專利名稱：整合光敏肽及其應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明總體上涉及光學成像、可視化技術(shù)和光線治療。具體而言，本發(fā)明涉及光敏功能單元向生物活性靶向肽或假肽中的結(jié)構(gòu)整合。

背景技術(shù)：
在整篇說明書中參考了圓括號內(nèi)的出版物。與各份參考文獻相應的全部引文在具體實施方式
后列出。在此將這些出版物的公開內(nèi)容通過引用全文納入本說明書中，以完整而清楚地描述本發(fā)明所屬領域的技術(shù)發(fā)展水平。
電磁光譜中可見區(qū)、近紅外(NIR)區(qū)或長波(UV-A，＞300nm)區(qū)的分子吸收、發(fā)射光或散射光適用于光學層析成像、光學相干斷層成像、熒光內(nèi)窺鏡探查、光聲技術(shù)、聲致熒光技術(shù)、光散射技術(shù)、激光輔助導航手術(shù)(LAGS)和光線治療。與熒光現(xiàn)象相關的高靈敏性與核醫(yī)學成像的高靈敏性相當，并可使器官和組織可視化而無電離輻射的副作用。在各種病變的診斷、預后和治療中，對診斷劑和治療劑(通常稱為“半抗原”、“效應物”或“功能單元”)——例如熒光團、光敏劑、放射性核素、順磁劑等——向體內(nèi)特定部位的靶向給藥一直都具有相當?shù)男枨?Hassan et al.，Licha et al.，Shah et al.，Vasquez et al.，and Solban etal.)。被稱作“生物綴合物法(bioconjugate approach)”或“鉤環(huán)設計(pendant design)”的常規(guī)靶向法涉及這些試劑與靶向體內(nèi)特定部位的生物活性載體的化學連接。在生物綴合物法中，所述兩個單元可獨立地存在和起作用，其中靶向和成像/治療功能可以是分隔開的。生物活性載體包括小分子藥物、激素、模擬肽(peptidomimetics)、酶抑制劑、受體結(jié)合劑、受體拮抗劑、受體激動劑、受體調(diào)節(jié)劑、DNA結(jié)合劑、轉(zhuǎn)錄因子、細胞周期系統(tǒng)(cell cycle machinery)抑制劑、轉(zhuǎn)導分子、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用抑制劑、蛋白質(zhì)-生物大分子相互作用抑制劑、大分子蛋白質(zhì)、多糖、多核苷酸等。在過去幾十年已對生物綴合物法進行了廣泛的探索，并取得了一定的成功，特別是在使用中型和大型載體(分子量約＞1000道爾頓)的腫瘤檢測方面(Licha et al.和Shah et al.)。這是因為染料、藥物、金屬絡合物或其它效應分子與大分子載體如抗體、抗體片段或長鏈肽的連接不會明顯改變生物活性靶向性；即生物綴合物仍然能夠有效地結(jié)合受體。然而，這種方法確實有一些嚴重局限，因為高分子量的生物綴合物向腫瘤細胞的擴散是非常不利的，并且會被固體腫瘤中的凈正壓進一步復雜化(Jain et al.)。此外，很多染料在水性介質(zhì)中趨向于形成導致熒光淬滅的團聚體。
因此，對同樣具有生物活性靶向能力的小光敏分子存在需求。然而，設計小分子生物綴合物的一個問題是，當診斷劑或治療劑與生物活性靶向載體的尺寸接近時，常常會觀測到該診斷劑或治療劑與靶向受體的結(jié)合大打折扣(Hunter et al.)。因此，替代使一個大如染料或光敏劑取代進入小分子藥物、肽、假肽或模擬肽中存在艱巨的挑戰(zhàn)。為克服這個問題，已經(jīng)實施了一些方法(稱為“整合法”或“內(nèi)部雙功能法(internalbifunctional approach)”)，其中將放射性核素金屬離子納入類固醇或嗎啡生物堿框架中，使得原藥與其相應的放射性核素模擬物的分子拓撲結(jié)構(gòu)非常相似(Rajagopalan，美國專利5,330,737；Rajagopalan，美國專利5,602,236；以及Horn et al.)。與上述生物綴合物法不同，整合單元的兩種個功能(例如，靶向和成像/治療)是不可分隔的。整合法所依據(jù)的原則是抗體、酶、和受體是多特異性的，且會與同天然抗原、底物或配體拓撲結(jié)構(gòu)相似的任何分子結(jié)合。之前針對類固醇模擬物的研究證實，將金屬離子整合進入天然受體配體中對于診斷和治療上適用的放射性核素向靶組織的選擇性送遞而言是一種可行策略(Horn，et al.和Skaddan et al.)。該整合設計包括使一個功能單元通過單原子同配取代進入分子框架。然而，代替大功能單元如染料或光敏劑進入小分子藥物、肽、假肽或模仿肽中存在艱巨的挑戰(zhàn)。雖然核苷向熒光核苷的轉(zhuǎn)化此前已有報道(Miyata et.al.)，但是電子光譜(吸收、激發(fā)和發(fā)射)峰值保持在UV區(qū)域內(nèi)。另外，這種轉(zhuǎn)化僅限于此單核苷應用。


發(fā)明內(nèi)容
在本發(fā)明的各個方面中，提供一種肽或假肽的整合光敏類似物、其制備方法及其診斷和治療用途。
一方面，本發(fā)明涉及一種制備非光敏肽或假肽的整合光敏類似物的方法。所述方法包括用光敏官能團取代所述非光敏肽或假肽的非光敏官能團。
另一方面，本發(fā)明涉及一種對患者實施診斷程序的方法。所述方法包括對患者施用診斷有效量的非光敏肽或假肽的整合光敏類似物。
另一方面，本發(fā)明涉及一種對患者實施光線治療程序的方法。所述方法包括對患者施用治療有效量的非光敏肽或假肽的整合光敏類似物，并使用可導致所述分子光碎片化的波長的光線照射所述患者。
又一方面，本發(fā)明涉及非光敏肽或假肽的整合光敏類似物。
本發(fā)明的其他方面和特征一部分將顯而易見，一部分將于下文指出。

具體實施例方式 本發(fā)明涉及非光敏肽或假肽的整合光敏肽或假肽類似物(下文稱為“整合光敏類似物”或簡稱“類似物”)的制備和使用方法，其中所述非光敏肽或假肽的非光敏官能團用具有相似尺寸和分子拓撲結(jié)構(gòu)的光敏部分取代。本發(fā)明還涉及通過用光敏部分取代已知的非光敏肽或假肽序列中的非光敏官能團來合成整合光敏類似物的方法?？蓪⑺稣瞎饷纛愃莆锝o予患者，用作生物光學診斷造影劑和/或光線治療劑。在一個實施方案中，所述整合光敏類似物具有生物活性，其中它能靶向患者體內(nèi)的特定組織、細胞、受體等。在一個實例中，所述類似物靶向患者體內(nèi)的患病組織、細胞、受體等。
本發(fā)明的整合光敏類似物在350nm或更長的近紅外(NIR)或可見光譜中具有吸收、激發(fā)和發(fā)射最大波長。這對患者的診斷和治療是有益的，因為可見光和NIR光在用于生物光學診斷和治療程序時損傷組織的可能性較小。相反，波長低于350nm的紫外(UV)光可導致組織損傷。350nm或更長的較長波光還能更深地穿透組織，從而能夠?qū)λP注的組織實施在低于350nm的波長下所不能實現(xiàn)的診斷和治療程序。在一個實施方案中，整合光敏類似物的吸收、激發(fā)、和發(fā)射最大波長在約400nm到約900nm之間。
將結(jié)構(gòu)和功能部分整合進入一個分子類似物中的兩種常規(guī)方法包括(a)將一種已知的生物活性肽或假肽轉(zhuǎn)化為一種整合光敏類似物；和(b)將一種光敏實體轉(zhuǎn)化為一種具有生物活性的整合光敏類似物。在任一種方法中，所得分子都具有光敏性和生物功能的基本性質(zhì)。根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能，可將本發(fā)明的整合光敏類似物稱為“整合熒光團”、“整合發(fā)色團”、“整合光敏劑”等。設計整合光敏類似物的常規(guī)方法主要包括(a)選擇一種需要的生物活性肽或假肽；(b)確定所述肽或假肽含有可取代部分(例如芳族、雜芳族或脂肪族部分)的區(qū)域；和(c)用相似尺寸的光敏官能團取代所述部分，或?qū)λ霾糠诌M行改性使其具有光敏性。本發(fā)明所得的整合光敏類似物對診斷和治療應用二者都適用。
整合光敏類似物的合成和應用可以多種方式進行。在一個實施方案中，選擇具有已知或所需結(jié)構(gòu)和功能的肽或假肽。例如，所選擇的光敏肽或假肽可靶向患者體內(nèi)所關注的特定組織或細胞。確定肽或假肽分子結(jié)構(gòu)中的非光敏官能團并用光敏官能團取代以制備整合光敏類似物。所得整合光敏類似物以治療有效量給藥至患者，以在所述患者體內(nèi)檢測光敏肽或假肽。在所述類似物與其靶位點結(jié)合一段時間后，使患者全身或靶組織暴露于波長為350到1200nm的光線下。在一個實例中，隨后將患者全身或靶組織暴露于波長為400-900nm的光線下。然后檢測因整合光敏類似物的吸收和激發(fā)而從患者發(fā)出的光。由于整合光敏類似物的靶向性，通過評價自患者發(fā)出的光的位置和強度可做出診斷。
所述整合光敏類似物還可用于治療性地處理遭受病癥折磨的患者，所述病癥展現(xiàn)出所述類似物靶向的患病組織或細胞(例如，腫瘤、纖維化組織、白血病細胞等)。在對患者施用整合光敏類似物后，該類似物會靶向并結(jié)合至所關注的組織、細胞、受體或蛋白質(zhì)上。將適用于使整合光敏類似物光碎片化/光激發(fā)為反應活性物(reactive species)的波長的光施加至結(jié)合類似物所在的患者部位。通過整合光敏類似物的光碎片化/光激發(fā)所產(chǎn)生的反應活性物破壞或殺死位于結(jié)合類似物附近的患病組織或細胞，從而有利地治療患者的病癥。
整合光敏類似物的開發(fā)包括選擇一種靶向特定組織、器官、損傷、細胞等的合適的生物活性肽或假肽。這些包括但不局限于靶向以下的肽或假肽組織或器官，如大腦、心臟、肝、肺或腎；患病組織，如癌性腫瘤、白血病細胞、纖維化上皮細胞、囊性纖維化組織、子宮內(nèi)膜異位組織等；與特定疾病相關的受體，如生腱蛋白(tenascin)C受體或ST受體；以及感染或發(fā)炎的組織。靶向與結(jié)腸癌有關的ST受體的肽的非限制性實例公開于美國專利5,518,888中，該專利通過引用的方式被全文納入本文。已發(fā)現(xiàn)其他肽或假肽如氨基酸序列ProLeuAlaGluIleAspGlyIleGluLeuThrTyr(SEQ ID NO1)可結(jié)合與囊性纖維化、腫瘤轉(zhuǎn)移和心肌活力相關的生腱蛋白C(Schneider et al.)?？捎糜谠\斷和治療病理性紊亂——如癌、動脈粥樣硬化、再狹窄、糖尿病性視網(wǎng)膜病、新生血管性青光眼、類風濕性關節(jié)炎、子宮內(nèi)膜異位和其他與血管發(fā)生相關的病癥——的生物活性肽或假肽公開于美國專利公布號20040053828中，該專利通過引用的方式被全文納入本文。生物活性肽或假肽的實例包括，但不局限于， AlaAsnIleLysLeuSerValGlnMetLysLeu(SEQ ID NO2)、 SerValGlnMetLysLeu(SEQ ID NO3)、 IleLysLeuSerValGInMetLysLeu(SEQ ID NO4)、和 AsnIleLysLeuSerValGInMetLysLeu(SEQ ID NO5)。
在靶向特定組織、器官、受體等方面也具有生物活性的肽和假肽的片段和/或衍生物，也可被改性為或合成為本發(fā)明的光敏分子。依照慣用表示法，此處用來定義肽和假肽的命名以這樣一種方式書寫在一個給定的氨基酸序列中，N端出現(xiàn)在左側(cè)，C端出現(xiàn)在右側(cè)。
在選擇一種生物活性靶向肽或假肽之后，確定位于所述肽或假肽上的非光敏部分，并用光敏部分取代。所述肽或假肽的任何部分或片段都可用光敏部分取代，只要該取代不會導致所得光敏肽或假肽的生物活性或生物活性靶向性大幅降低即可。例如，靶向特定組織、受體等的肽或假肽上的非光敏部分可使用光敏部分取代，只要所得的光敏肽或假肽也優(yōu)先靶向所述特定組織、受體等即可。
在一個實施方案中，所述非光敏部分是一個位于肽或假肽上的芳族或雜芳族部分，其被光敏芳族或雜芳族部分取代。在一個實施例中，所述非光敏芳族或雜芳族官能團為羥苯基基團、吲哚基基團或苯基基團。在另一個實例中，肽或假肽含有一個或多個在其支鏈上含有非光敏芳族或雜芳族部分的氨基酸殘基，如酪氨酸(Tyr/Y)、色氨酸(Trp，W)、苯丙氨酸(Phe/F)或組氨酸(His/H)，其被光敏部分取代。在另一個實例中，所述非光敏芳族或雜芳族部分被其環(huán)結(jié)構(gòu)與所述非光敏部分的原子數(shù)相同的芳族或雜芳族部分取代。在又一個實例中，所述非芳族或雜芳族部分被吡嗪、薁或氮雜薁(azaazulene)部分取代。
在另一個實施方案中，所述肽或假肽內(nèi)的非芳族或非雜芳族氨基酸殘基的非光敏支鏈部分被光敏部分取代。在一個實例中，所述非芳族或非雜芳族部分被吡嗪、薁或氮雜薁部分取代。
在一個實施方案中，所述光敏部分包含一個具有下式的吡嗪部分
其中R1到R3獨立地選自氫、烷基、芳基、-OR4、-SR5、-NR6R7、-CN、-CO2R8、-NO2、-COR9、-CNR10R11、-SOR12和-SO2R13；W為N或-CR16；X選自-(CH2)n-、-N(R17)CO(CH2)n-、-CON(R18)(CH2)n-、-N(R19)SO2(CH2)n-、-NHCONH(CH2)n-、-O(CH2)n-、-CO2(CH2)n-、-S(CH2)n-、-SO(CH2)n-、-SO2(CH2)n-和-SO2N(R20)(CH2)n-；R4到R20獨立地選自由氫、C1-C6烷基、C1到C6羥基烷基、C1到C6烷氧基烷基；且n在0到10之間變化。
在另一個實施方案中，所述光敏部分包含具有下式的薁部分
其中X選自-(CH2)n-、-N(R17)CO(CH2)n-、-CON(R18)(CH2)n-、-N(R19)SO2(CH2)n-、-NHCONH(CH2)n-、-O(CH2)n-、-CO2(CH2)n-、-S(CH2)n-、-SO(CH2)n-、-SO2(CH2)n-和-SO2N(R20)(CH2)n-；R4和R17到R20獨立地選自氫、C1-C6烷基、C1到C6羥基烷基、C1到C6烷氧基烷基；n在0到10之間變化。
在另一個實施方案中，所述光敏部分包含具有下式的氮雜薁部分
其中X選自-(CH2)n-、-N(R17)CO(CH2)n-、-CON(R18)(CH2)n-、-N(R19)SO2(CH2)n-、-NHCONH(CH2)n-、-O(CH2)n-、-CO2(CH2)n-、-S(CH2)n-、-SO(CH2)n-、-SO2(CH2)n-和-SO2N(R20)(CH2)n-；R4和R17到R20獨立地選自氫、C1-C6烷基、C1到C6羥基烷基、C1到C6烷氧基烷基；n在0到10之間變化。
在另一個實施方案中，所述整合光敏類似物為一種與式(A)相對應的化合物
其中R21包含一個光敏官能團，R22選自氫、一個α-氨基酸殘基以及兩個或多個α-氨基酸殘基的序列，并且R23選自-OH、一個α-氨基酸殘基以及兩個或多個α-氨基酸殘基的序列。
在一個實例中，式(A)化合物包含酪氨酸殘基、色氨酸殘基、苯丙氨酸殘基或組氨酸殘基的光敏類似物，結(jié)構(gòu)如下
其中R21包含一個支鏈光敏官能團。
本發(fā)明光敏部分的非限制性實例包括但不局限于烯烴、苯、萘、萘醌、芴、蒽、蒽醌、菲、并四苯、并四苯二酮、吡啶、喹啉、喹嗪、喹喔啉、奎尼丁、蝶啶、異喹啉、吲哚、異吲哚、吡咯、咪唑、噁唑、噻唑、吡唑、吡嗪、嘌呤、苯并咪唑、呋喃、苯并呋喃、二苯并呋喃、咔唑、吖啶、吖啶酮、菲啶、噻吩、苯并噻吩、二苯并噻吩、呫噸、呫噸酮、黃酮、蒽環(huán)類物(anthacylines)；薁和氮雜薁、吲哚菁、苯并卟啉、方酸、咕啉、香豆素和菁。通過將氨基酸或肽官能團添加到這些光敏部分，使所得光敏類似物具有生物活性或生物靶向性，從而可將所述光敏部分可以化學轉(zhuǎn)化為生物活性光敏類似物(例如受體結(jié)合劑)。
本發(fā)明的光敏部分還包括用于光線治療程序的反應活性物(即中間體)。光線治療的部分包括但不局限于自由基、卡賓、氮賓、單線態(tài)氧等。可納入肽或假肽中以合成光線治療類似物的I型光反應部分的實例包括但不局限于疊氮化物、偶氮化合物、重氮化合物、亞磺酸酯(sulfenate)、噻二唑、過氧化物和照射下形成的自由基或活性中間體?？杉{入肽或假肽中以合成光線治療類似物的II型光反應部分的實例包括但不局限于酞菁、卟啉、擴展卟啉(extended porphyrin)和苯并卟啉。這可通過將酞菁、卟啉、擴展卟啉和/或苯并卟啉系統(tǒng)化學轉(zhuǎn)化成生物活性物質(zhì)(例如受體結(jié)合劑)來實現(xiàn)。這可通過將官能團添加到所述部分使所得肽或假肽具有生物活性或生物靶向性來完成。
在一個實施方案中，本發(fā)明的生物活性肽或假肽既包含光敏部分，也包含光反應部分。
在制備整合光敏類似物之后，將所述類似物給藥至個體。給定一段適當?shù)臅r間以使所述類似物結(jié)合到所述患者體內(nèi)的靶組織或細胞等上。應理解，本發(fā)明的化合物和組合物的給藥由主治醫(yī)師在穩(wěn)妥的醫(yī)學判斷范圍內(nèi)確定。任何特定患者的具體有效劑量水平取決于多種因素，包括治療的病癥、該病癥的嚴重程度、所用具體化合物的活性、所用的具體組合物、患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食。整合光敏類似物的檢測可通過本領域已知的、使用侵入式或非侵入式探針如內(nèi)窺鏡、導管、耳夾、手帶(hand band)、頭帶(head band)、表面線圈(surface coil)、指探針(finger probe)等的光學熒光、吸收或光散射法實現(xiàn)(Muller et al.)。成像可使用本領域已知的平面成像、光學層析成像、光學相干斷層成像、內(nèi)窺鏡探查、光聲技術(shù)、聲致熒光技術(shù)、共聚焦顯微鏡技術(shù)或光散射設備實現(xiàn)。
與上述的診斷程序相似，整合光敏類似物也可給藥至患者以用于治療。在整合光敏類似物給藥至患者后，給定一段適當?shù)臅r間以使類似物結(jié)合到患者體內(nèi)的靶組織或細胞等上?；颊呖扇芜x用上述任方法成像以確定類似物在患者體內(nèi)結(jié)合的位置。在確定類似物與一個或多個靶位點結(jié)合后，使用具有足以使整合光敏類似物光碎片化的波長和強度的光線照射患者。通常，光碎片化可導致類似物的均裂，從而導致自由基中間體的產(chǎn)生。然后，所產(chǎn)生的自由基破壞已結(jié)合整合光敏類似物的靶向位點的患病組織或細胞，從而有效地治療患者病癥。
在一個實施方案中，所述非光敏肽為一種由式1表示的ST(熱敏感細菌腸毒素)受體結(jié)合序列(Waldman，美國專利5,518,888)
式1的非光敏肽序列，即 AsnThrPheTyrCysCysAspLeuCysCysTyrProAlaGluAlaGlyCysAsn(SEQ ID NO6)，包含支鏈中含非光敏羥苯基部分的酪氨酸殘基。所述酪氨酸殘基的羥苯基部分被吡嗪、薁或氮雜薁的光敏部分取代，分別得到 AsnThrPheTyrCysCysAspLeuCysCysXaaProAlaGluAlaGlyCysAsn(SEQ ID NO7)(式2)、 AsnThrPheTyrCysCysAspLeuCysCysXaaProAlaGluAlaGlyCysAsn(SEQ ID NO8)(式3)或 AsnThrPheTyrCysCysAspLeuCysCysXaaProAlaGluAlaGlyCysAsn(SEQ ID NO9)(式4)。所得的類似物式2-4具有光敏性，其中R1到R3獨立地為給電子基團或吸電子基團，如氫、烷基、芳基、-OR6、-SR7、-NR8R9、-CN、-CO2R10、-NO2、-COR11、-CNR12R13、-SOR14、-SO2R15等。W為-N或-CR16。X為一種選自-(CH2)n-、-N(R17)CO(CH2)n-、-CON(R18)(CH2)n-、-N(R19)SO2(CH2)n-、-NHCONH(CH2)n-、-O(CH2)n-、-CO2(CH2)n-、-S(CH2)n-、-SO(CH2)n-、-SO2(CH2)n-和-SO2N(R20)(CH2)n-的間隔基團；n在0到10之間變化。R4到R20獨立地選自氫、C1-C6烷基、C1到C6羥基烷基、和C1到C6烷氧基烷基。本實施方案中的整合光敏肽適用于對結(jié)腸癌的診斷、預后和光線治療。
在另一個實施方案中，所述非光敏肽為一種由式5表示的生腱蛋白C結(jié)合序列(Edelberg et al.和Schneider et al.)
式5的非光敏肽序列，即 ProLeuAlaGluIleAspGlyIleGluLeuThrTyr(SEQ ID NO 10)，包含支鏈中含非光敏羥苯基部分的酪氨酸殘基。所述非光敏羥苯基部分被吡嗪、薁或氮雜薁的光敏部分取代，分別得到 ProLeuAlaGluIleAspGlyIleGluLeuThrXaa(SEQ ID NO 11)(式6)、 ProLeuAlaGluIleAspGlyIleGluLeuThrXaa(SEQ ID NO 12)(式7)或 ProLeuAlaGluIleAspGlyIleGluLeuThrXaa(SEQ ID NO 13)(式8)。所得的類似物式6-8具有光敏性，其中R1到R3獨立地為給電子基或吸電子基，如氫、烷基、芳基、-OR6、-SR7、-NR8R9、-CN、-CO2R10、-NO2、-COR11、-CNR12R13、-SOR14、-SO2R15等。W為-N或-CR16。X為一種選自-(CH2)n-、-N(R17)CO(CH2)n-、-CON(R18)(CH2)n-、-N(R19)SO2(CH2)n-、-NHCONH(CH2)n-、-O(CH2)n-、-CO2(CH2)n-、-S(CH2)n-、-SO(CH2)n-、-SO2(CH2)n-和-SO2N(R20)(CH2)n-的間隔基團；n在0到10之間變化。R4到R20獨立地選自氫、C1-C6烷基、C1到C6羥基烷基和C1到C6烷氧基烷基。本實施方案中的整合光敏肽適用于評估心肌活力和囊性纖維化。
在另一個實施方案中，所述非光敏肽靶向子宮內(nèi)膜異位組織，并具有由式9表示的序列(Nothick和Mayo et al.)
式9的非光敏肽序列，即 AlaAsnIleLysLeuSerValGlnMetLysLeu(SEQ ID NO 14)，包含支鏈中含非光敏脂肪基團的谷氨酰胺殘基。所述非光敏的脂肪基團被吡嗪、薁或氮雜薁光敏部分取代，分別得到 AlaAsnIleLysLeuSerValXaaMetLysLeu(SEQ ID NO 15)(式10)、 AlaAsnIleLysLeuSerValXaaMetLysLeu(SEQ ID NO 16)(式11)或 AlaAsnIleLysLeuSerValXaaMetLysLeu(SEQ ID NO 17)(式12)。所得的類似物式10-12具有光敏性，其中R1到R3獨立地為給電子基或吸電子基，如氫、烷基、芳基、-OR6、-SR7、-NR8R9、-CN、-CO2R10、-NO2、-COR11、-CNR12R13、-SOR14、-SO2R15等。W為-N或-CR16。X為一種選自-(CH2)n-、-N(R17)CO(CH2)n-、-CON(R18)(CH2)n-、-N(R19)SO2(CH2)n-、-NHCONH(CH2)n-、-O(CH2)n-、-CO2(CH2)n-、-S(CH2)n-、-SO(CH2)n-、-SO2(CH2)n-、和-SO2N(R20)(CH2)n-的間隔基團；n在0到10之間變化。R4到R20獨立地選自氫、C1-C6烷基、C1到C6羥基烷基、和C1到C6烷氧基烷基。本實施方案中的整合光敏肽適用于子宮內(nèi)膜異位診斷、預后和光線治療。
在另一個實施方案中，所述非光敏肽靶向白血病細胞，并具有由式13表示的序列
式13的非光敏肽序列SerPhePheTyrLeuArgSer(SEQ ID NO18)，包含支鏈中含非光敏羥苯基基團的酪氨酸殘基。所述非光敏的羥苯基基團被吡嗪、薁或氮雜薁的光敏部分取代，分別得到 SerPhePheXaaLeuArgSer(SEQ ID NO19)(式14)、 SerPhePheXaaLeuArgSer(SEQ ID NO20)(式15)或 SerPhePheXaaLeuArgSer(SEQ ID NO21)(式16)。所得的類似物式14-16具有光敏性，其中R1到R3獨立地為給電子基或吸電子基，如氫、烷基、芳基、-OR6、-SR7、-NR8R9、-CN、-CO2R10、-NO2、-COR11、-CNR12R13、-SOR14、-SO2R15等。W為-N或-CR16。X為一種選自-(CH2)n-、-N(R17)CO(CH2)n-、-CON(R18)(CH2)n-、-N(R19)SO2(CH2)n-、-NHCONH(CH2)n-、-O(CH2)n-、-CO2(CH2)n-、-S(CH2)n-、-SO(CH2)n-、-SO2(CH2)n-和-SO2N(R20)(CH2)n-的間隔基團；n在0到10之間變化。R4到R20獨立地選自氫、C1-C6烷基、C1到C6羥基烷基、和C1到C6烷氧基烷基。本實施方案中的整合光敏肽適用于對白血病的診斷、預后和光線治療。
光敏衍生物的合成 吡嗪、薁或氮雜薁衍生物，以及由它們衍生的整合光敏類似物通?？赏ㄟ^本領域已知的Strecker法或其他氨基酸合成法來制備(Wentroup et al.、Nozoe et al.和Schneider et al.)。本發(fā)明的整合光敏類似物的合成可通過本領域已知的液相或自動固相肽合成法實現(xiàn)(Bodansky et al.)。以下實施例中詳述的固相法一般使用于市售的多肽合成儀(例如，Applied Biosystems Model 432A SYNERGY多肽合成儀)中使用的芴基甲氧羰基(Fmoc)保護的氨基酸。如有必要，每一個肽柱體(cartridge)可包含與具有另外支鏈保護基的Fmoc-氨基酸相連的Wang樹脂。
制劑 可對本發(fā)明的整合光敏劑進行配制以用于腸內(nèi)給藥(口服給藥或直腸給藥)、胃腸外給藥、局部給藥、透皮給藥或皮下給藥。局部給藥、透皮給藥和表皮給藥的制劑還可包括氣霧劑、霜劑、凝膠劑、乳劑、溶液劑或懸浮劑。進入或透過皮膚的給藥可基于已知的方法和試劑進行強化，所述試劑如經(jīng)皮滲透增強劑，例如，“氮酮”、N-烷基環(huán)酰胺、二甲亞砜、長鏈脂肪酸(C10)等(Gennaro)。
制備可藥用制劑的方法可按照本領域已知的方法實現(xiàn)(Gennaro)。制劑可使用任一整合光敏劑，與可藥用的緩沖劑、表面活性劑、賦形劑、觸變劑、調(diào)味劑、穩(wěn)定劑或經(jīng)皮滲透增強劑一起制備。如果發(fā)明化合物具有水溶性，可使用生理鹽水溶液劑給藥。如果化合物不具有水溶性，可將所述化合物溶于生物相容油(例如豆油、魚油、維生素E、亞麻油、植物油、甘油酯、長鏈脂肪酸酯等)中，并于含有表面活性化合物(例如，植物或動物磷脂、卵磷脂、長鏈脂肪酸鹽和醇、聚乙二醇酯和醚等)的水中乳化，然后作為局部霜劑、懸浮劑、水/油乳劑或水/油微乳劑給藥。
整合光敏劑還可封裝進膠團、脂質(zhì)體、納米顆粒、殼交聯(lián)納米顆粒、樹枝狀聚合物、樹枝狀結(jié)晶、微膠囊或其他組織化微粒中，并通過前述任一途徑給藥。整合光敏劑也可與納米顆粒、殼交聯(lián)納米顆粒、樹枝狀聚合物或樹枝狀結(jié)晶化學綴合，以同時產(chǎn)生整合光子效應和多價生物效應。這些制劑可增強所述試劑在體內(nèi)的穩(wěn)定性。封裝法包括清潔劑透析、冷凍干燥、成膜或注射(Janoff et al.)。制造脂質(zhì)體和在其中封裝各種分子的方法為本領域所公知(Braun-Falco et al.和Lasic et al.)。
劑量 含有本發(fā)明整合光敏類似物的組合物可以單劑量或多劑量給藥以達到有效診斷或治療的目地。給藥后，整合光敏類似物于靶組織處聚集，并且將選定的靶位點暴露在具有足夠能量和強度以作出診斷和/或治療的光線之下。所述劑量可根據(jù)所用的特定整合光敏類似物、檢查的器官或組織、臨床程序中所用的器材、達到的治療效果等在寬的范圍內(nèi)變化。所述化合物的劑量可在約0.1mg/kg體重到約500mg/kg體重之間變化，通常為約0.5mg/kg體重到約2mg/kg體重。對于胃腸外給藥而言，無菌液或懸浮液含有濃度范圍為約1nM到約0.5M的整合光敏劑。在另一個實例中，無菌液或懸浮液含有濃度范圍為約1μM到約0.5mM的整合光敏劑。
盡管本發(fā)明可有利地以小分子的形式應用，但所述方法也可用于任何生物活性分子，大小均可。本發(fā)明適用于各種生物醫(yī)學光學應用，包括但不局限于平面成像、光學層析成像、光學相干斷層成像、內(nèi)窺鏡探查、光聲技術(shù)、聲致熒光技術(shù)、光散射技術(shù)、激光輔助導航手術(shù)(LAGS)、共聚焦顯微鏡技術(shù)、動態(tài)器官功能監(jiān)測和光線治療。
縮寫和定義 為幫助理解本發(fā)明，一些術(shù)語定義如下 本文使用的二十個遺傳編碼α-氨基酸的氨基酸符號均為常規(guī)符號，縮寫如下

除非另有注釋，否則當肽序列以一系列單字母和/或三字母縮寫出現(xiàn)時，根據(jù)常規(guī)做法，序列按照從氨基到羧基的方向呈現(xiàn)。
“診斷有效量”意指所討論的物質(zhì)的用量，對于大部分患者而言，如果在給藥患者的體內(nèi)存在，應為能夠檢測細胞靶向組織的物質(zhì)的合適量。術(shù)語“有效量”也意味著所給予的物質(zhì)的量僅對用藥對象產(chǎn)生輕微副作用或無副作用，或鑒于該物質(zhì)所作用的疾病的嚴重程度，所述副作用從醫(yī)學和藥學的角度來看可以忍受。
“整合非光敏官能團”是指在350-1200nm范圍內(nèi)不顯現(xiàn)激發(fā)峰和發(fā)射峰的生物活性分子內(nèi)的官能團。
“光敏官能團”或“光敏部分”是指在350-1200nm波長范圍內(nèi)顯現(xiàn)吸收、激發(fā)、發(fā)射最大值的任何官能團或部分。這樣的官能團或部分包括但不局限于熒光團、發(fā)色團、光敏劑和光反應部分，其中“熒光團”、“發(fā)色團”、“光敏劑”、和“光反應部分”具有本領域通常理解的含義。
“光反應部分”是指分子的一部分，當用350到1200nm波長的光激發(fā)時，其能進行光化學反應以產(chǎn)生能造成組織損傷的反應活性物。
“假肽”是一種改性肽序列，其中肽鍵或氨基酸支鏈被局部改性。
“治療有效量”是指在用各藥劑進行治療期間各藥劑能達到改善病情嚴重程度和發(fā)生頻率的目的、同時避免通常與備選治療有關的不良副作用的量。
“治療”是指任一方法、行為、應用、治療等，其中提供給包括人在內(nèi)的受試者以醫(yī)療援助，以達到直接地或者間接地改善該受試者的病癥或減慢所述受試者體內(nèi)病理狀態(tài)進程的目的。
當介紹本發(fā)明及其實施方案的要素時，詞語“a(一)”、“an(一個)”和“the(該)”意欲表示一個或多個要素。術(shù)語“包括”、“包含”和“含有”意欲為包含在內(nèi)，并意指除所列要素外可還有其它要素。
下面的實施例對本發(fā)明的具體實施方案進行了說明。對技術(shù)人員顯而易見的是，各種變化方案和修改方案都是可行的，并且意欲包括在本發(fā)明描述的范圍內(nèi)。
實施例1 式2-4的整合光敏ST受體結(jié)合肽的制備 為合成與ST受體結(jié)合的整合光敏類似物，第一柱體包含與Fmoc-Asn羧基端綴合的Wang樹脂。氨基酸柱體2-7分別包含F(xiàn)moc-Cys(Acm)、Fmoc-Gly、Fmoc-Ala、Fmoc-Glu(γ-O-t-Bu)、Fmoc-Ala和Fmoc-Pro；且柱體9-18分別包含F(xiàn)moc-Cys(Acm)、Fmoc-Cys(Acm)、Fmoc-Leu、Fmoc-Asp(β-O-t-Bu)、Fmoc-Cys(Acm)、Fmoc-Cys(Acm)、Fmoc-Tyr(O-t-Bu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Thr(O-t-Bu)和Fmoc-Asn。第八柱體包含光敏Fmoc-保護的氨基酸殘基。將所述氨基酸柱體置于多肽合成儀上，從C-端位置到N-端位置合成肽。偶合反應在2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)/N-羥基-苯并三唑(HOBt)的存在下進行。用20％的哌啶二甲基甲酰胺溶液脫除Fmoc保護基，并用含三氟乙酸∶水∶苯酚∶茴香硫醚(85∶5∶5∶5)的裂解混合物將產(chǎn)物與固體支持物分離。裂解反應通常約6小時反應完全。所得肽用叔丁基甲基醚沉淀，用HPLC純化，并冷凍干燥。
實施例2 式6-8的整合光敏生腱蛋白C結(jié)合肽的制備 為合成光敏生腱蛋白C結(jié)合肽，氨基酸柱體2-12分別包含F(xiàn)moc-Thr(O-t-Bu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Glu(γ-O-t-Bu)、Fmoc-Ile、Fmoc-Gly、Fmoc-Asp(β-O-t-Bu)、Fmoc-Ile、Fmoc-Glu(γ-O-t-Bu)、Fmoc-Ala、Fmoc-Leu、Fmoc-Pro。第一柱體包含與光敏Fmoc保護氨基酸殘基綴合的Wang樹脂。按與實施例1描述的相同方式進行肽的合成、裂解和純化。
實施例3 式10-12的整合光敏子宮內(nèi)膜異位肽的制備 為合成光敏子宮內(nèi)膜異位肽，第一柱體包含與Fmoc-Leu羧基端綴合的Wang樹脂。氨基酸柱體2和3分別包含F(xiàn)moc-Lys(ε-t-Boc)和Fmoc-Met；柱體5-11分別包含F(xiàn)moc-Val、Fmoc-Ser(O-t-Bu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Lys(ε-t-Boc)、Fmoc-Ile、Fmoc-Asn和Fmoc-Ala。第四柱體包含光敏Fmoc-保護的氨基酸殘基。按實施例1描述的相同方式進行肽的合成、裂解和純化。
實施例4 式14-16的整合光敏白血病細胞結(jié)合肽的制備 為合成光敏白血病細胞結(jié)合肽，第一柱體包含與Fmoc-Ser(O-t-Bu)羧基端綴合的Wang樹脂。氨基酸柱體2和3分別包含F(xiàn)moc-Arg(O-t-Bu)和Fmoc-Leu；柱體5-7分別包含F(xiàn)moc-Phe、Fmoc-Phe和Fmoc-Ser(O-t-Bu)。第四柱體包含光敏Fmoc-保護的氨基酸殘基。按實施例1描述的相同方式進行肽的合成、裂解和純化。
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序列表
<110>馬林克羅特公司
<120>整合光敏肽及其應用
<130>H-MI-00104
<160>21
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成肽
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<220>
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<223>含有薁支鏈的改性氨基酸殘基
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
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<400>16
Ala Asn Ile Lys Leu Ser Val Xaa Met Lys Leu
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<220>
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<223>含有吡嗪支鏈的改性氨基酸殘基
<220>
<221>MISC_FEATURE
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<212>PRT
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<223>含有薁支鏈的改性氨基酸殘基
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<221>MISC_FEATURE
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<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
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<400>21
Ser Phe Phe Xaa Leu Arg Ser
1 權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生非光敏肽或假肽的整合光敏類似物的方法，所述方法包括用光敏官能團取代所述非光敏肽或假肽的非光敏官能團。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述光敏官能團選自烯烴、苯、萘、萘醌、芴、蒽、蒽醌、菲、并四苯、并四苯二酮、吡啶、喹啉、喹嗪、喹喔啉、奎尼丁、蝶啶、異喹啉、吲哚、異吲哚、吡咯、咪唑、噁唑、噻唑、吡唑、吡嗪、嘌呤、苯并咪唑、呋喃、苯并呋喃、二苯并呋喃、咔唑、吖啶、吖啶酮、菲啶、噻吩、苯并噻吩、二苯并噻吩、呫噸、呫噸酮、黃酮、蒽環(huán)類物；薁和氮雜薁、吲哚菁、苯并卟啉、方酸、咕啉、香豆素和菁。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述光敏官能團是一種選自以下的光反應部分疊氮化物、偶氮化合物、重氮化合物、亞磺酸酯、噻二唑、過氧化物、酞菁、卟啉、擴展卟啉、苯并卟啉和形成這些基團的自由基或反應中間體。
4.上述權(quán)利要求任一項的方法，其中所述非光敏官能團是芳族或雜芳族。
5.上述權(quán)利要求任一項的方法，其中所述非光敏官能團是羥苯基、吲哚基或苯基。
6.上述權(quán)利要求任一項的方法，其中所述非光敏官能團是酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸或組氨酸殘基的支鏈部分。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述光敏官能團選自下式的部分，其中
R1到R3獨立地為氫、烷基、芳基、-OR4、-SR5、-NR6R7、-CN、-CO2R8、-NO2、-COR9、-CNR10R11、-SOR12或-SO2R13；
W為N或-CR16；
X為-(CH2)n-、-N(R17)CO(CH2)n-、-CON(R18)(CH2)n-、-N(R19)SO2(CH2)n-、-NHCONH(CH2)n-、-O(CH2)n-、-CO2(CH2)n-、-S(CH2)n-、-SO(CH2)n-、-SO2(CH2)n-或-SO2N(R20)(CH2)n-；
R4到R20獨立地為氫、C1-C6烷基、C1到C6羥基烷基、和C1到C6烷氧基烷基；并且
n在0到10之間變化。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述整合光敏類似物具有下式，其中
R21是光敏官能團；
R22是氫、α-氨基酸殘基、或兩個或多個α-氨基酸殘基的序列；并且
R23是-OH、α-氨基酸殘基、和兩個或多個α-氨基酸殘基的序列。
9.權(quán)利要求8的方法，其中
是酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸或組氨酸殘基的光敏類似物。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述整合光敏類似物包括靶向患病組織、細胞或受體的肽或假肽靶向基團。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述患病的組織或細胞選自癌組織、白血病細胞、纖維化上皮細胞、囊性纖維化組織和子宮內(nèi)膜異位組織。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述肽或假肽靶向基團包含ST受體靶向基團。
13.權(quán)利要求10的方法，其中所述肽或假肽靶向基團為選自SEQID NO 7、SEQ ID NO 8和SEQ ID NO 9的序列。
14.權(quán)利要求10的方法，其中所述肽或假肽靶向基團包含生腱蛋白C靶向基團。
15.權(quán)利要求10的方法，其中所述肽或假肽靶向基團為選自SEQID NO 11、SEQ ID NO 12和SEQ ID NO 13的序列。
16.權(quán)利要求10的方法，其中所述肽或假肽靶向基團包含子宮內(nèi)膜異位靶向基團。
17.權(quán)利要求10的方法，其中所述肽或假肽靶向基團為選自SEQID NO 15、SEQ ID NO 16和SEQ ID NO 17的序列。
18.權(quán)利要求10的方法，其中所述肽或假肽靶向基團包含白血病細胞靶向基團。
19.權(quán)利要求10的方法，其中所述肽或假肽靶向基團為選自SEQID NO 19、SEQ ID NO 20和SEQ ID NO 21的序列。
20.上述權(quán)利要求任一項的整合光敏類似物，用于醫(yī)學診斷程序。
21.權(quán)利要求20的類似物，其中所述診斷程序包括使患者暴露于波長為約350nm到約1200nm的光線下。
22.權(quán)利要求20的類似物，其中所述診斷程序包括使患者暴露于波長為約400nm到約900nm的光線下。
23.權(quán)利要求20-22中任一項的類似物，其中所述診斷程序包括觀測從患者發(fā)射出的光線。
24.上述權(quán)利要求任一項的整合光敏類似物，用于醫(yī)學光線治療程序。
25.權(quán)利要求24的類似物，其中所述光線治療是一種對選自癌組織、白血病細胞、纖維化上皮細胞、囊性纖維化組織和子宮內(nèi)膜異位組織的患病組織或細胞的治療療法。
全文摘要
本發(fā)明涉及將已知結(jié)構(gòu)和功能的生物活性化合物轉(zhuǎn)化成光敏分子，以保留原生物活性的一般方法。通過將光敏性和生物功能兩個基本性質(zhì)整合進單個分子實體中產(chǎn)生的分子下文統(tǒng)稱為“整合光敏類似物”或“整合光敏肽或假肽”。設計整合光敏類似物的一般方法主要包括(a)選擇需要的生物活性肽或假肽；(b)確定所述分子含有芳族或雜芳族基序的區(qū)域；和(c)用尺寸相似的光敏官能團取代所述基序，或?qū)λ龌蜻M行改性使其具有光敏性。其他方面包括光敏類似物化合物及其光線診斷和光線治療應用。
文檔編號A61K41/00GK101626786SQ200880006840
公開日2010年1月13日 申請日期2008年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月1日
發(fā)明者R·拉杰戈帕蘭, W·L·紐曼, R·B·多肖 申請人:馬林克羅特公司