具有粘附性的細胞進行10 14天的單 層培養(yǎng)，然后用胰蛋白酶-EDTA(IOmM) (Sigma, UK)剝離，計數(shù)，每隔3天繼代1次。實施例3褐藻酸微球的制備將實施例2所得的細胞用過濾滅菌的Milli-Q水懸浮于調(diào)節(jié)為2% w/v的褐藻酸 鈉溶液中，使細胞濃度為2. 5 X IO7個細胞/mL。將懸浮液用移液管滴加到CaCl2溶液中，形 成凝膠，10分鐘后，將形成的微膠囊用無Ca-Mg的PBS清洗2次，然后用DMED-HG清洗1次。 每個微球40 μ L，制成含有1 X IO6個細胞的微球。從褐藻酸微球中收集細胞是用PBS清洗3次，在50mM的EDTA (Gidco BRL laboratories)中、在37°C、5% CO2下溫育。10分鐘后以1500g離心5分鐘，收集細胞。實施例4對褐藻酸微球中的細胞的鈣毒件(方法)通過細胞計數(shù)試劑盒-8 (CCK-8，Dojindo Laboratories，東京，日本)測定通過滴 加CaCl2溶液形成褐藻酸膠囊的細胞的存活率。按照實施例3的順序，將實施例2所得的 細胞懸浮于2% w/v純化褐藻酸鈉溶液中，使細胞濃度為2. 5 X IO7個細胞/mL，滴加到50、 100、200、400mM的各濃度的CaCl2溶液中，浸泡15分鐘，每個微球40 μ L，制成含有1 X IO6 個細胞的微球。將褐藻酸微球用PBS清洗2次，然后按照實施例3所述的方法收集微球中 的細胞，懸浮于DMED-HG中。將各組的細胞鋪于96孔板，進行1小時溫育，然后將20 μ L CCK-8溶液加入到各孔 中，進一步溫育4小時。細胞的存活率是使用微量板讀數(shù)儀(Bio-Rad Japan Life Science Research,東京，日本)、在吸光度450nm下測定而獲得的。(結(jié)果)各CaCl2溶液濃度下的細胞存活率如圖1所示。褐藻酸微球中的活細胞數(shù)與鈣濃度相關(guān)性地減少，自200mM起顯著降低。由此顯 示了 CaCl2的細胞毒性。還發(fā)現(xiàn)，為了將其對細胞的影響抑制到最低限度、且使褐藻酸鈉盡 可能快地形成硬的凝膠，使與褐藻酸鈉接觸的氯化鈣溶液的濃度為IOOmM左右較為適當。實施例5(方法)用經(jīng)低內(nèi)毒素處理的純化褐藻酸鈉和未經(jīng)低內(nèi)毒素處理的食品級褐藻酸鈉，比較 褐藻酸微球中的細胞存活率。各褐藻酸微球如下制備按照實施例3的順序，將由實施例2 得到的細胞懸浮于2% w/v褐藻酸鈉溶液中，滴加到IOOmM的CaCl2溶液中。各微球是每個 微球40 μ L，制成含有IX IO6個細胞的微球。將兩種褐藻酸膠囊在加入了 10%FBS、1%抗生素的DMED-HG中培養(yǎng)0、1、2、3、7、14天。按照實施例3所述的方法從各膠囊中收集細胞， 通過CCK-8計算活細胞數(shù)。(結(jié)果)結(jié)果如圖2所示。在第1、3、7天中，使用經(jīng)低內(nèi)毒素處理的純化褐藻酸鈉溶液與 使用未經(jīng)低內(nèi)毒素處理的食品級褐藻酸鈉溶液的情形相比，前者中的活細胞顯著殘留。經(jīng) 低內(nèi)毒素處理的純化褐藻酸鈉溶液與未經(jīng)低內(nèi)毒素處理的食品級褐藻酸鈉溶液相比，特別 是在早期(7天以內(nèi))，可見前者對細胞的毒性小等有利之處。實施例6體外褐藻酸微球中的培養(yǎng)Tffe(培養(yǎng))分別將純化褐藻酸鈉和食品級褐藻酸鈉按照實施例3、與實施例5同樣地制備 每個微球40 μ L、含有IX IO6個細胞的微球。在24孔培養(yǎng)皿中，每孔中一個微球，在下面 的ImL標準培養(yǎng)基中培養(yǎng)。即，所使用的標準培養(yǎng)基是將包含100yg/mL丙酮酸鈉(ICN Biomedicals, Aurora,俄亥俄州)>40 μ g/mL 脯氨酸(ICN Biomedicals, Aurora,俄亥俄 州)、50μ g/mL抗壞血酸2-磷酸(Wako，大阪，日本)、1 X ICT7M地塞米松(ICN Biomedicals, Aurora，俄亥俄州)、1% ITS plus mix (Sigma-Aldrich，圣路易斯，密蘇里州)、1 %抗生素、 以及l(fā)Ong/mL重組人轉(zhuǎn)基因生長因子β 3 (R&D System,明尼阿波利斯，明尼蘇達州)的 DMEM-HG用lmg/mL含牛血清白蛋白的4mM HCl溶解而形成。培養(yǎng)皿在37°C下溫育，每隔3 天更換1次培養(yǎng)基。(RNA 的實時 RT-PCR 分析)培養(yǎng)14天后，由勻漿后的細胞中提取總RNA，分析I、II、X型膠原、聚集蛋白聚糖、 Sox 9的基因表達。試驗全部按照常規(guī)方法進行。S卩，RNA是通過以吸光度260nm、280nm測定求出收量。接著，通過mProm-II 反 轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(Promega，麥迪遜，威斯康星州)，按照手冊，由0.05μβ的RNA合成cDNA。此 時，將總RNA和隨機引物的結(jié)合物在70°C下變性5分鐘，立即在冰水中冷卻5分鐘，然后 用ImProm-II 反轉(zhuǎn)錄酶，在42 °C下反轉(zhuǎn)錄60分鐘。接著將所得cDNA用PCR-Grade水 (Roche Diagnostics,印第安納波利斯，印第安納州)稀釋，濃度調(diào)整為低于40ng/yLo以 20 μ L的反應容量進行PCR，使用DNA Engine Opt icon 2連續(xù)熒光檢測系統(tǒng)(Bio-Rad laboratories, Hercules，加利福尼亞州)進行監(jiān)測。使用通過 DNASIS (HitachiSoftware Engineering，東京，日本)設(shè)計的基因特異性引物，使用SYBRgreen qPCR試劑盒(Finzyme， Espoo，芬蘭)檢測信號。具體來說，使用下面的引物兔I 型膠原(5，-3，) TAAGAGCTCCAAGGCCAAGA (SEQ ID NO. 1)禾口(3，-5，) TGTACCTACTCCTTTGACCG (SEQ ID N0. 2)兔II 型膠原(5，-3，)AGAGACCTGAACTGGGCAGA(SEQ ID N0. 3)禾口(3，-5，)ACCACGATATGAGGCACAGTTT(SEQ ID N0. 4)兔X 型膠原(5，-3，) GCCAGGACCTCCAGGACTAT (SEQ ID N0. 5)禾口(3，-5，) CTTTGGACCTGTTGTCCCT (SEQ ID N0. 6)
兔聚集蛋白聚糖(5，-3，)GAGGTCGTGGTGAAAGGTGT (SEQ ID NO. 7)禾口(3，-5，)TGACAGTCCATGGGGTAGGT(SEQ ID NO. 8)兔Sox9 (5，-3，) AAGGGCTACGACTGGACGCT (SEQ ID NO. 9)禾口(3，-5，)GTGCAGTTCGCCGGGT(SEQ ID NO. 10)在95 °C、10分鐘的初期變性步驟后，將cDNA產(chǎn)物以40個PCR循環(huán)進行擴增。各循 環(huán)包含如下步驟94°C、10秒的變性步驟；58°C、20秒的退火步驟；以及72°C、30秒的鏈延 伸步驟。使用 OpticonMonitor 軟件(Bio-Rad Laboratories，Hercules，加利福尼亞州) 進行數(shù)據(jù)分析。當熒光強度達到0.03時以Ct(循環(huán)閾值)值的形式求出各樣品的值。該 值通過在該范圍內(nèi)確認所有的曲線處于指數(shù)擴增期進行選擇。使用改良比較Ct法，由該目 標基因和比較基因(GAPDH)的Ct值計算各基因的相對表達水平。(染色)將培養(yǎng)21天、28天后的微球用PBS清洗，用10%磷酸緩沖液-低聚甲醛固定24 小時，然后包埋到石蠟中，由微球的中央切取5μ m的部分，按照常規(guī)方法進行H-E染色、番 紅-0染色。另外，通過抗I型、抗II型(Fuji Pharm. Lab.，富山，日本)、抗X型(Sigma，圣 路易斯，密蘇里州)的抗膠原抗體確認I、II、X型膠原的生成。MMRNA的實時RT-PCR分析的結(jié)果如圖3所示。染色結(jié)果如圖4所示。圖4㈧和⑶ 顯示使用純化褐藻酸鈉的結(jié)果，圖4(C)和(D)顯示使用食品級褐藻酸鈉的結(jié)果。圖4(A) 和(C)為培養(yǎng)21天，圖4(B)和⑶為培養(yǎng)28天。另外，在圖4(A) ⑶的各照片中，由 左依次表示Η-Ε、番紅-0、抗I型、抗II型、抗X型的抗膠原抗體的染色結(jié)果。參照RT-PCR的結(jié)果(圖3)，在使用純化褐藻酸鈉和食品級褐藻酸鈉的任意情形 下，均可見顯示細胞的軟骨分化的II型膠原、聚集蛋白聚糖、SOX9的增加。將兩種進行比 較，則以純化褐藻酸鈉培養(yǎng)的顯示聚集蛋白聚糖、sox9的水平顯著高。另外，參照染色的結(jié)果(圖4)，可見兩種褐藻酸微球均產(chǎn)生了被番紅0染色或顯示 軟骨分化的II型膠原免疫染色所染色的胞外基質(zhì)，可見軟骨分化。實施例7兔軟骨修復模型^fe(手術(shù))將40只雌性日本白兔(體重2. 6 2. 9kg)用異氟烷· O2氣和戊巴比妥靜注 (0. 05mg/kg)進行麻醉，肌肉注射抗生素(青霉素G，Meiji-Seika,日本)，然后腿部剃毛。 將前側(cè)中央部切開2cm，通過髕旁內(nèi)側(cè)入路到達髁間部位。使用電鉆(Rexon，日本)，制作股 骨滑車的骨軟骨缺損(直徑5mm，深度2mm)。將膝部用生理鹽水浸潤，確認缺損部位沒有出 血，使缺損部位干燥。本實施例中，分成以下5組進行試驗。A)對照組(空白)B)食品級褐藻酸組(無細胞)C)食品級褐藻酸+有細胞(2. 5 X IO7個/mL)組D)純化褐藻酸組(無細胞)
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E)純化褐藻酸+有細胞(2. 5 X IO7個/mL)組A)的對照組是對缺損部位未進行任何處置的組。B)的食品級褐藻酸組(無細胞) 是將2% w/v的食品級褐藻酸鈉溶液應用于缺損部位的組，D)的純化褐藻酸組(無細胞) 是將2% w/v的純化褐藻酸鈉溶液應用于缺損部位的組。并且，C)食品級褐藻酸+有細胞 組、E)純化褐藻酸+有細胞組是將實施例2所得的細胞懸浮于2% w/v的食品級褐藻酸鈉 溶液或2% w/v的純化褐藻酸鈉溶液中，應用于關(guān)節(jié)軟骨的缺損部位。此時，細胞使用了按 照實施例2的方法制備的兔自體細胞。使褐藻酸鈉溶液的濃度為2 % w/v，這是由于由實施例1的結(jié)果可知，這樣可以使 粘度為適合手術(shù)的5000mPa · s 6000mPa · s。以缺損部位朝向上方的姿勢固定兔，使用凝膠用移液管將本發(fā)明的組合物應用于 缺損部位。B) E)的各組中，褐藻酸鈉濃度的粘度均適度，因此，即使由于關(guān)節(jié)液而形成容 易流動的條件，褐藻酸鈉溶液也不會從缺損部位流出。然后，用27G針的注射器將約0.5mL IOOmM的CaCl2溶液用10秒的時間緩慢持續(xù)地加到移植片的表面。移植片的表面層立即形 成凝膠，移植細胞不會從患部脫離。用生理鹽水清洗CaCl2溶液。無需進一步固定，手術(shù)后 縫合患部。兔可自由活動。在手術(shù)4周后或12周后，對受試體的兔靜脈注射過量戊巴比妥，使其安樂死。然 后將其腿部的末端部用電鋸切除。圖5是手術(shù)時的照片。(全體觀察)用肉眼觀察全體外觀，進行評分。評分是參考Gabriele G.等人的方法 (Biomaterial，21 (2000)，2561 2574)，按照圖 6 的基準打分。(染色)之后將受試體用低聚甲醛固定，脫鈣，用石蠟固定。將自缺損部位中央向外5μπι 的部分實施番紅-0、Η-Ε染色、抗I型膠原、抗II型膠原免疫染色。為了評價新形成的軟骨 組織，采用圖7所示的評分系統(tǒng)，通過顯微鏡進行評價。評分由獨立的、盲試人員進行。(機械強度測定)通過壓痕試驗儀測定患部的機械強度。將股骨膝關(guān)節(jié)朝向上方，牢固地進行夾板 固定，試驗在室溫下進行。壓頭運動自動的朝向再生軟骨的中心，記錄相對于負荷(N)的移 動(mm)。新生組織的厚度由組織切片來測量。由負荷-變形曲線的直線部分得出楊氏模量。MM染色結(jié)果如圖8 11所示。H-E染色、番紅0染色、抗II型膠原免疫染色的結(jié)果如下E)的純化褐藻酸+有細 胞組(圖11)中，與其它組比較，自4周后這樣較早的階段即可見形成最優(yōu)異的透明軟骨、 II型膠原。12周時可見約80%的軟骨再生。從H-E染色結(jié)果可知，軟骨下骨的形成也極為 良好。番紅0染色中可見蛋白聚糖的形成，也可見胞外基質(zhì)的形成。另一方面，通過H-E染 色、抗I型膠原免疫染色，幾乎未見纖維軟骨的生成。D)的純化褐藻酸組(無細胞)(圖10)與C)的食品級褐藻酸+有細胞組(圖9) 比較，透明軟骨、II型膠原、軟骨下骨的形成均良好，在未包埋細胞的D)組中，得到了通過透明軟骨細胞引發(fā)的軟骨再生，這是另人驚訝的結(jié)果。另外，未包埋細胞的D)組與包埋了 細胞的C)組相比，軟骨損傷的再生能力優(yōu)異，這是預想以外的結(jié)果。另一方面，缺損部位未經(jīng)任何處理的A)對照組(圖8)中幾乎未見軟骨細胞、II型 膠原的新生。肉眼觀察外觀全體并評分得到的評價結(jié)果(肉眼)、以及對上述染色觀察進行評 分的評價結(jié)果(組織學)如圖12所示。12周中，結(jié)合肉眼和組織學的結(jié)果進行綜合評分(總分)，E)純化褐藻酸+有細 胞組為22. 71分，D)純化褐藻酸組(無細胞)為19. 57分，C)食品級褐藻酸+有細胞組為 14. 75分，B)食品級褐藻酸組(無細胞)為10. 25分，A)對照組(空白)為8. 43分，E)純 化褐藻酸+有細胞組最為優(yōu)異，其次是D)純化褐藻酸組(無細胞)、C)食品級褐藻酸+有 細胞組的順序。未包埋細胞的D)組與包埋了細胞的C)組比較，綜合評分(總分)優(yōu)異，軟 骨損傷的再生能力優(yōu)異，這是完全未預想到的結(jié)果。肉眼的外觀全體的評價(肉眼-全體)、染色評價(組織學-全體)的評分結(jié)果均 與上述同樣，E)純化褐藻酸+有細胞組最優(yōu)，其次是D)純化褐藻酸組(無細胞)。肉眼的評價項目中，使用純化褐藻酸的D)組和E)組與使用食品級褐藻酸的B) 組、C)組比較，端部融合(新生細胞相對于原有的軟骨(new tissue relative to native cartilage))、軟骨表面的光滑程度(smoothness of cartilage surface)、軟骨表面、±真充 度(cartilage surface, degree of filling)、軟骨顏色、新生軟骨的不透明程度、透明性 (color ofcartilage, opacity or translucency of the neocartilage) ^PJfW^M Ιξ|i-^iJt
已在組織學的評價項目中，使用純化褐藻酸的D)組和E)組特別是在優(yōu)勢組織的性 M (nature of predominant tissue)(surfaceregularity)
禾口均勾性(structural integrity andhomogeneity)、厚度(thickness)、與周圍軟骨的結(jié) (bonding to adjacentcartilage) ^ΜΗΙ ^'Μ' ' Μ τ ιβ^^ (degenerative changes in adjacentcartilage)、炎癥反應(inflammatory response)項目中比使用食品級褐藻酸的 B)組、C)組的評分高。由以上可知，作為本發(fā)明組合物的D)組、E)組中，透明軟骨、II型膠原、軟骨下骨 的形成等的軟骨損傷中的軟骨細胞、軟骨組織的形成極為良好，幾乎未見纖維軟骨的形成?？芍律M織與宿主組織的融合性好，周圍軟骨的變性或炎癥反應少，機體親和性高?？梢源_認本發(fā)明的組合物有效地促進了軟骨損傷部位的軟骨再生。純化褐藻酸組D)組、E)組的機械強度測定結(jié)果如圖13所示。純化褐藻酸組的機械強度測定的結(jié)果是相對于正常軟骨組織的楊氏模量10，E) 純化褐藻酸+有細胞組為8，可見強度恢復至幾乎沒有損傷的正常狀態(tài)。由此證明，包埋了 細胞的本發(fā)明的組合物機械強度優(yōu)異，可再生具有強度的透明軟骨，也可良好地形成軟骨 下骨。實施例8經(jīng)適性處理的男性尸體(Cadaver)模型(方法)
對經(jīng)適性處理的男性尸體進行福爾馬林固定，在室溫下膝部沒有變形部位或不穩(wěn) 定的性質(zhì)。通過髕旁內(nèi)側(cè)入路使股骨側(cè)面關(guān)節(jié)丘暴露。關(guān)節(jié)軟骨光滑，且未見變性或退化 等。使用多種類的打孔機，在內(nèi)側(cè)關(guān)節(jié)面負荷最重的部位制備幅寬(IOmmX20mm)、深度5mm 的軟骨全層缺損并縫合。由前外側(cè)插入傾斜30°的關(guān)節(jié)鏡。手術(shù)器具全部由前內(nèi)側(cè)插入。 將生理鹽水應用于患部，然后排出殘留在關(guān)節(jié)部位的液體，用干棉球擦拭。用18G針的注射 器將臺盼藍著色的2% w/v純化褐藻酸鈉溶液(無細胞)、粘度5000 6000mPa 緩慢注 入軟骨缺損部位。手術(shù)時，患部朝向下方，但本發(fā)明的組合物未從損傷部位脫落，停留在損 傷部位。將約IOmL IOOmM的CaCl2溶液應用于患部，使表面形成凝膠。通過生理鹽水回流， 充分清洗膝關(guān)節(jié)，為防止干燥，用20mL生理鹽水充滿患部。手術(shù)后，每隔6小時手動將膝蓋進行彎曲和伸展200次，在0°C 120°C的范圍內(nèi) 運動。手術(shù)24小時后評價患部。(結(jié)果)表示本實驗的情形的照片如圖14所示。圖14(A)是表示制作軟骨缺損部位的情形 的照片。圖14(B)是表示將著色的褐藻酸鈉移植到軟骨缺損部位的情形的照片。圖14(C) 是在褐藻酸鈉的表面施加CaCl2溶液，使其凝膠化(固化)時的照片。并且，圖14(D)是手 術(shù)后活動關(guān)節(jié)、24小時后進行觀察的情形的照片。本試驗不僅是對兔，也是對在人的尸體上制作較大的缺損部位時確認是否可移植 而進行的試驗。如圖14B的照片所示，將褐藻酸鈉溶液注入到缺損部位，即使表面不形成凝膠，褐 藻酸鈉溶液也不會從患部流出。另外，對于使褐藻酸鈉溶液的表面凝膠化，在術(shù)后活動關(guān) 節(jié)，即使是在24小時后觀察時缺損部位仍停留有褐藻酸鈉溶液。這樣，在施加負荷、活動劇 烈的較嚴酷的條件的部位中，上述形態(tài)的組合物也可以停留，這是另人驚訝的。由此可知， 本發(fā)明的用于軟骨再生或用于治療軟骨疾病的組合物對于各種形態(tài)的軟骨損傷部位、對于 各種應用條件均可以廣泛地臨床應用。實施例9在軟骨損傷部位制作1個 多個小孔的方法(1) M 1軟骨損傷部位或軟骨缺損部位殘留有軟骨時，按照實施例7、8的方法，使用電鉆， 在軟骨損傷部位或殘留軟骨上以直徑1. 5mm、深度5 IOmm左右的較小的直徑制作1個 多個深達軟骨下骨的全層缺損。用18G針向其中緩慢注入3000 4000mPa 的純化褐藻 酸鈉溶液(無細胞)，然后將l.OmL IOOmM的CaCl2溶液應用于在缺損部位注入有褐藻酸鈉 溶液的表面，使表面形成凝膠。由于制作了全層缺損，來自患者的骨髓出血使骨髓中的軟骨 前體細胞游離到軟骨缺損部位。通過游離的軟骨前體細胞和本發(fā)明的組合物的效果促進軟 骨的再生，可以改善軟骨全體的功能。(2)例 2與例1同樣，在軟骨損傷部位或殘留有軟骨的軟骨缺損部位制作未達軟骨下骨的 部分缺損。與例1同樣，對其應用2000 3000mPa · s的純化褐藻酸鈉溶液(無細胞)、 IOOmM的CaCl2溶液。由于缺損部位沒有來自患者的骨髓出血，受試者沒有骨髓中的軟骨前 體細胞的浸潤。但是，即使在這種情況下，通過在小直徑的孔中應用組合物，也可發(fā)揮本發(fā)明的組合物的效果，軟骨再生良好，可改善軟骨全體的功能。這些方法對于軟骨損傷部位范 圍較廣時、殘留有損傷的軟骨時均是有效的方法。
實施例10使用褐藻酸鈉((株)Kimica)水溶液，對本發(fā)明的組合物的粘度和附著性的關(guān)系 進行研究。(方法)使用褐藻酸鈉水溶液的粘度因分子量不同而顯示110、360、570mPa · s的三種 褐藻酸鈉水溶液，制備各種褐藻酸鈉水溶液(下述表2)，將一定量注入到離心用的微量管 (內(nèi)徑9mm、高39mm)中，注意不要有氣泡混入，在迅速地傾斜135度的角度時測定至各水溶 液開始由微量管中流出所用的時間。此時，褐藻酸鈉水溶液的粘度通過東機產(chǎn)業(yè)制造的B型粘度計、在20°C的條件下 進行測定。(表 2)樣品
褐藻酸納水溶液濃度(％)IlOmPa-S0.51.01.52.02.53.01%粘度360 mPa.s0.51.01.52.02.53.0570 mPa-s0.51.01.52.02.53.0(結(jié)果)各種褐藻酸鈉的濃度與附著時間的關(guān)系如圖15所示?？芍N褐藻酸鈉水溶液 中的任意一種，隨著褐藻酸鈉水溶液濃度的升高，附著時間延長，附著性升高。另外，將3種 褐藻酸鈉水溶液進行比較，可知如果選擇1 %濃度下粘度高的褐藻酸鈉水溶液，則顯示高附 著性，可獲得更長的附著時間。各種褐藻酸鈉水溶液的粘度與附著時間的關(guān)系如圖16所示。隨著褐藻酸鈉水溶 液粘度的升高，附著時間延長，顯示高附著性。以上顯示，含有褐藻酸的1價金屬鹽的組合 物的粘度與附著性之間可得到一定的相關(guān)性?；谝陨习l(fā)現(xiàn)，當將本發(fā)明的組合物應用于傾斜的或朝向下方狀態(tài)的軟骨損傷部 位時，以及除去所應用的患部的水分或血液等、以符合本試驗條件時，可以參照該結(jié)果，調(diào) 節(jié)本發(fā)明的組合物的粘度。例如，為了獲得約5秒左右的附著時間，可將本發(fā)明的組合物的 粘度調(diào)節(jié)至約2000mPa 左右以上；為獲得大約10秒左右的附著時間，可將本發(fā)明的組合 物的粘度調(diào)節(jié)至約3000 4000mPa · s左右以上；為獲得大約20秒左右的附著時間，可將 粘度調(diào)節(jié)至約7000 8000mPa · s左右以上；為獲得大約30秒左右的附著時間，可將粘度 調(diào)節(jié)至約8000 9000mPa · s左右以上。但是，實際應用于患部時，由于組合物的注入量、注入部位的形狀等，附著時間發(fā) 生變化。特別是組合物的注入量少時，除粘性之外，表面張力等因素也有影響，因此，即使是 低粘性也可長時間附著。
除此之外，可以適當考慮測定中使用的粘度計的特性、室溫、包埋的細胞量、本發(fā) 明的組合物的狀態(tài)，結(jié)合手術(shù)的方法獲得目標附著時間。實施例11純化褐藻酸鈉的分子量分布測定(1)方法按照以下條件，通過凝膠過濾色譜進行純化褐藻酸鈉的分子量分布測定。柱=TSKgelGMPffxl 2 根 +TSKgel G2500Pffxl 1 根(Tosoh 株式會社制備)(直徑 7. 8mmX300mmX3 根)柱溫40°C洗脫液200mM硝酸鈉水溶液試樣濃度0.05%流速LOmL/分鐘注入量200μ L檢測器RI (差示折射儀)標準物質(zhì)普魯蘭、葡萄糖(分子量160萬、78. 8萬、40. 4萬、21. 2萬、11. 2萬、4. 73 萬、2. 28 萬、1. 18 萬、5900、180)(2)結(jié)果(表 3)
權(quán)利要求
用于治療軟骨疾病的組合物，該組合物是關(guān)節(jié)內(nèi)注入給藥，其特征在于含有低內(nèi)毒素褐藻酸的1價金屬鹽作為有效成分。
2.權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于上述低內(nèi)毒素褐藻酸的1價金屬鹽通過凝 膠過濾色譜測得的重均分子量為50萬以上。
3.權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中，上述軟骨疾病是骨關(guān)節(jié)炎。
4.權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中，上述軟骨疾病是肩周炎。
5.權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中，上述軟骨疾病是風濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)疼痛。
6.用于抑制軟骨退行性改變的組合物，該組合物是關(guān)節(jié)內(nèi)注入給藥，其特征在于含 有低內(nèi)毒素褐藻酸的1價金屬鹽作為有效成分。
7.用于保護軟骨的組合物，該組合物是關(guān)節(jié)內(nèi)注入給藥，其特征在于含有低內(nèi)毒素 褐藻酸的1價金屬鹽作為有效成分。
8.用于修復軟骨的組合物，該組合物是關(guān)節(jié)內(nèi)注入給藥，其特征在于含有低內(nèi)毒素 褐藻酸的1價金屬鹽作為有效成分。
9.用于抑制關(guān)節(jié)疼痛的組合物，該組合物是關(guān)節(jié)內(nèi)注入給藥，其特征在于含有低內(nèi) 毒素褐藻酸的1價金屬鹽作為有效成分。
10.用于抑制關(guān)節(jié)炎的組合物，該組合物是關(guān)節(jié)內(nèi)注入給藥，其特征在于含有低內(nèi)毒 素褐藻酸的1價金屬鹽作為有效成分。
11.用于改善關(guān)節(jié)機能的組合物，該組合物是關(guān)節(jié)內(nèi)注入給藥，其特征在于含有低內(nèi) 毒素褐藻酸的1價金屬鹽作為有效成分。
12.用于軟骨再生的組合物，該組合物通過應用于軟骨損傷部位而在患部固化，該組合 物含有凝膠過濾色譜測得的重均分子量為50萬以上的低內(nèi)毒素褐藻酸的1價金屬鹽，粘度 為400mPa · s 20000mPa · s，具有流動性。
13.權(quán)利要求12所述的組合物，該組合物包埋有骨髓間充質(zhì)干細胞。
14.用于透明軟骨再生的組合物，該組合物通過應用于軟骨損傷部位而在患部固化，該 組合物含有凝膠過濾色譜測得的重均分子量為50萬以上的低內(nèi)毒素褐藻酸的1價金屬鹽， 不含有用于軟骨組織再生的細胞，粘度為400mPa · s 20000mPa · s，具有流動性。
15.權(quán)利要求12 14中任一項所述的組合物，其中，上述組合物應用于軟骨損傷部位， 通過在該組合物的表面應用CaCl2溶液來進行固化。
全文摘要
本發(fā)明提供用于軟骨再生或用于治療軟骨疾病的組合物，其特征在于該組合物含有使內(nèi)毒素水平降低至實質(zhì)上不會引發(fā)炎癥或發(fā)熱程度的褐藻酸的1價金屬鹽作為有效成分。由此，可以提供使軟骨再生作用和應用于軟骨損傷部位的容易程度更為改善的用于軟骨再生的組合物，以及同時具有通過機械刺激保護軟骨的效果、抑制因磨損或炎癥而導致的軟骨退行性改變的效果、修復軟骨損傷部位的效果以及抑制關(guān)節(jié)組織的炎癥或疼痛的效果的用于治療軟骨疾病的組合物。
文檔編號A61K9/06GK101951969SQ20088000492
公開日2011年1月19日 申請日期2008年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月21日
發(fā)明者三浪明男, 五十嵐達彌, 今井真理子, 大澤伸雄, 宮島千尋, 巖崎倫政, 河村太介, 笠原文善, 笠原靖彥 申請人:持田制藥株式會社;國立大學法人北海道大學