專利名稱：：抗egfr抗體在治療egfr突變體介導的疾病中的用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及治療抗酪氨酸激酶抑制劑療法的EGFR介導的疾病，特別是癌癥。提供了用于在具有次級EGFR突變，特別地酪氨酸激酶結構域突變的抗標準療法的個體中治療癌癥和降低腫瘤生長的方法。制月體靶向癌癥療法被設計用來破壞致癌作用和腫瘤生長所需的特定分子的功能，從而殺死或阻止癌細胞的生長(JiH等人(2006)CellCycle5(18):2072-2076Epub2006S印15)。與常規(guī)細胞毒性化學療法相反，此類靶向癌癥療法更有效并且對正常細胞的傷害更小。靶向癌癥療法領域的主要努力一直以來是開發(fā)靶向表皮生長因子受體(EGFR)的試劑。EGFR是密切相關的受體(包括的EGFR(ErbB-l)、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)和Her4(ErbB-4))的ErbB家族的成員。EGFR的激活導致受體酪氨酸激酶的激活和一系列下游信號傳導事件(所述述信號傳導事件介導細胞增殖、運動、粘著、侵入和對化學療法的抗性以及對細胞凋亡的抑制(2-4))，對于癌細胞的持續(xù)增殖和存活至關重要的過程。迄今為止，兩個主要類型的抗EGFR試劑已進入臨床環(huán)境抗EGFR抗體和小分子EGFR酪氨酸激酶抑制劑(TKI)(5，6)?？笶GFR抗體例如西妥昔單抗(cetuximab)經設計以結合EGFR的細胞外結構域并且阻斷EGFR下游信號傳導的激活(7)。西妥昔單抗(也稱為抗體225，美國專利4，943，533)是針對A431細胞產生的，所述細胞表達高水平的野生型EGFR。相反地，小分子TKI例如吉非替尼(化合物ZD1839，易瑞沙)或厄洛替尼(化合物OSI-774,它賽瓦)與ATP競爭對EGFR酪氨酸激酶的細胞外催化結構域的結合，從而阻止EGFR的自磷酸化作用和下游信號轉導(4)。這兩種抗EGFR藥物類型都已在患有多種不同類型癌癥的患者的亞群中顯示一些臨床功效。在患有具有EGFR激酶結構域突變的肺癌的患者中使用吉非替尼或厄洛替尼進行的治療通常產生顯著的臨床反應(5，8)。然而，吉非替尼或厄洛替尼在具有野生型EGFR的肺腺癌或其他組織學亞型例如鱗狀細胞癌中的功效是有限的(9，10)。此外，在臨床前和臨床試驗中已顯示吉非替尼或厄洛替尼在抑制EGFRvIII突變體(11)(其中存在外顯子II至VII的符合讀框的缺失(也稱為EGFRde2-7)的不同的激活性EGFR突變)的功能中很大程度上是無效的。EGFRvIII通常見于成膠質細胞瘤(Glioblastoma)，并且最近發(fā)現存在于人肺鱗狀細胞癌的亞群(12)和大部分頭頸癌(13)中。顯示西妥昔單抗在非小細胞肺癌(NSCLC)患者和患有頭頸癌的患者以及結腸直腸癌患者的小亞群中是有效的。然而，對西妥昔單抗的反應似乎與EGFR的表達水平無關。因此，不清楚這些患者對西妥昔單抗治療有反應然而其腫瘤具有高EGFR表達的其他癌癥患者對西妥昔單抗治療不顯療效的原因(14)。由于EGFRvIII突變受體的表達限定于腫瘤細胞，因此其代表了抗體療法的高度特異性靶。因此，已產生了對于de2-7EGFR的獨特的肽是特異性的多克隆和單克隆抗體。使用獨特的de2-7肽免疫后分離的一系列小鼠mAb都顯示對于截短的受體和裸小鼠中生長的被耙向的de2-7EGFR陽性異種移植物的選擇性和特異性(WikstrandCJ等人(1995)3CancerRes55:3140-3148;0kamoto，S等人(1996)BrJCancer73:1366-1372;HillsD等人(1995)IntJCancer63:537-543;ReistCJ等人(1997)CancerRes57:1510-1515;ReistCJ等人(1995)CancerRes55:4375-4382;美國專利5，401，828)?？笶GFRvIII抗體的實例包括ABX-EGF(帕尼單抗)、DH8.3、L8A.4和Y10。MAb806是新型鼠抗體，最初使用表達EGFRvIII突變體的完整細胞作為免疫原產生該抗體以識別獨特的截短的突變體EGFRvIII(15-17)。重要地，被mAb806識別的表位在無活性的野生型(wt)EGFR中是不可接近的，但在過表達EGFR和表達EGFRvIII的細胞中暴露于wtEGFR的過渡形式中(18)。表位研究受到免疫組織化學研究支持，后者證明806抗體結合存在于神經膠質瘤以及廣泛的上皮癌中的表位但不結合正常人組織(16,19)。這些和其他臨床前數據表明mAb806可能具有與西妥昔單抗和其他抗EGFR抗體不同的臨床活性譜和副作用特征譜。在異種移植模型中，mAb806已展示出有效的不靶向正常組織的抗腫瘤活性。因此，mAb806的獨特的靶向能力代表了癌癥特異性分子靶向療法的新范例。當過表達時或被突變激活時，酪氨酸激酶(包括EGFR)促成了癌癥的發(fā)生并且這些突變的酪氨酸激酶(TK)通常為選擇性和特異性癌癥療法提供了靶或敏感性。EGFR基因的酶氨酸激酶結構域中的體細胞突變與肺癌對包括吉非替尼和厄洛替尼的某些酪氨酸激酶抑制劑(TKI)的敏感性有關。外顯子19中的符合讀框的EGFR缺失(delL747-S752)和密碼子858(外顯子21)中的常見點突變(L858R)已在非小細胞肺癌和腺癌中得到鑒定，并且與對TKI吉非替尼和厄洛替尼的敏感性相關(LynchTJ等人(2004)NEnglJMed350:2129-2139;PaezJG等人(2004)Science304:1497-1500;PaoW等人(2004)PNAS101(36):13306-13311)。最近的研究已顯示10-30%的NSCLC患者具有EGFR激酶結構域突變，而5%的肺鱗狀細胞癌(SCC)患者具有細胞外結構域EGFRvIII突變(12,20)。測定癌癥對EGFR靶向治療的反應性的方法基于對EGFR中，特別是激酶結構域中的突變的估量，患者中預測的抑制劑敏感性描述于Bell等人(WO2005/094357和US20060147959)。由繼發(fā)抗藥性(secondaryresistance)或補償性突變(compensatorymutations)介導的、所獲得的對化學療法或靶向癌癥療法的抗性是正在面臨的挑戰(zhàn)。盡管使用TKI進行持續(xù)的治療，但對TKI(包括吉非替尼或厄洛替尼)敏感的腫瘤最終不斷地發(fā)展。已在復發(fā)性和抗性患者的腫瘤活檢組織中鑒定了EGFR的位點790上的次級突變(T790M)(KobayashiS等人(2005)NEnglJMed352(8):786-792)。預測該突變導致抑制劑在ATP-激酶-結合口袋中的結合的空間位阻?？紤]到在EGFR介導的疾病中獲得的對TKI的抗性的存在和盛行以及顯著的癌癥復發(fā)率，存在對更廣的有效的治療方案的臨床需要，所述治療方案使用EGFR靶向試劑，所述試劑有效地針對，靶向或避免在EGFR突變體和EGFR介導的疾病中獲得的抗性。本文中參考資料的引用不應當解釋為這是對于本發(fā)明的現有技術的承認。發(fā)明概述現已在許多EGFR介導的癌癥(包括肺癌)中鑒定了激活表皮生長因子受體(EGFR)的突變。已在人非小細胞肺癌(NSCLC)中鑒定了EGFR突變，5%的人肺鱗狀細胞癌具有EGFRvIII突變以及10-30%的肺腺癌具有EGFR激酶結構域突變。EGFR耙向性單克隆抗體mAb806識別野生型(wt)EGFR以及截短的EGFRvIII突變體的構象表位。為了進一步表征mAb806對EGFR介導的癌癥療法的應用，將mAb806用于治療經基因工程改造的、患4有肺腫瘤的小鼠，所述肺腫瘤由EGFRvIII或EGFR激酶結構域的突變驅動。本發(fā)明驗證了抗EGFRvIII抗體，特別是mAb806在阻斷EGFRvIII信號傳導和誘導腫瘤細胞凋亡，從而在EGFRvIII驅動的鼠類肺癌中導致顯著的腫瘤衰退中是非常有效的。針對表達高水平的野生型EGFR的細胞產生的不同的EGFR-靶向性抗體-西妥昔單抗未能在這些遺傳上確定的肺腫瘤中顯示活性。此外，使用mAb806進行的對由公認的和臨床相關的EGFR激酶結構域突變(L858R)驅動的鼠肺腫瘤的治療誘導了顯著的腫瘤衰退。已顯示該激酶結構域突變對TKI療法，特別是吉非替尼或厄洛替尼是敏感的。獲得的對TKI(包括吉非替尼或厄洛替尼)的抗性是正在面臨的挑戰(zhàn)，并且盡管進行持續(xù)的療法，但對TKI敏感的腫瘤最終繼續(xù)發(fā)展。該獲得的抗性可由繼發(fā)抗藥性或補償性突變，特別包括在EGFR的位點790上的次級突變(T790M)介導。研究者現在證明抗EGFR抗體，特別是mAb806有效地抗T790M突變，從而在EGFRT790M/L858R驅動的鼠肺癌中導致顯著的腫瘤衰退?？偟恼f來，這些數據證明抗EGFR抗體，特別是mAb806在具有EGFR激酶結構域突變的患者(包括癌癥患者，特別是肺癌患者)的治療中提供了有效的備選或輔助。本發(fā)明提供了在哺乳動物中治療酪氨酸激酶抑制劑抗性EGFR介導的疾病的方法，其中所述抗性EGFR介導的疾病是EGFR中次級突變從而產生突變的EGFR的結果并且其中所述突變與EGFRvIII突變不同，該方法包括對所述哺乳動物施用有效量的能夠結合并抑制突變的EGFR的抗EGFR抗體。在特定的方面，次級EGFR突變是EGFR酪氨酸激酶結構域突變。在另外的方面，酪氨酸激酶結構域突變是T790M。在所述方法的特定實施方案中，抗EGFR抗體是mAb806抗體或其活性片段。MAb806包括鼠抗體、重組抗體或人源化抗體。另外的抗EGFR抗體，包括靶向EGFRvIII突變體的那些抗體，可用于本發(fā)明的治療方法。示例性和已知的抗EGFR抗體可選自ABX-EGF(帕尼單抗)、DH8.3、L8A4和/或其活性片段。在所述方法中進行治療的EGFR介導的疾病包括癌癥。EGFR介導的癌癥包括成膠質細胞瘤、頭頸癌、胰腺癌、肺癌、神經系統(tǒng)的癌癥、胃腸癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、腎癌、視網膜癌、皮膚癌、肝癌、生殖-泌尿癌和膀胱癌。在特定的方面，EGFR介導的癌癥是肺腺癌、肺鱗狀細胞癌或非小細胞肺癌。本發(fā)明提供了用于在癌癥患者中降低EGFR介導的腫瘤生長的方法，其中所述癌癥患者之前已用一種或多種酪氨酸激酶抑制劑進行了治療并且已發(fā)生了復發(fā)性疾病和腫瘤生長，該方法包括對所述患者施用有效量的抗EGFR抗體以使復發(fā)性疾病和腫瘤生長被抑制和降低。在用于降低腫瘤生長的本方法的特定實施方案中，抗EGFR抗體是mAb806抗體或其活性片段。MAb806包括鼠抗體、重組抗體或人源化抗體?？墒褂昧硗獾目笶GFR抗體，包括靶向EGFRvIII突變體的那些抗體。示例性和已知的抗EGFR抗體可選自ABX-EGF(帕尼單抗)、DH8.3、L8A4和/或其活性片段。在特定的臨床方面，癌癥患者中的復發(fā)性疾病和腫瘤生長是次級EGFR突變的結果，所述次級EGFR突變是EGFR酪氨酸激酶結構域突變。特定的次級EGFR突變是酶氨酸激酶結構域突變T790M。本發(fā)明還提供了在哺乳動物中治療EGFR介導的癌癥的方法，該方法包括對所述5哺乳動物施用酪氨酸激酶抑制劑和抗EGFR抗體，其中在使用酪氨酸激酶抑制劑作為二線療法的治療后施用所述抗EGFR抗體來抑制抗酪氨酸激酶抑制劑的潛在的次級突變的EGFR。EGFR介導的癌癥可選成膠質細胞瘤、頭頸癌、胰腺癌、肺癌、神經系統(tǒng)的癌癥、胃腸癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、腎癌、視網膜癌、皮膚癌、肝癌、生殖-泌尿癌和膀胱癌。在特定的方面，癌癥是肺腺癌、肺鱗狀細胞癌或非小細胞肺癌。在本方法的一個方面，酶氨酸激酶抑制劑是可逆酪氨酸激酶抑制劑。可逆酪氨酸激酶抑制劑可以是苯胺喹唑啉化合物(aniliniquinazoline)和選自吉非替尼、厄洛替尼、AG1478、ST1571和SU_6668。在本方法的另外方面，酪氨酸激酶抑制劑是不可逆酪氨酸激酶抑制劑。示例性不可逆酪氨酸激酶抑制劑在本領域內是已知的并且包括但不限于EKB-569、EKI-569、HKI-272、HKI-357和BIBW2992。根據參考下列舉例說明的附圖的下列描述，其他目的和有利方面對于本領域技術人員將變得顯而易見。附圖概沭圖1描繪由EGFRvIII表達驅動的鼠肺癌腫瘤對mAb806和ch806抗體治療敏感但抗西妥昔單抗治療。通過每日一次I.P.注射O.5mg/劑的mAb806或ch806或lmg/劑的西妥昔單抗治療Tet-op-EGFRvIII/CCSP-rtTA，Ink4A/Arf-/_小鼠。在第一周的治療后，以相同的劑量每兩天給予抗體。在指定的時間點上進行系列MRI，顯示各治療組中代表性小鼠的相應切片。表示為平均值±標準差(SD)的條狀圖(Bardiagram)示例說明通過MRI測量的腫瘤衰退，并且使用學生氏精確t檢驗(Student'sexactttest)進行統(tǒng)計分析。在整個實驗過程中使所有小鼠持續(xù)飲食多西環(huán)素。H:標示心臟的區(qū)域。圖2A和2B描繪了使用mAb806治療的EGFRvIII驅動的小鼠中的肺腺癌的組織病理學特征。(A)通過EGFRvIII表達進行超過8周驅動的肺腺癌(上方的圖框)。在用mAb806治療l周后，腫瘤開始變小并且具有增加的纖維化(中間的圖框)。當在第5周結束mAb806治療時肺樣品總體上正常(下方的圖框)。箭頭顯示纖維化結節(jié)(fibroticnodule)，其由成纖維細胞和巨噬細胞組成。在該特定的纖維化區(qū)域中未發(fā)現腫瘤細胞。左圖框100X，在圖框800X。(B)可在對照小鼠和用mAb806治療1周的小鼠(分別為左上和左下圖框)中觀察到總EGFR的免疫組織學染色的相似模式和強度；當與未治療的腫瘤(右上圖框)相比時，在l周的治療后，腫瘤細胞的phospho-EGFR染色的強度減小(右下圖框)。代表性照片在200X放大率下拍攝。(C)TUNEL染色顯示當與未治療的腫瘤(左上圖框)相比時，在用mAb806治療1周后在EGFRvIII驅動的肺腫瘤(左下圖框)中凋亡的細胞核(紅色箭頭)增加。代表性照片在200X放大率下拍攝。表示為平均值士SD的條狀圖示例說明從至少200倍的高倍視野(HPF)中測定在1周的mAb806治療前和治療后肺腫瘤中的細胞凋亡指數。使用學生氏精確t檢驗(右圖框)進行統(tǒng)計分析。圖3顯示來自mAb806治療的Tet-op-EGFRvIII/CCSP-rtTA、Ink4A/Arf-/_小鼠的整個肺裂解物的Western印跡分析。分析來自在mAb806治療的不同時間點上從小鼠采集的腫瘤的完整肺裂解物。EGFR磷酸化的抑制可在治療的1周后就觀察到，然而總EGFR水平只在治療的5周后才減少。在mAb806施用的整個過程中，Erkl，2磷酸化被抗體抑制，但AKT磷酸化在兩個治療時間點上都保持在與未治療的對照相當的水平上，13肌動蛋白用作上樣對照。圖4A和4B。EGFR激酶結構域突變L858R驅動的小鼠肺腺癌對ch806治療有反應。(A)通過每日一次I.P注射O.5mg/劑的ch806來治療Tet-op-EGFRL858R-IRES-熒光素酶/CCSP-rtTA小鼠，進行4周。在治療的2和4周后，MRI顯示腫瘤體積減少。表示為平均值±SD的條狀圖示例說明通過MRI測量到的腫瘤衰退，使用學生氏精確t檢驗進行統(tǒng)計分析(右圖框)。H:標示心臟的區(qū)域。(B)組織病理學分析顯示，當與未治療對照(左邊的兩個圖框)相比較時，Tet-op-EGFRL858R-IRES-熒光素酶/CCSP-rtTA小鼠(右邊的兩個圖框)中腫瘤皺縮并且具有顯著的巨噬細胞浸潤。箭頭顯示殘留腫瘤的病灶。來自100X和800X放大率的照片如圖中的腳標所標示所示。圖5A和5B描繪了使用mAb806對比西妥昔單抗，對EGFRT790M-L858R肺腫瘤治療的結果。將持續(xù)多西環(huán)素飲食超過8周的小鼠進行MRI以記錄腫瘤負荷。每日一次通過I.P.注射O.5mg劑量，將mAb806遞送至具有肺腫瘤的小鼠，進行4周。每日一次通過I.P.注射lmg/劑對小鼠施用西妥昔單抗，進行4周。使用同窩出生小鼠(Littermate)作為所有治療研究的對照(未治療)。(A)在第0、2和4或5周用MRI對小鼠進行成像來測定腫瘤體積的減小。(B)在治療和MRI成像完成后，殺死小鼠以進行進一步的組織學和生物化學研究。發(fā)明詳沭根據本發(fā)明，可使用在本領域技術人員的能力之內的常規(guī)分子生物學、微生物學和重組DNA技術。此類技術在文獻中進行了詳盡的說明。參見，例如，Sambrook等人，〃MolecularCloning:ALaboratoryMaruml〃(1989);〃CurrentProtocolsinMolecularBiology〃第I—III巻[Ausubel，R.M.，ed.(1994)];〃CellBiology:ALaboratoryHandbook"第I-III巻[J.E.Celis，ed.(1994))];〃CurrentProtocolsinImmunology〃第I-III巻[Coligan，J.E.，ed.(1994)];〃OligonucleotideSynthesis〃(M.J.Gaited.1984);〃NucleicAcidHybridization〃[B.D.Hames&S.J.Higginseds.(1985)];〃TranscriptionAndTranslation〃[B.D.Hames&SJ.Higgins，eds.(1984)];〃AnimalCellCulture〃[R.I.Freshney，ed.(1986)];〃ImmobilizedCellsAndEnzymes"[IRLPress,(1986)];B.Perbal，〃APracticalGuideToMolecularCloning"(1984)。因此，如果在本文中出現，下列術語將具有下面所示的定義。術語"抗體"描述了無論是天然還是部分或完全合成產生的免疫球蛋白。抗體包括結合特定表位的任何免疫球蛋白，包括抗體和其片段。該術語包括多克隆、單克隆、重組、人源化以及嵌合抗體。該術語還涵蓋具有是抗體結合結構域的或與其同源的結合結構域的任何多肽或蛋白質。該術語也包括CDR移植抗體。由于抗體可通過許多方法進行修飾，因此，術語"抗體"應當解釋為涵蓋具有擁有需特異性的結合結構域的任何特定的結合成員或物質。因此，該術語涵蓋抗體的抗體片段、衍生物、功能等同物和同源物，其中包括包含免疫球蛋白結合結構域的任何多肽，無論是天然的還是完全或部分合成的多肽。因此包括包含融合至另一個多肽的免疫球蛋白結合結構域或等同物的免疫嵌合分子。嵌合抗體的克隆和表達描述于EP-A-0120694和EP-A-0125023以及美國專利4，816，397和4，816，567中。已顯示，完整抗體的片段可行使結合抗原的功能。結合片段的實例是(i)由VL、VH、CL和CHl結構域組成的Fab片段；(ii)由VH和CHI結構域組成的Fd片段；(iii)由單個抗體的VL和VH結構域組成的Fv片段；(iv)由VH結構域組成的dAb片段(Ward,E.S.等人.，Nature341，544-546(1989));(v)分離的CDR區(qū)域；(vi)F(ab')2片段，包含兩個連接的Fab片段的二價片段；(vii)單鏈Fv分子(scFv)，其中VH結構域和VL結構域通過肽連接體連接，所述肽連接體允許兩個結構域結合形成抗原結合部位(Bird等人，Science,242，423-426，1988;Huston等人，PNASUSA，85，5879-5883，1988);(viii)多價抗體片段(scFv二聚體、三聚體和/或四聚體(Power和Hudson,JI匪nol.Methods242:193-2049(2000));(ix)雙特異性單鏈Fv二聚體(PCT/US92/09965)和(x)"雙特異抗體(Diabody)"，通過基因融合構建的多價或多特異性片段(W094/13804;P.Holliger等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-6448，(1993))。"抗體結合部位"是由輕鏈或重鏈以及輕鏈可變區(qū)和高變區(qū)組成的抗體分子的結構部分，其特異性結合抗原。以其不同語法形式在本文中使用的短語"抗體分子"包括完整的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分。示例性抗體分子是完整的免疫球蛋白分子、大體上完整的免疫球蛋白分子和包含互補位(paratope)的免疫球蛋白分子的那些部分，其中包括本領域內稱為Fab、Fab'、F(ab'h和F(v)的那些部分，所述部分優(yōu)選用于本文中描述的治療方法?？贵w還可以是雙特異性的，其中抗體的一個結合結構域是本發(fā)明的特定結合成員，并且另一個結合結構域具有不同的特異性，例如招募效應子功能等。本發(fā)明的雙特異性抗體包括其中抗體的一個結合結構域是本發(fā)明的特定結合成員(以括其片段)，并且另一個結合結構域是不同的抗體或其片段，包括不同的抗EGFR抗體例如抗體528(美國專利4，943，533)、嵌合的和人源化的225抗體(美國專利4，943，533和WO/9640210)、抗de2-7抗體例如DH8.3(Hills，D.等人(1995)Int.J.Cancer63(4):537-543)、抗體L8A4和Y10(Reist，CJ等人(1995)CancerRes.55(19):4375-4382;FoulonCF等人.(2000)CancerRes.60(16):4453-4460)，ICR62(ModjtahediH等人(1993)CellBiophys.Jan-Jun;22(1-3):129-46;Modjtahedi等人(2002)P.A.A.C.R.55(14):3140-3148或Wikstrand等人的抗體(WikstrandC.等人(1995)CancerRes.55(14):3140-3148)的片段。另一個結合結構域可以是識別或靶向特定細胞類型的抗體，如在神經或膠質細胞特異性抗體中的。在本發(fā)明的雙特異性的抗體中，本發(fā)明的抗體的一個結合結構域可以與其他結合結構域或分子組合，所述其他結合結構域或分子識別特定細胞受體和/或以特定的方式例如作為免疫調節(jié)劑(例如，白細胞介素)、生長調節(jié)劑或細胞因子(例如腫瘤壞死因子(TNF)，特別地，2002年2月13日提交的U.S.S.N.60/355，838(以其全文通過引用合并入本文)中記載的TNF雙特異性形式(modality))或毒素(例如，蓖麻毒素)或抗有絲分裂或細胞凋亡試劑或因子來調控細胞?？贵w分子的Fab和F(ab')2部分可通過熟知的方法通過木瓜蛋白酶和胃蛋白酶分別對大體上完整的抗體分子進行蛋白水解反應來制備。參見例如，屬于Theofilopolous等人的美國專利4，342，566。Fab'抗體分子部分也是熟知的并且從F(ab')2部分產生，然后用巰基乙醇還原連接兩個重鏈部分的二硫鍵，然后用試劑例如碘乙酰胺來烷基化所得的蛋白質硫醇來產生。包含完整的抗體分子的抗體在本文中是優(yōu)選的。以其不同語法形式顯示的短語"單克隆抗體"是指只具有一種能夠與特定抗原發(fā)生免疫反應的抗體結合部位的抗體。因此單克隆抗體通常展示對于與其發(fā)生免疫反應的任何抗原的單一結合親和力。單克隆抗體還可以包含具有多個抗體結合部位的抗體分子，每一個抗體結合部位對于不同的抗原是免疫特異性的；例如，雙特異性(嵌合)的單克隆抗體。術語"抗原結合結構域"描述了包含特異性結合抗原的部分或全部和與抗原的部分或全部互補的區(qū)域的抗體的部分。當抗原很大時，抗體可以只結合抗原的特定部分，該部分稱為表位?？乖Y合結構域可由一個或多個抗體可變結構域提供。優(yōu)選，抗原結合結構域包含抗體輕鏈可變區(qū)(VL)和抗體重鏈可變區(qū)(VH)。術語"mAb806"、"806抗體"、"單克隆抗體806"、"ch806"、"人源化806"和未特別列出的任何變體可在本文中互換使用，并且如在整個本申請和權利要求中所使用。因此，同樣地包括抗體，其中包括重組的、嵌合的、經遺傳修飾的或備選的抗體。這些修飾可以是有意的，例如通過定點誘變獲得的修飾，或者可以是偶然的，例如通過在作為抗體或其片段的產生者的宿主中的突變獲得的修飾。同樣，術語"mAb806"、"806抗體"、"單克隆抗體806"、"ch806"、"人源化806"意欲將本文中明確引用的和本領域技術人員已知的、公共公開的蛋白質和免疫球蛋白以及所有大體上同源的類似物和等位基因變異包括在它們的范圍內。mAb806抗體，包括其產生、特定的活性、氨基酸和核酸序列、抗原結合結構域、可變區(qū)序列得到了公開并且對于本領域技術人員來說是已知的，包括WO02/092771;L麗orRB等人(2001)CancerRes61:5355-5361;MishimaK等人(2001)CancerRes61:5349-5354;JohnsTG等人(2002)IntJCancer98:398-408;JungbluthAA等人(2003)ProcNatlAcadSci100(2):639-644(其各自以其全文通過引用合并入本文)中所提供的。本文中描述的氨基酸殘基優(yōu)選以"L"同分異構形式存在。然而，可用以"D"同分異構形式存在的的殘基置換任何L氨基酸殘基，只要多肽保持期望的免疫球蛋白-結合的功能特性。朋2是指存在于多肽的氨基末端的游離氨基。COOH是指存在于多肽的羧基末端的游離羧基。與標準的多肽命名法，J.Biol.Chem.，243:3552-59(1969)一致，氨基酸殘基的縮寫示于下列對應表(tableofCorrespondence)中對應表符號氨某酸l-字母3-字母YTyr酪氨酸GGly甘氨酸FPhe苯丙氨酸MMet甲硫氨酸AAla丙氨酸SSer絲氨酸Ilie異亮氨酸Leu亮氨酸TThr蘇氨酸VVal纈氨酸PPro脯氨酸KLys賴氨酸HHis組氨酸QGin谷氨酰胺EGlu谷氨酸WTrp色氨酸RArg精氨酸DAsp天冬氨酸NAsn天冬酰胺CCys半胱氨酸應當指出，所有氨基酸殘基序列在本文中由其左至右的方向以氨基端至羧基端的常規(guī)方向排列的分子式(formulae)表示。此外，應當指出氨基酸殘基序列的起始或終止處的短劃線(dash)表示連接至一個或多個氨基酸殘基的另外序列的肽鍵。提供上表以使在本文中交替出現的三字母和一字母符號相對應。應當理解，也在用于本發(fā)明的方法的組合物的范圍內的是編碼和/或表達有效的抗EGFR抗體，特別包括mAb806和ch806的DNA序列，其編碼具有與公共公開的和本領域技術人員已知的mAb806抗體相同的氨基酸序列的抗EGFR抗體、其抗原結合結構域或其活性片段，但與已知的mAb806序列簡并。"與……簡并"是指不同的三字母密碼子用于確定特定的氨基酸。本領域內熟知的是，下列密碼子可互換用于編碼各特定的氨基酸苯丙氨酸(Phe或F)UUU或UUC亮氨酸(Leu或L)UUA或UUG或CUU或CUC或CUA或CUG異亮氨酸(Ile或I)AUU或AUC或AUA甲硫氨酸(Met或M)AUG纈氨酸(Val或V)GUU或GUC或GUA或GUG絲氨酸(Ser或S)UCU或UCC或UCA或UCG或AGU或AGC脯氨酸(Pro或P)CCU或CCC或CCA或CCG蘇氨酸(Thr或T)ACU或ACC或ACA或ACG丙氨酸(Ala或A)GCU或GCG或GCA或GCG酪氨酸(Tyr或Y)■或UAC組氨酸(His或H)CAU或CAC谷氨酰胺(Gin或Q)CAA或CAG天冬酰胺(Asn或N)AAU或AAC賴氨酸(Lys或K)AAA或AAG天冬氨酸(Asp或D)GAU或GAC谷氨酸(Glu或E)GAA或GAG半胱氨酸(Cys或C)UGU或UGC精氨酸(Arg或R)CGU或CGC或CGA或CGG或AGA或AGG甘氨酸(Gly或G)GGU或GGC或GGA或GGG色氨酸(Trp或W)UGG終止密碼子UAA(赭石)或UAG(琥珀)或UGA(蛋白石)應當理解，上面指定的密碼子是針對RNA序列的。DNA的相應密碼子用T替代U?？稍诳笶GFR抗體序列，包括在mAb806抗體序列中進行突變以使特定的密碼子改變成編碼不同氨基酸的密碼子。這樣的突變通常通過盡可能最少的核苷酸變化來產生?？梢砸苑潜Ｊ胤绞?即，通過將密碼子從屬于具有特定大小或特征的氨基酸類型的氨基酸變成屬于另一類型的氨基酸)或以保守方式(即，通過將密碼子從以屬于具有特定大小或特征的氨基酸類型的氨基酸變成屬于相同類型的氨基酸)進行該類置換突變來改變所得蛋白質中的氨基酸。這樣的保守變化通常導致所得蛋白質的結構和功能的更少的變化。非保守變化更可能改變所得蛋白質的結構、活性或功能。應當認為本發(fā)明包括包含不顯著改變所得免疫球蛋白和抗體的活性或結合特征的保守變化的序列。類似地，預期某些EGFR突變(其可以甚至顯著地影響或改變EGFR的活性)，例如本文中描述和利用的EGFR激酶結構域突變，可以不影響抗EGFR抗體(特別地包括抗EGFRvIII突變抗體，特別地包括mAb806抗體)對EGFR的識別、結合或抑制。因此，預期mAb806可相似地有效抗其他迄今未被識別的或迄今未知的EGFR突變，特別地在抗癌療法中產生的次級突變。這些突變可作為TKI抑制療法的結果或作為抗性EGFR介導的疾病的其他療法的結果產生，所述療法可靶向EGFR的激酶或其他活性。氨基酸可分類為相似的或不同、保守的或非保守的。氨基酸的分類可基于它們的R基團(例如非極性、不帶電荷的極性、帶電荷的極性、具有苯基的氨基酸)、基于它們的分子量或它們R基的大小、以及基于分子量。特別優(yōu)選置換是Lys對Arg的置換以及反之亦然，這樣正電荷可得到保持；Glu對Asp的置換以及反之亦然，這樣負電荷可得到保持；Ser對Thr的置換，這樣游離-OH可得到保持；以及Gin對Asn的置換，這樣游離NH2可得到保持。還可導入氨基酸置換以置換具有特別優(yōu)選的性質的氨基酸。例如，可將Cys導入用于與另一個Cys形成二硫鍵的潛在位置?？蓪際is作為獨特的"催化"位點(即，His可作為酸或堿起作用并且是生物化學催化中最常見的氨基酸)。由于其特殊的平面結構(該結構在蛋白質的結構中誘導13轉角)，可導入Pro。當至少大約70%的氨基酸殘基(優(yōu)選至少大約80%，和最優(yōu)選至少大約90或95%)是相同的或代表保守置換時，兩個氨基酸序列是"大體上同源的"。短語"藥學上可接受的"是指當對人施用時，為生理上可耐受的和通常不產生過敏的或相似的不利反應例如心嘈(gastricupset)、眩暈等的分子實體和組合物。短語"治療有效量"在本文中用于指這樣的量，該量足以預防和優(yōu)選減少靶細胞團塊的S期活性的臨床顯著變化或靶細胞團塊或腫瘤的大小或尺寸的顯著變化或可伴隨其存在和活性的其他病理學特征的顯著變化的至少大約20%、更優(yōu)選至少30%、更優(yōu)選至少50%、更優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少90%?？贵w或活性片段可配制成經中和的藥學上可接受的鹽形式的治療性組合物。藥學上可接受的鹽包括與無機酸例如鹽酸或磷酸或者與有機酸例如醋酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的酸加成鹽(與多肽或抗體分子的游離氨基形成的)。從游離羧基形成的鹽還可來源于無機堿例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鋁、氫氧化鈣或氫氧化鐵和有機堿例如異丙胺、三甲胺、2_乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因(procaine)等。常規(guī)地靜脈內例如通過單位劑量的注射施用包含治療性抗體或活性片段的組合物。術語"單位劑量"，當涉及本發(fā)明的治療性組合物使用時，是指適合作為用于人的單一劑量的物理上分開的單位，每一個單位包含經計算產生期望的治療效果的與所需的稀釋劑(即載體或媒介物)結合的預先確定量的活性物質。以與劑型相兼容的方式和治療有效量施用組合物。待施用的量取決于待治療的受試者、受試者的免疫系統(tǒng)利用活性成份的能力和期望的抑制程度或被靶向的腫瘤塊的大小。需要施用的活性成份的精確量取決于醫(yī)生的判斷并且對于每一個體是特有的。然而，合適的劑量可在大約0.1至20，優(yōu)選大約0.5至大約10，以及更優(yōu)選1至數毫克的活性成份/千克個體體重/天的范圍內，并且取決于施用的途徑。用于最初施用和加強注射的合適方案也是可變的，但通常在初始施用后，通過隨后的注射或其他施用途徑以1小時或數小時的間隔重復給藥。備選地，包括使用足以在血液中保持10納摩爾至10微摩爾的濃度的連續(xù)靜脈內輸注。如本文中所使用的，"pg"表示皮克，"ng"表示納克，"ug"或"iig"表示微克，"mg"表示毫克，"ul"或"iil"表示微升，"ml"表示毫升，"l"表示升。為了進一步表征mAb806在EGFR介導的癌癥療法中的應用，本發(fā)明描述了mAb806用于治療經基因工程改造的、具有由EGFRvIII或EGFR激酶結構域突變驅動的肺腫瘤的小鼠的用途。這些突變中的每一個突變對于EGFR介導的疾病，特別是癌癥(包括肺癌、胰腺癌、結腸直腸癌、頭頸癌和成膠質細胞瘤)是臨床相關的和重要的(significant)。本發(fā)明驗證了抗EGFRvIII抗體，特別是mAb806在阻斷EGFRvI11信號傳導和誘導腫瘤細胞凋亡，從而在EGFRvIII驅動的鼠肺癌中導致顯著的腫瘤衰退中是非常有效的。針對表達高水平的野生型EGFR的細胞產生的獨特的靶向EGFR的抗體——西妥昔單抗在這些經遺傳確定的肺腫瘤中不能顯示活性。此外，使用mAb806對由公認的和臨床相關的EGFR激酶結構域突變(L858R)驅動的鼠肺腫瘤的治療誘導了顯著的腫瘤衰退。已顯示該激酶結構域突變對TKI療法，特別是吉非替尼或厄洛替尼敏感。獲得的對TKI包括吉非替尼或厄洛替尼的抗性是正在面臨的挑戰(zhàn)，盡管繼續(xù)治療，但對TKI敏感的腫瘤最終繼續(xù)發(fā)展。該獲得的抗性可通過繼發(fā)抗性或補償性突變，特別是在EGFR的位點790上的次級突變(T790M)介導。研究者現在顯示抗EGFR抗體，特別是mAb806有效地抗T790M突變，從而在EGFRT790M/L858R驅動的鼠肺癌中導致顯著的腫瘤衰退?？偟膩碚f，這些數據證明抗EGFR抗體，特別是mAb806在具有EGFR激酶結構域突變的患者，包括癌癥患者，特別是肺癌患者的治療中提供了有效的備選或輔助。因此，通過證明抗EGFR抗體，特別是mAb806的抗腫瘤活性提供和產生了治療性和診斷性應用以及方法。如在本文中最初建議的和進一步詳細闡述的，本發(fā)明包括其中牽涉EGFR的級聯反應和信號傳導的藥物干預，從而調節(jié)與EGFR突變包括激酶結構域突變(原發(fā)性和次級抗性突變)相關的致瘤能力。本文中提供的數據證明mkb806抗EGFR激酶結構域突變包括L858R和抗TKI的T790M的活性。預期另外的激酶結構域突變或EGFR次級突變可存在或隨著持續(xù)的和推進的導向抗EGFR治療而產生。在半胱氨酸T797(對應于EGFRvIII缺失突變體中的半胱氨12酸530)上結合EGFR的不可逆抑制劑HKI272在臨床前方案中推行。如果不是預期的，那么在半胱氨酸上具有置換的抗性次級突變也是可能的。這些額外的EGFR二次突變體將是抗EGFR抗體療法的候選物。因此，本發(fā)明提供了在療哺乳動物中治療酪氨酸激酶抑制劑抗性EGFR介導的疾病的方法，其中所述抗性EGFR介導的疾病是EGFR中次級突變從而產生突變的EGFR的結果，并且其中所述突變與EGFRvIII突變不同，所述方法包括對所述哺乳動物施用有效量的能夠結合并抑制突變的EGFR的抗EGFR抗體。在特定的方面，次級EGFR突變是EGFR酪氨酸激酶結構域突變。在另外的方面，酪氨酸激酶結構域突變是T790M。在所述方法的特定實施方案中，抗EGFR抗體是mAb806抗體或其活性片段。MAb806包括鼠抗體、重組抗體或人源化抗體。另外的抗EGFR抗體，包括靶向EGFRvIII突變體的抗體，可用于本發(fā)明的治療方法。示例性和已知的抗EGFR抗體可選自ABX-EGF(帕尼單抗)、DH8.3、L8A4和其活性片段。用以治療的EGFR介導的疾病特別地是癌癥并且可選自成膠質細胞瘤、頭頸癌、胰腺癌、肺癌、神經系統(tǒng)的癌癥、胃腸癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、腎癌、視網膜癌、皮膚癌、肝癌、生殖_泌尿癌和膀胱癌。在特定的方面，EGFR介導的癌癥是肺腺癌、肺鱗狀細胞癌或非小細胞肺癌。本發(fā)明包括用于在癌癥患者中降低EGFR介導的腫瘤生長的方法，其中所述癌癥患者之前已用一種或多種酪氨酸激酶抑制劑進行治療并且已發(fā)生了復發(fā)性疾病和腫瘤生長，該方法包括對所述患者施用有效量的抗EGFR抗體以使復發(fā)性疾病和腫瘤生長被抑制和降低。在用于降低腫瘤生長的本方法的特定實施方案中，抗EGFR抗體是mAb806抗體或其活性片段。MAb806包括鼠抗體、重組抗體或人源化抗體?？墒褂昧硗獾目笶GFR抗體，其中包括靶向EGFRvIII突變體的那些抗體。示例性和已知的抗EGFR抗體可選自ABX-EGF(帕尼單抗)、DH8.3、L8A4和/或其活性片段。在特定的臨床方面，癌癥患者中的復發(fā)性疾病和腫瘤生長是次級EGFR突變的結果，所述次級EGFR突變是EGFR酪氨酸激酶結構域突變。特定的次級EGFR突變是酪氨酸激酶結構域突變T790M。本發(fā)明還提供了在哺乳動物中治療EGFR介導的癌癥的方法，該方法包括對所述哺乳動物施用酪氨酸激酶抑制劑和抗EGFR抗體。在一個方面，同時施用酪氨酸激酶抑制劑和抗EGFR抗體。在一個方面，在常規(guī)化學療法之前或之后，同時或順次地和反復地施用酪氨酸激酶抑制劑和抗EGFR抗體。本發(fā)明還提供了在哺乳動物中治療EGFR介導的癌癥的方法，該方法包括對所述哺乳動物施用酪氨酸激酶抑制劑和抗EGFR抗體，其中在使用酪氨酸激酶抑制劑作為二線療法的治療后施用所述抗EGFR抗體來抑制抗酪氨酸激酶抑制劑的潛在的次級突變的EGFR。酶氨酸激酶抑制劑可以是可逆酪氨酸激酶抑制劑或不可逆酪氨酸激酶抑制劑?？梢种评野彼峒っ敢种苿┛梢允潜桨粪蜻衔锖瓦x自吉非替尼、厄洛替尼、AG1478、ST1571和SU-6668。示例性不可逆酪氨酸激酶抑制劑在本領域內是已知的并且包括但不限于EKB-569、EKI-569、HKI-272、HKI-357和BIBW2992(KwakEL等人(2005)ProcNatlAcadSciUSA102(21):7665-70)。EGFR介導的癌癥可選自成膠質細胞瘤、頭頸癌、胰腺癌、肺癌、神經系統(tǒng)的癌癥、胃腸癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、腎癌、視網膜癌、皮膚癌、肝癌、生殖-泌尿癌和膀胱癌。特別地，癌癥是肺腺癌、肺鱗狀細胞癌或非小細胞肺癌?？稍谒龇椒ㄖ袉为毜鼗蚺c其他抗EGFR抗體組合施用抗EGFR抗體，特別是mAb806。因此，可連續(xù)地或與西妥昔單抗組合施用Mab806。還可連續(xù)地或與其他抗EGFRvIII抗體包括ABX-EGF(帕尼單抗)、DH8.3、L8A4和/或其活性片段組合施用mAb806?？蓪⒖笶GFR抗體與適當的載體一起并且以對于通過不同方法對患者施用是有效的強度制備于藥物組合物中?？墒褂枚喾N施用技術，其中有胃腸外技術例如皮下、靜脈內和腹膜內注射、導管插入術(catheterization)等?？贵w或它們的活性片段的量可以變化并且特別地應當基于有資格的醫(yī)生或獸醫(yī)的推薦和處方，其中包括基于對本文中提供的結果和數據的考慮。用于本發(fā)明的抗EGFR抗體包括mAb806可提供有用的診斷應用，其中包括成像應用或診斷性活組織檢查應用，以用于診斷和/或監(jiān)控癌癥患者(包括在TKI治療后或TKI治療一有結論后)。通常用于此類研究的標記物是放射性元素、酶、當暴露于紫外光時發(fā)熒光的化學藥品和其他物質。許多熒光材料是已知的并且可用作標記物。這些標記物包括例如，熒光素、羅丹明、金胺、德克薩斯紅、AMCA藍和熒光黃?？捎每蓹z測的或功能性的標記物標記本發(fā)明的抗體?？蓹z測的標記物包括但不限于放射性標記物例如同位素3H4C、32p、35S、36Cl,Cr、57C0、58C0、59Fe，Y、1211、1241、1251、1311、mIn、211At、198AU、67CU、225AC、213Bi、99TC和186Re，可使用抗體成像領域內已知的常規(guī)化學作用將其連接至本發(fā)明的抗體。標記物還包括熒光標記物和在本領域中常規(guī)用于MRI-CT成像的標記物。它們還包括酶標記物，例如辣根過氧化物酶。標記物還包括化學部分例如生物素，其可通過結合至特定的關聯(cognate)可檢測部分例如經標記的抗生物素蛋白而被檢功能性標記物包括經設計用來被靶向腫瘤的位點以引起破壞腫瘤組織的物質。此類功能性標記物包括細胞毒性藥物例如5-氟尿嘧啶或蓖麻毒素，以及酶例如細菌羧肽酶或硝基還原酶，其能夠在腫瘤的位點將前體藥物轉化成活性藥物。放射性標記的抗EGFR抗體和其片段用于體外診斷技術和用于體內放射成像(radioimaging)技術和用于放射免疫療法。在體內成像的情況下，可將本發(fā)明的特定結合成員綴合至顯像劑(imagingagent)而非放射性同位素，所述顯像劑包括磁共振成像增強劑(magneticresonanceimageenhancingagent)，其中例如通過螯合基用大量的順磁離子裝載抗體分子。螯合基的實例包括EDTA、嚇啉、多胺冠醚(polyaminescrownether)和聚肟(polyoxime)。順磁離子的實例包括釓、鐵、錳、錸、銪、鑭、鈥和ferbium。在本發(fā)明的另外方面中，放射性標記的特定結合成員，特別是抗體和其片段，特別是放射免疫綴合物(radioimmunoconjugate)用于放射免疫療法，特別是作為放射性標記的抗體用于癌癥治療。在另外的方面，放射性標記的特定結合成員，特別是抗體和其片段用于放射免疫導向手術技術(radioimmuno-guidedsurgerytechnique)，其中它們可在除去癌細胞、癌前細胞、腫瘤細胞、腫瘤細胞和過度增殖(hyperproliferative)細胞的手術之前、期間或之后鑒定和指示這樣的細胞的存在和/或定位。本發(fā)明的免疫綴合物或抗體融合蛋白(其中本發(fā)明的特定結合成員，特別是抗體和其片段綴合至或連接至其他分子或試劑)還包括但不限于綴合至化學消融劑(chemicalablationagent)、毒素、免疫調節(jié)劑、細胞因子、細胞毒素劑、化學治療劑或藥物的結合成員。放射免疫療法(RAIT)已進入臨床并且通過使用各種抗體免疫綴合物證明了其功效。已在結腸直腸癌中評估了mI標記的人源化抗癌胚抗原(抗CEA)抗體h麗-14(BehrTM等人(2002)Cancer94(4Su卯l):1373-81)，和已在甲狀腺髓樣癌中評估了用9°Y標記的相同抗體(SteinR等人(2002)Cancer94(1):51-61)。關于何杰金氏淋巴瘤和胰腺癌，也已評估和報導了使用單克隆抗體的放射免疫療法(Goldenberg匿(2001)CritRevOncolHematol39(1-2):195-201;GoldDV等人(2001)CritRevOncolHematol39(1-2)147-54)。使用特定抗體的放射免疫療法也描述于美國專利6，306，393和6，331，175中。放射免疫導向手術(RIGS)也已進入臨床并且證明了功效和有用性，其中包括使用抗CEA抗體和定向針對與腫瘤相關的抗原的抗體(KimJC等人(2002)IntJCancer97(4):542-7;SchneebaumS等人(2001)WorldJSurg25(12):1495-8;AvitalS等人(2000)Cancer89(8):1692-8;McIntoshDG等人(1997)CancerBiotherRadiopharm12(4):287-94)?？赏ㄟ^任何適當的途徑，通常通過注射入血流或CSF或直接注射入腫瘤的位點來對需要治療的患者施用本發(fā)明的抗體。精確的劑量將取決于許多因素，包括抗體是用于診斷的還是用于治療的，腫瘤的大小和位置、抗體的精確性質(是完整抗體、片段或者雙特異抗體等)以及連接至抗體的可檢測的或功能性的標記物的性質。當放射性核素用于治療時，適當的最大單一劑量是大約45mCi/m2至最大大約250mCi/m2。優(yōu)選劑量在15至40mCi的范圍內，更優(yōu)選的劑量范圍為20至30mCi或10至30mCi。這樣的治療可能需要骨髓或干細胞置換。用于腫瘤成像或腫瘤治療的常用抗體劑量可在0.5至40mg，優(yōu)選1至4mg的F(ab')2形式的抗體的范圍內。優(yōu)選以20至1000mg蛋白質/齊U，或20至500mg蛋白質/齊U，或20至100mg蛋白質/劑的劑量施用裸抗體。這是用于成年患者的單次治療的劑量，其可按比例調整用于兒童和嬰兒，還可按分子量比例調整用于其他抗體形式?？稍卺t(yī)生的指導下以每日一次，每周兩次、每周一次或每月一次的間隔重復治療。通過參考下列作為本發(fā)明的示例提供的非限定性實施例可更好地理解本發(fā)明。下列實施例提供用來更詳盡地舉例說明本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，然而絕不應當解釋為限定本發(fā)明的寬廣的范圍。實施例1治療件抗EGFR抗體806在具有新牛EGFR突變體依賴件肺癌的鼠中產牛反應。激活性表皮生長因子受體(EGFR)突變發(fā)生在人非小細胞肺癌(NSCLC)中，5%的人肺鱗狀細胞癌具有EGFRvIII突變，10-30X的肺腺癌具有EGFR激酶結構域突變。靶向EGFR的單克隆抗體mAb806識別野生型(wt)EGFR以及截短的EGFRvIII突變體的構象表位。為了進一步探測該抗體對于EGFR靶向的癌癥療法的抗癌譜，將mAb806用于治療經基因工程改造的、具有由EGFRvIII或EGFR激酶結構域突變驅動的肺腫瘤的小鼠。我們的結果證明mAb806在阻斷EGFRvIII信號傳導和誘導腫瘤細胞凋亡，從而在EGFRvIII驅動的鼠肺癌中導致顯著的腫瘤衰退中是非常有效的。另一種靶向EGFR的抗體西妥昔單抗在這些經遺傳確定的肺腫瘤中不能顯示活性。此外，使用mAb806進行的對由EGFR激酶結構域突變驅動的鼠肺腫瘤的治療誘導了顯著的腫瘤衰退，雖然達到比在EGFRvIII驅動的腫瘤中觀察到的程度更低的程度。總的來說，這些數據支持假說，即mAb806可在具有這兩類EGFR突變的NSCLC患者的群體的治療中提供顯著的活性。引言靶向癌癥療法經設計用來破壞致癌作用和腫瘤生長所需的特定分子的功能，從而殺死或阻止癌細胞的生長(1)。與常規(guī)化學毒性化學療法相反，此類靶向癌癥療法可以更有效并且對正常細胞的傷害更小。靶向癌癥療法領域的主要努力一直以來是開發(fā)靶向表皮生長因子受體(EGFR)的試劑。EGFR是密切相關的受體(包括的EGFR(ErbB-l)、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)和Her4(ErbB-4))的ErbB家族的成員。EGFR的激活導致受體酪氨酸激酶的激活和一系列下游信號傳導事件(所述述信號傳導事件介導細胞增殖、運動、粘著、侵入和對化學療法的抗性以及對細胞凋亡的抑制(2-4))、對于癌細胞的持續(xù)增殖和存活是至關重要的過程。迄今為止，兩個主要類型的抗EGFR試劑已進入臨床環(huán)境抗EGFR抗體和小分子EGFR酪氨酸激酶抑制劑(TKI)(5，6)?？笶GFR抗體例如西妥昔單抗經設計用來結合EGFR的細胞外結構域并且阻斷EGFR下游信號傳導的激活(7)。相反，小分子TKI例如吉非替尼或厄洛替尼與ATP競爭對EGFR酪氨酸激酶的細胞外催化結構域的結合，從而阻止EGFR的自磷酸化作用和下游信號轉導(4)。這兩種抗EGFR藥物類型都已在患有多種不同類型癌癥的患者的亞群中顯示一些臨床功效。在患有具有EGFR激酶結構域突變的肺癌的患者中使用吉非替尼或厄洛替尼進行的治療通常產生顯著的臨床反應(5，8)。然而，吉非替尼或厄洛替尼在具有野生型EGFR的肺腺癌或其他組織學亞型例如鱗狀細胞癌中的功效是有限的(9，10)。此外，在臨床前和臨床試驗中已顯示吉非替尼或厄洛替尼在抑制EGFRvIII突變體(11)(其中存在外顯子II至VII的符合讀框的缺失的不同的激活性EGFR突變)的功能中是基本無效的。EGFRvIII通常見于成膠質細胞瘤，最近發(fā)現存在于人肺鱗狀細胞癌的亞型(12)和大部分頭頸癌(13)中。顯示西妥昔單抗在非小細胞肺癌(NSCLC)患者和患有頭頸癌的患者以及結腸直腸癌患者的小亞群中是有效的。然而，對西妥昔單抗的反應似乎與EGFR的表達水平無關。因此，不清楚這些患者對西妥昔單抗治療有反應然而其腫瘤具有高EGFR表達的其他癌癥患者對西妥昔單抗治療不顯療效的原因(14)。MAb806是新型鼠類抗體，最初產生用來識別獨特的截短突變體EGFRvI11(15-17)。重要地，被mAb806識別的表位在無活性的野生型(wt)EGFR中是不可接近的，但在過表達EGFR和表達EGFRvIII的細胞中暴露于于wtEGFR的過渡形式中(18)。表位研究受到免疫組織化學研究的支持，后者證明806抗體結合存在于神經膠質瘤以及廣泛的上皮癌中的表位但不結合正常人組織(16，19)。這些和其他臨床前數據表明mAb806可能具有與西妥昔單抗和其他抗EGFR抗體不同的臨床活性譜和副作用特征譜。在異種移植模型中，mAb806已展示有效的不靶向正常組織的抗腫瘤活性。因此，mAb806的獨特的靶向能力代表了癌癥特異性分子靶向療法的新范例。最近的研究已顯示10_30%的NSCLC患者具有EGFR激酶結構域突變，而5%的肺鱗狀細胞癌(SCC)患者具有細胞外結構域EGFRvIII突變(12,20)。為了研究mAb806在具16有EGFR突變的NSCLC患者的癌癥特異性靶向治療中的臨床潛能，我們使用兩個已建立的依賴于EGFRvIII或EGFR激酶結構域突變體的小鼠肺癌模型。我們的數據顯示mAb806在由EGFRvI11或EGFR激酶結構域突變的表達驅動的鼠NSCLC的治療中十分有效，并且表明該抗體可能在其腫瘤具有相似突變的患者中具有臨床活性。結果使用mAb806而非西妥昔單抗的治療在具有擁有EGFRvIII突變的肺腫瘤的小鼠中誘導腫瘤衰退。之前的研究已確定了EGFRvIII突變在由突變驅動的鼠肺腫瘤的維持中的重要作用。阻斷EGFRvIII的激活導致在新生鼠肺癌模型中與細胞凋亡相關的顯著的腫瘤衰退(12)。Tet-op-EGFRvIII/CCSP-rtTA、Ink4A/Arf-/-小鼠在施用8至10周的多西環(huán)素后產生具有細支氣管肺泡癌(BAC)特征的肺腺癌，(圖l，左圖框；圖2A，上方的圖框)。在通過MRI鑒定具有腫瘤的小鼠后，通過在第一周中每日一次，其后的4周中每2天一次進行腹膜內(I.P.)注射給予0.5mg/劑量的mAb806。在治療的1、3和5周結束時進行系列MRI來測定腫瘤體積和/或密度的變化。在mAb806治療1周后通過MRI觀察到腫瘤的減小是顯著的(在6只小鼠中60%±5%的平均減小，圖l，上方的圖框)。在治療3周后腫瘤負荷持續(xù)減小(95%±8%的平均減小)，并且所有6只小鼠在治療5周后具有完全的腫瘤衰退。相反地，使用西妥昔單抗進行的小鼠治療甚至在使用相同的給藥方案以每小鼠lmg進行5周的治療后，不能在4只Tet-op-EGFRvIII/CCSP-rtTA、Ink4A/Arf-/_小鼠中誘導腫瘤衰退。我們還觀察到用西妥昔單抗治療的小鼠日益變得虛弱并且一些小鼠由于在治療期間嚴重的腫瘤負荷而甚至死亡(數據未顯示)。來自這些小鼠的肺的病理檢查與MRI發(fā)現在使用mAb806治療1周后，在腺癌中存在腫瘤細胞構成的減少(圖2A，中間的圖框)相關。在5周后，肺具有局灶性纖維化和瘢痕化，具有零星的單核細胞浸潤；可能代表從退縮的腫瘤持續(xù)重塑的區(qū)域(圖2A，下方的圖框)。雖然在這些纖維化結節(jié)的幾個病灶中仍可罕見地觀察到活的癌細胞，但大部分纖維化和瘢痕化區(qū)域不包含任何腫瘤細胞。相反地，來自用西妥昔單抗治療的小鼠的腫瘤，當與未治療的腫瘤相比較時，似乎未受影響，無可見的組織學差異(數據未顯示)。因此，使用mAb806抗體的治療在EGFRvIII驅動的小鼠肺癌模型中導致快速和顯著的腫瘤衰退，而西妥昔單抗治療基本上是無效的。MAb806抑制EGFRvIII磷酸化并且在Tet-op-EGFRvIII/CCSP-rtTA、Ink4A/Arf-/_小鼠中誘導腫瘤細胞的細胞凋亡。為了確定腹膜內施用的mAb806是否在肺腫瘤中識別其靶，我們使用抗總EGFR和phospho-EGFR的抗體在用或不用mAb806治療的小鼠的肺腫瘤中進行免疫組織化學染色。如所預期的，mAb806治療對腫瘤細胞中總EGFRvIII的表達沒有影響(圖2B)。然而，在mAb806治療1周后，phospho-EGFRvIII的表達減少(圖2B)。然后，我們通過使用在使用mAb806的治療期間在不同時間點上收集的肺裂解物進行的免疫印跡分析來驗證這些發(fā)現。在mAb806治療l周后，phospho-EGFRvIII的水平顯著降低，然而總EGFRvIII水平與未治療的對照的總EGFRvIII水平保持相似(圖3)，這表明mAb806對EGFRvIII磷酸化的強抑制作用。有趣地，總EGFRvIII水平在mAb806施用5周后最終確實減少。該現象的一個解釋可以是有活力的腫瘤細胞的數目的顯著減少。與該解釋相符的是，在mAb806治療1周后，與未治療的腫瘤相比，在肺腫瘤中觀察到大大增加的TUNEL染色(圖2C)。除了phospho-EGFR水平的改變以外，1周的mAb806治療還減少phospho-Akt和phospho-Erkl，2的表達，這些EGFR下游信號傳導分子在功能上與抗細胞凋亡和增殖通路相關。令人驚訝的是，當與l周的治療相比較時，在mAb806治療5周后我們觀察到微弱的但可重現的phopho-Akt水平的增加。Akt的該磷酸化不可能由EGFRvIII啟動，因為phospho-EGFRvIII在該時間點上非常低。很可能，Akt可通過參與肺重塑過程的其他信號傳導事件來激活。這些數據表明mAb806通過阻止EGFR的激活和增加腫瘤細胞的細胞凋亡來在EGFRvIII小鼠中誘導腫瘤的退縮。Ch806治療在具有EGFRvIII突變的鼠肺腫瘤中導致顯著的腫瘤衰退。Ch806是mAb806的人源化形式(22)。為了確定人源化抗體在肺腺癌的體內治療中是否與鼠mAb806—樣有效，我們在第一周中每日一次進行通過I.P.注射一個劑量的0.5mg的ch806，然后在另外7周每兩天一次施用一個劑量，來治療荷瘤Tet-op-EGFRvIII/CCSP-rtTA、Ink4A/Arf-/_小鼠。這些小鼠在治療的第1.5、5和8周經歷再成像，然后殺死小鼠以用于組織學分析。我們通過從治療的1.5周開始的MRI掃描觀察到腫瘤體積的顯著減小(43%±3%)，在4只用ch806治療的小鼠的每一只中在治療8周時獲得幾乎完全的腫瘤衰退(83%±7%)(圖1，下方的圖框)。用ch806治療的小鼠的組織學(數據未顯示)與mAb806治療后的腫瘤的組織學相似并且與MRI數據相符。Ch806在具有EGFRL858R突變的鼠肺腫瘤的治療中是有效的為了闡明ch806是否有效地抗EGFR激酶結構域突變驅動的肺癌，使用EGFRL858R-IRES-熒光素酶/CCSP-rtTA小鼠。每天一次以0.5mg/小鼠施用Ch806，進行4周，在治療的1、2和4周結束時對所有治療的小鼠進行系列MRI掃描。在ch806治療2周后觀察到腫瘤的退縮(21%±2%)，在ch806治療4周時腫瘤的退縮為41X±2%(圖4A)。通過顯微鏡觀察，ch806治療的小鼠的肺顯示巨噬細胞，特別地在圍繞剩下的有活力的腫瘤的區(qū)域中的巨噬細胞的彌散性細胞浸潤增加。此外，巨噬細胞存在于腫瘤的多個區(qū)域，這表明巨噬細胞介導的細胞毒性可能是抗體誘導的腫瘤衰退(圖4B)的背后機制中的一個機制。還應當指出，由于不斷增加的與腫瘤細胞相關的巨噬細胞的積累而引起的肺內實變(consolidation)的存在可高估通過MR成像測量的腫瘤體積。討論EGFR突變和激活事件在人惡性腫瘤包括NSCLC中是常見的。EGFR信號傳導的激活可通過受體過表達而發(fā)生以及通過由于EGFR的功能獲得突變形式引起的組成型信號傳導而發(fā)生。大約10-30%的NSCLC患者在它們的肺腫瘤中具有EGFR激酶結構域突變，大約5%的患者具有鱗狀細胞肺癌的患者具有特定的EGFRvIII細胞外結構域突變(12,20)。此處，我們顯示mAb806和其人源化形式ch806在治療具有兩種類型的EGFR突變的鼠肺癌中是有效的。觀察到的顯著的腫瘤衰退與EGFRvIII信號傳導的阻斷和隨后增加的細胞凋亡相關。在具有擁有EGFR激酶結構域突變的肺腫瘤的小鼠中，對ch806的反應沒有報導的對厄洛替尼和cetuximab的反應那么明顯，盡管它們在放射攝影和組織學上(21，23)確實具有客觀的反應(objectiveresponse)(41%±2%)。相反地，在用mAb806治療后，在具有EGFRvIII驅動的肺腫瘤的小鼠中獲得幾乎完全的腫瘤衰退，然而西妥昔單抗無效。該后一結果可能不令人驚訝，因為西妥昔單抗經設計用來干擾配體和EGFR細胞外結構域之間的相互作用(24)。已確定，EGFRvIII突變導致構象變化并且展示不依賴于配體剌激的組成型激酶活性，這促成了腫瘤形成(25)。雖然西妥昔單抗已被FDA批準用于癌癥患者，但不存在用以預測使用該抗體的治療在個體患者中的功效的明確的生物標記，因為應答率和總存活與通過免疫組織化學測量的EGFR蛋白的表達不相關(14)。雖然小分子TKI在具有EGFR激酶結構域突變的許多NSCLC患者的治療中是有效的，但所有患者最終產生與次級突變T790M相關的抗性(10,26)。相一致地，體外研究已顯示具有T790M突變的腫瘤細胞使用厄洛替尼的治療具有抗性(27，28)。來自具有次級T790M突變的EGFR激酶結構域的晶體結構的證據表明T790M突變對受體功能的影響應當很小。T790M突變可能干擾厄洛替尼與ATP酶口袋的結合(27)。然而，T790M突變體的細胞外結構域潛在地提供了基于抗體的癌癥治療(包括西妥昔單抗和mAb806)的良好的靶。這可意味著抗小TKI治療的具有次級T790M點突變的NSCLC腫瘤可能對mAb806治療有反應。為了測試該假說，正在進行產生如下小鼠的努力，所述小鼠具有包含激活性激酶結構域突變和T790M突變的復合突變EGFR等位基因。最近從I期臨床試驗釋放的數據已顯示ch806抗體，與西妥昔單抗不同，選擇性地結合肺癌包括鱗狀細胞肺癌的腫瘤細胞，但不結合正常組織(Scott，ASCO2006)。在該試驗中未觀察到ch806抗體的顯著毒性。與其他EGFR靶向癌癥療法包括西妥昔單抗和TKI治療相比較，通過靶向癌細胞上的EGFR的構象依賴性表位然而極少靶向大多數(如果不是全部)正常細胞上的wtEGFR，ch806似乎具有大得多的特異性。我們的結果清楚地表明mAb806在阻斷EGFR信號傳導上的功效。因此，ch806的獨特的靶向能力代表了癌癥特異性分子靶向療法的新型和令人激動的范例，該療法可使其癌癥依賴于由于過表達或功能獲得突變(包括EGFRvIII或EGFR激酶結構域突變)而引起的不受控制的EGFR信號轉導的患者受益。方法小鼠群(Mousecohorts)之前描述了Tet-op-EGFRvIII/CCSP-rtTA、Ink4A/Arf-/_小鼠和Tet-op-EGFRL858R-IRES-熒光素酶/CCSP-rtTA小鼠的產生(12，21)。所有小鼠圈養(yǎng)HarvardSchoolofPublicHealth的無病原體環(huán)境中并且進行的所有小鼠實驗獲得InstitutionalAnimalCareandUseCommittee，IACUC)批準。同窩出生小鼠在所有實驗中用作對照。為了誘導EGFRvIII和EGFRL858R表達，用多西環(huán)素飲食(ResearchDiets,Inc.)飼養(yǎng)小鼠。之前的研究中的多西環(huán)素撤回實驗(withdrawe鄧eriment)明確地鑒定了來自兩個等位基因的肺腫瘤完全依賴于多西環(huán)素。體內使用mAb806或ch806或西妥昔單抗的靶向療法將持續(xù)進行多西環(huán)素飲食超過8周的小鼠經歷MRI以記錄肺腫瘤負荷。通過I.P.注射，以每日一次0.5mg/劑將MAb806或ch806(由LudwigInstituteforCancerResearch,Melbourne,Australia生產的)遞送入具有肺腫瘤的小鼠。在1周的治療后，以相同的劑量每兩天一次施用抗體，進行另外的指定的周數。使用相同的給藥方案通過I.P.注射以lmg/劑對小鼠施用西妥昔單抗(從BMSpharmaceuticals商購獲得的)。在指定的時間點上使用MRI對小鼠進行成像以確定腫瘤體積的減少，然后殺死小鼠以在完成治療后進行進一步的組織學和生物化學研究。將所有小鼠在整個實驗過程中保持多西環(huán)素飲食。同窩出生小鼠用作所有藥物治療研究的對照。19肺腫瘤的病理學評估在指定的時間上對小鼠實施安樂死，解剖它們的左肺，然后進行快速冷凍以進行生物化學分析。然后在壓力(25cm)下用中性緩沖的10%福爾馬林使它們的右肺膨脹，進行10分鐘，然后固定過夜。在DepartmentofPathologyatBrighamandWomen'sHospital對來自福爾馬林固定的、石蠟包埋的腫瘤樣品的5ym厚的切片進行蘇木精和伊紅(H&E)染色。對福爾馬林固定的石蠟切片進行免疫組織化學分析。在二甲苯中對切片脫石蠟，然后在乙醇中進行連續(xù)再水化。對于需要抗原修復的抗體，按照廠商說明書使用抗原暴露溶液(antigen-皿maskingsolution)(VectorLaboratories)。在過氧化氫(0.3%-3%)中淬滅載玻片以阻斷內源過氧化物酶活性，然后在自動緩沖器(FisherScientific)中洗滌。在室溫下在5%正常血清中封閉載玻片1小時，然后在4t:下與稀釋于封閉緩沖液中的一抗溫育過夜。使用抗生物素蛋白生物素過氧化物酶復合物法(Vector)，使用蘇木精對載玻片進行復染。將載玻片在乙醇中進行連續(xù)脫水，用二甲苯清洗，然后用Permo皿t(Fisher)進行封片(mount)。以l:100使用生物素化的DBA凝集素(Vector)。使用的抗體是總EGFR禾口phospho-EGFRY1068(l:50，CellSignalingTechnology)。使用TUNEL測定法(ApopTag試劑盒；Intergen，Inc.)通過計數陽性細胞來測量細胞凋亡。Western印跡分析。在含有完全蛋白酶抑制劑混合物(CompleteProteaselnhibitorsCocktail)和磷酸酶抑制劑混合物組I和II(PhosphataseInhibitorsCocktailSetIandII)(EMDBiosciences)的RIPA緩沖(BostonBioproducts)中勻槳快速冷凍的肺組織樣品。通過離心澄清肺裂解物，然后在lx終十二烷基硫酸鈉(SDS)樣品緩沖液(50mMTris(pH6.8)，10%甘油，0.715M|3_巰基乙醇，2%SDS和0.01X溴酚藍)中煮沸5分鐘。然后通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離裂解物，將其轉移至硝基纖維素膜，然后使用SuperSignalWestPicoChemiluminescentSubstrate(PierceBiotechnology)利用抗體進行免疫印跡來檢測。本研究中所使用的抗體為定向針對總EGFR、phospho-EGFR(pY1068)、總Akt、phospho-AKT(pS473)、總Erkl/2和phospho-ERK1/2(pT202/pY204)(全部來自CellSignaling);和P-肌動蛋白(SantaCruzBiotechnology,Inc.)的抗體。按照廠商推薦的條件使用抗體。MRI和腫瘤體積的測量通過鼻錐體(nosecone)使用混合在100%的氧氣中的1.5_2%異氟烷(IsoFlo，AbbotLaboratories)麻醉動物。為了消除運動問題，給所有MRI研究提供心臟和呼吸門控。因為MR信號的采集與心臟和呼吸循環(huán)同步，因此在各心期(cardiacphase)和終末呼出期(end-e鄧iratoryphase)獲得MR信號，從而使得運動偽差顯著減小。經最優(yōu)化用于估量正常小鼠(29)中的肺實質和脈管的MRI方案適用于在4.7德斯拉(Biospec47/40，BrukerBioSpin，Karlsruhe,Germany)下的操作。系統(tǒng)配備有具有30G/cm的最大功率梯度(powergradient)的屏蔽梯度系統(tǒng)和心臟_呼吸觸發(fā)系統(tǒng)(cardiac-respiratorytriggeringsystem,BioTrig，BrukerBioSpin，Karlsruhe,Germany)。然后，將使動物俯臥放置，將用于心臟門控的電極(前墊和左后墊)和呼吸傳感器置于它們身體上，頭首先進入系統(tǒng)，使胸廓中心對準射頻籠式線圈(內徑3cm)的中心。為了成像區(qū)域的可重復定位，使用快速自旋回波程序(fastspinechosequence)(RARE:使用弛豫增強快速采集，TR/有效TE=1000/28毫秒，帶寬=50kHz，視野二30咖，矩陣=128X128，層面厚度=1咖，激勵次數=1)首先獲得整個肺在橫切面和冠狀平面上的低分辨率多層圖像(用作終末呼出期定位器)。此外，使用心臟-呼吸門控在包括整個肺的多層橫截面和冠狀平面中進行二維(2D)多層梯度回波成像。選擇短于一個心動周期(范圍在150至200毫秒內，平均178毫秒)的持續(xù)時間的脈沖重復時間(TR)，其中就每一單次脈搏的每一個圖像填充一個k-空間線(k-spaceline)。使用最小回波時間(TE:1.8毫秒)以減少由于空氣/骨和組織之間的干擾引起的可減少MR信號的易感性效應。其他掃描參數是翻轉角=22°，矩陣大小=256x256，視野(FOV)=2.56(^2，薄片厚度=lmm以及激發(fā)次數(NEX)=4，提供100iim2的面內分辨率(in-planeresolution)。在各平面內，總掃描時間為大約6-7分鐘，這取決于個體動物的心臟/呼吸率。在每一個MR圖像上，手工分割標示肺腫瘤的區(qū)域，然后使用ImageJ(ver.1.33，NationalInstituteofHealth)進行測量以計算腫瘤體積。參考文獻1.Ji，H.，Sharpless，N.E.，andWong，K.K.2006.EGFRTargetTherapy:ViewFromBiologicalStandpoint.CellCycle.5(18):2072-2076.Epub2006S印15.2.Hynes，N.E.，andLane，H.A.2005.ERBBreceptorsandcancer:thecomplexityoftargetedinhibitors.Nat.Rev.Cancer.5:341—354.3.Arteaga，C丄2003.ErbB-targetedtherapeuticapproachesinhumancancer.Exp.Cell.Res.284:122—130.4.Mendelsohn,J.，andBaselga，J.2000.TheEGFreceptorfamilyastargetsforcancertherapy.Oncogene.19:6550—6565.5.Snyder，L.C.，Astsaturov，I.，andWeiner，L.M.2005.Overviewofmonoclonalantibodiesandsmallmoleculestargetingtheepidermalgrowthfactorrec印torpathwayincolorectalcancer.Clin.ColorectalCancer.5Suppl2:S71_80.6.Herbst，R.S.2002.Targetedtherapyinnon_small_celllungcancer.Oncology(WillistonPark).16:19-24.7.Groner，B.，Hartma皿，C.，andWels，W.2004.Therapeuticantibodies.Curr.Mol.Med.4:539-5478.Haber，D.A.，etal.2005.Moleculartargetedtherapyoflungcancer:EGFRmutationsandresponsetoEGFRinhibitors.ColdSpringHarbSymp.Quant.Biol.70:419-426.9.Park,K.，andGoto,K.2006.Areviewofthebenefit-riskprofileofgefitinibinAsianpatientswithadvancednon_small_celllungcancer.Curr.Med.Res.Opin.22:561-573.10.Sakurada，A.，Sh印herd，F.A.，andTsao，M.S.2006.Epidermalgrowthfactorrec印tortyrosinekinaseinhibitorsinlungcancer:impactofprimaryorsecondarymutations.Clin.UmgCancer.7Suppl4:S138-144.11.Halatsch，M.E.，Schmidt,U.，Behnke—Mursch，J.，Unterberg，A.，andWirtz，C.R.2006.Epidermalgrowthfactorreceptorinhibitionforthetreatmentofglioblastomamultiformeandothermalignantbraintumours.CancerTreat.Rev.32:74-89.12.Ji，H.，etal.2006.EpidermalgrowthfactorreceptorvariantIIImutationsinl皿gtumorigenesisandsensitivitytotyrosinekinaseinhibitors.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.103:7817—7822.13.Sok，J.C.，etal.2006.Mutantepidermalgrowthfactorreceptor(EGFRvIII)contributestoheadandneckcancergrowthandresistancetoEGFRtargeti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大多數實質腫瘤顯示強烈的SPC染色，暗示著II型的肺細胞來源，如所預期的。相反地，支氣管腫瘤對于SPC是陰性的。有趣地，只有支氣管腫瘤細胞的小亞群對于CCSP是陽性的。這可能可通過克拉拉細胞起源，然后經歷導致CCSP表達標記丟失的不良分化來解釋。hEGFRT790M-L858R突變體的表達對于實質和支氣管腺癌的腫瘤維持是重要的。來自hEGFRT790M-L858R/CCSP-rtTA小鼠的支氣管和實質肺腺癌被總EGFR和phospho-EGFR抗體陽性染色，這表明表達的EGFR突變體具有功能活性。在3天的多西環(huán)素撤回后，未觀察到來自任一抗體的陽性信號，這表明兩種類型的腫瘤由EGFRT790M-L858R驅動并且它們的存活依賴于EGFRT790M-L858R。在多西環(huán)素撤回后，我們還觀察到末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP-生物素缺口末端標(TUNEL)測定的陽性染色增加，這表明細胞凋亡過程被觸發(fā)。與通過TUNEL染色表明的細胞凋亡一致，MRI結果證明EGFRT790M-L858R驅動的肺腫瘤在10天的多西環(huán)素撤回后完全退縮。來自通過MRI檢查的相同小鼠的肺的顯微鏡分析顯示大體上正常的肺組織學。在12周的多西環(huán)素撤回后，在其他具有腫瘤的小鼠的氣道和實質中未發(fā)現腫瘤損傷。為了更好地在蛋白質水平上定量突變的EGFR在腫瘤中的表達，我們在多西環(huán)素施用的不同時間使用來自雙轉基因小鼠的完整肺裂解物進行western印跡。雖然存在個體差異，但EGFR磷酸化受到多西環(huán)素的密切調控并且與腫瘤的存在同步，這驗證了突變的EGFR信號傳導在腫瘤維持中的重要作用，如在IHC染色和MRI中觀察到的。因此，EGFR仍然是我們的新型小鼠肺癌模型的具有吸引力的治療靶。使用mAb806講行的對EGFRT790M-L858R驅動的肺腫瘤的治療使用mAb806對比使用西妥昔單抗進行的對EGFRT790M-L858R肺腫瘤的治療的結果描述于圖5中。將持續(xù)進行多西環(huán)素飲食超過8周的小鼠經歷MRI以記錄腫瘤負荷。通過I.P.注射每天一次進行4周以0.5mg的劑量將mAab806遞送入具有肺腫瘤的小鼠。通過I.P.注射每天一次進行4周以lmg/劑對小鼠施用西妥昔單抗。在第0、2和4或5周使用MRI對小鼠成像，以確定腫瘤體積的減小。通過使用mAb806的治療，腫瘤體積在第2周減小(超過20%)，在第4周減小更顯著減少(超過30%)。雖然通過使用西妥昔單抗治療2周時，腫瘤體積開始減小，但腫瘤體積在經過使用西妥昔單抗治療5周后顯著增加(在5周的西妥昔單抗治療時觀察到的腫瘤體積比在第0周的初始體積更大)。在治療和MRI成像完成后，殺死小鼠以進行進一步的組織學和生物化學研究。對于所有治療研究，同窩出生小鼠用作對照(未治療)。本發(fā)明可以以其他形式體現或以其他方式進行而不背離其精神和基本特征。因此本公開內容在所有方面被認為是示例說明而非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權利要求指出，并且在等同的意義和范圍內出現的所有變化意在包含在其中。在整個本說明書中引用了不同的參考資料，其各自以其全文通過引用合并入本文。權利要求在哺乳動物中治療酪氨酸激酶抑制劑抗性EGFR介導的疾病的方法，其中所述抗性EGFR介導的疾病是EGFR中次級突變從而產生突變的EGFR的結果，并且其中所述突變與EGFRvIII突變不同，該方法包括對所述哺乳動物施用有效量的、能夠結合并抑制突變的EGFR的抗EGFR抗體。2.權利要求1的方法，其中次級EGFR突變是EGFR酪氨酸激酶結構域突變。3.權利要求2的方法，其中酪氨酸激酶結構域突變是T790M。4.權利要求1的方法，其中抗EGFR抗體是mAb806抗體或其活性片段。5.權利要求4的方法，其中mAb806是重組抗體或人源化抗體。6.權利要求1的方法，其中抗EGFR抗體選自ABX-EGF(帕尼單抗)、DH8.3、L8A4和/或其活性片段。7.權利要求1的方法，其中EGFR介導的疾病是癌癥并且選自成膠質細胞瘤、頭頸癌、胰腺癌、肺癌、神經系統(tǒng)的癌癥、胃腸癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、腎癌、視網膜癌、皮膚癌、肝癌、生殖_泌尿癌和膀胱癌。8.權利要求7的方法，其中癌癥是肺腺癌、肺鱗狀細胞癌或非小細胞肺癌。9.用于在癌癥患者中降低EGFR介導的腫瘤生長的方法，其中所述癌癥患者之前已用一種或多種酪氨酸激酶抑制劑進行治療并且已發(fā)生了復發(fā)性疾病和腫瘤生長，該方法包括對所述患者施用有效量的抗EGFR抗體以使復發(fā)性疾病和腫瘤生長被抑制和降低。10.權利要求9的方法，其中抗EGFR抗體是mAb806抗體或其活性片段。11.權利要求10的方法，其中mAb806是重組抗體或人源化抗體。12.權利要求9的方法，其中抗EGFR抗體選自ABX-EGF(帕尼單抗)、DH8.3、L8A4和/或其活性片段。13.權利要求9的方法，其中癌癥患者已經發(fā)生了為EGFR酪氨酸激酶結構域突變的次級EGFR突變。14.權利要求13的方法，其中酪氨酸激酶結構域突變是T790M。15.在哺乳動物中治療EGFR介導的癌癥的方法，該方法包括對所述哺乳動物施用酪氨酸激酶抑制劑和抗EGFR抗體，其中在使用酪氨酸激酶抑制劑作為二線療法的治療后施用所述抗EGFR抗體來抑制抗酪氨酸激酶抑制劑的潛在的次級突變的EGFR。16.權利要求15的方法，其中EGFR介導的癌癥選自成膠質細胞瘤、頭頸癌、胰腺癌、肺癌、神經系統(tǒng)的癌癥、胃腸癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、腎癌、視網膜癌、皮膚癌、肝癌、生殖-泌尿癌和膀胱癌。17.權利要求16的方法，其中癌癥是肺腺癌、肺鱗狀細胞癌或非小細胞肺癌。18.權利要求15的方法，其中酪氨酸激酶抑制劑是可逆酪氨酸激酶抑制劑。19.權利要求18的方法，其中可逆酪氨酸激酶抑制劑是苯胺喹唑啉化合物和選自吉非替尼、厄洛替尼、AG1478、ST1571和SU_6668。20.權利要求15的方法，其中酪氨酸激酶抑制劑是不可逆酪氨酸激酶抑制劑。21.權利要求20的方法，其中不可逆酪氨酸激酶抑制劑選自EKB-569、EKI-569、HKI-272、HKI-357和BIBW2992。全文摘要本發(fā)明涉及治療抗酪氨酸激酶抑制劑療法的EGFR介導的疾病，特別是癌癥。提供了用于在具有次級EGFR突變，特別地酪氨酸激酶結構域突變的抗標準療法的個體中治療癌癥和減少腫瘤生長的方法。本發(fā)明提供了使用抗EGFR抗體治療抗酪氨酸激酶抑制劑的癌癥的方法。描述了使用抗體抗EGFRmAb806治療抗酪氨酸激酶抑制劑的復發(fā)性肺癌包括非小細胞肺癌的方法。文檔編號A61K38/16GK101711284SQ200880006008公開日2010年5月19日申請日期2008年1月24日優(yōu)先權日2007年1月25日發(fā)明者K-K·王申請人:達娜-法勃腫瘤研究所