專利名稱：切割來自β-2-微球蛋白基因之DNA靶序列的大范圍核酸酶變體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及I-CreI變體，其中兩種I-CreI單體中至少一種具有至少兩個替換，各位于I-CreI的26至40以及44至77位的LAGLIDADG核心結(jié)構(gòu)域的兩個功能性亞結(jié)構(gòu)域中的每一個中，并且所述變體能夠切割來自β-2-微球蛋白基因的DNA靶序列。
可以通過任何眾所周知的體外或體內(nèi)切割測定來測量根據(jù)本發(fā)明的變體的切割活性，例如PCT國際申請WO 2004/067736；Epinat等，NucleicAcids Res.，2003，31，2952-2962；Chames等，Nucleic Acids Res.，2005，33，e178和Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458中描述的。例如，可通過同向重復(fù)重組測定在酵母或哺乳動物細(xì)胞中使用報告載體測量本發(fā)明變體的切割活性。所述報告載體包含克隆在酵母或哺乳動物表達(dá)載體中報告基因的兩個截短的非功能性拷貝(同向重復(fù))以及間插序列之中的基因組DNA靶序列。變體的表達(dá)產(chǎn)生能夠切割基因組DNA靶標(biāo)序列的功能性核酸內(nèi)切酶。此切割誘導(dǎo)同向重復(fù)之間的同源重組，產(chǎn)生功能性報告基因，可通過合適的測定來監(jiān)測該基因的表達(dá)。
定義 -多肽序列中的氨基酸殘基在本文中由單字母代碼表示，其中例如Q意為Gln或谷氨酰胺殘基，R意為Arg或精氨酸殘基，D意為Asp或天冬氨酸殘基。
-核苷酸按如下表示使用單字母代碼表示核苷堿基a是腺嘌呤，t是胸腺嘧啶，c是胞嘧啶，g是鳥嘌呤。對于簡并核苷酸來說，r代表g或a(嘌呤核苷酸)，k代表g或t，s代表g或c，w代表a或t，m代表a或c，y代表t或c(嘧啶核苷酸)，d代表g、a或t，v代表g、a或c，b代表g、t或c，h代表a、t或c，n代表g、a、t或c。
-“大范圍核酸酶”是指具有12到45bp的雙鏈DNA靶序列的內(nèi)切核酸酶。所述大范圍核酸酶是其中各結(jié)構(gòu)域位于單體上的二聚體酶，或是在單個多肽上包含兩個結(jié)構(gòu)域的單體酶。
-“大范圍核酸酶結(jié)構(gòu)域”是指這樣的區(qū)域，其與大范圍核酸酶DNA靶標(biāo)的一半相互作用，并能夠與相同大范圍核酸酶的另一結(jié)構(gòu)域結(jié)合，形成能夠切割所述DNA靶標(biāo)的功能性大范圍核酸酶，所述另一結(jié)構(gòu)域與所述DNA靶標(biāo)的另一半相互作用。
-“大范圍核酸酶變體”或“變體”是指通過將野生型大范圍核酸酶(天然大范圍核酸酶)氨基酸序列中的至少一個殘基替換為不同的氨基酸而獲得的大范圍核酸酶。
-“功能性變體”是指能夠切割DNA靶序列的變體，優(yōu)選地所述靶標(biāo)是不被親本大范圍核酸酶切割的新靶標(biāo)。例如，這些變體在接觸DNA靶序列的位置上或與所述DNA靶標(biāo)直接或間接相互作用的位置上具有氨基酸改變。
-“具有新特異性的大范圍核酸酶Cre變體”是指具有與親本大范圍核酸酶不同的靶標(biāo)切割模式的變體。等價且無差異地使用的術(shù)語“新特異性”、“經(jīng)改變的特異性”、“新切割特異性”、“新底物特異性”是指變體針對DNA靶序列中核苷酸的特異性。
-“I-CreI”是指具有序列SWISSPROT P05725或pdb登錄號1g9y的野生型I-CreI，對應(yīng)于序列表中的序列SEQ ID NO1或SEQ ID NO107。
-“結(jié)構(gòu)域”或“核心結(jié)構(gòu)域”是指“LAGLIDADG歸巢內(nèi)切核酸酶核心結(jié)構(gòu)域”，它是LAGLIDADG家族歸巢內(nèi)切核酸酶的特征性α1β1β2α2β3β4α3折疊，對應(yīng)于約一百個氨基酸殘基的序列。所述結(jié)構(gòu)域包含折疊成反向平行β-片層的四條β鏈(β1β2β3β4)，所述β-片層與DNA靶標(biāo)的一半相互作用。該結(jié)構(gòu)域能夠與另一LAGLIDADG歸巢內(nèi)切核酸酶核心結(jié)構(gòu)域結(jié)合，形成能夠切割所述DNA靶標(biāo)的功能性內(nèi)切核酸酶，所述另一結(jié)構(gòu)域與所述DNA靶標(biāo)的另一半相互作用。例如，在二聚體歸巢內(nèi)切核酸酶I-CreI(163個氨基酸)的情況下，LAGLIDADG歸巢內(nèi)切核酸酶核心結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)于殘基6到94。
-“單鏈大范圍核酸酶”是指包含通過肽間隔區(qū)連接的兩個LAGLIDADG歸巢內(nèi)切核酸酶結(jié)構(gòu)域或核心結(jié)構(gòu)域的大范圍核酸酶。單鏈大范圍核酸酶能夠切割嵌合DNA靶序列，所述靶序列包含各親本大范圍核酸酶靶序列中不同的一半。
-“亞結(jié)構(gòu)域”是指LAGLIDADG歸巢內(nèi)切核酸酶核心結(jié)構(gòu)域中的區(qū)域，其與歸巢內(nèi)切核酸酶DNA靶標(biāo)半位點的不同部分相互作用。
-“β-發(fā)夾”是指LAGLIDADG歸巢內(nèi)切核酸酶核心結(jié)構(gòu)域反向平行β-片層的兩條連續(xù)β-鏈(β1β2或β3β4)，其通過環(huán)或轉(zhuǎn)角相連。
-“I-CreI位點”是指被I-CreI切割的22到24bp的雙鏈DNA序列。I-CreI位點包括野生型(天然)非回文I-CreI歸巢位點和衍生的回文序列，如序列5’-t-12c-11a-10a-9a-8a-7c-6g-5t-4c-3g-2t-1a+1c+2g+3a+4c+5g+6t+7t+8t+9t+10g+11a+12，也稱為C1221(SEQ ID NO2，圖5)。
-“DNA靶標(biāo)”、“DNA靶序列”、“靶序列”、“靶位點”、“靶標(biāo)”、“位點”；“目的位點”；“識別位點”、“識別序列”、“歸巢識別位點”、“歸巢位點”、“切割位點”是指被LAGLIDADG歸巢內(nèi)切核酸酶識別并切割的20到24bp的雙鏈回文、局部回文(假回文)或非回文的多核苷酸序列，例如I-CreI，或變體，或來自于I-CreI的單鏈嵌合型大范圍核酸酶。這些術(shù)語是指大范圍核酸酶要在其中誘導(dǎo)雙鏈斷裂(切割)的獨特DNA定位，優(yōu)選地為基因組定位。DNA靶標(biāo)通過雙鏈多核苷酸一條鏈的5′到3′序列來定義，如上文針對C1221所指出的。DNA靶標(biāo)的切割分別發(fā)生在有義和反義鏈位置+2和-2的核苷酸處。除非另有說明，否則I-Cre I大范圍核酸酶變體對DNA靶標(biāo)進(jìn)行切割的位置對應(yīng)于DNA靶標(biāo)有義鏈上的切割位點。
-“DNA靶標(biāo)半位點”、“半切割位點”或“半位點”是指DNA靶標(biāo)中與各個LAGLIDADG歸巢內(nèi)切核酸酶核心結(jié)構(gòu)域結(jié)合的部分。
-“嵌合DNA靶標(biāo)”或“雜合DNA靶標(biāo)”是指兩條親本大范圍核酸酶靶序列中不同之一半的融合物。另外，所述靶標(biāo)的至少一半可包含與至少兩個獨立的亞結(jié)構(gòu)域結(jié)合的核苷酸組合(組合DNA靶標(biāo))。
-“β-2-微球蛋白基因”是指哺乳動物的β-2-微球蛋白基因。例如，人β-2-微球蛋白基因(B2M，6673bp)位于登錄號NC_000015對應(yīng)序列的42790977至42797649位。B2M基因包含四個外顯子(外顯子11-127位；外顯子23937-4215位；外顯子34843-4870位；外顯子46121-6673位)。從61位(外顯子1)至4856位(外顯子3)的ORF的兩側(cè)是分別位于其5”和3端的短的和長的非翻譯區(qū)域(圖4)。
-“來自β-2-微球蛋白基因的DNA靶序列”、“基因組DNA靶序列”、“基因組DNA切割位點”、“基因組DNA靶標(biāo)”或“基因組靶標(biāo)”是指β-2-微球蛋白基因中被大范圍核酸酶變體識別并切割的20到24bp序列。
-“載體”是指能夠轉(zhuǎn)運與之連接的另一核酸的核酸分子。
-“同源”是指一條序列與另一序列具有足夠?qū)е滦蛄虚g發(fā)生同源重組的同一性，更具體地具有至少95％的同一性，優(yōu)選97％的同一性，更優(yōu)選99％的同一性。
-“同一性”是指兩條核酸分子或多肽之間的序列同一性?？赏ㄟ^比較各序列中可為比較目的而排列的位置來測定同一性。當(dāng)所比較序列中的一個位置被相同的堿基占據(jù)時，則這些分子在該位置上是相同的。核酸或氨基酸序列之間的相似性或同一性程度是核酸序列間共有的位置上相同或匹配的核苷酸數(shù)量的函數(shù)?？墒褂枚喾N比對算法和/或程序來計算兩條序列之間的同一性，包括FASTA或BLAST，它們可作為GCG序列分析包(University of Wisconsin，Madison，Wis.)的一部分獲得，并可以例如默認(rèn)設(shè)置使用。
-“個體”包括哺乳動物，以及其它脊椎動物(例如鳥類、魚和爬行動物)。本文使用的術(shù)語“哺乳動物”是指任何這樣的脊椎動物，包括單孔類、有袋類和胎盤動物，它們對其幼仔哺乳，并且分娩活的幼仔(真哺乳亞綱(eutharian)或胎盤哺乳動物)或者產(chǎn)卵(后獸亞綱(metatharian)或非胎盤(nonplacental)哺乳動物)。哺乳動物物種的實例包括人和其它靈長類(例如猴、猩猩)、嚙齒動物(例如大鼠、小鼠、豚鼠)和其它，例如牛、豬和馬。
-突變是指在多核苷酸(cDNA、基因)或多肽序列中替換、缺失、插入一個或多個核苷酸/氨基酸。所述突變可影響基因的編碼序列或其調(diào)節(jié)序列。其還可影響基因組序列的結(jié)構(gòu)或所編碼mRNA的結(jié)構(gòu)/穩(wěn)定性。
本發(fā)明的變體可以是同二聚體或異二聚體。優(yōu)選地，其為異二聚體，其中兩個單體均在Cre26到40位以及44到77位中具有突變。更優(yōu)選地，兩個單體均在I-CreI的26到40位以及44到77位中具有不同的替換。
在所述變體的一個優(yōu)選實施方案中，位于I-CreI中44到77位的亞結(jié)構(gòu)域中的所述替換位于44、68、70、75和/或77位。
在所述變體的另一個優(yōu)選實施方案中，位于I-CreI中26到40位的亞結(jié)構(gòu)域中的所述替換位于26、28、30、32、33、38和/或40位。
在所述變體的另一個優(yōu)選實施方案中，它包含接觸DNA靶序列或者與DNA主鏈或核苷酸堿基直接或通過水分子相互作用的其它氨基酸殘基位置上的一個或多個突變；這些殘基是本領(lǐng)域眾所周知的(Jurica等，Molecular Cell.，1998，2，469-476；Chevalier等，J.Mol.Biol.，2003，329，253-269)。特別的，可以在接觸磷酸骨架的位置引入額外替換，例如在最后一個C端環(huán)中(137至143位)。優(yōu)選地，所述殘基參與所述DNA切割位點的結(jié)合和切割。更優(yōu)選地，所述殘基是I-CreI的138、139、142或143位?？梢栽谝粋€變體中突變兩個殘基，只要各突變屬于選自138和139位殘基對、142和143位殘基對的不同殘基對即可。引入的突變改變了最后一個C端環(huán)中所述氨基酸與I-CreI位點磷酸骨架的相互作用。優(yōu)選地，138或139位殘基被疏水氨基酸所替換，以避免與DNA切割位點的磷酸骨架形成氫鍵。例如138位殘基被丙氨酸替換，或者139位殘基被甲硫氨酸替換。142或143位殘基有利地被小氨基酸如甘氨酸所替換，以減小這些氨基酸殘基側(cè)鏈的尺寸。更優(yōu)選地，最后一個C端環(huán)中的所述替換改變變體對I-CreI位點±1至2，±6至7和/或±11至12位核苷酸的特異性。
在所述變體的另一個優(yōu)選實施方案中，它包含一個或多個改善所述變體對來自β-2-微球蛋白基因的DNA靶序列的結(jié)合和/或切割特性的額外突變。
額外的突變堿基可以在整個I-CreI序列上，特別地，可以在I-CreI的C端一半(80至163位)內(nèi)。例如，所述變體包含在以下位置上的一個或多個額外替換2、4、19、24、31、43、49、50、53、54、56、57、59、60、64、66、69、72、73、80、81、82、83、85、87、89、92、94、96、100、103、105、107、110、111、117、120、128、129、132、135、140、142、147、153、154、155、156、157、158、159、161、163。優(yōu)選地，所述替換選自N2I、N2Y、K4Q、G19S、I24F、I24V、Q31L、F43L、T49A、Q50R、W53R、F54L、D56E、D56G、K57N、V59A、D60E、D60G、D60N、V64A、V64D、Y66C、D69G、D69E、S72F、S72P、S72T、V73I、E80G、I81T、I81V、K82E、K82R、P83Q、P83A、H85R、F87L、T89A、T89I、Q92L、Q92R、F94L、F94Y、K96R、K100R、K100Q、N103T、N103S、V105A、K107R、E110D、E110G、Q111L、E117G、D120G、W128R、V129A、I132V、L135P、T140M、K142R、T147A、T147N、D153G、D153V、S154G、L155Q、S156N、S156R、E157V、K158N、K159Q、K159R、S161P、S161F、S162F、P163L和P163Q。更優(yōu)選地，所述突變選自G19S、I24V、F54L、F87L和I132V。
所述變體還可包含插入到I-CreI序列C端(164和165位)的一個或兩個額外殘基；例如，可以在164位插入G，在165位插入T或P。
在所述變體的另一個優(yōu)選實施方案中，所述替換是原始氨基酸被替代為以下的氨基酸A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、Y、C、V、L和W。
本發(fā)明的變體可來自野生型I-CreI(SEQ ID NO1)或I-CreI骨架蛋白(scaffold protein)，例如具有Cre2位丙氨酸插入、D75N替換以及I-CreI序列C端的AAD插入(164位至166位)的SEQ ID NO106的骨架(167個氨基酸)。
另外，本發(fā)明的變體可包含在序列的NH2端和/或COOH端插入的一個或多個殘基。例如，在NH2端和/或COOH端引入標(biāo)簽(表位或多聚組氨酸序列)；所述標(biāo)簽可用于所述變體的檢測和/或純化。
本發(fā)明的變體可以是能切割回文或假回文DNA靶序列的同二聚體。
或者，所述變體是異二聚體，其來自在I-CreI的26至40和44至77位具有不同替換的第一和第二單體的結(jié)合，所述異二聚體能切割來自β-2-微球蛋白基因的非回文DNA靶序列。
所述變體切割的DNA靶序列可以是β-2-微球蛋白基因的外顯子或內(nèi)含子。
在所述變體的另一個優(yōu)選實施方案中，所述DNA靶序列來自人β-2-微球蛋白基因(B2M基因)。優(yōu)選地，所述DNA靶序列選自序列SEQ IDNO82至91(24bp；圖4和15)以及在所述24bp序列的一端或兩端缺少一個或兩個末端堿基對的20至22bp的衍生序列。因為編碼外顯子只占基因的一小部分(圖4)，所以發(fā)現(xiàn)大多數(shù)潛在靶位點位于內(nèi)含子序列或非翻譯外顯子序列中。但是，例如B2M18和B2M20的靶標(biāo)(SEQ ID NO89和90)位于B2M的開放讀碼框中。
更優(yōu)選地，對于所述第一和第二單體而言，所述變體的單體分別具有至少下列替換 -Y33R、Q38A、Q44D、R68A、R70S、D75K和I77R(第一單體)，以及K28R、Y33A、Q38Y、S40Q、Q44A、R68Y、R70S、D75Y和I77K(第二單體)；該變體切割位于第一內(nèi)含子中的B2M4靶標(biāo)(圖4和15)， -S32T、Y33T、Q44T、R68Y、R70S、D75Y和I77V(第一單體)，以及Y33R、Q38A、Q44N、R68Q、R70S、D75S和I77V(第二單體)；該變體切割位于第一內(nèi)含子中的B2M10靶標(biāo)(圖4和15)， -S32G、Y33H、Q44A、R68Y、R70S、D75Y和I77K或者S32A、Y33H、Q44A、R68Y、R70S、D75Y和I77K(第一單體)和N30Q、Y33G、Q38C、R68N、R70S、D75N和I77R(第二單體)；該變體切割位于第一內(nèi)含子中的B2M11靶標(biāo)(圖4和15)， -S32G、Y33H、Q44A、R68Y、R70S、D75Y和I77K(第一單體)，和S32T、Q38S、Q44K、R70S和I77A(第二單體)；該變體切割位于第一內(nèi)含子的B2M13靶標(biāo)(圖4和15)， -S32T、Y33T、Q44K、R68E、R70S和I77R(第一單體)，以及N30A、Y33T、Q44N、R68K、R70S、D75H和I77F(第二單體)；該變體切割位于第一內(nèi)含子中的B2M14靶標(biāo)(圖4和15)， -S32R、Y33D、Q44A、R70S、D75E和I77R(第一單體)，以及N30D、Y33R、Q44K、R68Y、R70S、D75N和I77Q(第二單體)；該變體切割位于第一內(nèi)含子中的B2M16靶標(biāo)(圖4和15)， -S32T、Q38W、Q44A、R70S、D75R和I77Y(第一單體)，以及Y33H、S40Q、Q44N、R70S、D75R和I77Y(第二單體)；該變體切割位于第一內(nèi)含子中的B2M17靶標(biāo)(圖4和15)， -Y33H、Q38G、Q44N、R68Y、R70S、D75R和I77V(第一單體)，第二單體選自N30A、Y33T、Q44N、R68Y、R70S、D75R和I77V；N30H、Y33C、R68Y、R70S、D75R和I77Q；S32G、Y33C、R68Y、R70S、D75R和I77Q；S32R、Y33T、R68Y、R70S、D75R和I77Q；S32G、Y33C、Q44N、R68Y、R70S、D75R和I77Q；S32A、Y33C、Q44N、R68Y、R70S、D75R和I77Q；S32G、Y33S、Q44N、R68Y、R70S、D75R和I77Q；N30H、Y33C、Q44N、R68Y、R70S、D75R和I77V；S32G、Y33C、Q44N、R68Y、R70S、D75R和I77V；Y33C、S40Q、Q44N、R68Y、R70S、D75R和I77V；S32G、Y33S、Q44N、R68Y、R70S、D75R和I77V；S32G、Y33C、Q44T、R68Y、R70S、D75R和I77Q；S32A、Y33C、Q44T、R68Y、R70S、D75R和I77Q；S32G、Y33C、R68Y、R70S、D75R和I77V；S32G、Y33C、R68Y、R70S和D75R；S32G、Y33C、Q44N、R68Y、R70S、D75R和I77Y；S32A、Y33C、Q44N、R68Y、R70S、D75R和I77Y；S32R、Y33T、R68Y、R70S、D75R、I77Q和D153G；N30H、Y33C、Q44R、R68Y、R70S、D75R和I77Q；這些變體切割位于外顯子2中的B2M18靶標(biāo)(圖4和15、表VII)， -Y33T、S40N、Q44T、R68Y、R70S、D75R和I77V(第一單體)，第二單體選自K28R、Y33A、Q38Y、S40Q、Q44A、R68S、R70S、D75S和I77R；K28A、Y33S、S40R、R70S和D75N；K28A、Y33T、S40R、R70S和D75N；K28R、Y33A、Q38Y、S40Q、R70S和D75N；K28R、Y33N、Q38R、S40Q、R70S和D75N；K28R、Y33R、Q38Y、S40Q、R70S和D75N；K28R、Y33S、Q38R、S40Q、R70S和D75N；K28R、Y33S、Q38Y、S40Q、R70S和D75N；K28T、Y33T、S40D、R70S和D75；K28T、Y33T、S40R、R70S和D75N；S32G、Y33C和D75N；Y33C和D75N；Y33S、S40R和D75N；Y33S和S40R；N30A和Y33G；N30A和Y33T；N30C和Y33A；N30G和Y33C；N30S、Y33S和Q38T；N30A和S32W；N30H和Y33K；N30R和Y33P；N30K和Y33T；N30P和Y33W；S32G和Y33P；S32T和Y33A；Y33T和S40E；這些變體切割位于內(nèi)含子2-外顯子3接合處的B2M20靶標(biāo)(圖4和15；表VIII)，以及 -K28T、Y33R、S40R、Q44T、R70S和D75Y(第一單體)，以及N30D、Y33R、Q44N、R68Y、R70S、D75Y和I77Q(第二單體)；該變體切割位于外顯子4中的B2M33靶標(biāo)(圖4和15)。
更優(yōu)選地，所述變體由第一單體和第二單體組成，所述第一單體具有SEQ ID NO24至28、126至134中任一的序列，所述第二單體具有SEQ IDNO37至77和135中任一的序列，如上所述的來自于切割B2M11靶標(biāo)之單體的此變體具有增加B2M11靶標(biāo)切割的額外替換(圖4和15，表IV、V和VI)。
所述異二聚化變體有利地是專性(obligate)異二聚體變體，其具有針對在兩個I-CreI單體之間產(chǎn)生分子間相互作用的第一和第二單體對應(yīng)殘基的至少一對突變，其中所述突變對的第一突變在第一單體，第二突變在第二單體，所述突變對阻礙各單體形成功能性同二聚體，卻不阻礙形成能切割來自β-2-微球蛋白基因的基因組DNA靶標(biāo)的功能性異二聚體。
分別對第一和第二單體而言，所述單體有利地具有至少下述突變對之一 a)8位的谷氨酸被堿性氨基酸所替換，優(yōu)選精氨酸(第一單體)，以及7位的賴氨酸被酸性氨基酸所替換，優(yōu)選谷氨酸(第二單體)；第一單體還可包含7位和96位的至少一個賴氨酸殘基被精氨酸替換。
b)61位的谷氨酸被堿性氨基酸所替換，優(yōu)選精氨酸(第一單體)，以及96位的賴氨酸被酸性氨基酸所替換，優(yōu)選谷氨酸(第二單體)；第一單體還可包含7位和96位的至少一個賴氨酸殘基被精氨酸替換。
c)97位的亮氨酸被芳香族氨基酸所替換，優(yōu)選苯丙氨酸(第一單體)，以及54位的苯丙氨酸被小氨基酸所替換，優(yōu)選甘氨酸(第二單體)；第一單體還可包含54位的苯丙氨酸被色氨酸替換，第二單體還可包含58位的亮氨酸或57位的賴氨酸被甲硫氨酸所替換，以及 d)137位的天冬氨酸被堿性氨基酸所替換，優(yōu)選精氨酸(第一單體)，51位的精氨酸被酸性氨基酸所替換，優(yōu)選谷氨酸(第二單體)。
例如，第一單體可具有突變D137R，第二單體可具有突變R51D。
專性異二聚體大范圍核酸酶有利地包含至少兩對如上文a)、b)、c)或d)中所述的突變，其中一對突變對有利地如c)或d)中所述。優(yōu)選地，一個單體包含7位和96位的賴氨酸殘基被酸性氨基酸替換，另一個單體包含8和61位的谷氨酸殘基被堿性氨基酸替換。更優(yōu)選地，專性異二聚體大范圍核酸酶包含三對如上文a)、b)和c)中所述的突變。所述專性異二聚體大范圍核酸酶有利地由第一單體(A)和第二單體(B)組成，所述第一單體具有至少選自以下的突變(i)E8R、E8K或E8H、E61R、E61K或E61H和L97F、L97W或L97Y；(ii)K7R、E8R、E61R、K96R和L97F、或者(iii)K7R、E8R、F54W、E61R、K96R和L97F，所述第二單體(B)具有至少選自以下的突變iv)K7E或K7D、F54G或F54A和K96D或K96E；(v)K7E、F54G、L58M和K96E、或者(vi)K7E、F54G、K57M和K96E。例如，所述第一單體可具有突變K7R、E8R、E61R、K96R和L97F，或者K7R、E8R、F54W、E61R、K96R和L97F，所述第二單體可具有突變K7E、F54G、L58M和K96E，或者K7E、F54G、K57M和K96E。
本發(fā)明的主題還包括來自如上所述I-CreI變體的單鏈嵌合型大范圍核酸酶(融合蛋白)。所述單鏈大范圍核酸酶可包含兩個I-CreI單體、兩個I-CreI核心結(jié)構(gòu)域(I-CreI的6至94位)或兩者的組合。優(yōu)選地，所述兩個單體/核心結(jié)構(gòu)域或兩者的組合由肽接頭連接。
本發(fā)明的主題還包括編碼如上所述的變體或單鏈嵌合型大范圍核酸酶的多核苷酸片段，所述多核苷酸可編碼同二聚化或異二聚化變體的一個單體，或者單鏈嵌合型大范圍核酸酶的兩個結(jié)構(gòu)域/單體。
本發(fā)明的主題還包括用于表達(dá)本發(fā)明的變體或單鏈大范圍核酸酶的重組載體。所述重組載體包含至少一個編碼如上所述的變體或單鏈大范圍核酸酶的多核苷酸片段。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述載體包含兩個不同的多核苷酸片段，各自編碼異二聚化變體的一個單體。
可在本發(fā)明中使用的載體包括但不限于病毒載體、質(zhì)粒、RNA載體，或者可由染色體、非染色體、半合成或合成的核酸所組成的線性或環(huán)形DNA或RNA分子。優(yōu)選的載體是能夠自主復(fù)制與其連接之核酸的載體(附加型載體)和/或表達(dá)與之連接的核酸的載體(表達(dá)載體)。大量的合適載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并可以商品獲得。
病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、細(xì)小病毒(parvovirus)(例如腺相關(guān)病毒)、冠狀病毒、負(fù)鏈RNA病毒如正粘病毒(orthomyxovirus)(例如流感病毒)、桿狀病毒(例如狂犬病毒和皰疹性口炎病毒(vesicularstomatitis virus))、副粘病毒(paramyxovirus)(例如麻疹病毒和仙臺病毒(Sendai))、正鏈RNA病毒如小RNA病毒(picornavirus)和α病毒，以及雙鏈DNA病毒，其包括腺病毒、皰疹病毒(例如1和2型單純皰疹病毒、EB病毒、巨細(xì)胞病毒)和痘病毒(例如牛痘病毒、禽痘病毒和金絲雀痘病毒)。其他病毒包括例如諾瓦克病毒、披膜病毒(togavirus)、黃病毒(flavivirus)、呼腸病毒(reoviruses)、乳多空病毒(papovavirus)、嗜肝DNA病毒(hepadnavirus)和肝炎病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒的實例包括禽白血病-肉瘤、哺乳動物C型、B型病毒、D型病毒，HTLV-BLV組、慢病毒、泡沫病毒(spumavirus)(Coffin，J.M.，RetroviridaeThe viruses and their replication，In Fundamental Virology，第三版，B.N.Fields，等編輯，Lippincott-RavenPublishers，Philadelphia，1996)。
優(yōu)選的載體包括慢病毒載體，尤其是自失活(self inactivacting)的慢病毒載體。
載體可包含選擇標(biāo)記，例如用于真核細(xì)胞培養(yǎng)的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、組氨醇脫氫酶、二氫葉酸還原酶、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、單純皰疹病毒胸苷激酶、腺苷脫氨酶、谷氨酰胺合成酶和次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶；用于釀酒酵母(S.cerevisiae)的TRP1；大腸桿菌(E.coli)中的四環(huán)素、利福平或氨芐青霉素抗性。
優(yōu)選地，所述載體是表達(dá)載體，其中編碼本發(fā)明變體/單鏈大范圍核酸酶的序列置于適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯控制元件的控制下，以允許產(chǎn)生或合成所述變體。因此，所述多核苷酸包含在表達(dá)盒中。更具體地，載體包含復(fù)制起點、與所述編碼多核苷酸有效連接的啟動子、核糖體結(jié)合位點、RNA剪接位點(使用基因組DNA時)、多腺苷酸化位點和轉(zhuǎn)錄終止位點。其還可包含增強(qiáng)子。啟動子的選擇將取決于其中表達(dá)多肽的細(xì)胞。優(yōu)選地，當(dāng)所述變體是異二聚體時，編碼各個單體的兩種多核苷酸包含在一個載體中，所述載體能夠驅(qū)動兩種多核苷酸同時表達(dá)。合適的啟動子包括組織特異性和/或誘導(dǎo)型啟動子。誘導(dǎo)型啟動子的實例是由提高重金屬水平誘導(dǎo)的真核金屬硫蛋白(metallothionine)啟動子，應(yīng)答于異丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)誘導(dǎo)的原核lacZ啟動子，和由提高溫度誘導(dǎo)的真核熱休克啟動子。組織特異性啟動子的實例是骨骼肌肌酸激酶、前列腺特異性抗原(PSA)、α-抗胰蛋白酶、人表面活性劑(SP)A和B蛋白、β-酪蛋白和酸性乳清蛋白基因。
根據(jù)所述載體的另一個有利的實施方案，其包含靶向構(gòu)建體，所述靶向構(gòu)建體包含與如上所述的基因組DNA切割位點周圍的區(qū)域有同源性的序列。
或者，編碼I-CreI變體/單鏈大范圍核酸酶的載體和包含所述靶向構(gòu)建體的載體是不同的載體。
更優(yōu)選地，所述靶向DNA構(gòu)建體包含 a)與如上所述的基因組DNA切割位點周圍的區(qū)域有同源性的序列，和 b)兩側(cè)是a)中序列的待引入序列。
對于基因組治療或產(chǎn)生基因敲除動物/細(xì)胞而言，待引入序列是失活β-2-微球蛋白基因的序列。必須使得兩條同源染色體都被靶向，以使得完全失活該基因的功能。此外，所述序列還可缺失β-2-微球蛋白基因或其部分，最終引入外源基因或其部分(敲入/基因置換)。對于產(chǎn)生基因敲入的動物/細(xì)胞而言，修復(fù)目的位點的DNA包含外源目的基因序列，以及最終地選擇標(biāo)記，例如HPRT基因?；蛘?，待引入序列可以是用于以某些定方式改變?nèi)旧wDNA的任何其它序列(包括用于改變特異性序列的序列)，以弱化或激活內(nèi)源目的基因或者向目的位點引入突變。這些染色體DNA改變可用于基因組工程(動物模型和重組細(xì)胞系，包括人細(xì)胞系)。
可以通過插入使轉(zhuǎn)錄中斷的轉(zhuǎn)錄終止信號來失活β-2-微球蛋白基因，其產(chǎn)生截短的蛋白質(zhì)(圖6a)。在此情況下，待引入序列以5’至3’的順序包含至少轉(zhuǎn)錄終止序列(多聚A1)，優(yōu)選地，所述序列還包含標(biāo)記物盒，所述標(biāo)記物盒包含啟動子和標(biāo)記開放讀碼框(ORF)以及第二轉(zhuǎn)錄終止序列(多聚A2；圖6a)?？梢岳萌魏吻懈钗挥贐2M啟動子下游和位于B2M終止密碼子上游之靶標(biāo)的大范圍核酸酶來實施此策略，例如下述任一靶標(biāo)B2M4、B2M10、B2M11、B2M13、B2M14、B2M16、B2M17、B2M18和B2M20(SEQ ID NO82至90；圖4和15)。
還可以通過在B2M開放讀碼框(ORF)中插入標(biāo)記基因來失活β-2-微球蛋白基因，其破壞編碼序列(圖6b)。所述插入還可以與切割位點兩側(cè)ORF序列的缺失相結(jié)合，并最終與插入外源目的基因(基因置換)相結(jié)合?？梢岳们懈钔怙@子序列的大范圍核酸酶來實施此策略，例如切割B2M18或B2M20的大范圍核酸酶(SEQ ID NO90，91)。
另外，還可以通過插入使轉(zhuǎn)錄本不穩(wěn)定的序列來失活β-2-微球蛋白基因。可以利用任何切割B2M啟動子下游靶標(biāo)的大范圍核酸酶來實施此策略，例如圖4和15中列出的任一靶標(biāo)(SEQ ID NO82至91)。
優(yōu)選地，使用至少50bp，優(yōu)選大于100bp，更優(yōu)選大于200bp的同源序列。事實上，共有的DNA同源序列位于斷裂位點上游和下游的兩側(cè)區(qū)域，待引入DNA序列應(yīng)位于兩個臂之間。
因此，靶向構(gòu)建體優(yōu)選200pb至6000pb，更優(yōu)選1000pb至2000pb，它包含具有在靶位點兩側(cè)至少200bp的同源序列的β-2-微球蛋白基因片段以修復(fù)切割，還包含使β-2-微球蛋白基因失活的序列，以及有可能包含用于如上所述置換β-2-微球蛋白基因的目的外源基因序列。
對于插入序列而言，DNA同源序列一般位于斷裂位點上游和下游緊鄰的區(qū)域(緊鄰所述斷裂的序列；最小修復(fù)基質(zhì))。但是，當(dāng)所述插入與切割位點兩側(cè)ORF序列的缺失相結(jié)合時，共有的DNA同源序列位于缺失區(qū)域的上游和下游區(qū)域。
例如，由如上所述各個變體切割的B2M靶標(biāo)以及用于修復(fù)各個變體之切割的最小基質(zhì)在

圖15中顯示。
本發(fā)明的主題還包括組合物，其特征在于包含至少一種上述大范圍核酸酶(變體或單鏈衍生嵌合大范圍核酸酶)和/或編碼上述大范圍核酸酶的至少一種表達(dá)載體。
在所述組合物的一個優(yōu)選實施方案中，其包含靶向DNA構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含使β-2-微球蛋白基因失活的序列，其兩側(cè)是與所述變體的基因組DNA切割位點有同源性的序列，如上所述。
優(yōu)選地，所述靶向DNA構(gòu)建體包含在重組載體中，或者包含在表達(dá)載體中，所述載體包含編碼本發(fā)明大范圍核酸酶的多核苷酸。
本發(fā)明的主題還包括如上所述的至少一種大范圍核酸酶和/或一種表達(dá)載體在制備用于將細(xì)胞從供體移植到有此需要的個體(接受者)內(nèi)期間預(yù)防、改善或治療異體移植排斥的藥物中的用途。
本發(fā)明的主題還包括如上所述的至少一種大范圍核酸酶和/或一種表達(dá)載體在制備用于在有此需要的個體中預(yù)防、改善或治療與β-2-微球蛋白的纖絲構(gòu)象相關(guān)病癥的藥物中的用途。
所述大范圍核酸酶的使用可至少包括步驟(a)和(b)，步驟(a)在供體/個體的體細(xì)胞組織中通過使所述切割位點與所述大范圍核酸酶相接觸而在包含所述大范圍核酸酶的至少一個識別和切割位點的β-2-微球蛋白基因的目的位點處誘導(dǎo)雙鏈斷裂，步驟(b)將靶向DNA引入所述體細(xì)胞組織，其中所述靶向DNA包含(1)與所述切割位點周圍區(qū)域有同源性的DNA和(2)在靶向DNA與染色體DNA重組時使β-2-微球蛋白基因失活的DNA，如上所述。在適于向目的位點引入所述靶向DNA的條件下，將所述靶向DNA引入體細(xì)胞組織中。所述靶向構(gòu)建體可包含缺失β-2-微球蛋白基因的序列，并且可能包含外源目的基因的序列(基因置換)。
或者，可通過非同源末端連接來修復(fù)雙鏈斷裂通過誘變開放讀碼框來失活β-2-微球蛋白基因(圖6c)。在不存在修復(fù)基質(zhì)時，外顯子中的DNA雙鏈斷裂主要由易錯的非同源末端連接途徑(Non HomologousEnd Joining，NHEJ)來修復(fù)，得到少量缺失(數(shù)個核苷酸)，這會使所述切割位點失活，得到移碼突變。
在該情況下，大范圍核酸酶的使用包括至少下述步驟在供體/個體的體細(xì)胞組織中在包含所述大范圍核酸酶的至少一個識別和切割位點的β-2-微球蛋白基因的目的位點處誘導(dǎo)雙鏈切割，這通過將所述切割位點與所述大范圍核酸酶相接觸來實現(xiàn)，由此通過非同源末端連接修復(fù)雙鏈斷裂來誘導(dǎo)β-2-微球蛋白基因開放讀碼框發(fā)生突變。
根據(jù)本發(fā)明，可以通過將所述大范圍核酸酶引入到來自供體/個體的體細(xì)胞(胰腺、腎、心臟、肌肉)中，然后將經(jīng)修飾的細(xì)胞移植進(jìn)接受者(異體移植)或移植回患病個體(與β-2-微球蛋白基因的纖絲構(gòu)象相關(guān)的疾病)，從而離體誘導(dǎo)所述雙鏈切割。
本發(fā)明的主題還包括在有此需要的個體中在移植期間預(yù)防、改善或治療異體移植排斥的方法，所述方法包括至少下述步驟將如上所述組合物通過任何方式施用給所述個體。
本發(fā)明的主題還包括在有此需要的個體中預(yù)防、改善或治療與β-2-微球蛋白纖絲構(gòu)象相關(guān)之病癥的方法，所述方法包括至少下述步驟將如上所述組合物通過任何方式施用給所述個體。
本發(fā)明的主題還包括如上所述的大范圍核酸酶、一種或兩種多核苷酸(優(yōu)選包含在表達(dá)載體中)用于在β-2-微球蛋白基因座處的基因組工程(動物模型和重組細(xì)胞產(chǎn)生基因敲入或敲除)的用途，其是用于非治療目的。
根據(jù)所述用途的一個有利的實施方案，其用于在包含基因組DNA靶序列的β-2-微球蛋白基因的目的位點誘導(dǎo)雙鏈斷裂，由此誘導(dǎo)DNA重組事件、DNA丟失或細(xì)胞死亡。
根據(jù)本發(fā)明，所述雙鏈斷裂是用于修復(fù)β-2-微球蛋白基因中的特定序列，修飾β-2-微球蛋白基因中的特定序列，恢復(fù)功能性β-2-微球蛋白基因而代替突變的β-2-微球蛋白基因，弱化或活化內(nèi)源β-2-微球蛋白基因，將突變引入到β-2-微球蛋白基因的目的位點中，引入外源基因或其部分，失活或缺失內(nèi)源β-2-微球蛋白基因或其部分，使染色體臂易位，或者使DNA不被修復(fù)并降解。
根據(jù)所述用途的另一個有利實施方案，所述變體、多核苷酸、載體與如上所述的靶向DNA構(gòu)建體相關(guān)聯(lián)。
在根據(jù)本發(fā)明的大范圍核酸酶用途的第一個實施方案中，它包括至少下列步驟1)通過使切割位點與所述大范圍核酸酶相接觸而在包含所述大范圍核酸酶的至少一個識別和切割位點的β-2-微球蛋白基因的目的位點處引入雙鏈斷裂；2)提供包含兩側(cè)是靶標(biāo)基因座同源序列的待引入序列的靶向DNA構(gòu)建體。所述大范圍核酸酶可以直接提供給細(xì)胞或者通過表達(dá)載體提供，所述表達(dá)載體包含編碼所述大范圍核酸酶的多核苷酸序列并適于在所使用細(xì)胞中表達(dá)所述大范圍核酸酶。此策略用于在靶位點引入DNA序列，例如用來產(chǎn)生可用于藥物測試的基因敲入或敲除動物模型或細(xì)胞系。
在根據(jù)本發(fā)明的大范圍核酸酶用途的第二個實施方案中，其包括至少下列步驟1)通過使所述切割位點與所述大范圍核酸酶相接觸而在包含所述大范圍核酸酶的至少一個識別和切割位點的β-2-微球蛋白基因的目的位點處引入雙鏈斷裂；2)在適于同與所述切割位點周圍區(qū)域具有同源序列的染色體DNA發(fā)生同源重組的條件下維持所述斷裂基因組座位。
在根據(jù)本發(fā)明的大范圍核酸酶用途的第三個實施方案中，其包括至少下列步驟1)通過使所述切割位點與所述大范圍核酸酶相接觸而在包含所述大范圍核酸酶的至少一個識別和切割位點的β-2-微球蛋白基因的目的位點處引入雙鏈斷裂；2)在適于通過非同源末端連接修復(fù)所述雙鏈斷裂的條件下維持所述斷裂基因組座位。
本發(fā)明的主題還包括制備β-2-微球蛋白基因敲入或敲除動物的方法，其至少包括下述步驟 (a)將如上所述的大范圍核酸酶引入動物的多能前體細(xì)胞或胚中，從而在包含所述大范圍核酸酶的DNA識別和切割位點的β-2-微球蛋白基因的目的位點處誘導(dǎo)雙鏈切割；與此同時或者依次地； (b)將靶向DNA引入步驟(a)的動物前體細(xì)胞或胚中，其中所述靶向DNA包含(1)與所述切割位點周圍區(qū)域具有同源性的DNA和(2)在所述靶向DNA和所述染色體DNA重組時修復(fù)目的位點的DNA，從而產(chǎn)生已通過同源重組修復(fù)了目的位點的經(jīng)基因組修飾的動物前體細(xì)胞或胚， (c)使步驟(b)中經(jīng)基因組修飾的動物前體細(xì)胞或胚發(fā)育成嵌合動物，以及 (d)從步驟(c)的嵌合動物產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。
優(yōu)選地，步驟(c)包括將步驟(b)中產(chǎn)生的經(jīng)基因組修飾的前體細(xì)胞引入囊胚中，以產(chǎn)生嵌合動物。
本發(fā)明的主題還包括產(chǎn)生β-2-微球蛋白敲入或敲除細(xì)胞的方法，其至少包括下述步驟 (a)如上所述將大范圍核酸酶引入細(xì)胞中，從而在包含所述大范圍核酸酶的DNA識別和切割位點的β-2-微球蛋白基因的目的位點處誘導(dǎo)雙鏈切割；與此同時或者依次地； (b)將靶向DNA引入步驟(a)的細(xì)胞中，其中所述靶向DNA包含(1)與所述切割位點周圍區(qū)域具有同源性的DNA和(2)在所述靶向DNA和所述染色體DNA重組時修復(fù)目的位點的DNA，從而產(chǎn)生已通過同源重組修復(fù)了目的位點的重組細(xì)胞， (c)通過任意適當(dāng)方式分離步驟(b)的重組細(xì)胞。
在適于將所述靶向DNA引入所述目的位點中的條件下將所述靶向DNA引入細(xì)胞中。
在一個優(yōu)選的實施方案中，所述靶向DNA構(gòu)建體插入到載體中。
或者，可以通過非同源末端連接修復(fù)雙鏈斷裂來失活β-2-微球蛋白基因(圖6c)。
本發(fā)明的主題還包括制備β-2-微球蛋白基因敲除動物的方法，其至少包括下述步驟 (a)將如上所述的大范圍核酸酶引入動物多能前體細(xì)胞或胚中，從而在包含所述大范圍核酸酶的DNA識別和切割位點的β-2-微球蛋白基因的目的位點處誘導(dǎo)雙鏈切割，由此產(chǎn)生已通過非同源末端連接修復(fù)了目的位點的經(jīng)基因組修飾的前體細(xì)胞或胚； (b)使步驟(a)中經(jīng)基因組修飾的動物前體細(xì)胞或胚胎發(fā)育成嵌合動物，以及 (c)從步驟(b)的嵌合動物產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。
優(yōu)選地，步驟(b)包括將步驟(a)中得到的經(jīng)基因組修飾的前體細(xì)胞引入囊胚中，從而產(chǎn)生嵌合動物。
本發(fā)明的主題還包括產(chǎn)生β-2-微球蛋白缺陷型細(xì)胞的方法，其至少包括下述步驟 (a)如上所述將大范圍核酸酶引入細(xì)胞中，從而在包含所述大范圍核酸酶的DNA識別和切割位點的β-2-微球蛋白基因的目的位點處誘導(dǎo)雙鏈切割，由此產(chǎn)生已通過非同源末端連接修復(fù)了雙鏈斷裂的經(jīng)基因組修飾的HPRT型缺陷細(xì)胞， (b)通過任意合適方式分離步驟(a)的經(jīng)基因組修飾的HPRT型缺陷細(xì)胞。
所述經(jīng)修飾的細(xì)胞可以是任何目的細(xì)胞。為產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因/基因敲除動物，所述細(xì)胞是多能前體細(xì)胞，例如胚胎來源干細(xì)胞(ES cell)，其是本領(lǐng)域眾所周知的。為產(chǎn)生重組細(xì)胞系，所述細(xì)胞可以有利地為人細(xì)胞，例如PerC6(Fallaux等，Hum.Gene Ther.9，1909-1917，1998)或HEK293(ATCC # CRL-1573)細(xì)胞。所述大范圍核酸酶可以直接提供給細(xì)胞或者通過表達(dá)載體提供，所述表達(dá)載體包含編碼所述大范圍核酸酶的多核苷酸序列，并且適于所述大范圍核酸酶在所用細(xì)胞中的表達(dá)。
為產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物/重組細(xì)胞系(包括表達(dá)異源目的蛋白的人細(xì)胞系)，所述靶向DNA包含編碼目的蛋白的外源基因序列，并最終包含標(biāo)記基因，如上所述其兩側(cè)是β-2-微球蛋白基因的上游和下游序列，從而產(chǎn)生經(jīng)基因組修飾的細(xì)胞(動物前體細(xì)胞或胚胎/動物或人細(xì)胞)，所述細(xì)胞的β-2-微球蛋白基因已通過同源重組被外源目的基因置換。
如上所述，將所述外源基因和所述標(biāo)記基因插入到合適表達(dá)盒中，從而使得在所述轉(zhuǎn)基因動物/重組細(xì)胞系中表達(dá)異源蛋白/標(biāo)記。
所述大范圍核酸酶可以以多肽或編碼所述多肽的多核苷酸構(gòu)建體的形式使用。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的適于特定細(xì)胞類型的任何合適方式，將其單獨或者至少與合適的介質(zhì)(vehicle)或運載體(carrier)和/或所述靶向DNA組合在一起引入個體的體細(xì)胞中。
根據(jù)本發(fā)明用途的一個有利的實施方案，所述大范圍核酸酶(多肽)與下列項組合 -脂質(zhì)體、聚乙烯亞胺(PEI)；在這些情況下施用所述組合并因此將其引入體細(xì)胞靶細(xì)胞內(nèi)。
-膜易位肽(Bonetta，The Scientist，2002，16，38；Ford等，Gene Ther.，2001，8，1-4；Wadia和Dowdy，Curr.Opin.Biotechnol.，2002，13，52-56)；在這樣的情況下，將變體/單鏈大范圍核酸酶的序列與膜易位肽的序列融合(融合蛋白)。
根據(jù)本發(fā)明用途的另一個有利的實施方案，將所述大范圍核酸酶(編碼所述大范圍核酸酶的多核苷酸)和/或所述靶向DNA插入載體中?？赏ㄟ^多種方法(例如注射、直接攝入、基因槍轟擊、脂質(zhì)體、電穿孔)將包含靶向DNA和/或編碼大范圍核酸酶的核酸的載體引入細(xì)胞中?？墒褂帽磉_(dá)載體在細(xì)胞中穩(wěn)定或瞬時地表達(dá)大范圍核酸酶。在真核細(xì)胞中表達(dá)的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的(見Current Protocols in Human Genetics第12章“Vectors For Gene Therapy”&第13章“Delivery Systems for GeneTherapy”)。任選地，可優(yōu)選在重組蛋白中摻入核定位信號以確保其在核內(nèi)表達(dá)。
一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，大范圍核酸酶和包含靶向DNA和/或編碼大范圍核酸酶的核酸的載體(如果存在的話)被細(xì)胞從胞質(zhì)輸入或易位至核內(nèi)的作用位點。
對治療目的而言，以治療有效量施用所述大范圍核酸酶和可藥用賦形劑。如果施用量是有生理意義的，則這樣的組合被稱作以“治療有效量”施用。如果一種藥劑的存在導(dǎo)致接受者生理學(xué)可檢測的改變，則它是生理學(xué)顯著的。在本文中，如果一種藥劑的存在導(dǎo)致目標(biāo)疾病的一個或多個癥狀的嚴(yán)重程度減輕以及損傷或異常的基因組矯正，則它是生理學(xué)顯著的。
在根據(jù)本發(fā)明用途的一個實施方案中，所述大范圍核酸酶基本上是非免疫原性的，即不引發(fā)或幾乎不引發(fā)不利的免疫應(yīng)答。根據(jù)本發(fā)明，可使用改善或消除這類有害免疫反應(yīng)的大量方法。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述大范圍核酸酶基本不含N-甲?；琢虬彼帷１苊獠幌胍拿庖叻磻?yīng)的另一個方法是將大范圍核酸酶與聚乙二醇(″PEG″)或聚丙二醇(″PPG″)(優(yōu)選500到20,000道爾頓的平均分子量(MW))綴合。與PEG或PPG綴合(例如Davis等(US 4,179,337)所述)可提供具有抗病毒活性的非免疫原性的生理活性水溶性內(nèi)切核酸酶綴合物。Saifer等(US5,006,333)描述了還使用聚乙烯-聚丙二醇共聚物的類似方法。
本發(fā)明還涉及通過上文所述的多核苷酸或載體(優(yōu)選表達(dá)載體)修飾的原核或真核宿主細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及非人轉(zhuǎn)基因動物或轉(zhuǎn)基因植物，其特征是其所有或部分細(xì)胞通過上文所述的多核苷酸或載體進(jìn)行修飾。
本文使用的“細(xì)胞”是指原核細(xì)胞如細(xì)菌細(xì)胞，或真核細(xì)胞如動物、植物或酵母細(xì)胞。
本發(fā)明的主題還包括如上所述的至少一種大范圍核酸酶變體作為產(chǎn)生其它大范圍核酸酶的骨架的用途。例如，可以對所述變體進(jìn)行第三輪誘變和選擇/篩選，以產(chǎn)生新型第三代大范圍核酸酶。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明的所述大范圍核酸酶的不同用途以及使用所述大范圍核酸酶的方法包括使用所述I-CreI變體、來源于所述變體的單鏈嵌合型大范圍核酸酶、編碼所述變體或單鏈嵌合型大范圍核酸酶的多核苷酸、載體、細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物或非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物。
可以通過改造能夠切割來自β-2-微球蛋白基因的基因組DNA靶序列的I-CreI變體的方法來獲得本發(fā)明的I-CreI變體，所述方法至少包括下列步驟 (a)構(gòu)建第一系列I-CreI變體，其在LAGLIDADG核心結(jié)構(gòu)域的第一功能性亞結(jié)構(gòu)域中具有至少一個替換，所述第一功能性亞結(jié)構(gòu)域位于I-CreI的26到40位， (b)構(gòu)建第二系列I-CreI變體，其在LAGLIDADG核心結(jié)構(gòu)域的第二功能性亞結(jié)構(gòu)域中具有至少一個替換，所述第二功能性亞結(jié)構(gòu)域位于I-CreI的44到77位， (c)從步驟(a)的第一系列中選擇和/或篩選能夠切割突變I-CreI位點的變體，所述位點中(i)I-CreI位點中-10到-8位的核苷酸三聯(lián)體已被存在于所述基因組靶標(biāo)中-10到-8位的核苷酸三聯(lián)體所替換，且(ii)+8到+10位的核苷酸三聯(lián)體已被存在于所述基因組靶標(biāo)中-10到-8位的核苷酸三聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列所替換， (d)從步驟(b)的第二系列中選擇和/或篩選能夠切割突變I-CreI位點的變體，所述位點中(i)I-CreI位點中-5到-3位的核苷酸三聯(lián)體已被存在于所述基因組靶標(biāo)中-5到-3位的核苷酸三聯(lián)體所替換，且(ii)+3到+5位的核苷酸三聯(lián)體已被存在于所述基因組靶標(biāo)-5到-3位的核苷酸三聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列所替換， (e)從步驟(a)的第一系列中選擇和/或篩選能夠切割突變I-CreI位點的變體，所述位點中(i)I-CreI位點中+8到+10位的核苷酸三聯(lián)體已被存在于所述基因組靶標(biāo)中+8到+10位的核苷酸三聯(lián)體所替換，且(ii)-10到-8位的核苷酸三聯(lián)體已被存在于所述基因組靶標(biāo)+8到+10位的核苷酸三聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列所替換， (f)從步驟(b)的第二系列中選擇和/或篩選能夠切割突變I-CreI位點的變體，所述位點中(i)I-CreI位點中+3到+5位的核苷酸三聯(lián)體已被存在于所述基因組靶標(biāo)+3到+5位的核苷酸三聯(lián)體所替換，且(ii)-5到-3位的核苷酸三聯(lián)體已被存在于所述基因組靶標(biāo)+3到+5位的核苷酸三聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列所替換， (g)將步驟(c)和步驟(d)的兩個變體的26到40位和44到77位中的突變在單個變體中組合，以獲得切割下述序列的新的同二聚體I-CreI變體，所述序列中(i)-10到-8位的核苷酸三聯(lián)體與存在于所述基因組靶標(biāo)-10到-8位的核苷酸三聯(lián)體相同，(ii)+8到+10位的核苷酸三聯(lián)體與存在于所述基因組靶標(biāo)-10到-8位的核苷酸三聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列相同，(iii)-5到-3位的核苷酸三聯(lián)體與存在于所述基因組靶標(biāo)-5到-3位的核苷酸三聯(lián)體相同，和(iv)+3到+5位的核苷酸三聯(lián)體與存在于所述基因組靶標(biāo)-5到-3位的核苷酸三聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列相同，和/或 (h)將來自步驟(e)和步驟(f)的兩個變體的26到40位和44到77位中的突變在單個變體中組合，以獲得切割下述序列的新的同二聚體I-CreI變體，所述序列中(i)+3到+5位的核苷酸三聯(lián)體與存在于所述基因組靶標(biāo)+3到+5位的核苷酸三聯(lián)體相同，(ii)-5到-3位的核苷酸三聯(lián)體與存在于所述基因組靶標(biāo)+3到+5位的核苷酸三聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列相同，(iii)I-CreI位點中+8到+10位的核苷酸三聯(lián)體已被存在于所述基因組靶標(biāo)+8到+10位的核苷酸三聯(lián)體所替換，和(iv)-10到-8位的核苷酸三聯(lián)體與存在于所述基因組靶標(biāo)+8到+10位的核苷酸三聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列相同， (i)將步驟(g)和(h)中獲得的變體組合，形成異二聚體，和 (j)選擇和/或篩選來自步驟(i)的能夠切割來自β-2-微球蛋白基因的所述基因組DNA靶標(biāo)的異二聚體。
步驟(a)、(b)、(g)和(h)可包括引入另外的突變以改善突變體的結(jié)合和/或切割特性，特別是在接觸DNA靶序列或者直接或間接地與所述DNA靶標(biāo)相互作用的其它位置上。這可通過如PCT國際申請WO 2004/067736中所述的產(chǎn)生組合文庫來進(jìn)行。
此外，步驟(g)和/或(h)還可包括在整個變體上或變體的一部分(尤其是變體的C端一半(80到163位))上引入隨機(jī)突變?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域公知的并可以商品獲得的標(biāo)準(zhǔn)誘變方法，通過對變體池(pool)產(chǎn)生隨機(jī)誘變文庫來進(jìn)行隨機(jī)突變。
可根據(jù)公知的重疊PCR技術(shù)，通過擴(kuò)增包含兩個亞結(jié)構(gòu)域中各一個的重疊片段來進(jìn)行步驟(g)和(h)中的(分子內(nèi))突變組合。
通過將來自步驟(g)的一個變體與來自步驟(h)的一個變體共表達(dá)以允許其形成異二聚體來進(jìn)行步驟(i)中的(分子間)變體組合。例如，可利用編碼所述變體的一種或兩種重組表達(dá)載體來修飾宿主細(xì)胞。然后在允許變體表達(dá)的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，從而在宿主細(xì)胞中形成異二聚體，如先前在PCT國際申請WO 2006/097854和Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458中所述的。
可如PCT申請國際WO 2004/067736，Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458，Epinat等，Nucleic Acids Res.，2003，31，2952-2962和Chames等，Nucleic Acids Res.，2005，33，e178中所述，通過利用體外或體內(nèi)切割測定來進(jìn)行步驟(c)、(d)、(e)、(f)和/或(j)中的選擇和/或篩選。
根據(jù)所述方法的另一個優(yōu)選的實施方案，通過重組介導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂修復(fù)，在下述條件下在體內(nèi)進(jìn)行步驟(c)、(d)、(e)、(f)和/或(j)，在所述條件下，由所述變體產(chǎn)生的突變DNA靶序列中的雙鏈斷裂導(dǎo)致陽性選擇標(biāo)記或報告基因的激活或者陰性選擇標(biāo)記或報告基因的失活。
本發(fā)明的主題還包括在I-CreI的26到40位和/或44到77位具有突變的I-CreI變體，其可用于改造出能夠切割來自β-2-微球蛋白基因的DNA靶標(biāo)的本發(fā)明變體。具體地，本發(fā)明包括如上所述改造I-CreI變體的方法的步驟(c)到(f)中所定義的I-CreI變體(包括SEQ ID NO78，79，80，81和105的變體)。本發(fā)明還包括如上所述改造I-CreI變體的方法的步驟(g)和(h)中定義的I-CreI變體(包括SEQ ID NO29至36的變體)。
能夠切割來自目的基因的DNA靶標(biāo)的單鏈嵌合型大范圍核酸酶根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法衍生自本發(fā)明的變體(Epinat等，Nucleic Acids Res.，2003，31，2952-62；Chevalier等，Mol.Cell.，2002，10，895-905；Steuer等，Chembiochem.，2004，5，206-13；PCT國際申請WO 03/078619和WO2004/031346)。任何這些方法都可用于構(gòu)建衍生自本發(fā)明所述變體的單鏈嵌合型大范圍核酸酶。
編碼本發(fā)明所述變體的多核苷酸序列可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法來制備。例如，通過使用特定引物的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從cDNA模板來擴(kuò)增它們。優(yōu)選將所述cDNA的密碼子選擇成有利于所述蛋白質(zhì)在期望的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。
可通過公知的重組DNA和遺傳工程技術(shù)獲得包含所述多核苷酸的重組載體并將其引入宿主細(xì)胞中。
通過表達(dá)如上所述的多肽來產(chǎn)生本發(fā)明所述的I-CreI變體或單鏈衍生物；優(yōu)選在適合多肽表達(dá)或共表達(dá)的條件下，在以一種表達(dá)載體或兩種表達(dá)載體(僅在變體的情況下)修飾的宿主細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因動物/植物中表達(dá)或共表達(dá)(僅在變體的情況下)所述多肽，并從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物或從轉(zhuǎn)基因動物/植物中回收變體或單鏈衍生物。
除非另有說明，否則本發(fā)明的實施將使用本領(lǐng)域內(nèi)的細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有詳盡解釋。參閱，例如CurrentProtocols in Molecular Biology(Frederick M.AUSUBEL，2000，Wiley和son Inc，Library of Congress，USA)；Molecular CloningALaboratory Manual，第三版，(Sambrook等，2001，Cold Spring Harbor，New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait編輯，1984)；Mullis等美國專利4,683,195；NucleicAcid Hybridization(B.D.Harries & S.J.Higgins編輯1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames & S.J.Higgins編輯1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，APractical Guide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods InENZYMOLOGY(主編J.Abelson和M.Simon，Academic Press，Inc.，New York)，尤其是第154和155卷(Wu等編輯)和第185卷，″GeneExpression Technology″(D.Goeddel，編輯)；Gene Transfer Vectors ForMammalian Cells(J.H.Miller和M.P.Calos編輯，1987，Cold SpringHarbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell And MolecularBiology(Mayer和Walker，編輯，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell，編輯，1986)；以及Manipulating the Mouse Embryo，(ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
除了上述特征以外，本發(fā)明還包括在以下說明以及附圖中所體現(xiàn)的其他特征，其中參考舉例說明本發(fā)明I-CreI大范圍核酸酶變體及其用途的實施例，在附圖中 -圖1圖示說明基因打靶策略。(a)可將含有標(biāo)記(其周圍是靶標(biāo)基因座同源序列)的線性序列引入細(xì)胞核中，并與同源靶標(biāo)基因座重組。此實驗設(shè)計方案是目前最廣泛使用的基因敲入和基因敲除方案。注意，標(biāo)記的插入可以與靶標(biāo)基因座中的缺失相結(jié)合，導(dǎo)致基因置換。(b)大范圍核酸酶誘導(dǎo)的基因打靶。在此情況下，所述靶向序列經(jīng)常是環(huán)形質(zhì)粒的一部分。
-圖2顯示與其DNA靶標(biāo)相結(jié)合的I-CreI歸巢內(nèi)切核酸酶的三維結(jié)構(gòu)。由兩個αββαββα折疊圍繞催化核心，在DNA大溝上形成鞍形相互作用界面。
-圖3圖示說明用于產(chǎn)生重新設(shè)計的歸巢內(nèi)切核酸酶的組合方法。產(chǎn)生特異性局部改變的大的I-CreI衍生物文庫。然后，使用兩步組合方法將這些突變體組裝成同二聚化蛋白(通過組合在同一單體內(nèi)的突變)，然后組裝成異二聚體，得到具有完全重新設(shè)計特異性的大范圍核酸酶。
一圖4顯示人B2M基因(登錄號NC_000015；6673pb)。外顯子由方框表示(外顯子11-127位，外顯子23937至4215位，外顯子34843至4870位，外顯子46121至6673位)。ORF從61位(外顯子1)至4856位(外顯子3)。標(biāo)出了多個大范圍核酸酶位點(B2Mn)。
-圖5顯示B2M系列靶標(biāo)。B2M11.2和B2M11.3是來源于B2M靶標(biāo)的通過對一半靶標(biāo)進(jìn)行鏡像復(fù)制而獲得的兩個回文序列。如果認(rèn)為B2M11.2和B2M11.3靶標(biāo)中±11、±7和±6位核苷酸對切割沒有影響的話，則可將這兩個靶標(biāo)視為發(fā)現(xiàn)其被I-CreI靶標(biāo)切割的10GAA_P與5TAG_P的組合(B2M11.2)以及10CTG_P與5TTT_P靶標(biāo)的組合(B2M11.3)Cre。所有靶標(biāo)與I-CreI切割的回文序列C1221靶標(biāo)排列在一起。
-圖6顯示通過大范圍核酸酶誘導(dǎo)重組進(jìn)行基因失活的三種策略。注意在所有這三種情況下，兩條同源染色體都必須被靶向，以使得基因的功能完全失活。(a)通過在內(nèi)含子中切割產(chǎn)生的失活轉(zhuǎn)錄終止序列(多聚A1)和標(biāo)記盒，其包含啟動子、標(biāo)記ORF和第二轉(zhuǎn)錄終止序列(多聚A2)。轉(zhuǎn)錄終止序列會產(chǎn)生截短的轉(zhuǎn)錄本，從而產(chǎn)生截短的蛋白質(zhì)。(b)通過在外顯子中切割以及敲入標(biāo)記盒產(chǎn)生的失活。標(biāo)記基因敲入可以與外顯子序列缺失相結(jié)合(參見圖1)。(c)通過在外顯子中切割以及易錯非同源末端連接途徑產(chǎn)生的失活。在修復(fù)基質(zhì)不存在時，DNA雙鏈斷裂基本上通過NHEJ進(jìn)行修復(fù)，使得多數(shù)情況下大范圍核酸酶切割導(dǎo)致的3’粘末端完美再連接。在此情況下，恢復(fù)的切割位點可以再次被大范圍核酸酶切割。但是此易錯修復(fù)途徑還可導(dǎo)致少量缺失(少數(shù)核苷酸)，這會使所述切割位點失活，并導(dǎo)致移碼突變。
-圖7圖示說明通過組合突變體對B2M11.2靶標(biāo)的切割。該圖顯示了用B2M11.2靶標(biāo)對I-CreI組合突變體進(jìn)行初次篩選的實例。H12是陽性對照(C)。在上面的頂層濾紙中，B3位陽性突變體序列(圓)是KNAHQS/AYSYK(命名法同表I)。在下面的第二濾紙中，F(xiàn)7位的陽性突變體序列是KNGHQS/AYSYK。
-圖8圖示說明優(yōu)化突變體對B2M11.2靶標(biāo)的切割。由突變體KNAHQS/AYSYK和KNGHQS/AYSYK的隨機(jī)誘變獲得一系列切割B2M11.2的I-CreI N75優(yōu)化突變體。使用B2M11.2靶標(biāo)測試切割。將切割B2M11.2的突變體環(huán)化。例如，B3位的陽性突變體序列對應(yīng)于28K30N32A33H38Q40S44A68Y70S75Y77K/2Y53R66C(命名法同表II)。H12是陽性對照。
-圖9圖示說明組合突變體對B2M11.3靶標(biāo)的切割。該圖顯示了用B2M11.3靶標(biāo)對I-CreI組合突變體進(jìn)行初次篩選的實例。H10、H11和H12分別是陰性對照(C1)和不同長度的兩個陽性對照(C2和C3)。在所述濾紙中，G5位陽性突變體序列(圓)是KQSGCS/QNSNR(命名法同表III)。
-圖10圖示說明異二聚化組合突變體對B2M11靶標(biāo)的切割。該圖顯示了用B2M11靶標(biāo)對I-CreI突變體組合進(jìn)行的初次篩選。圈出了一列陽性異二聚化組合突變體。在實例濾紙中，(1)和(2)是分別帶有B2M11靶標(biāo)和突變體28K30N32G33H38Q40S44A68Y70S75Y77K/2I96R105A(1)和28K30N32A33H38Q40S44A68Y70S75Y77K/132V(2)的酵母菌株，其與帶有28K30Q32S33G38C40S44Q68N70S75N77R(M1)的酵母菌株接合(命名法同表IV)。
-圖11圖示說明優(yōu)化異二聚化組合突變體對B2M11靶標(biāo)的切割。將一系列切割B2M11.3的I-CreI N75優(yōu)化突變體與切割B2M11.2的突變體共表達(dá)。使用B2M11靶標(biāo)測試切割。圈出了切割B2M11的突變體(例如G9，對應(yīng)于28K30Q32S33G38C40S44Q68N70S75N77R和28K30N32A33H38Q40S44A68Y70S75Y77K/2Y53R66C的異二聚體)。在實例濾紙中，帶有B2M11靶標(biāo)和突變體28K30N32A33H38Q40S44A68Y70S75Y77K/2Y53R66C的酵母菌株與帶有28K30Q32S33G38C40S44Q68N70S75N77R的酵母菌株(MI)(命名法同表V)或?qū)φ?C1至C3)以對角方式接合。H10、H11和H12同樣分別是陰性對照(C1)和不同長度的兩個陽性對照(C2和C3)。
-圖12顯示pCLS1055載體圖。
-圖13顯示pCLS0542載體圖。
-圖14顯示pCLS1107載體圖。
-圖15顯示可見于人B2M基因中的大范圍核酸酶靶序列以及能切割所述DNA靶標(biāo)的相應(yīng)I-CreI變體。指出了與靶序列最近的外顯子，以及外顯子連接(第2欄和第3欄)，顯示了DNA靶標(biāo)序列(第4欄)及其位置(第5欄)。在靶位點修復(fù)切割的最小修復(fù)基質(zhì)由其第一個核苷酸(起點，第8欄)和最后一個核苷酸(終點，第9欄)表示。各變體序列由在所示位置上突變的殘基來定義。例如，圖15的第一異二聚化變體由第一單體和第二單體組成，所述第一單體在28、30、32、33、38、40、44、68、70、75和77位分別是K、N、S、R、A、S、D、A、S、K、R，所述第二單體在28、30、32、33、38、40、44、68、70、75和77位分別是R、N、S、A、Y、Q、A、Y、S、Y和K。參考I-CreI序列SWISSPROT P05725(SEQ ID NO1)來標(biāo)示位置，I-CreI在28、30、32、33、38、40、44、68、70、75和77位分別是K、N、S、Y、Q、S、Q、R、R、D和I。
-圖16顯示pCLS1069載體圖。
-圖17顯示pCLS1058載體圖。
-圖18顯示B2M18系列靶標(biāo)。B2M18.3和B2M18.4是來自于B2M18靶標(biāo)的通過對一半靶標(biāo)進(jìn)行鏡像復(fù)制而得到的兩個回文序列。如果認(rèn)為B2M18.3和B2M18.4靶標(biāo)中±11、±7和±6位核苷酸對切割沒有影響的話，則這兩個靶標(biāo)可以視為發(fā)現(xiàn)其被I-CreI靶標(biāo)切割的10NNN和5NNN靶標(biāo)的組合Cre。所有靶標(biāo)與I-CreI切割的回文序列C1221靶標(biāo)排列在一起。
-圖19圖示說明組合突變體對B2M18.4靶標(biāo)的切割。該圖顯示了用B2M18.4靶標(biāo)對I-CreI組合突變體進(jìn)行初次篩選的實例。每四分之一圖上的右側(cè)雙點(C)分別是陰性對照(C1)和不同長度的兩個陽性對照(C2和C3)。濾紙中左側(cè)雙點(M)是測試的組合克隆。B10位陽性突變體序列(圓)是KNGCQS/QYSRQ(命名法同表VII)。
-圖20顯示B2M20系列靶標(biāo)。B2M20.3和B2M20.4是來自于B2M20靶標(biāo)的通過對一半靶標(biāo)進(jìn)行鏡像復(fù)制而得到的兩個回文序列。如果認(rèn)為B2M20.3和B2M20.4靶標(biāo)中±11、±7和±6位核苷酸對切割沒有影響的話，則這兩個靶標(biāo)可以視為發(fā)現(xiàn)其被I-CreI靶標(biāo)切割的10NNN和5NNN靶標(biāo)的組合Cre。所有靶標(biāo)與I-CreI切割的回文序列C1221靶標(biāo)排列在一起。
-圖21圖示說明組合突變體對B2M20.4靶標(biāo)的切割。該圖顯示了用B2M20.4靶標(biāo)對I-CreI組合突變體進(jìn)行初次篩選的實例。每四分之一圖上的右側(cè)雙點(C)分別是陰性對照(C1)和不同長度的兩個陽性對照(C2和C3)。濾紙中左側(cè)雙點(M)是測試的組合克隆。F6位陽性突變體序列(圓)是KNSTQE/QRRDI(命名法同表VIII)。
實施例1改造出切割人B2M基因的新型大范圍核酸酶的策略 使用Smith等，Nucleic Acids Res.，2006中所描述的且在圖3中顯示的組合方法改造I-CreI的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并切割B2M靶標(biāo)之一B2M11(圖5和15)，其為位于人B2M基因(登錄號NC_000015.8，42790977至42797649位)2892至2915位的24bp(非回文)的靶標(biāo)(圖5)。切割B2M11的大范圍核酸酶可用來通過插入中斷轉(zhuǎn)錄并得到截短蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄終止信號而失活B2M基因(圖6a)。
B2M11序列的一部分是被先前鑒定的大范圍核酸酶所切割的10GAA_P、10CTG_P、5TAG_P和5TTT_P靶標(biāo)的拼湊物(圖5)，所述大范圍核酸酶如PCT國際申請WO 2006/097784，WO 2006/097853；Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458和Smith等，Nucleic AcidsRes.，2006，34，e149中所述獲得。因此B2M11可被組合切割這四個靶標(biāo)的I-CreI衍生物中所發(fā)現(xiàn)突變的Cre大范圍核酸酶切割。
10GAA_P、10CTG_P、5TAG_P和5TTT_P序列是I-CreI所切割的回文序列C1221的24bp衍生物(PCT國際申請WO 2006/097784、WO2006/097853；Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458和Smith等，Nucleic Acids Res.，2006，34，e149)。
然而，Cre與其DNA靶標(biāo)結(jié)合的I-CreI的結(jié)構(gòu)提示，這些靶標(biāo)的兩個外側(cè)堿基對(-12和12位)對結(jié)合和切割沒有影響(Chevalier等，Nat.Struct.Biol.，2001，8，312-316；Chevalier B.S.和Stoddard B.L.，NucleicAcids Res.，2001，29，3757-3754；Chevalier等，J.Mol.Biol.，2003，329，253-269)，在此研究中，僅考慮-11至11位。因此，B2M11系列靶標(biāo)被確定為22bp序列，而不是24bp。
兩種回文靶標(biāo)B2M11.2和B2M11.3來源于B2M11(圖5)。因為B2M11.2和B2M11.3是回文的，因此它們應(yīng)該被同二聚化蛋白質(zhì)切割。因此，首先設(shè)計同二聚體形式的能切割B2M11.2和B2M11.3序列的蛋白質(zhì)(實施例2和3)，然后優(yōu)化能更有效切割B2M11.2靶標(biāo)的同二聚體(實施例4)，接著共表達(dá)以獲得切割B2M11.1的異二聚體(實施例5)。然后對切割B2M11.3的所選突變體進(jìn)行精制，隨機(jī)誘變所選突變體，用于形成針對B2M11靶標(biāo)進(jìn)行篩選的新型異二聚體(實施例6)。
實施例2切割B2M11.2的大范圍核酸酶的制備 該實施例顯示I-CreI突變體可切割B2M11.2DNA靶序列，其為來源于B2M11靶標(biāo)左側(cè)部分的回文形式(圖5)。
本實施例中所述靶序列是22bp回文序列。因此，僅通過前11個核苷酸后接后綴_P對它們進(jìn)行描述。例如，靶標(biāo)B2M11.2也被記做tgaaattaggt_P；SEQ ID NO96。
B2M11.2在±1，±2，±3，±4，±5和±7位類似于5TAG_P，而在±1，±2，±7，±8，±9和±10位類似于10GAA_P。推測±6和±11位對結(jié)合和切割活性影響很小。之前通過對I-CreI N75的44，68，70，75和77位的誘變獲得了能切割5TAG_P靶標(biāo)(caaaactaggt_P；SEQ ID NO94)的突變體，如Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458和PCT國際申請WO 2006/097784、WO 2006/097853中所述。通過對I-CreI N75和D75的28，30，32，33，38，40位的誘變獲得了能切割10GAA_P靶標(biāo)(cgaaacgtcgt_P；SEQ ID NO92)的突變體，如之前Smith等，Nucleic Acids Res.，2006，34，e149中所述。因此，將這些突變體對組合會使得可以切割B2M11.2靶標(biāo)。
因此，為檢驗組合的突變體是否能切割B2M11.2靶標(biāo)，將來自切割5TAG_P(caaaactaggt_P；SEQ ID NO94)的蛋白質(zhì)的44，68，70，75和77位的突變與來自切割10GAA_P(cgaaacgtcgt_P；SEQ ID NO92)的蛋白質(zhì)的28，30，32，33，38和40位的突變相組合。
1)材料與方法 PCT國際申請WO 2004/067736；Epinat等，Nucleic Acids Res.，2003，31，2952-2962；Chames等，Nucleic Acids Res.，2005，33，e178和Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458中描述了產(chǎn)生大范圍核酸酶變體的方法和哺乳動物或酵母細(xì)胞中基于切割誘導(dǎo)重組的測定，其用于篩選具有改變的特異性的變體。這些測定產(chǎn)生可通過標(biāo)準(zhǔn)方法監(jiān)測的功能性LacZ報告基因。
a)構(gòu)建靶標(biāo)載體 如下克隆靶標(biāo)從PROLIGO定購對應(yīng)于兩側(cè)是gateway克隆序列的靶序列的寡核苷酸5′tggcatacaagttttgttctcaggtacctgagaacaacaatcgtctgtca 3′(SEQ ID NO98)。使用Gateway方案(INVITROGEN)，將通過PCR擴(kuò)增單鏈寡核苷酸而產(chǎn)生的雙鏈靶DNA克隆進(jìn)酵母報告載體(pCLS1055，圖12)中。將酵母報告載體轉(zhuǎn)化進(jìn)釀酒酵母菌株FYBL2-7B(MATα，ura3Δ851，trp1Δ63，leu2Δ1，lys2Δ202)中。
b)構(gòu)建組合突變體 如之前Smith等，Nucleic Acids Res.，2006，34，e149以及Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458，PCT國際申請WO 2006/097784、WO2006/097853中所述，分別針對10GAA_P或5TAG_P靶標(biāo)鑒定切割10GAA_P或5TAG_P的I-CreI突變體。為產(chǎn)生同時含有來自兩個系列突變的I-CreI衍生編碼序列，進(jìn)行了擴(kuò)增I-CreI編碼序列5′端(1-43位氨基酸)或3′端(39-167位)的獨立的重疊PCR反應(yīng)。對5′和3′端二者而言，均使用對載體(pCLS0542，圖13)具有特異性的Gal10F(5’-gcaactttagtgctgacacatacagg-3’；SEQ ID NO99)或Gal10R(5’-acaaccttgattggagacttgacc-3’；SEQ ID NO100)引物和對氨基酸39-43的I-CreI編碼序列具有特異性的引物(assF 5’-ctannnttgaccttt-3’(SEQ IDNO101)或assr5’-aaaggtcaannntag-3’(SEQ ID NO102))進(jìn)行PCR反應(yīng)，其中nnn編碼殘基40。將得自利用相同引物進(jìn)行的擴(kuò)增反應(yīng)并對殘基40具有相同編碼序列的PCR片段合并。然后，將得自使用引物Gal10F和assR或assF和Gal10R的反應(yīng)的各個PCR片段庫以等摩爾比混合。最后，利用高效LiAc轉(zhuǎn)化方案(Gietz和Woods，Methods Enzymol，2002，350，87-96)，使用兩種重疊PCR片段最終集合物各約25ng以及75ng經(jīng)NcoI和EagI消化而線性化的載體DNA(pCLS0542)轉(zhuǎn)化酵母即釀酒酵母菌株FYC2-6A(MATα，trp1Δ63，leu2Δ1，his3Δ200)。通過在酵母中的同源重組來產(chǎn)生含有兩組突變的完整編碼序列。
c)在酵母中接合表達(dá)大范圍核酸酶的克隆并篩選 如前文所述進(jìn)行篩選(Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458)。使用菌落網(wǎng)格(QpixII，Genetix)進(jìn)行接合。使用低網(wǎng)格密度(約4點/cm2)將突變體在尼龍濾膜覆蓋的YPD平板上劃成網(wǎng)格狀。在同一濾膜上進(jìn)行第二次劃網(wǎng)格，從而將第二層點于其上，所述第二層由針對每個靶標(biāo)的帶有不同報告基因的酵母菌株組成。將膜置于富含固體瓊脂YPD的培養(yǎng)基上，在30℃孵育一夜，使其接合。接著，將濾膜轉(zhuǎn)移到缺少亮氨酸和色氨酸的含半乳糖(2％)作為碳源的合成培養(yǎng)基上，在37℃孵育五天，以選擇帶有表達(dá)和靶標(biāo)載體的二倍體。五天后，將濾膜置于在0.5M磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)中的含0.02％X-Gal、0.1％SDS、6％二甲基甲酰胺(DMF)、7mM β-巰基乙醇、1％瓊脂糖的固體瓊脂糖培養(yǎng)基中，在37℃孵育，以檢測β-半乳糖苷酶活性。通過掃描分析結(jié)果，使用合適的軟件進(jìn)行定量。
d)突變體測序 為了回收突變體表達(dá)質(zhì)粒，使用標(biāo)準(zhǔn)方案提取酵母DNA并用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli.)。然后在MILLEGEN SA提供的質(zhì)粒上進(jìn)行突變體ORF的測序?；蛘?，通過PCR從酵母DNA中擴(kuò)增ORF(Akada等，Biotechniques，2000，28，668-670)并在MILLEGEN SA提供的PCR產(chǎn)物上直接進(jìn)行測序。
2)結(jié)果 通過將I-CreI N75或D75骨架中44、68、70、75和77位的突變與28、30、33、38和40位突變組合來構(gòu)建I-CreI組合突變體，產(chǎn)生有2014復(fù)雜度的文庫。組合的實例顯示在表1中。將這些文庫轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母中，并對4464個克隆(多樣性的2.2倍)的針對B2M11.2DNA靶標(biāo)(tgaaattaggt_P；SEQ ID NO96)的切割進(jìn)行了篩選。發(fā)現(xiàn)了2個活性水平非常低的陽性克隆，其在測序和二次篩選驗證后證實對應(yīng)于2種不同的新的內(nèi)切核酸酶(參見表I)。陽性克隆顯示在圖7中。
在全文和附圖中，組合突變體序列用28、30、32、33、38、40、44、68和70、75以及77位殘基的11個字母的代碼命名。例如，KNGHQS/AYSYK代表I-CreI K28，N30，G32，H33，Q38，S40，A44，Y68，S70，Y75和K77(I-CreI 28K30N32G33H38Q40S44A68Y70S75Y77K)。親本突變體用28、30、32、33、38和40位殘基的6字母代碼命名，或者用44、68、70、75和77位殘基的5字母代碼表示。例如，KNGHQS代表I-CreIK28，N30，G32，H33，Q38和S40，AYSYK代表I-CreI A44，Y68，S70，Y75和K77。
表I組合變體對B2M11.2靶標(biāo)的切割
＊僅顯示2014個組合中的176個 +表示組合變體對B2M11.2靶標(biāo)的切割 實施例3通過對切割B2M11.2的大范圍核酸酶進(jìn)行隨機(jī)誘變來制備以更高效率切割B2M11.2的大范圍核酸酶。
已經(jīng)通過組裝切割回文10GAA_P和5TAG_P靶標(biāo)的突變體鑒定出能切割回文B2M11.2靶標(biāo)的I-CreI突變體(實施例2)。但是，這些組合中僅有兩個能切割B2M11.2，且效率很低。
因此，對切割B2M11.2的兩個蛋白質(zhì)組合進(jìn)行誘變，并篩選以更高效率切割B2M11.2的變體。根據(jù)與其靶標(biāo)結(jié)合的I-CreI蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，I-CreI蛋白質(zhì)中用于第一組合方法的殘基(28，30，32，33，38和40以及44，68，70，75和77)之間沒有接觸(Chevalier等，Nat.Struct.Biol.，2001，8，312-316；Chevalier B.S.和Stoddard B.L.，Nucleic Acids Res.，2001，29，3757-3754；Chevalier等，J.Mol.Biol.，2003，329，253-269)。因此，很難通過推理選擇一組位置來誘變，由此，針對蛋白質(zhì)的C端部分(后83個氨基酸)或整個蛋白質(zhì)進(jìn)行了誘變。
1)材料和方法 通過在兩步PCR過程中使用Mn2+或dNTP衍生物(如8-氧代-dGTP和dPTP)進(jìn)行的PCR，在所選突變體集合的基礎(chǔ)上建立隨機(jī)誘變文庫，如JENA BIOSCIENCE GmbH的JBS dNTP-Mutagenis試劑盒中的方案所述。所用引物是preATGCreFor(5’-gcataaattactatacttctatagacacgcaaacacaaatacacagcggccttgccacc-3’；SEQID NO103)和ICreIpostRev(5’-ggctcgaggagctcgtctagaggatcgctcgagttatcagtcggccgc-3’；SEQ ID NO104)。將新文庫在酵母體內(nèi)克隆進(jìn)線性化卡那霉素載體中，所述線性化卡那霉素載體帶有半乳糖誘導(dǎo)型啟動子、作為選擇標(biāo)記的KanR以及2μ復(fù)制起點。通過測序驗證陽性結(jié)果克隆(MILLEGEN)。
通過使用亮氨酸載體(pCLS0542，圖13)和卡那霉素載體(pCLS1107，圖14)共用的這些引物進(jìn)行的PCR反應(yīng)擴(kuò)增突變體集合。利用高效LiAc轉(zhuǎn)化方案，使用約75ng PCR片段和用NcoI與EagI線性化的75ng載體DNA(pCLS0542)轉(zhuǎn)化酵母即釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株FYC2-6A(MATα，trp1Δ63，leu2Δ1，his3Δ200)。通過酵母中的體內(nèi)同源重組產(chǎn)生I-CreI突變體的完整編碼序列文庫。
如實施例2中所述進(jìn)行接合測定。
2)結(jié)果 合并切割B2M11.2的兩個突變體I-CreI28K30N32G33H38Q40S44A68Y70S75Y77K和I-CreI28K30N32A3338Q40SH44A68Y70S75Y77K(根據(jù)表I的命名法也被稱為KNGHQS/AYSYK和KNAHQS/AYSYK)，隨機(jī)誘變并轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母(圖13)；然后將4464個轉(zhuǎn)化克隆與含有處于報告質(zhì)粒之中的B2M11.2靶標(biāo)的酵母菌株接合。在與這些酵母菌株接合時，發(fā)現(xiàn)32個克隆引發(fā)B2M11.2靶標(biāo)的切割，對應(yīng)于至少13個不同的新型核酸內(nèi)切酶(參見表II)。陽性實例顯示在圖8中。
表II針對B2M11.2靶標(biāo)的優(yōu)化突變體
+B2M11.2靶標(biāo)切割 ＊優(yōu)化的突變以粗體顯示 實施例4切割B2M11.3的大范圍核酸酶的制備 本實施例表明，I-CreI突變體可切割來源于B2M11.1靶標(biāo)右側(cè)部分的回文形式的B2M11.3 DNA靶序列(圖5)。該實施例中所述的所有靶序列都是22bp回文序列。因此，僅用前11個核苷酸和其后的后綴_P對它們進(jìn)行描述，用于表明這一點(例如，B2 M11.3被稱為tctgactttgt_P；SEQID NO97)。
B2M11.3在±1，±2，±3，±4，±5，±6和±7位類似于5TTT_P，在±1，±2，±6，±7，±8，±9和±10位類似于10CTG_P。有假說認(rèn)為±11位對結(jié)合和切割活性影響很小。之前通過對I-CreI N75的44，68，70，75和77位進(jìn)行誘變獲得了能切割5TTT_P靶標(biāo)(caaaactttgt_P；SEQ ID NO95)的突變體，如Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458和PCT國際申請WO2006/097784、WO 2006/097853所述。通過對I-CreI N75和D75的28，30，32，33，38，40和70位進(jìn)行誘變獲得了能切割10CTG_P靶標(biāo)(cctgacgtcgt_P；SEQ ID NO93)的突變體，如Smith等，Nucleic Acids Res.，2006，34，e149所述。因此，將這些突變體對進(jìn)行組合將使得能夠切割B2M11.3靶標(biāo)。
在70位突變這兩組蛋白質(zhì)。然而，之前曾證明了I-CreI中存在兩個可分離的功能性結(jié)構(gòu)域(Smith等，Nucleic Acids Res.，2006，34，e149)。這說明此位置對于所述靶標(biāo)10至8位堿基的特異性影響很小。因此，為檢驗組合突變體是否能切割B2M11.3靶標(biāo)，將切割5TTT_P(caaaactttgt_P；SEQ ID NO95)的蛋白質(zhì)在44、68、70、75和77位的突變與切割10CTG_P(cctgacgtcgt_P；SEQ ID NO93)的蛋白質(zhì)在28，30，32，33，38，40位的突變相組合。
1)材料和方法 如之前的Smith等，Nucleic Acids Res.，2006，34，e149，和Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458；PCT國際申請WO 2006/097784、WO2006/097853中分別針對10CTG_P或5TTT_P靶標(biāo)所述，鑒定切割10CTG_P或5TTT_P的I-CreI突變體。
為了從兩個序列中得到含有突變的I-CreI來源的編碼序列，分別進(jìn)行重疊PCR反應(yīng)，其擴(kuò)增I-CreI編碼序列的5’端(1-43位氨基酸)或3’端(39-167位氨基酸)。對于5’和3’端，都使用載體(pCLS0542，圖13)特異性的Gal10F(5’-gcaactttagtgctgacacatacagg-3’SEQ ID NO99)或Gal10R(5’-acaaccttgattggagacttgacc-3’SEQ ID NO100)引物以及I-CreI編碼序列39-43位氨基酸特異性的引物(assF 5’-ctannnttgaccttt-3’(SEQ IDNO101)或assR 5’-aaaggtcaannntag-3’(SEQ ID NO102)，其中nnn編碼40位殘基)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。合并由使用相同引物和40位殘基的相同編碼序列實現(xiàn)的擴(kuò)增反應(yīng)而得到的PCR片段。然后將由使用引物Gal10F和assR或assF和Gal10R的反應(yīng)得到的PCR片段的每個集合以等摩爾比例相混合。最后，利用高效LiAc轉(zhuǎn)化方案(Gietz和Woods，methodsEnzymol.，2002，350，87-96)，使用兩種重疊PCR片段的每個最終集合約25ng、通過利用DraIII和NgoMIV消化而線性化的75ng載體DNA(卡那霉素抗性酵母表達(dá)載體，pCLS1107，圖14)來轉(zhuǎn)化酵母即釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株FYC2-6A(MATα，trp1Δ63，leu2Δ1，his3Δ200)。通過酵母中的體內(nèi)同源重組產(chǎn)生含有兩組突變Cre的完整編碼序列。
2)結(jié)果 通過將44、68、70、75和77位的突變與28、30、33、38和40位的突變在I-CreI N75或D75骨架中相組合來構(gòu)建I-CreI組合突變體，得到復(fù)雜度1600的文庫。組合突變體的實例顯示于表III中。將該文庫轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母，針對B2M11.3DNA靶標(biāo)(tctgactttgt_P；SEQ ID NO97)的切割篩選了3348個克隆(多樣性的2.1倍)。發(fā)現(xiàn)一個陽性克隆，隨后將其測序并通過二次篩選進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)其對應(yīng)于新型核酸內(nèi)切酶(參見表III)。
陽性顯示于圖9中。
表III組合突變體對B2M11.3靶標(biāo)的切割＊
＊僅顯示1600個組合中的240個. +顯示組合突變體對B2M11.3靶標(biāo)的切割。
實施例5通過共表達(dá)與切割B2M11.3的蛋白質(zhì)組裝在一起的切割B2M11.2的大范圍核酸酶來制備切割B2M11的大范圍核酸酶 在實施例2、3和4中鑒定了能切割來自B2M11的每個回文靶標(biāo)(B2M11.2和B2M11.3)的I-CreI突變體。這些突變體對(一個切割B2M11.2，一個切割B2M11.3)在酵母中共表達(dá)。共表達(dá)后，應(yīng)該有三種活性分子類型，兩種同二聚體和一種異二聚體。檢測所應(yīng)該形成的異二聚體是否切割B2M11靶標(biāo)。
1)材料和方法 a)在B2M11靶標(biāo)酵母中，將優(yōu)化的突變體克隆于亮氨酸載體中 使用高效LiAc轉(zhuǎn)化方案，將切割B2M11.2靶標(biāo)的優(yōu)化突變體轉(zhuǎn)化進(jìn)含有包含在酵母報告載體(pCLS1055，圖12)中的B2M11靶標(biāo)的酵母菌株FYBL2-7B(MAT a，ura3Δ851，trp1Δ63，leu2Δ1，lys2Δ202)，所述優(yōu)化突變體克隆于亮氨酸載體(pCLS0542，圖13)中。使用突變體-靶標(biāo)酵母作為針對切割卡那霉素載體(pCLS1107)中B2M11.3的突變體進(jìn)行接合測定的靶標(biāo)，如實施例2和4中所述。
b)酵母中共表達(dá)大范圍核酸酶克隆的接合和篩選 使用菌落網(wǎng)格(QpixII，Genetix)進(jìn)行接合。使用低網(wǎng)格密度(約4點/cm2)將突變體在尼龍濾膜覆蓋的YPD平板上劃成網(wǎng)格狀。在同一濾膜上進(jìn)行第二次劃網(wǎng)格，從而將第二層點于其上，所述第二層由針對每個突變體-靶標(biāo)的含有不同報告基因的酵母菌株組成。將膜置于富含YPD的固體瓊脂培養(yǎng)基上，在30℃孵育一夜，使其接合。接著，將濾膜轉(zhuǎn)移到缺少亮氨酸和色氨酸的含半乳糖(1％)作為碳源且加入G418的合成培養(yǎng)基上，在37℃孵育五天，以選擇帶有表達(dá)載體和靶標(biāo)載體的二倍體。五天后，將濾膜置于在0.5M、pH 7.0磷酸鈉緩沖液中的含0.02％X-Gal、0.1％SDS、6％二甲基甲酰胺(DMF)、7mM β-巰基乙醇、1％瓊脂糖的固體瓊脂糖培養(yǎng)基中，在37℃孵育，以檢測β-半乳糖苷酶活性。通過掃描分析結(jié)果，使用合適的軟件進(jìn)行定量。
2)結(jié)果 在大多數(shù)情況下，切割B2M11.2和B2M11.3的突變體的共表達(dá)得到對B2M11靶標(biāo)的切割(圖10)。功能性組合歸納于表IV中。
表IV導(dǎo)致切割B2M11靶標(biāo)的組合 +表示異二聚突變體切割B2M11靶標(biāo) 實施例6通過將切割B2M11.3的大范圍核酸酶進(jìn)行隨機(jī)誘變并與切割B2M11.2的蛋白質(zhì)共表達(dá)來制備以更高效率切割B2M11的大范圍核酸酶 通過共表達(dá)切割回文B2M11.2和B2M11.3靶標(biāo)的突變體鑒定出能切割回文B2M11靶標(biāo)的I-CreI突變體(實施例5)。但是，能切割B2M11的陽性組合的效率和數(shù)量都很低。
因此，誘變切割B2M11.3的蛋白質(zhì)，并篩選在與B2M11.2的優(yōu)化突變體相組合時具有更高效率的切割B2M11的變體。根據(jù)與其靶標(biāo)結(jié)合的I-CreI蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，I-CreI蛋白質(zhì)中用于第一組合方法的殘基(28，30，32，33，38和40以及44，68，70，75和77)之間沒有接觸(Chevalier等，Nat.Struct.Biol.，2001，8，312-316；Chevalier B.S.和Stoddard B.L.，NucleicAcids Res.，2001，29，3757-3754；Chevalier等，J.Mol.Biol.，2003，329，253-269)。因此，很難通過推理選擇一組位置來誘變，由此，針對蛋白質(zhì)的C端部分(后83個氨基酸)或整個蛋白質(zhì)進(jìn)行了誘變。
1)材料和方法 通過在兩步PCR過程中使用Mn2+或dNTP衍生物(如8-氧代-dGTP和dPTP)進(jìn)行的PCR，在所選突變體的基礎(chǔ)上建立隨機(jī)誘變文庫，如JENABIOSCIENCE GmbH的JBS dNTP-Mutagenis試劑盒中的方案所述。所用引物是preATGCreFor(5’-gcataaattactatacttctatagacacgcaaacacaaatacacagcggccttgccacc-3’；SEQID NO103)和ICreIpostRev(5’-ggctcgaggagctcgtctagaggatcgctcgagttatcagtcggccgc-3’；SEQ ID NO104)。將新文庫在酵母體內(nèi)克隆于線性化卡那霉素載體中，所述卡那霉素載體帶有半乳糖誘導(dǎo)型啟動子、作為選擇標(biāo)記的KanR以及2μ復(fù)制起點。通過測序驗證陽性結(jié)果克隆(MILLEGEN)。
通過使用亮氨酸載體(pCLS0542，圖13)和卡那霉素載體(pCLS1107，圖14)共用的那些引物進(jìn)行的PCR反應(yīng)來擴(kuò)增突變體集合。利用高效LiAc轉(zhuǎn)化方案，使用約75ng PCR片段和用DraIII與NgoMIV消化而線性化的75ng載體DNA(pCLS1107)來轉(zhuǎn)化酵母即釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株FYC2-6A(MATα，trp1Δ63，leu2Δ1，his3Δ200)。通過酵母中的體內(nèi)同源重組產(chǎn)生I-CreI突變體的完整編碼序列文庫。
制備突變體-靶標(biāo)酵母并用做接合測定的靶標(biāo)，如實施例5中所述。
2)結(jié)果 將切割B2M11.3的突變體(I-CreI28K30Q32S33G38C40S44Q68N70S75N77R，根據(jù)表III的命名法也稱作KQSGCS/QNSNR)進(jìn)行隨機(jī)誘變，并轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母。然后將6696個轉(zhuǎn)化克隆與酵母菌株接合，所述酵母菌株為(i)在報告質(zhì)粒中含有B2M11靶標(biāo)的，(ii)表達(dá)在實施例5中所述變體中選擇的切割B2M11.2靶標(biāo)的優(yōu)化變體。使用四個這樣的菌株，其表達(dá)I-CreI28K30N32A33H38Q40S44A68Y70S75Y77K/132V突變體，I-CreI28K30N32G33H38Q40S44A68Y70S75Y77K/2I96R105A突變體，28K30N32G33H38Q40S44A68Y70S75Y77K/120G突變體或28K30N32A33H38Q40S44A68Y70S75Y77K/2Y53R66C突變體(參見表V)。在與這些酵母菌株接合時，發(fā)現(xiàn)101個克隆引起B(yǎng)2M11靶標(biāo)的切割。在對照實驗中，在沒有KQSGCS/QNSNR蛋白共表達(dá)的情況下，在這些克隆中沒有發(fā)現(xiàn)引起B(yǎng)2M11的切割。于是認(rèn)為101個陽性克隆在與KQSGCS/QNSNR形成異二聚體時含有能切割B2M11的蛋白質(zhì)。這些異二聚化突變體的實例列于表V中。陽性克隆的實例顯示于圖11中。
表V導(dǎo)致切割B2M11靶標(biāo)的組合
+表示異二聚化變體切割B2M11靶標(biāo)。
優(yōu)化突變體以粗體顯示 實施例7通過將切割B2M11.3的大范圍核酸酶進(jìn)行隨機(jī)誘變并與切割B2M11的蛋白質(zhì)共表達(dá)制備在CHO細(xì)胞的染色體外模型中以更高效率切割B2M11.2的大范圍核酸酶 已經(jīng)通過共表達(dá)切割回文B2M11.2和B2M11.3靶標(biāo)的突變體(優(yōu)化的或未優(yōu)化的)在酵母中鑒定了能以更高效率切割回文B2M11靶標(biāo)的I-CreI突變體(實施例5)。但是，CHO細(xì)胞中的功能性異二聚體引人注意，在使用染色體外測定的哺乳動物細(xì)胞中能切割B2M11的陽性組合的效率和數(shù)目不同于酵母細(xì)胞中的。
因此，如實施例5中將切割B2M11.2的最佳蛋白質(zhì)進(jìn)行誘變，并篩選在與針對B2M11.3的優(yōu)化變體組合時高效切割B2M11的變體。根據(jù)與其靶標(biāo)結(jié)合的I-CreI蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，I-CreI蛋白質(zhì)中用于第一組合方法的殘基(28，30，32，33，38和40以及44，68，70，75和77)之間沒有接觸(Chevalier等，Nat.Struct.Biol.，2001，8，312-316；Chevalier B.S.和Stoddard B.L.，Nucleic Acids Res.，2001，29，3757-3754；Chevalier等，J.Mol.Biol.，2003，329，253-269)。因此，很難通過推理選擇一組位置來誘變，由此，針對蛋白質(zhì)的C端部分(后83個氨基酸)或整個蛋白質(zhì)進(jìn)行了誘變。
1)材料和方法 a)通過隨機(jī)誘變構(gòu)建文庫 通過在兩步式PCR過程中使用Mn2+或dNTP衍生物(如8-氧代-dGTP和dPTP)進(jìn)行的PCR，在所選突變體集合的基礎(chǔ)上建立隨機(jī)誘變文庫，如JENA BIOSCIENCE GmbH的JBS dNTP-Mutagenis試劑盒中的方案所述。所用引物是attB1-ICreIFor(5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcgaaggagatagaaccatggccaataccaaatataacaaagagttcc-3′(SEQ ID NO120)和attB2-ICreIRev(5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtttagtcggccgccggggaggatttcttcttctcgc-3’SEQID NO121)。將所得PCR產(chǎn)物體外克隆于INVITROGEN的CHOGateway表達(dá)載體pCDNA6.2中(pCLS1069，圖16)。同時，將用于文庫的所選突變體以相同方式克隆于此載體中。通過測序驗證所克隆的突變體和文庫的陽性結(jié)果克隆(MILLEGEN)。
b)在用于在CHO細(xì)胞中篩選的載體中構(gòu)建B2M11靶標(biāo) 通過兩步式PCR使用引物M1s(5’-aaaaagcaggctgattggcatacaagtt-3’SEQ ID NO122)和M2s(5’-agaaagctgggtgattgacagacgattg-3’SEQ IDNO123)，然后使用attB1adapbis(5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagca-3’SEQID NO124)和attB2adapbis(5’-ggggaccactttgtacaagaaagct-3′SEQ IDNO125)從酵母靶標(biāo)載體(如實施例1)擴(kuò)增B2M11靶標(biāo)。引物來自PROLIGO。使用Gateway方案(INVITROGEN)將最終PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)CHO報告載體(pCLS1058，圖17)。通過測序驗證所克隆的靶標(biāo)(MILLEGEN)。
c)哺乳動物細(xì)胞中的染色體外測定 根據(jù)供應(yīng)商的方案(QIAGEN)使用Polyfect轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后72小時，除去培養(yǎng)基，加入150μl裂解/顯示(revelation)緩沖液，用于進(jìn)行β-半乳糖苷酶液體測定(通常1升緩沖液含有100ml裂解緩沖液(Tris-HCl 10mM pH7.5，NaCl 150mM，Triton X100 0.1％，BSA0.1mg/ml，蛋白酶抑制劑)、10ml Mg 100X緩沖液(MgCl2 100mM，β-巰基乙醇35％)、110ml ONPG 8mg/ml和780ml磷酸鈉0.1M pH7.5)。在37℃孵育之后，測定420nm處的光密度(OD)。整個過程在自動化Velocity11 BioCel平臺上進(jìn)行。每個測定中，將150ng靶標(biāo)載體與兩種突變體各12.5ng(12.5ng切割回文B2M11.2靶標(biāo)的突變體和12.5ng切割回文B2M11.3靶標(biāo)的突變體)共轉(zhuǎn)染。
2)結(jié)果 將切割B2M11.2的優(yōu)化突變體(I-CreI32G33H44A68Y70S75Y77K/120G，32A33H44A68Y70S75Y77K/2Y53R66C，32G33H44A68Y70S75Y77K/2I96R105A和32A33H44A68Y70S75Y77K/132V，如表V中所述)進(jìn)行隨機(jī)誘變，并轉(zhuǎn)化進(jìn)Gateway載體(圖16)。純化1920個轉(zhuǎn)化克隆的DNA質(zhì)粒，然后與CHO B2M11靶標(biāo)載體和選自實施例6中所述的那些切割B2M11.3靶標(biāo)的優(yōu)化變體共轉(zhuǎn)染。為了進(jìn)行比較，包括了轉(zhuǎn)化克隆與CHO B2M11靶標(biāo)載體和切割B2M11.3的初始突變體(30Q33G38C68N70S77R)的共轉(zhuǎn)染。在與切割B2M11.3靶標(biāo)的優(yōu)化變體共轉(zhuǎn)染時，發(fā)現(xiàn)60個克隆引起B(yǎng)2M11靶標(biāo)的切割。
在對照實驗中，在不與切割B2M11.3靶標(biāo)的變體(優(yōu)化的或未優(yōu)化的)共轉(zhuǎn)染的情況下，這些克隆中未發(fā)現(xiàn)有引起B(yǎng)2M11的切割。因此，結(jié)論認(rèn)為，60個陽性克隆含有在與切割B2M11.3靶標(biāo)的優(yōu)化變體形成異二聚體時能切割B2M11的蛋白質(zhì)。來源于切割B2M11.3靶標(biāo)的兩種優(yōu)化變體(30Q33G38C68N70S77R/43L115T117G和30Q33G38C68N70S77R/110D)的這些異二聚化突變體的實例列于表VI中。
表VI導(dǎo)致在CHO細(xì)胞中切割＊B2M11靶標(biāo)的組合
＊(-)＜0.25.(±)0.25≤＜0,5.(+)0,5≤＜1,2.(++)≥1,2.值(吸收單位)對應(yīng)于CHO細(xì)胞中染色體外測定的平均實驗結(jié)果 實施例8切割B2M18的大范圍核酸酶的制備 兩個新的回文靶標(biāo)系列B2M18.3和B2M18.4來自于B2M18，B2M20.3和B2M20.4來自于B2M20(圖18和21)。因為B2M18.3、B2M18.4、B2M20.3和B2M20.4是回文的，所以它們應(yīng)該被同二聚化蛋白質(zhì)切割。首先，設(shè)計同二聚體形式的能切割B2M18.4序列的蛋白質(zhì)(實施例8)，然后設(shè)計同二聚體形式的能切割B2M20.4序列的蛋白質(zhì)(實施例9)。
本實施例表明I-CreI變體可切割回文形式的B2M18.4 DNA靶序列，其來自于B2M18靶標(biāo)的右側(cè)部分(圖18)。本實施例中描述的所有靶序列都是22bp回文序列。因此，僅用前11個核苷酸后接后綴_P對它們進(jìn)行描述。例如，B2M18.4也被記做TTAACTATCGT_P(SEQ ID NO113)。
B2M18.4在±1，±2，±3，±4，±5，±8和±9位類似于5ATC_P，在±1，±2，±3，±4，±8，±9和±10位類似于10TAA_P。有假說認(rèn)為±6，±7和±11位對結(jié)合和切割活性影響很小。之前通過對I-CreI N75的44，68，70，75和77位的誘變獲得了能切割5ATC_P靶標(biāo)(CAAAACATCGT_P)的突變體，如Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458和PCT國際申請WO2006/097784、WO 2006/097853中所述。通過對I-CreI N75和D75的28，30，32，33，38，40和70位的誘變獲得了能切割5ATC_P靶標(biāo)(CTAAACGTCGT_P)的突變體，如之前Smith等，Nucleic Acids Res.，2006，34，e149中所述。因此，將這些突變體對組合將使得能夠切割B2M18.4靶標(biāo)。
兩組蛋白質(zhì)都在70位突變。但是，猜想存在兩個可分離的功能性亞結(jié)構(gòu)域。這暗示該位置對靶標(biāo)的10至8堿基的特異性影響很小。因此，將切割5ATC_P(CAAAACATCGT_P)的蛋白質(zhì)的44，68，70，75和77位的突變與的切割10TAA_P(CTAAACGTCGT_P)的蛋白質(zhì)的28，30，32，33，38，40位的突變相組合，以驗證組合突變體是否能切割B2M18.4靶標(biāo)。
1)材料和方法 實驗步驟同實施例2中所述。
2)結(jié)果 通過將I-CreI N75或D75骨架中44、68、70、75和77位的突變與28、30、33、38和40位的突變相組合來構(gòu)建I-CreI組合突變體，得到復(fù)雜度1600的文庫。組合突變體的實例顯示于表VII中。將該文庫轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母，針對切割B2M18.4 DNA靶標(biāo)(TTAACTATCGT_P)篩選了3348個克隆(多樣性的2.1倍)。得到59個陽性克隆，隨后將其測序并通過二次篩選進(jìn)行驗證，證明其對應(yīng)于18種新型核酸內(nèi)切酶(SEQ ID NO136至152和179，參見表VII)。陽性結(jié)果顯示于圖19中。一個陽性克隆在153位有一個另外的突變。此克隆的序列是KNRTQS/QYSRQ-153G。
表VII組合突變體對B2M18.4靶標(biāo)的切割＊
＊僅顯示組合文庫中理論上存在的1600個組合中的138個 +表示在所鑒定的陽性克隆中發(fā)現(xiàn)的組合突變體。
實施例9切割B2M20的大范圍核酸酶的制備 本實施例表明I-CreI變體可切割回文形式的B2M20.4 DNA靶序列，其來自于B2M20.1靶標(biāo)的右側(cè)部分(圖19)。本實施例中描述的所有靶序列都是22bp回文序列。因此，僅用前11個核苷酸后接后綴_P對它們進(jìn)行描述。例如，靶標(biāo)B2M20.4被記做TTACATGTCGT_PSEQ ID NO119。
B2M18.4在±1，±2，±3，±4，±5和±7位類似于5GTC_P，在±1，±2，±3，±4，±5，±7，±8，±9和±10位類似于10TAC_P。有假說認(rèn)為±6和±11位對結(jié)合和切割活性影響很小。之前通過對I-CreI的70和77位的誘變獲得了能切割5GTC_P靶標(biāo)(CAAAACGTCGT_P)的突變體，如Arnould等，J.Mol.Biol.，2006，355，443-458和PCT國際申請WO 2006/097784、WO2006/097853中所述。通過對I-CreI N75和D75的28，30，32，33，38，40和70位的誘變獲得了能切割10TAC_P靶標(biāo)(CTACACGTCGT_P)的突變體，如之前Smith等，Nucleic Acids Res.，2006，34，e149中所述。因此，將這些突變體對組合將使得能夠切割B2M20.4靶標(biāo)。
兩組蛋白質(zhì)都在70位突變。但是，猜想存在兩個可分離的功能性亞結(jié)構(gòu)域。這暗示該位置對靶標(biāo)的10至8堿基的特異性影響很小。因此，將切割5GTC_P(CAAAACGTCGT_P)的蛋白質(zhì)的70和75位的突變與切割10TAC_P(CTACACGTCGT_P)的蛋白質(zhì)的28，30，32，33，38，40位的突變相組合，以驗證組合突變體是否能切割B2M20.4靶標(biāo)。
1)材料和方法 實驗步驟如實施例2中所述。
2)結(jié)果 通過將I-CreI N75或D75骨架中70和75位的突變與28、30、33、38和40位的突變相組合來構(gòu)建I-CreI組合突變體，得到復(fù)雜度1536的文庫。組合突變體的實例顯示于表VIII中。將該文庫轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母，針對切割B2M20.4 DNA靶標(biāo)(TTACATGTCGT_P)篩選了6696個克隆(多樣性的4.4倍)。發(fā)現(xiàn)了196個陽性克隆，隨后將其測序并通過二次篩選進(jìn)行驗證，證明其對應(yīng)于164種新型核酸內(nèi)切酶(參見表VIII顯示SEQ ID NO153至178)。陽性結(jié)果顯示于圖21中。12個陽性克隆有另外的突變(56G，82R，147A或161F)，如實施例8。
表VIII組合突變體時B2M20.4靶標(biāo)的切割＊
＊僅顯示組合文庫中理論上存在的1536個組合中的230個 +表示在所鑒定的陽性克隆中發(fā)現(xiàn)的組合突變體。
序列表
<110>賽萊克蒂斯公司
西爾萬.阿爾努
安德烈.舒利卡
<120>切割來自β-2微球蛋白基因之DNA靶序列的大范圍核酸酶變體及其用途
<130>1546PCT16
<160>179
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>163
<212>PRT
<213>菜茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)
<400>1
Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe
1 5 10 15
Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser
20 25 30
Tyr Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Ala Phe Gln Val Thr Gln Lys
35 40 45
Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val
50 55 60
Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser Glu
65 70 75 80
Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys
85 90 95
Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Trp Arg Leu
100 105 110
Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp
115 120 125
Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr
130 135 140
Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys
145 150 155 160
Ser Ser Pro
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>C1221靶標(biāo)
<400>2
tcaaaacgtc gtacgacgtt ttga
<210>3
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI變體
<400>3
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln
20 25 30
Ser Arg Lys Phe Lys His Ala Leu Ser Leu Thr Phe Asp Val Thr Gln
35 40 45
Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly
50 55 60
Val Gly Tyr Val Ala Asp Ser Gly Ser Val Ser Lys Tyr Arg Leu Ser
65 70 75 80
Glu Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu
85 90 95
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<211>167
<212>PRT
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<220>
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165
<210>42
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI變體
<400>42
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
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165
<210>43
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<220>
<223>I-CreI變體
<400>43
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165
<210>44
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<212>PRT
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<220>
<223>I-CreI變體
<400>44
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
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165
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<223>I-CreI變體
<400>45
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Gln Gln
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Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
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Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
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35 40 45
Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly
50 55 60
Val Gly Tyr Val Asn Asp Ser Gly Ser Val Ser Asn Tyr Arg Leu Ser
65 70 75 80
Glu Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu
85 90 95
Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln
100 105 110
Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
115 120 125
Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr
130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Val Lys Lys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>67
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI變體
<400>67
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Gln Gln
20 25 30
Ser Gly Lys Phe Lys His Cys Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln
35 40 45
Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly
50 55 60
Val Gly Tyr Val Asn Asp Ser Gly Ser Val Ser Asn Tyr Arg Leu Ser
65 70 75 80
Glu Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu
85 90 95
Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln
100 105 110
Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
115 120 125
Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr
130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu ASn Lys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>68
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI變體
<400>68
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI變體
<400>69
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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165
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI變體
<400>70
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<220>
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<400>71
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35 40 45
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100 105 110
Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
115 120 125
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Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
145 150 155 160
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165
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
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<400>72
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Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
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<212>PRT
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<220>
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<400>73
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
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165
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<212>PRT
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<220>
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<400>74
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<212>PRT
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<220>
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<400>76
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130 135 140
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI變體
<400>77
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
115 120 125
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130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
145 150 155 160
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165
<210>78
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI變體
<400>78
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
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20 25 30
Ser Tyr Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Ala Val Thr Gln
35 40 45
Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
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165
<210>79
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI變體
<400>79
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln
20 25 30
Gly His Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln
35 40 45
Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly
50 55 60
Val Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asn Tyr Ile Leu Ser
65 70 75 80
Glu Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu
85 90 95
Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln
100 105 110
Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
115 120 125
Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr
130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>80
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI變體
<400>80
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln
20 25 30
Ala His Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln
35 40 45
Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly
50 55 60
Val Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asn Tyr Ile Leu Ser
65 70 75 80
Glu Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu
85 90 95
Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln
100 105 110
Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
115 120 125
Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr
130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
145 150 155 160
63
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>81
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI變體
<400>81
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Gln Gln
20 25 30
Ser Gly Lys Phe Lys His Cys Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln
35 40 45
Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly
50 55 60
Val Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asn Tyr Ile Leu Ser
65 70 75 80
Glu Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu
85 90 95
Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln
100 105 110
Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
115 120 125
Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr
130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>82
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B2M靶標(biāo)
<400>82
ttgtaatccc agcacttagg gaga
<210>83
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B2M靶標(biāo)
<400>83
tttagctcat gaaattaggt acaa
<210>84
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B2M靶標(biāo)
<400>84
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<210>85
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B2M靶標(biāo)
<400>85
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<210>86
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B2M靶標(biāo)
<400>86
tctagacact tcatacagtt taga
<210>87
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B2M靶標(biāo)
<400>87
ttcatacagt ttagaaaatc agat
<210>88
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B2M靶標(biāo)
<400>88
gtacaataac atgagtaatt tgat 24
<210>89
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B2M靶標(biāo)
<400>89
ttgtcacagc ccaagatagt taag 24
<210>90
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B2M靶標(biāo)
<400>90
ttttcataga tcgagacatg taag 24
<210>91
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B2M靶標(biāo)
<400>91
atgaaacatt ttgtcatata agat 24
<210>92
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B2M衍生靶標(biāo)
<400>92
tcgaaacgtc gtacgacgtt tcga 24
<210>93
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B2M衍生靶標(biāo)
<400>93
tcctgacgtc gtacgacgtc agga 24
<210>94
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B2M衍生靶標(biāo)
<400>94
tcaaaactag gtacctagtt ttga24
<210>95
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B2M衍生靶標(biāo)
<400>95
tcaaaacttt gtacaaagtt ttga24
<210>96
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>BM衍生靶標(biāo)
<400>96
tgaaattagg tacctaattt ca 22
<210>97
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B2M衍生靶標(biāo)
<400>97
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<210>98
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>98
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<210>99
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>99
gcaactttag tgctgacaca tacagg 26
<210>100
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>100
acaaccttga ttggagactt gacc 24
<210>101
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(6)
<223>n是a，c，g，或t
<400>101
ctannnttga ccttt 15
<210>102
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(12)
<223>n是a，c，g，或t
<400>102
aaaggtcaan nntag 15
<210>103
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>103
gcataaatta ctatacttct atagacacgc aaacacaaat acacagcggc cttgccacc 59
<210>104
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>104
ggctcgagga gctcgtctag aggatcgctc gagttatcag tcggccgc 48
<210>105
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI變體
<400>105
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln
20 25 30
Ser Tyr Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln
35 40 45
Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly
50 55 60
Val Gly Tyr Val Asn Asp Ser Gly Ser Val Ser Asn Tyr Arg Leu Ser
65 70 75 80
Glu Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu
85 90 95
Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln
100 105 110
Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
115 120 125
Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr
130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>106
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI N75骨架蛋白
<400>106
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln
20 25 30
Ser Tyr Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln
35 40 45
Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly
50 55 60
Val Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asn Tyr Ile Leu Ser
65 70 75 80
Glu Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu
85 90 95
Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln
100 105 110
Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
115 120 125
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130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
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<211>163
<212>PRT
<213>萊茵衣藻
<400>107
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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65 70 75 80
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115 120 125
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130 135 140
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<213>人工序列
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<211>24
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<213>人工序列
<220>
<223>B2M靶標(biāo)
<400>109
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>24
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<213>人工序列
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<212>DNA
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<220>
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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tcaaaacaga gtactctgtt ttga24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>B2M靶標(biāo)
<400>117
tcaaaacgtc gtacgacgtt ttga24
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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tttcatagag tactctatga aa 22
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<211>22
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<213>人工序列
<220>
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atataacaaa gagttcc77
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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tcgc 64
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<212>DNA
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<220>
<223>引物
<400>122
aaaaagcagg ctgattggca tacaagtt28
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<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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agaaagctgg gtgattgaca gacgattg28
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<220>
<223>引物
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ggggacaagt ttgtacaaaa aagca 25
<210>125
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>125
ggggaccact ttgtacaaga aagct 25
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<212>PRT
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<220>
<223>I-CreI變體
<400>126
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50 55 60
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130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
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Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>127
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI變體
<400>127
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Ser Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln
20 25 30
Ala His Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Leu Ala Val Thr Gln
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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115 120 125
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130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
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<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI變體
<400>128
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50 55 60
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
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Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
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<212>PRT
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<220>
<223>I-CreI變體
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50 55 60
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165
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<212>PRT
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<220>
<223>I-CreI變體
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165
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI變體
<400>131
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165
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<211>167
<212>PRT
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<220>
<223>I-CreI變體
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Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
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165
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<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI變體
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Lys Ser Phe Pro Ala Pro Asp
165
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<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI變體
<400>134
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165
<210>135
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI變體
<400>135
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Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>136
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI變體
<400>136
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro His Gln
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Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln
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Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
115 120 125
Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr
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145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>137
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI變體
<400>137
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln
20 25 30
Gly Cys Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln
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Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln
100 105 110
Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
115 120 125
Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr
130 135 140
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145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>138
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI變體
<400>138
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln
20 25 30
Arg Thr Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln
35 40 45
Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr
130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>139
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI變體
<400>139
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln
20 25 30
Gly Cys Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Asn Val Thr Gln
35 40 45
Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln
100 105 110
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115 120 125
Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr
130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>140
<211>167
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<213>人工序列
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130 135 140
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<220>
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<400>175
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<220>
<223>I-CreI變體
<400>176
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Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln
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Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
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Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr
130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>177
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI變體
<400>177
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln
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Thr Ala Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln
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115 120 125
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130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>178
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI變體
<400>178
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln
20 25 30
Ser Thr Lys Phe Lys His Gln Leu Glu Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln
35 40 45
Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly
50 55 60
Val Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser
65 70 75 80
Glu Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu
85 90 95
Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln
100 105 110
Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
115 120 125
Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr
130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
165
<210>179
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>I-CreI變體
<400>179
Met Ala Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro His Gln
20 25 30
Ser Cys Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Arg Val Thr Gln
35 40 45
Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly
50 55 60
Val Gly Tyr Val Tyr Asp Ser Gly Ser Val Ser Arg Tyr Gln Leu Ser
55 70 75 80
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Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln
100 105 110
Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr
115 120 125
Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr
130 135 140
Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys
145 150 155 160
Lys Ser Ser Pro Ala Ala Asp
16權(quán)利要求
1.一種I-CreI變體，其特征為兩個I-CreI單體中的至少一個具有至少兩個替換，所述替換各自位于LAGLIDADG核心結(jié)構(gòu)域的兩個功能性亞結(jié)構(gòu)域之一中，所述亞結(jié)構(gòu)域位于I-CreI的26到40位和44到77位，所述變體能夠切割來自β-2-微球蛋白基因的DNA靶序列，并且所述變體可通過至少包括下述步驟的方法而獲得
(a)構(gòu)建第一系列I-CreI變體，其在LAGLIDADG核心結(jié)構(gòu)域的第一功能性亞結(jié)構(gòu)域中具有至少一個替換，所述第一功能性亞結(jié)構(gòu)域位于I-CreI的26到40位，
(b)構(gòu)建第二系列I-CreI變體，其在LAGLIDADG核心結(jié)構(gòu)域的第二功能性亞結(jié)構(gòu)域中具有至少一個替換，所述第二功能性亞結(jié)構(gòu)域位于I-CreI的44到77位，
(c)從步驟(a)的第一系列中選擇和/或篩選能夠切割突變I-CreI位點的變體，在所述突變位點中，(i)I-CreI位點中-10到-8位的核苷酸三聯(lián)體已被存在于來自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中-10到-8位的核苷酸三聯(lián)體所替換，且(ii)+8到+10位的核苷酸三聯(lián)體已被存在于來自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中-10到-8位的核苷酸三聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列所替換，
(d)從步驟(b)的第二系列中選擇和/或篩選能夠切割突變I-CreI位點的變體，在所述突變位點中，(i)I-CreI位點中-5到-3位的核苷酸三聯(lián)體已被存在于來自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中-5到-3位的核苷酸三聯(lián)體所替換，且(ii)+3到+5位的核苷酸三聯(lián)體已被存在于所述來自β-2-微球蛋白基因的DNA靶序列中-5到-3位的核苷酸三聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列所替換，
(e)從步驟(a)的第一系列中選擇和/或篩選能夠切割突變I-CreI位點的變體，在所述突變位點中，(i)I-CreI位點中+8到+10位的核苷酸三聯(lián)體已被存在于來自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中+8到+10位的核苷酸三聯(lián)體所替換，且(ii)-10到-8位的核苷酸三聯(lián)體已被存在于來自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中+8到+10位的核苷酸三聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列所替換，
(f)從步驟(b)的第二系列中選擇和/或篩選能夠切割突變I-CreI位點的變體，在所述突變位點中，(i)I-CreI位點中+3到+5位的核苷酸三聯(lián)體已被存在于來自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中+3到+5位的核苷酸三聯(lián)體所替換，且(ii)-5到-3位的核苷酸三聯(lián)體已被存在于來自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中+3到+5位的核苷酸三聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列所替換，
(g)將來自步驟(c)和步驟(d)的兩個變體中26到40位和44到77位的突變在單個變體中組合，以獲得切割以下序列的新的同二聚體I-CreI變體，在所述序列中，(i)-10到-8位的核苷酸三聯(lián)體與存在于來自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中-10到-8位的核苷酸三聯(lián)體相同，(ii)+8到+10位的核苷酸三聯(lián)體與存在于來自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中-10到-8位的核苷酸三聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列相同，(iii)-5到-3位的核苷酸三聯(lián)體與存在于來自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中-5到-3位的核苷酸三聯(lián)體相同，并且(iv)+3到+5位的核苷酸三聯(lián)體與存在于來自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中-5到-3位的核苷酸三聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列相同，和/或
(h)將來自步驟(e)和步驟(f)的兩個變體中26到40位和44到77位的突變在單個變體中組合，以獲得切割以下序列的新的同二聚體I-CreI變體，在所述序列中，(i)+3到+5位的核苷酸三聯(lián)體與存在于來自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中+3到+5位的核苷酸三聯(lián)體相同，(ii)-5到-3位的核苷酸三聯(lián)體與存在于來自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中+3到+5位的核苷酸三聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列相同，(iii)I-CreI位點中+8到+10位的核苷酸三聯(lián)體已被存在于來自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中+8到+10位的核苷酸三聯(lián)體所替換，并且(iv)-10到-8位的核苷酸三聯(lián)體與來自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列中+8到+10位的核苷酸三聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列相同，
(i)將步驟(g)和(h)中所獲得的變體相組合以形成異二聚體，以及
(j)選擇和/或篩選來自步驟(i)的能夠切割來自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列的異二聚體。
2.權(quán)利要求1的變體，其中所述位于I-CreI中44到77位的亞結(jié)構(gòu)域中的替換位于44、68、70、75和/或77位。
3.權(quán)利要求1的變體，其中所述位于I-CreI中26到40位的亞結(jié)構(gòu)域中的替換位于26、28、30、32、33、38和/或40位。
4.權(quán)利要求1至3中任一項的變體，其包含I-CreI的137至143位中的一個或多個替換，所述替換改變了所述變體對所述I-CreI位點中±1至2、±6至7和/或±11至12位核苷酸的特異性。
5.權(quán)利要求1至4中任一項的變體，其包含完整I-CreI序列上的一個或多個替換，所述替換提高了所述變體對來自β-2-微球蛋白基因的所述DNA靶序列的結(jié)合和/或切割特性。
6.權(quán)利要求1至5中任一項的變體，其中所述替換是用選自A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、Y、C、W、L和V的氨基酸替代原始氨基酸。
7.權(quán)利要求1至6中任一項的變體，其為異二聚體，來自于在I-CreI的26至40位和44至77位具有不同突變的第一單體和第二單體的結(jié)合，所述異二聚體能切割來自β-2-微球蛋白基因的非回文DNA靶序列。
8.權(quán)利要求7的變體，其中所述第一單體和第二單體分別至少具有下列替換
-Y33R，Q38A，Q44D，R68A，R70S，D75K，I77R和K28R，Y33A，Q38Y，S40Q，Q44A，R68Y，R70S，D75Y，I77K，
-S32T，Y33T，Q44T，R68Y，R70S，D75Y，I77V和Y33R，Q38A，Q44N，R68Q，R70S，D75S，I77V，
-S32G，Y33H，Q44A，R68Y，R70S，D75Y，I77K或S32A，Y33H，Q44A，R68Y，R70S，D75Y，I77K和N30Q，Y33G，Q38C，R68N，R70S，D75N，I77R，
-S32G，Y33H，Q44A，R68Y，R70S，D75Y，I77K和S32T，Q38S，Q44K，R70S，I77A，
-S32T，Y33T，Q44K，R68E，R70S，I77R和N30A，Y33T，Q44N，R68K，R70S，D75H，I77F，
-S32R，Y33D，Q44A，R70S，D75E，I77R和N30D，Y33R，Q44K，R68Y，R70S，D75N，I77Q，
-S32T，Q38W，Q44A，R70S，D75R，I77Y和Y33H，S40Q，Q44N，R70S，D75R，I77Y，
-Y33H，Q38G，Q44N，R68Y，R70S，D75R，I77V和N30A，Y33T，Q44N，R68Y，R70S，D75R，I77V，
-Y33T，S40N，Q44T，R68Y，R70S，D75R，I77V和K28R，Y33A，Q38Y，S40Q，Q44A，R68S，R70S，D75S，I77R，以及
-K28T，Y33R，S40R，Q44T，R70S，D75Y和N30D，Y33R，Q44N，R68Y，R70S，D75Y，I77Q。
9.權(quán)利要求8的變體，其中所述第一單體的序列是序列SEQ ID NO24至28、126至134中的任一個，所述第二單體的序列是序列SEQ ID NO37至77、135至179中的任一個。
10.權(quán)利要求1-9中任一項的變體，其中所述DNA靶序列來自人β-2-微球蛋白基因。
11.權(quán)利要求10的變體，其中所述DNA靶標(biāo)選自序列SEQ ID NO82至91。
12.權(quán)利要求7至11中任一項的變體，其為專性異二聚體，其中所述第一單體和第二單體還分別包含D137R突變和R51D突變。
13.權(quán)利要求7至12中任一項的變體，其為專性異二聚體，其中所述第一單體還包含K7R、E8R、E61R、K96R和L97F或者K7R、E8R、F54W、E61R、K96R和L97F突變，所述第二單體還包含K7E、F54G、L58M和K96E或者K7E、F54G、K57M和K96E突變。
14.單鏈嵌合型大范圍核酸酶，其包含權(quán)利要求1至13中任一項的一個或兩個變體的兩個單體或核心結(jié)構(gòu)域，或二者的組合。
15.權(quán)利要求14的單鏈大范圍核酸酶，其包含由肽接頭相連接的權(quán)利要求7、8、12和13中任一項定義的所述第一單體和第二單體。
16.多核苷酸片段，其編碼權(quán)利要求1到13中任一項的變體或者權(quán)利要求14或15的單鏈嵌合型大范圍核酸酶。
17.一種表達(dá)載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求16的至少一個多核苷酸片段。
18.權(quán)利要求17的表達(dá)載體，其包含兩個不同的多核苷酸片段，所述每個多核苷酸片段編碼權(quán)利要求7、8、12和13中任一項的異二聚體變體的單體之一。
19.一種載體，其包括靶向構(gòu)建體，所述靶向構(gòu)建體包含待引入序列，如權(quán)利要求1、10和11中任一項所定義，所述待引入序列的兩側(cè)是與β-2-微球蛋白基因中存在的基因組DNA切割位點周圍區(qū)域有同源性的序列。
20.權(quán)利要求17或權(quán)利要求18的載體，其包括靶向構(gòu)建體，所述靶向構(gòu)建體包含待引入序列，如權(quán)利要求1、10和11中任一項中所定義，所述待引入序列的兩側(cè)是與β-2-微球蛋白基因中存在的基因組DNA切割位點周圍區(qū)域有同源性的序列。
21.權(quán)利要求19或權(quán)利要求20的載體，其中所述待引入序列是使β-2-微球蛋白基因失活的序列。
22.權(quán)利要求21的載體，其中所述使β-2-微球蛋白基因失活的序列以5’至3’的方向包含第一轉(zhuǎn)錄終止序列以及包含啟動子、標(biāo)記物開放讀碼框和第二轉(zhuǎn)錄終止序列的標(biāo)記物盒，并且所述序列中斷所述編碼序列的轉(zhuǎn)錄。
23.權(quán)利要求22的載體，其中所述基因組DNA切割位點是SEQ IDNO82至90。
24.權(quán)利要求21的載體，其中所述使β-2-微球蛋白基因失活的序列包含標(biāo)記物基因，從而允許破壞β-2-微球蛋白編碼序列。
25.權(quán)利要求24的載體，其中所述使β-2-微球蛋白基因失活的序列包含外源目的基因，從而允許通過所述外源基因置換β-2-微球蛋白基因。
26.權(quán)利要求24或權(quán)利要求25的載體，其中所述基因組DNA切割位點是SEQ ID NO89或90。
27.權(quán)利要求19至26中任一項的載體，其中所述與β-2-微球蛋白基因中存在的基因組DNA切割位點周圍區(qū)域具有同源性的序列是包含選自下述位置序列的人β-2-微球蛋白基因片段1164至1363、2795至2994、2803至3002、3074至3273、3275至3474、3284至3483、3387至3586、4099至4298、4765至4944和6451至6650。
28.權(quán)利要求24至26中任一項的載體，其中所述與β-2-微球蛋白基因中存在的基因組DNA切割位點周圍區(qū)域具有同源性的序列是包含所述切割位點上游和下游序列的β-2-微球蛋白基因的片段，從而允許缺失緊鄰所述切割位點兩側(cè)的編碼序列。
29.一種組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1到13中任一項的至少一種變體，根據(jù)權(quán)利要求14或權(quán)利要求15的一種單鏈嵌合型大范圍核酸酶，和/或根據(jù)權(quán)利要求17到28中任一項的至少一種表達(dá)載體。
30.權(quán)利要求29的組合物，其包含有使β-2-微球蛋白基因失活之序列的靶向DNA構(gòu)建體，如權(quán)利要求21-28中任一項所限定的，該序列的兩側(cè)是與所述變體的基因組DNA靶標(biāo)切割位點周圍的區(qū)域有同源性的序列。
31.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項的至少一種變體、根據(jù)權(quán)利要求14或權(quán)利要求15的一種單鏈嵌合大范圍核酸酶、和/或根據(jù)權(quán)利要求17至28中任一項的一種表達(dá)載體在制備用于在從供體個體向有此需要的受體個體進(jìn)行細(xì)胞移植期間預(yù)防、改善或治療異體移植排斥的藥物中的用途。
32.權(quán)利要求31的用途，其中所述移植是腎、胰臟、肌肉或心臟細(xì)胞移植。
33.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項的至少一種變體，根據(jù)權(quán)利要求14或權(quán)利要求15的一種單鏈嵌合型大范圍核酸酶，和/或根據(jù)權(quán)利要求17至28中任一項的一種表達(dá)載體在制備用于在有此需要的個體中預(yù)防、改善或治療與β-2-微球蛋白的纖絲構(gòu)象相關(guān)之病癥的藥物中的用途。
34.經(jīng)權(quán)利要求16的多核苷酸或權(quán)利要求17到28中任一項的載體修飾的宿主細(xì)胞。
35.包含根據(jù)權(quán)利要求16或權(quán)利要求18中所定義的一個或兩個多核苷酸片段的非人轉(zhuǎn)基因動物。
36.包含根據(jù)權(quán)利要求16或權(quán)利要求18中所定義的一個或兩個多核苷酸片段的轉(zhuǎn)基因植物。
37.根據(jù)權(quán)利要求1到13中任一項的至少一種變體、根據(jù)權(quán)利要求14或權(quán)利要求15的一種單鏈嵌合型大范圍核酸酶、根據(jù)權(quán)利要求17到28中任一項的一種載體用于基因組工程的非治療目的的用途。
38.權(quán)利要求36的用途，其中所述變體、單鏈嵌合型大范圍核酸酶或載體與權(quán)利要求19到28中任一項所定義的靶向DNA構(gòu)建體相關(guān)聯(lián)。
39.權(quán)利要求38的用途，其中所述靶向DNA構(gòu)建體包含外源目的基因，并最終包含標(biāo)記物基因，其兩側(cè)是β-2-微球蛋白基因座上游和下游的序列，使得β-2-微球蛋白基因被該外源目的基因所替換。
40.權(quán)利要求37至39中任一項的用途，用于制備表達(dá)異源目的蛋白的轉(zhuǎn)基因動物或重組細(xì)胞系。
41.權(quán)利要求40的用途，其中所述重組細(xì)胞系是人重組細(xì)胞系。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種I-CreI變體，其具有至少兩個替換，所述替換各自位于LAGLIDADG核心結(jié)構(gòu)域的兩個功能性亞結(jié)構(gòu)域之一中，所述亞結(jié)構(gòu)域分別位于I-CreI的26到40位以及44到77位，所述變體能夠切割來自β-2-微球蛋白基因的DNA靶序列。本發(fā)明還涉及所述變體和衍生產(chǎn)物用于預(yù)防和治療異體移植排斥以及與β-2-微球蛋白的纖絲構(gòu)象相關(guān)之病癥的用途，以及用于制備表達(dá)異源目的蛋白的轉(zhuǎn)基因動物和重組細(xì)胞系的用途。
文檔編號A61K48/00GK101678126SQ200880005471
公開日2010年3月24日 申請日期2008年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月20日
發(fā)明者西爾萬·阿爾努, 安德烈·舒利卡 申請人:賽萊克蒂斯公司