專利名稱：：Cd200及其受體cd200r經(jīng)破骨細胞分化調(diào)控骨量的制作方法CD200及其受體CD200R經(jīng)破骨細胞分化調(diào)控骨量申請數(shù)據(jù)本申請要求2007年1月11日提交的美國臨時系列申請60/880，094的權(quán)利。此工作得到NIH資金的支持(給申請人的撥款號是DE12110)。介紹多核破骨細胞源自單核巨噬細胞的融合，并在骨再吸收中起主要作用(Vignery,2005a，b，c)。破骨細胞對于骨的發(fā)育及重建都是必需的，破骨細胞數(shù)量和/或活性的上升會導(dǎo)致與全身骨質(zhì)流失有關(guān)的疾病，如骨質(zhì)疏松，以及其它與局部骨質(zhì)流失有關(guān)的疾病，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及牙周病。因為融合是破骨細胞分化的主要步驟，所以詳盡了解巨噬細胞融合的分子機制會幫助我們開發(fā)阻止骨質(zhì)流失的策略。細胞在融合之前彼此粘附會涉及到一組蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)類似于病毒為了與宿主細胞融合所用的那些蛋白質(zhì)(Hemandezetal,1997)。另外，還有人主張病毒侵入了它們靶細胞的融合蛋白機制(Vignery,2000)?，F(xiàn)在普遍認為病毒-細胞融合既需要附著機制也需要融合肽。例如，此融合物涉及結(jié)合T淋巴細胞和巨噬細胞上CD4的人免疫缺陷病毒(HIV)的gpl20(Dalgleishetal.，1984;Klatzmannetal.，1984)，人們認為，與gpl20源自相同前體(gpl60)的融合分子gp40會促發(fā)實際的融合事件。我們以前主張(Saginarioetal,1995),巨噬細胞所用的融合機制與病毒感染細胞所用的機制類似。我們在1998年報道，在融合發(fā)生時會瞬時誘導(dǎo)在巨噬細胞中表達MFR/SIRPa(Saginario,1995)。MFR/SIRPa及其受體CD47，與CD4—樣屬于免疫球蛋白超家族(IgSF),它們的相互作用在識別自身以及在巨噬細胞融合中都起到了作用(Han,2000)。為進一步調(diào)查巨噬細胞融合的機制，我們將大鼠的小泡樣巨p藍細胞(alveolarmacrophage)與全基因組的寡核苷酸微陣列分析相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)在融合發(fā)生時CD200從頭表達。CD200屬于IgSF,并有胞質(zhì)短尾。它表達于多種小鼠和人細胞(綜述見于MinasandLiversidge,2006)及小鼠成骨細胞(Leeetal.，2006)上，但不表達于巨噬細胞上。與此相比，CD200的受體(CD200R)與CD200類似，也含有兩個IgSF結(jié)構(gòu)域，主要表達于髓樣細胞中，并包含介導(dǎo)下游信號傳導(dǎo)的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。因此，CD200-CD200R與MFR/SIRPa-CD47的表達類型類似，因為CD200象CD47—樣表達廣泛，而CD200R象MFR/SIRPa—樣主要表達于髓樣細胞系的細胞中。因此，我們認為CD200-CD200R軸在巨謹細胞融合中可能起作用，而且缺乏CD200的小鼠會有巨噬細胞融合的缺陷，因此破骨細胞分化及骨重建也會有缺陷。我們發(fā)現(xiàn)，在融合發(fā)生時強烈誘導(dǎo)CD200在巨噬細胞中的表達，而且CD200缺陷型破骨細胞有分化缺陷和RANK的下游信號傳導(dǎo)的缺陷，RANK是破骨細胞生成必需的。我們還發(fā)現(xiàn)，CD200缺陷型小鼠比野生型小鼠的骨密度高而破骨細胞數(shù)量較少?？傮w上，我們觀察到CD200-CD200R軸在巨噬細胞融合及破骨細胞形成中起核心作用。附圖簡述圖1:大鼠小泡樣(alveolar)巨噬細胞及小鼠骨髓衍生的巨噬細胞經(jīng)多核化而表達CD200。將新分離的大鼠小泡樣巨噬細胞以占每個孔表面50%以上的匯合度接種，以促進融合及多核化。5天后，對它們進行免疫組化分析。我們注意到單核巨噬細胞是MFR/SIRPa及CD44陽性的，而不是CD200陽性的(條4mm)。我們也注意到，多核的大鼠小泡樣巨噬細胞含有數(shù)百個被DAPI染色(藍)的核。將新分離的大鼠小泡樣巨噬細胞如圖A—樣接種，并在指定的時間進行Western印跡分析。我們注意到最初的24小時在巨噬細胞中檢測不到CD200。小鼠骨髓-衍生的巨噬細胞在M-CSF(30ng/ml)和RANKL(100ng/ml)存在時培養(yǎng)所述時間，來誘導(dǎo)多核破骨細胞的分化。用RT-PCR分析細胞。我們注意到小鼠骨髓-衍生的巨噬細胞表達CD200受體I(CD200RI)的而不是CD200的轉(zhuǎn)錄物。在有M-CSF(30ng/ml)及增量RANKL的情況下，測定CD200mKNA相對GAPDHmRNA的豐度(條代表標(biāo)準(zhǔn)偏差；n=3)。小鼠骨髓-衍生的巨噬細胞在M-CSF(30ng/ml)和RANKL(100ng/ml)存在時培養(yǎng)指定的時間，來誘導(dǎo)多核破骨細胞的分化。用抗指定抗原的抗體對細胞進行Western印跡分析。CD200表達的流式細胞分析(在萸光活化細胞分選儀(FACS)中)。從CD200+〃及CD200一小鼠分離小鼠骨髓-衍生的巨噬細胞，在M-CSF(30ng/ml)和RANKL(100ng/ml)存在時進行培養(yǎng)，并在指定的時間用抗CD200的抗體及對照的同種型抗體進行流式細胞分析。在促進融合、多核化及破骨細胞生成的M-CSF和RANKL存在時，骨髓-衍生的巨噬細胞隨著時間流逝而越來越多地表達CD200。圖3:缺乏CD200會增加骨密度。兩月齡的雄性和雌性CD200缺陷型小鼠比野生型小鼠的脊稚骨礦物質(zhì)密度(BMD)高(PIXImus/DEXA;w=8)。圖4:對兩月齡的CD200缺陷型和野生型小鼠的股骨遠端(distalfermurs)和股骨干(femoralshafts)的pQCT分析。我們注意到雄性和雌性CD200缺陷型小鼠的股骨干均出現(xiàn)總骨密度增加，但只有雌性CD200缺陷型小鼠的骨小梁面積縮小。雄性和雌性CD200缺陷型小鼠的股骨遠端均出現(xiàn)總骨密度增加。與此相對，雄性CD200缺陷型小鼠的骨小梁面積及骨膜圓周(circumference)比野生型小鼠增加，雌性CD200缺陷型小鼠的骨小梁面積及骨膜圓周比野生型小鼠縮小。圖5:兩月齡的CD200缺陷型雄性和雌性小鼠及野生型小鼠的脛骨近端的曱苯胺藍-染色的切片(條=1mm)。對兩月齡的CD200缺陷型雄性和雌性小鼠的脛骨近端進行組織形態(tài)測定分析(histomorphometricanalysis)。雄性和雌性CD200缺陷型小鼠都出現(xiàn)骨體積(BV/TV)增加，及破骨細胞表面相對于骨表面縮小(Oc.S/BS)。雌性CD200缺陷型小鼠的成骨細胞表面(Ob.S/BS)也縮小。對六月齡雄性和雌性CD200缺陷型小鼠股骨遠端作MicroCT分析。我們注意到CD200缺陷型雄性和雌性小鼠的股骨遠端內(nèi)側(cè)的骨小梁密度比野生型增加。骨切片的最大直徑大約為約3mm。圖6:成骨細胞不表達CD200R,成骨細胞和前破骨細胞(pre-osteoclast)都不受CD200缺無的影響。將六周齡到八周齡的CD200缺陷型和野生型小鼠的骨髓細胞以5xl(^個細胞/孔接種在24孔板中，并在補充了抗壞血酸(50pg/ml)及|3-磷酸甘油(10mM)的a-MEM中培養(yǎng)9-11天，以獲得成骨細胞表型。分析細胞裂解物的堿性磷酸酶活性及蛋白質(zhì)濃度(SD;n=6)。檢測成骨細胞的堿性磷酸酶活性，并用萏素紅(alizarinred)S進行鈣染色，來定量每孔中的結(jié)節(jié)數(shù)(SD;n-6)。用抗小鼠CJ)200、CD200R和GAPDH的抗體對細胞進行Western印跡分析。六周齡的CD200缺陷型和野生型小鼠的骨髓-衍生的巨噬細胞在M-CSF(30ng/ml)存在時培養(yǎng)2天，之后用抗表面標(biāo)記物c-fms、Mac-l和C-kit的抗體進行流式細胞分析。我們注意到缺無CD200不會影響破骨細胞前體細胞的數(shù)量(左圖，條=SD;n=5)。在M-CSF(30ng/ml)及濃度增加的RANKL存在時，培養(yǎng)六周齡CD200缺陷型小鼠的骨髓-衍生的巨噬細胞5天，來誘導(dǎo)破骨細胞的分化。缺無CD200的骨髓巨噬細胞比野生型細胞形成的破骨細胞少(右圖；條=SD;n=5)。圖7:在CD200缺陷型破骨細胞中，RANK下游信號分子的活化受到抑制。從CD200缺陷型和野生型小鼠分離的骨髓巨噬細胞在M-CSF(5ng/ml)存在時培養(yǎng)12-18小時。進一步將非貼壁(adherent)細胞在24孔im中培養(yǎng)2天，不加養(yǎng)料維持(starve)2小時，然后用50ng/mlRANKL刺激指定的時間。在用于SDS-PAGE分析的Laemmli，s樣品緩沖液中裂解細胞，該緩沖液中補充了蛋白酶和磷酸酶的抑制劑，然后用抗指定抗原的抗體進行Western印跡分析。IkB和JNK經(jīng)磷酸化而引起的活化在缺無CD200的細胞中不如在野生型細胞中強烈。重復(fù)此試-瞼3次，獲得相同的結(jié)果。圖8:破骨細胞的融合/多核化需要CD200-CD200R軸。六周齡野生型小鼠的骨髓-衍生的巨噬細胞在M-CSF(30ng/ml)和RANKL(50ng/ml)、有無CD200的重組胞外結(jié)構(gòu)域(rCD200e;100ng/ml)的條件下培養(yǎng)。rCD200e允許破骨細胞在缺無CD200的巨噬細胞中分化(SD;n=3)。從CD200缺陷型和野生型小鼠分離的骨髓巨噬細胞在M-CSF(5ng/ml)存在時培養(yǎng)12-18小時。非貼壁細胞進一步在M-CSF(30ng/ml)存在時培養(yǎng)2天，不加養(yǎng)料維持2小時，然后用帶有或不帶有rCD200e(0.5ng/ml)的RANKL(50ng/ml)處理30分鐘。然后用抗IkBa和JNK及其磷酸化形式的指定抗體對細胞進行Western印跡分析。添加rCD200e重新活化了JNK和IkBa。圖9:六周齡野生型小鼠的骨髓-衍生的巨噬細胞在M-CSF(30ng/ml)和RANKL(100ng/ml)存在、有或無CD200受體的重組胞外結(jié)構(gòu)域(rCD200Re)的情況下培養(yǎng)。rCD200Re阻斷了巨噬細胞的融合(SD;n二5)。六周齡野生型小鼠的骨髓-衍生的巨噬細胞在M-CSF(30ng/ml)存在時培養(yǎng)2天，之后用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體MigRl轉(zhuǎn)導(dǎo)，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體編碼或不編碼^沒計位于CD200R1cDNA之后的短發(fā)夾RNA。用編碼隨機(rdm)寡核苷酸的構(gòu)建體作為陰性對照。三個耙向逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體hRNAil、shRNAi2和shRNAi3,停止表達CD200R1并阻止形成多核的破骨細胞。圖10:CD200缺無時骨密度增加。A,六周齡的雄性和雌性CD200缺陷型小鼠的股骨遠端顯示骨小梁密度增加。CD200缺陷型雄性的皮質(zhì)下內(nèi)容物(subcorticalcontent)也比野生型雄性高(pQCT;w=8)。B,CD200缺無不阻止卵巢摘除術(shù)所致的骨質(zhì)流失。將兩月齡的雌性CD200缺陷型和野生型小鼠作為對照，或者它們接受安慰劑操作(shamoperation)或卵巢摘除術(shù)(n-8;SD)。
發(fā)明內(nèi)容術(shù)語"患者"包括人和非人的哺乳動物。術(shù)語"治療"指對患者疾病狀態(tài)的治療，其包括(i)阻止患者出現(xiàn)疾病狀態(tài)，特別是當(dāng)此患者遺傳上或者由于其它原因易處于疾病狀態(tài)，但還未診斷出患上該疾病時；(ii)抑制或改善(ameliorat)患者的疾病狀態(tài)，即阻滯(arrest)或減慢其發(fā)展；或者(iii)緩解患者的疾病狀態(tài)，也即使其消退(regression)或治愈疾病狀態(tài)。本文所指的推定化合物包括，例如化合物形式的合理化藥物設(shè)計的產(chǎn)物、天然產(chǎn)物及具有部分限定的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控特性的化合物。推定化合物可以是基于蛋白質(zhì)的化合物、基于碳水化合物的化合物、基于脂的化合物、基于核酸的化合物、天然有機化合物、合成的衍生有機化合物、抗獨特型抗體和/或催化抗體、或其片段。推定的調(diào)控化合物可得自，例如天然或合成化合物的文庫，特別是化學(xué)或組合文庫(即序列或大小不同但有相同結(jié)構(gòu)單元(buildingblock)的化合物的文庫；參見例如Rutter和Santi的美國專利5,010,175和5,266,684，它們?nèi)囊氡疚淖鳛閰⒖?，或通過合理化藥物設(shè)計獲得。將適量懸浮于培養(yǎng)基中的推定調(diào)控化合物加入細胞，該量足以調(diào)控細胞中的CD200，CD200R蛋白質(zhì)的活性，從而使調(diào)控可以用已知的檢測方法檢測。優(yōu)選量的推定調(diào)控化合物包括在96孔板的每個孔中約1nM到約10mM的推定調(diào)控化合物。將所述細胞溫育適當(dāng)?shù)臅r間長度，來使推定的調(diào)控化合物進入細胞并與靶蛋白質(zhì)相互作用。優(yōu)選的溫育時間介于約1分鐘到約48小時之間。制備單克隆抗體的技術(shù)是公知的。通常，將永生化細胞系(通常是骨髓瘤細胞)與來自哺乳動物的淋巴細胞(通常是脾細胞)融合，所述哺乳動物已免疫接種了表達已知抗原如CD200,CD200R的全細胞，然后用抗所述抗原的抗體篩選所得雜交瘤細胞的培養(yǎng)物上清。通常參見Kohleretat.,1975,Nature265:295-497,"ContinuousCulturesofFusedCellsSecretingAntibodyofPredefinedSpecificity"可用常用方法進行免疫接種。單位劑量及免疫方案取決于所免疫哺乳動物的物種、免疫狀態(tài)、該哺乳動物的體重等等。通常，給所免疫的哺乳動物取血，用合適的篩選試驗分析每份血液樣本的血清中的特定抗體。例如，抗整合素抗體可以用表達整合素的細胞的1251-標(biāo)記的細胞裂解物進行免疫沉淀來鑒定。抗體，包括例如抗CD200,CD200R的抗體，也可以用流式細胞術(shù)進行鑒定，如對與確認識別CD200,CD200R分子的抗體溫育過的表達抗體的細胞進行熒光染色測量。用于制備雜交瘤細胞的淋巴細胞通常分離自免疫過的哺乳動物，所述哺乳動物的血清已用這些篩選試驗檢測為抗CD200,CD200R抗體存在陽性。通常，永生化細胞系(如骨髓瘤細胞系)源自于與淋巴細胞相同的哺乳動物物種。優(yōu)選的永生化細胞系是對含次黃噪呤、氨基蝶呤與胸苷的培養(yǎng)基("HAT培養(yǎng)基")敏感的小鼠骨髓瘤細胞系。通常用分子量為1500的聚乙二醇("PEG1500")將HAT敏感型小鼠骨髓瘤細胞與小鼠脾細胞融合。然后用HAT培養(yǎng)基選出此融合所得的雜交瘤細胞，該培養(yǎng)基會殺死未融合的及不增殖的(unproductively)融合型骨髓瘤細胞(未融合的脾細胞在若干天后死亡，因為它們是未轉(zhuǎn)化的)。通過篩選雜交瘤培養(yǎng)物上清來檢測產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤。例如，篩選用于產(chǎn)生抗CD200，CD200R抗體的雜交瘤，可以通過分析雜交瘤培養(yǎng)物上清中的分泌型抗體，該抗體能結(jié)合重組的CD200,CD200R表達型細胞系。為了制備本發(fā)明范圍內(nèi)的抗體類似物，包括例如完整免疫球蛋白形式的抗CD200，CD200R抗體類似物，將在這些篩選試驗中檢測為陽性的雜交瘤細胞培養(yǎng)于營養(yǎng)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)的條件及時間足以使所述雜交瘤細胞將單克隆抗體分泌到培養(yǎng)基中。適合雜交瘤細胞的組織培養(yǎng)技術(shù)和培養(yǎng)基是公知的。可用公知方法收集經(jīng)過調(diào)整的(conditioned)雜交瘤培養(yǎng)物上清，任選進一步純化抗CD200,CD200R抗體?？蛇x地，通過將雜交瘤細胞注射到未經(jīng)免疫的小鼠的腹膜腔，可制備所需抗體。所述雜交瘤細胞在腹膜腔中增殖，分泌累積為腹水的抗體。通過用注射器從腹膜腔中抽取腹水可收獲該抗體。完全人化的(follyhuman)單克隆抗體類似物，例如抗CD200,CD200R的單克隆抗體類似物，是本發(fā)明方法中可阻斷抗原的另一種優(yōu)選結(jié)合劑。可用體外致敏的人脾細胞制備它們的完整形式，如Boemeretal.,1991，J.Immunol.147:86-95，"ProductionofAntigen-specificHumanMonoclonalAntibodiesfromInVitro-PrimedHumanSplenocytes"所述?？蛇x地，它們可通過全套(repertoire)克隆來制備，如Perssonetal.,1991,Proc.Nat.Acad.Sci.USA88:2432-2436,"Generationofdiversehigh-affinityhumanmonoclonalantibodiesbyrepertoirecloning"和Huang及Stollar，1991，J.Immunol.Methods141:227-236,"ConstructionofrepresentativeimmunoglobulinvariableregionCDNAlibrariesfromhumanperipheralbloodlymphocyteswithoutinvitrostimulation"所述。美國專利5,798,230(Aug.25,1998,"Processforthepreparationofhumanmonoclonalantibodiesandtheiruse")描述了從人類B細胞制備人單克隆抗體。根據(jù)此方法，產(chǎn)生人抗體的B細胞通過感染表達EB病毒核抗原2(EBNA2)的EB病毒或其衍生物而永生。隨后，永生所需的EBNA2功能關(guān)閉，導(dǎo)致抗體產(chǎn)生增加。在制備完全人化抗體的另一種方法中，美國專利5,789,650(Aug.4，1998，"Transgenicnon-humananimalsforproducingheterologousantibodies")描述了能夠制備異源抗體的轉(zhuǎn)基因非人動物，和具有失活的內(nèi)源性免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因非人動物。內(nèi)源性免疫球蛋白基因受抗內(nèi)源性免疫球蛋白的反義聚核苷酸和/或抗血清抑制。異源抗體通常由發(fā)現(xiàn)不存在于非人動物物種基因組的免疫球蛋白基因來編碼。將未重排的異源人免疫球蛋白重鏈的含一或多個轉(zhuǎn)基因的序列引入非人動物，從而形成轉(zhuǎn)基因動物，該動物能夠功能性重排轉(zhuǎn)基因免疫球蛋白序列，并制備由人免疫球蛋白基因所編碼的多種同種型的全套抗體。這些異源人抗體在B細胞中制備，所述B細胞在例如通過與永生化細胞系例如骨髓瘤融合后變?yōu)橛郎?，或者通過用其它技術(shù)處理(manipulate)這些B細胞來使能夠產(chǎn)生單克隆異源的完全人化抗體類似物的細胞系永存。在發(fā)生融合時在巨逸細胞中從頭0fe朋w)表達CD200為了鑒定巨噬細胞融合機制的新組分，我們將大鼠的融合型小泡樣巨噬細胞進行全基因組微陣列分析。這些巨噬細胞為研究巨噬細胞融合提供了有效均一的模型系統(tǒng)(Saginario，1995,1998;Sterling,1998;Han,2000;綜述參見Vignery，2005)，因為它們是"純天然的(naiVe)"，并且在匯合接種時，在不添加細胞因子時，在體外自發(fā)地融合。在新分離的巨噬細胞中幾乎檢測不到任何編碼CD200的轉(zhuǎn)錄物(登錄號#X01785),但是接種后l、24和120小時的轉(zhuǎn)錄物水平分別比新分離細胞中的轉(zhuǎn)錄物水平高0.6+/-1.4、34.9+/-7.2和61.6+/-23.4倍(均值+/-80;11=3)。為了證明CD200在細胞表面表達，我們使多核小泡樣巨噬細胞與抗CD200胞外結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體進行反應(yīng)。平行地，我們在不同時間對融合型小泡樣巨噬細胞進行Western印跡分析。我們用抗MFR/SIRPa的抗體作為對照，因為此蛋白質(zhì)的表達在發(fā)生巨噬細胞融合時受到誘導(dǎo)(Saginario,1995)。我們的結(jié)果證明，CD200早在接種后24小時就開始重新強表達了(圖1A,B)。然而，與表達在單核巨噬細胞中的MFR/SIRPa不同，CD200不在單核巨噬細胞中表達(圖1A)。為了研究CD200是否也在破骨細胞中表達，我們在M-CSF(30ng/ml)和RANKL(50ng/ml)存在時培養(yǎng)小鼠骨髓巨噬細胞5天，來產(chǎn)生破骨細胞(Lietal.，2005)。在巨噬細胞中未檢測到編碼CD200的轉(zhuǎn)錄物，但RANKL在第2天就誘導(dǎo)了此轉(zhuǎn)錄物的強表達。而且，誘導(dǎo)CD200的表達取決于RANKL的劑量(圖1C)。與此相比，CD200R的表達則很清楚是組成型的(圖1D)。另外，雖然破骨細胞分化時表達MFR/SIRPa、CD47和CD44，這些蛋白質(zhì)的水平卻不受破壞CD200表達的影響，這是因為CD200缺陷型小鼠的破骨細胞表達這些蛋白質(zhì)的水平相似。此觀察結(jié)果提示，這些融合分子的表達受不依賴于CD200的機制來調(diào)控。為了確認CD200是表達在破骨細胞的表面，我們?nèi)缜笆雠囵B(yǎng)了骨巨噬細胞，使它們在不同時間與識別CD200胞外結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體反應(yīng)，并對它們進行流式細胞分析。圖2所示的結(jié)杲證明，CD200在破骨細胞發(fā)生融合/多核化時在細胞表面強烈地從頭表達?？偠灾?，我們的結(jié)果表明CD200可能是巨噬細胞融合機制的之前不被識別的組分。因此，我們認為缺失CD200會影響破骨細胞分化，從而影響骨的發(fā)育和/或重建。CD200缺陷型小鼠比野生型小鼠的骨密度高且破骨細胞較少我們對兩月齡的雄性和雌性CD200;和野生型小鼠進行DEXA分析(參見"材料和方法，，)。象我們預(yù)測的一樣，雄性和雌性的CD200一小鼠比對應(yīng)的野生型小鼠脊推骨密度高(圖3)。對這些小鼠股骨的外周定量體層攝影術(shù)(Peripheralquantitativetomography,pQCT)分才斤顯示，與年齡性別匹配的野生型小鼠相比，CD200缺陷與雄性和雌性骨干及雌性股骨遠端的總密度增加有關(guān)(圖4)。與各自相應(yīng)的野生型小鼠比較，CD200缺陷型雌性小鼠出現(xiàn)骨干及股骨遠端的骨小梁面積增加，而CD200缺陷型雄性小鼠只出現(xiàn)股骨遠端的骨小梁面積增加。與相應(yīng)的野生型小鼠相比，CD200缺陷型雄性小鼠和CD200缺陷型雌性小鼠的骨干和股骨遠端的骨膜圓周分別增加和縮小。由此顯示，CD200缺陷導(dǎo)致了骨累積增強，骨的形狀和大小以性別特異性方式來改變。為了分析缺失CD200增強了總體骨密度的細胞機制，我們對CD200缺陷型和年齡性別匹配的野生型小鼠的股骨遠端進行組織形態(tài)測定分析。我們的結(jié)果證實，雄性和雌性CD200缺陷型小鼠的骨小梁體積比野生型增加(圖5)。我們還發(fā)現(xiàn)雄性和雌性CD200缺陷型小鼠的破骨細胞所占據(jù)的相對骨表面面積縮小。令我們驚訝的是，雖然CD200缺陷型雌性小鼠的骨密度增加，但我們卻發(fā)現(xiàn)成骨細胞所覆蓋的相對骨表面面積縮小(圖5)。此結(jié)果提示，事實上破骨細胞導(dǎo)致CD200缺陷型小鼠的骨體積增加。為了測定骨體積增加是否與衰老有關(guān)，我們對CD200缺陷型和野生型的6月齡小鼠的股骨遠端進行microCT分析。雄性和雌性CD200缺陷型小鼠比相應(yīng)的野生型小鼠骨小梁增加(圖5)。此觀察結(jié)果得到對相同骨的pQCT分析的支持，據(jù)pQCT分析顯示，CD200缺陷型小鼠的骨小梁密度比相應(yīng)的野生型高(數(shù)據(jù)未顯示)。CD200缺無損害了破骨細胞而不是成骨細胞的分化為測定CD200缺無是否會影響成骨細胞的分化，我們在存在抗壞血酸(50pg/ml)及p-磷酸甘油(10mM)的條件下培養(yǎng)CD200缺陷型和野生型小鼠的骨髓細胞9天，并且比較它們各自的堿性磷酸酶活性及它們形成骨樣小結(jié)節(jié)(bone-likenodule)的能力。CD200缺無不會影響堿性磷酸酶活性及成骨細胞形成骨4羊小結(jié)節(jié)(圖6)。然而，成骨細胞的Western印跡分析證實，CD200的表達水平相對較低(Leeetal.，2006)并且CD200R缺無。這些數(shù)據(jù)提示，骨體積增加不是成骨細胞造成的。CD200缺陷型小鼠體內(nèi)所見的破骨細胞數(shù)量下降可能是由于破骨細胞前體細胞數(shù)量下降或由于破骨細胞形成的缺陷。為了檢查這些可能性，我們用破骨前體細胞(pre-osteoclast)所表達的表面標(biāo)記物對新分離的骨髓細胞進行流式細胞分析(c-Fms"7c-Kit+ZMacl'。w;Amietal.，1999;Jimietal.,2004)。前體細胞占骨髓細胞總數(shù)的百分比在CD200+〃與CD200一小鼠中相似(圖6)。然后我們比較了CD200+〃和CD200一小鼠的破骨細胞體外生成速率。在M-CSF(30ng/ml)及濃度增加的RANKL存在時，我們培養(yǎng)小鼠骨髓巨噬細胞5天來產(chǎn)生破骨細胞。缺無CD200導(dǎo)致破骨細胞數(shù)目和破骨細胞所覆蓋的表面面積出現(xiàn)劑量依賴性下降(圖6)。這些數(shù)據(jù)有力支持了我們的假設(shè)，破骨細胞形成缺陷導(dǎo)致了骨體積增加。RANKL活化了在RANK下游起作用的NF-kB和MAP激酶信號途徑，因為RANKL是破骨細胞生成所需的，然后我們猜測，CD200缺陷是否會影響RANK下游的信號傳遞。我們在M-CSF(30ng/ml)存在時培養(yǎng)CD200缺陷型和野生型小鼠的骨髓細胞2天，然后不加養(yǎng)料2小時。之后，我們用RANKL(50ng/ml)處理這些細胞最多2小時。最后，我們用抗IkBa、p38、ERK1/2和JNK的磷酸化形式-特異的和對照的抗體對這些細胞進行Western印跡分析。在缺無CD200的細胞中，當(dāng)IkBa的活化程度隨著時間稍微下降，JNK的活化卻差不多全取消了。這些結(jié)果表明，缺無CD200減弱了RANK下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，還提示CD200-CD200R的相互作用可能在此信號傳導(dǎo)途徑和破骨細胞形成中起作用。CD200-CD200R軸是融合機制的新組分為了討論巨噬細胞融合中CD200-CD200R軸的推定作用，我們使用了多種互補策略。首先，我們想知道外源性CD200是否會恢復(fù)缺無CD200的細胞在體外的破骨細胞分化。我們制備了包含小鼠CD200胞外結(jié)構(gòu)域的可溶性重組蛋白質(zhì)(rCD200e)。在存在M-CSF(30ng/ml)、RANKL(50ng/ml)和rCD200e(0.5ug/ml)的條件，我們培養(yǎng)了從CD200缺陷型和野生型小鼠分離的骨髓細胞。添加rCD200e恢復(fù)了CD200缺陷型破骨細胞的分化(圖8)。然后，我們想知道rCD200e誘導(dǎo)的融合是否起因于在缺無CD200時受抑制的JNK和IkB的活化。我們在M-CSF(5ng/ml)存在時培養(yǎng)CD200缺陷型和野生型小鼠的骨髓細胞2天。在不給這些細胞加養(yǎng)料2小時后，我們用RANKL(50ng/ml)與或不與rCD200e(0.5i!g/ml)—起處理這些細胞30分鐘。最后，我們?nèi)缟鲜鰧@些細胞進行Western印跡分析。添加rCD200e恢復(fù)了IkBa和JNK的活化，證明CD200通過CD200R-介導(dǎo)的IkBa和JNK活化在破骨細胞分化中的作用(圖8)。之后，我們認為，如果CD200-CD200R相互作用在融合中起作用，那么干擾此相互作用會阻斷融合。我們設(shè)計了包含CD200R胞外結(jié)構(gòu)域的可溶性小鼠重組蛋白質(zhì)(rCD200Re)。在M-CSF(30ng/ml)和RANKL(50ng/ml)存在，rCD200Re(10-1,000ng/ml)存在或不在的條件下，我們培養(yǎng)了野生型小鼠的骨髓細胞。與預(yù)期的一樣，在rCD200Re存在時破骨細胞生成受到阻斷(圖9)。除了也稱為CDMORl的CD200R之外，小鼠表達CD200R2、CD200R3和CD200R4(Wrightetal.,2003)。我們發(fā)現(xiàn)小鼠破骨細胞只表達編碼CD200R1和CD200R4的轉(zhuǎn)錄物(數(shù)據(jù)未顯示)。至今，其它這些受體(CD200R2、R3及R4)的功能仍尚未不為我們所知。但已經(jīng)證明的是CD200^又僅結(jié)合并活化CD200R1(Hatherleyetal.，2005)。最后，為了更直接地研究CD200R在融合中的作用，我們試圖通過用短發(fā)夾RNA(shRNA)作RNA干擾(RNAi),來緘默(silence)此受體在融合的巨噬細胞中的表達。我們制備三個靶向CD200Rl(shRNAil、shRNAi2和shRNAB)的基于逆轉(zhuǎn)錄病毒的shRNA構(gòu)建體，和編碼隨機序列(MigRlrdm)的構(gòu)建體。我們用這些構(gòu)建體以及空載體(MigRl)轉(zhuǎn)導(dǎo)從野生型小鼠分離的骨髓巨噬細胞。每一個shRNA構(gòu)建體(shRNAil、shRNAi2和shRNAi3)都干擾CD200R的表達并阻止破骨細胞發(fā)生融合(圖9)。與此相比，MigRl和MigRlrdm都不影響CD200R表達和破骨細胞分化。總體上說，這些結(jié)果i正明了我們的想法，CD200-CD200R軸在巨噬細胞融合和破骨細胞生成中起重要作用。在破骨細胞分化所需的巨噬細胞融合和/或多核化中以及在骨量調(diào)節(jié)中，CD200-CD200R軸看來是新的且重要的。雖然我們的結(jié)果i正明單核巨噬細胞不表達CD200，但據(jù)觀察CD200的重新強表達與這些細胞的融合相伴。不僅CD200的表達突然誘導(dǎo)破骨細胞發(fā)生融合，而且缺無CD200損害了破骨細胞生成，隨后又出現(xiàn)骨體積增加，因此出現(xiàn)了輕微形式的骨硬化癥。我們的分析顯示，在CD200缺陷型和野生型小鼠中，骨髓巨噬細胞/破骨細胞前體細胞數(shù)占骨髓細胞總數(shù)的百分比是類似的，這表明CD200-CD200R軸不控制前單核細胞的分化(FumioAraietal,1999;EijiroJimietal,2004forfacsanalysis).這與在缺無CD200的小鼠中脾和腸系膜淋巴結(jié)巨噬細胞數(shù)上升的事實不符(HoeketaI.2000)?？赡苓@是因為來自骨髓的比來自淋巴樣器官的那些分化差，淋巴樣器官可能表達較低水平的CD200。然而，CD200缺陷型小鼠中破骨細胞數(shù)下降不能歸因于前體細胞數(shù)下降。CD200和CD200R象HIV受體CD4和精子融合蛋白質(zhì)Izumo(Inoueetal.,2005)—樣，都屬于IgSF,此相似性提示它們在細胞融合機制上有一些共同性。另外，已經(jīng)在一些但不是所有雙鏈DNA病毒家族的成員(如痘病毒、皰滲病毒和腺病毒)的基因組中鑒定了CD200樣蛋白質(zhì)的基因(Chungetal.2002;Foster-Cuevasetal.2004)。另外，卡波西氏肉瘤相關(guān)性(Kaposi，ssarcoma-associated)皰滲病毒的K14基因的產(chǎn)物是CD200R的配體(Chung,2002;Foster-Cuevas,2004)。類似地，M141R是粘液瘤(Myxoma)病毒所編碼的細胞表面蛋白質(zhì)，其與CD200在氨基酸水平同源性顯著，是歐洲兔(Europeanrabbit)發(fā)生粘液瘤病毒的全身病變(foilpathogenesis)所需的(Cameronetal.2005)。最重要的是，CD200及其病毒同系物活化CD200R,從而下調(diào)嗜堿性細胞(HHV-8;Shiratori，2005)和巨噬細胞(HHV-8和M141R;Foster-Cuevas,2004;Cameron,2005)的功能。因此，所迷病毒可能像CD47一樣，可能"竊取"了CD200來使自身逃避免疫應(yīng)答，并與細胞融合并感染細胞，CD47與痘苗病毒(Vaccinia)和粘液瘤病毒所編碼的蛋白質(zhì)同源(Parkinsonetal.,1995;Cameronetal"2005)。盡管CD200-CD200R軸在免疫系統(tǒng)起抑制作用(參見Minas和Liversidge，2006的綜述)，但它似乎對巨噬細胞融合起活化作用，因為缺無CD200會使破骨細胞分化變慢。因為有人提出過MFR/SIRPa-CD47軸在破骨細胞形成中起活化作用，所以可能CD200-CD200R和MFR/SIRPa-CD47這兩個軸先后起作用來保證破骨細胞的分化。缺無CD47和CD200的小鼠可以提供解決此問題的模型。另外，因為融合配偶體都是巨噬細胞，我們不能排除CD200及其受體通過它們氨基末端的結(jié)構(gòu)域順式(inc&)和反式(inmra)聯(lián)系的可能性。事實上，在未來研究中確定下游信號是以順式還是反式方式分別活化是有意義的。CD200缺陷型小鼠的破骨細胞生成缺陷是由于RANK下游活化的缺陷，這個事實提示CD200R和RANK可能相互溝通。然而，我們應(yīng)注意到，雖然CD200缺無使破骨細胞生成變慢，但它并不阻礙MFR/SIRPa和CD44的表達，MFR/SIRPa和CD44是巨噬細胞融合機制中的候選成分。另夕卜，還要測定缺無CD200是否影響巨噬細胞融合機制中最近鑒定出來的組分DC-STAMP的表達(Yagi，2005;Vignery,2005)?？傮w上，我們的結(jié)果提示，巨噬細胞融合的機制涉及多個、并可能涉及多余的分子。缺無CD200增加骨量，CD200R的可溶性重組胞外結(jié)構(gòu)域阻斷巨謹細胞體外融合。因此，CD200及其受體也許可以在阻止骨質(zhì)流失的嘗試中作為新的標(biāo)靶。但是，即使培養(yǎng)的成骨細胞表達低水平的CD200并且缺無CD200不影響它們的體外分化，我們?nèi)圆荒芘懦鼵D200在這些細胞體內(nèi)可能起作用。用CD200R的可溶性重組胞外結(jié)構(gòu)域處理動物模型作進一步研究，會有助于搞清楚這個問題。實驗部分動物.如上所述通過同源性重組制備CD20(T、鼠(Hoeketal,2000)。通過用CD200+/+正向引物5'-gtagaagatccctgcatccatcag-3'和反向引4勿5'-gcccagaaaacatggtcacctac-3'進行PCR來篩選小鼠，對于野生型和CD200缺陷型的小鼠，會分別產(chǎn)生1000個堿基和1250個堿基的PCR產(chǎn)物。在耶魯動物管理設(shè)施(YaleAnimalCarefacility)中在為免疫缺陷型小鼠設(shè)定的無菌條件下安置(house)并祠養(yǎng)動物，所述條件包括高壓滅菌的籠舍和食物，以及用無菌技術(shù)在潔凈空氣拒/流動工作臺(clean-aircabinet/changestation)中更換籠舍。在處死前第1天和第6天，給對骨頭進行組織形態(tài)測定分析的小鼠腹膜內(nèi)注射4丐黃纟錄素(calcein)(3ixg/g體重；Merck,Darmstadt,Germany)兩次。耶魯動物管理使用委員會(YaleAnimalCareandUseCommittee)批準(zhǔn)了如下進行的所有實驗。骨X線照相(Boneradiography)使用MX-20(FaxitronX-rayCorporation,Wheeling,IL)在30kV給切除的股骨照射X光3秒。用EpsonPerfection4870掃描X光片。顯微水平的計算機體層攝影術(shù)(microCT)對6月齡雄性CD200;和CD200+、鼠的脛骨近端進行掃描，用的是microCT掃描儀(microCT40;Scanco，Bassersdorf，Switzerland)矩陣為2,048x2,048，同位素分辨率為9^3，體素大小為12pm，對繼發(fā)性骨質(zhì)疏松(spongiosa)直接進行三維骨小梁測定，如前所述(Lietal,2005)。骨密度測定如前所述，用StmtecXCT960M型掃描儀(NorlandMedicalSystems,FortAtkinson,WI)通過外周定量體層攝影術(shù)(pQCT)測定骨密度(Ballicaetal,1998)。每日用限定義的標(biāo)準(zhǔn)進行常規(guī)校準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)包含在透明合成樹脂(lucite)中的羥磷灰石晶體(NorlandMedicalSystems提供)。我們掃描了1mm厚的薄片，該薄片從近端方向距離遠端股骨干骺端的遠末端3mm。將體素大小設(shè)為0.15mm。用生產(chǎn)商(XMICE，5.1版)提供的軟件程序分析掃描文件。通過Loop分析估計骨密度和幾何參數(shù)。將低密度和高密度閾值分別設(shè)置為1,300和2,000。用1號外型模式從骨的外緣分離軟組織。用3號去皮(ped)模式將骨皮質(zhì)(Corticalbone)(高骨密度)與骨小梁(低骨密度)分離，以獲得骨小梁數(shù)據(jù)。用l號皮質(zhì)模式將外皮和骨小梁分離，以獲得皮質(zhì)數(shù)據(jù)。組織形態(tài)測定如前所述，在系列的分級乙醇中(gradedethanolseries)將CD之00"+和CD200一小鼠的脛骨脫水，并不經(jīng)脫4丐就包埋在曱基丙烯酸甲酯中(Baronetal,1982)。用帶有碳化鎢刀片的AutocutW切片機切下縱切片(Jung，Reichert，Germany)。用曱苯胺藍(pH3.7)染色4(xm厚的切片，進行靜態(tài)組織形態(tài)測定分析；封固但不染色8^im厚的切片，在距離生長板(包括骨小梁)恒定距離處用影像分析系統(tǒng)(Osteomeasure頂；Osteometries,Atlanta,GA)進行動態(tài)組織形態(tài)測定分析。測定參數(shù)包括骨體積與總體積之比(BV/TV);骨形成速率(BFR/BV)(考慮到了礦物質(zhì)沉積速率)；每個活性重吸收周長的破骨細胞數(shù)(N.Oc/B.Pm);每個活性形成周長的成骨細胞數(shù)(N.Ob/B.Pm);以及類骨質(zhì)體積與骨體積之比(OV/BV)。試劑重組的小鼠RANKL和M-CSF得自R&DSystems(Minneapolis,MN)?？勾笫驝D200的小鼠單克隆抗體，和抗小鼠CD200及CD200R的大鼠單克隆抗體，均購自Serotec(Raleigh，NC)。之前已經(jīng)公開了抗MFR胞內(nèi)區(qū)的多克隆抗體(Han，2000)。抗p38、磷酸化-p38(P-p38)、ERK1/2、P-ERK1/2、JNK的兔多克隆抗體，以及抗IkB、P-IkB和P-JNK的小鼠單克隆抗體得自CellSignaling(Beverly,MA)?？剐∈驝D44的單克隆抗體得自BDBioscience(FranklinLakes,NJ)。抗GAPDH的小鼠單克隆抗體購自NovusBiologicals,Inc.(Littleton,CO)?？雇煤托∈驣gG的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的F(ab，)2購自JacksonImmunoResearch(WestGrove,PA)。用于流式細月包術(shù)的大鼠抗小鼠單克隆抗體，包括熒光素(fluorescein)偶聯(lián)的抗Mac-l(CD-lib)(Macl-FITC;Ml/70;PharMingen，SanDiego,CA)、藻紅蛋白偶聯(lián)的抗c-fins(c-fins-PE)和別藻藍蛋白偶聯(lián)的抗c-Kit(c-kit-APC;eBioscience，SanDiego，CA)。FITC偶聯(lián)的抗大鼠IgG2a的二級抗體購自PharMingen。所有組織培養(yǎng)的供給和試劑都無內(nèi)毒素。用硫酸多粘菌素B處理一些骨髓細胞24小時，以避免處理前內(nèi)毒素產(chǎn)生的作用。將6-12周齡CD200;和CD200"+小鼠的骨髓細胞接種在10cm皿中，在補充了10%FBS的a-MEM(LifeTechnologies,GrandIsland,NY)中，在存在M-CSF(5ng/m)(lxl()7個細胞/10cm皿)的條件下培養(yǎng)12-18小時。收獲非貼壁細胞，以與之前相同的密度和M-CSF(30ng/ml)—起培養(yǎng)在10cm皿中，另外培養(yǎng)48小時。去除漂浮的細胞，用貼壁細胞(attachedcell),即是酒石酸鹽耐受性酸性磷酸酶陽性(TRAP+)的巨噬細胞，作為破骨細胞前體(LietaL2005)。為了制備破骨細胞，我們在96孑L、24孔或60mm皿中，在存在RANKL(50ng/ml)和M-CSF(30ng/ml)或L929細胞培養(yǎng)物上清的30%(v/v)稀釋物的條件下，以0.5xl()S個細胞/ml的密度培養(yǎng)骨髓巨噬細胞。Western印跡分析在非變性RIPA緩沖液(150mMNaCl,20mMTris,pH7.5,1%NP40,5mMEDTA)中直接裂解培養(yǎng)的細胞，所述緩沖液補充了蛋白酶抑制劑混合物(CompleteTablets,RocheMolecularBiochemicals)和石舞酸酶4中制劑混合物2(Sigma,StLouis，MI)。超聲處理裂解物，將等量的每份標(biāo)本2xl05個細胞上樣到10%變性或非變性丙烯酰胺凝膠中，進行電泳1-2小時。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，在奶粉溶于T-PBS的5。/。溶液中封閉，先后與一級和二級抗體溫育。最后，將膜與supersignal(ECLkit,PierceChemicalCo.,NewYork,NY)溫育，并曝光X光片。將6-8周齡CD200"+和CD200一小鼠的骨髓細胞接種在10cm皿中，在M-CSF(10ng/m;1()7個細胞/10cm皿)存在時，于補充了10。/。FBS的a-MEM中培養(yǎng)12-18小時。收獲非貼壁細胞，以跟以前相同的密度，在10cm皿中與M-CSF(30ng/ml)—起另外培養(yǎng)48小時。去除漂浮的細胞，用貼壁細胞作為破骨細胞前體細胞。為了制備破骨細胞，在96孔、24孔或60mm皿中，在存在RANKL(25-100ng/ml)和M-CSF(30ng/ml)或L929細胞培養(yǎng)物上清的30。/。(vol/vol)稀釋物的條件下，以4xl()S個細胞/cn^的密度培養(yǎng)骨髓巨噬細胞。對TRAP陽性的破骨細胞樣多核細胞(有兩個以上的核)進行組織形態(tài)測定。成骨細胞喊性磷酸酶(ALP)測定(MikihikoMorinobuetal,2005)將6-8周齡的CD200—/_和CD200"+小鼠的骨髓細胞接種在24孔板上(5xl()6個細胞/孔)，培養(yǎng)在補充了10%FBS、50ng/ml抗壞血酸、lOmMp-磷酸甘油的a-MEM中。每3天更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)細胞9天。用冰冷的PBS沖洗細胞2次，刮入含2mMMgCl2和0.05°/。TritonX-100，pH8.2的10mMTris-HCl。在兩輪凍融之后，在冰上短暫超聲細胞裂解物。根據(jù)生產(chǎn)商的指示，對等份(aliquot)的上清進行ALP活性測定(Sigma，StLouis,MI)，并用Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度。礦化小結(jié)節(jié)形成試驗(MikihikoMorinobuetal，200"將6-8周齡的CD200—/_和CD200"+小鼠的骨髓細胞接種在24孔板上(5xl()6個細胞/孔)，培養(yǎng)在補充了10°/。FBS、50ng/ml抗壞血酸、10mM(3-磷酸甘油和抗生素(100U/ml青霉素G,100pg/ml硫酸鏈霉素)的a-MEM中。每3天更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)細胞11天。在培養(yǎng)末期將細胞用10%的甲醛/鹽水固定，并用茜素紅S(Sigma,StLouis,MI)染色鈣，來鑒定礦化的骨小結(jié)節(jié)。記錄每孔的小結(jié)節(jié)數(shù)。流式細胞分析用第一抗體染色細胞，在水上溫育30分鐘，用洗滌緩沖液(5%FCS/PBS)洗滌2次。加入第二抗體，在水上溫育細胞30分鐘。在溫育后，用洗滌緩沖液洗滌細胞2次，懸于FACS分析所用的洗滌緩沖液中，F(xiàn)ACS分析用FACSCalibur(BDBioscience,FranklinLakes,NJ)來進行。逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)在Trizol(Invitrogen,Carlsbad,CA)中根據(jù)生產(chǎn)商說明提取總RNA。用lpg總RNA和莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶合成第一條鏈的cDNA。PCR反應(yīng)的引物對如下GAPDH正向,5'-AAACCCATCACCATCTTCCA-3';反向，5'-GTGGTTCACACCCATCACAA-3'，制備的產(chǎn)物大小為198個堿基；TRAP正向,5'-CAGCTGTCCTGGCTCAAAA-3';反向，5'-ACATAGCCCACACCGTTCTC-3',制備的產(chǎn)物大小為218個堿基；CD200正向,5'-AGTGGTGACCCAGGATGAA-3';反向，5'-TACTATGGGCTGTACATAG-3'，制備的產(chǎn)物大小為337個堿基；CD200R1正向,5'-AGGAGGATGAAATGCAGCCTTA國3';反向，5'-TGCCTCCACCTTAGTCACAGTATC-3',制備的產(chǎn)物大小為103個堿基。對于CD200R2、CD200R3和CD200R4，我們使用Voehringeretal.(2004)所述的引物。在線形范圍內(nèi)進行21-25輪循環(huán)的擴增。將每輪循環(huán)設(shè)定為94°C,30秒；55。C,30秒；和72°C，40秒，在50pl反應(yīng)混合物中含有每種cDNA各0.5jlU，每種引物各200mM,0.2mM的dNTP,以及l(fā)UTaqDNA聚合酶(Invitrogen,Carlsbad,CA)。擴增后，對每份30pl的反應(yīng)混合物進行電泳，在1.2%瓊脂糖凝膠上分析。通過溴化乙啶染色觀察帶，并用數(shù)碼相機掃描。為了進行半定量PCR研究，用KodakID5軟件測量CD200帶相對GAPDH內(nèi)部對照的照明值(illuminantvalue)。制備CD200(sCD200e)和CD200R(sCD200Re)的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域用RT-PCR,使用如下引物從脾細胞cDNA擴增CD200和CD200R的胞外結(jié)構(gòu)域CD200正向，5'-CCCAAGCTTGGGCAAGTGGAAGTGGTGACCC-3，；反向，5'-CGGGATCCCGTGGAACTGAAAACCAAAATCCT-3，；CD200R正向5'-CCCAAGCTTGGGACTGATAAGAATCAAACAACACAGAAC畫3，；反向5'-CGGGATCCCGGTATGGAATATATGGTCGTAATGATTG-3'。將PCR產(chǎn)物亞克隆到pSectag/Hygro載體(Invitrogen,Carlsbad，CA)的HindIII和Bamffl位點中。通過測序確認重組DNA的序列。將可溶性CD200(sCD200e)和sCD200Re構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到293T細胞中，在轉(zhuǎn)染后第4天收獲上清。用Ni-NTA瓊脂糖珠子(Qiagen，Valencia,CA)純化sCD200e和sCD200Re蛋白質(zhì)。用Slide-A-Lyser(Pierce),將最后洗脫的sCD200e和sCD200Re蛋白質(zhì)相對lxPBS進行透析，并用0.22nm注射器式濾器將其滅菌。短發(fā)夾RNA干擾(shRNAi)我們制備了短發(fā)夾RNAs(shRNA)來緘默由U6-Zeocin-shRNAi載體表達CD200R，該載體是用如下引物來作PCR擴增的通用的正向引物5，-gaAGATCTtcGATTTAGGTGACACTATAG(下劃線字母標(biāo)示了BglII酶切位點)；SH1的反向引物5，-gGAATTCcAAAAAAACCAATCATTACGACCATCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAA-3';SH2的反向引物5，-gGAATTCcAAAAATGGGCCTCCACACCTGACCACGGTGTTTCGTCCTTTCCACAA-3';SH3的反向引物5、gGAATTCcAAAAAAAGCAGTATTAATCACATGGGGTGTTTCGTCCTTTCCACAA-3';倒序(scramble)對照的反向引物5，-gGAATTCcAAAAAGACAAGGATGTGTCGTCGACGGTGTTTCGTCCTTTCCACAA-3'(下劃線字母標(biāo)示了SH1、SH2、SH3和倒序?qū)φ盏腅coRI酶切位點)。如前所述(Pearetal，1998),將PCR產(chǎn)物亞克隆到MigRI-IRES-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒栽體中。通過將shRNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到GPG293包裝細胞系，來制備逆轉(zhuǎn)錄病毒。在重新接種非貼壁細胞2天后，用shRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠骨髓衍生的巨噬細胞8小時。然后在補充了30ng/mlM-CSF的生長培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)感染的細胞。感染有效性為大約45-50%,通過在紫外燈下用GFP表達來進行監(jiān)控。用100ng/mlRANKL處理感染的細胞3天，記錄TRAP陽性的破骨細胞。統(tǒng)計學(xué)分析通過方差分析評價試驗組之間的統(tǒng)計學(xué)顯著性差距(Zar,1984)。用不成對的學(xué)生雙尾t檢驗(unpairedStudent'stwo-tailedttest)來檢測平均改變的顯著性，在p〈0.05時認為有顯著性。參考文獻Baron,R.，Vignery，A.，Neff，L.,Silvergate,A.，andSantaMaria,A.1982.Processingofundecalcifiedbonespecimensforbonehistomorphometry.BoneHistomorphometry:TechniquesandInterpretation.RRRecker，腹Frost，Eds.CRCPress,Inc.,BocaRaton,FL.13-35.VigneryA.Osteoclastsandgiantcells:macrophage-macrophagefUsionmechanism.2000.Int.J.Exp.Pathol.81:291-304.20Vignery,A.Macrophageftision:themakingofosteoclastsandgiantcells.Commentary,2005.J.Exp.Med.202:337-340.Vignery,A.Macrophagefbsion:aresomaticandcancercellspossiblepartners2005.TrendsCellBiol.15:188-193.Hernandez,L.D.,Hoffinan，L.R.,Wolfsberg,T.G，andWhite,J.M.Virus-cellandcell-cellfiision.1996.Annu.Rev.CellDev.Biol.12:627-661.ReviewDalgleish,A.G.，Beverly,R，Clapham,P"Crawford,D.，Greaves,M.，andWeiss,R.TheCD4(T4)antigenisanessentialcomponentofthereceptorfortheAIDSretrovirus.1984.Nature(London)312:763-767.Klatzmann,D.，Champagne,E.,Chamaret,S.,Grust,J.,Guetard，D.,Hercent,T.,Gluckmann,J.C.，andMontagnier,L.T-lymphocyteT4moleculebehavesasthereceptorforhumanretrovirusLAV.1984.Nature(London/312:767-768.Saginario,C.，Qian,H.畫Y"andVignery，A.Identificationofaninduciblesurfacemoleculespecifictofiisingmacrophages.1995.Proc.NatlAcad.Sci,USA92:12210-12214.Saginario,C,,Sterling,H.,Beckers,C.，Kobayashi,R.,Solimena,M.，Ullu,E.,andVigneryA.MFR,aputativereceptormediatingthefbsionofmacrophages.1998.Mol.CellBiol.18:6213-6223.Han,X,，Sterling,H.,Chen，Y"Saginario,C.,Brown,E.J.，F(xiàn)razier,W.A.，Lindberg,F.P"andVignery,A.CD47,aligandforMFR，participatesinmacrophagemulti薩leation.2000.J.Biol.Chem.275:37984-37992.Minas,K.,andLiversidge，J.IstheCD200/CD200receptorinteractionmorethanjustamyeloidcellinhibitorysignal2006.CritRev.Immunol.26:213-230.Sterling,H.,Saginario,C.,andVignery,A.CD44occupancypreventsthefiisionofmacrophages.1998.J.CellBiol.143:837-847.Cui,W,ZhangKe,J"Zhang，Q"Ke,R-Z"Ghalouni,C.，andVignery,A.TheintracellulardomainofCD44promotesthefUsionofmacrophages.2006.Blood107:796-805.Arai,F.，Miyamoto,T.,Ohneda，O.，Inada，T.，Sudo，T.，Brasel，K.，Miyata，T.，AndersonD.M.,andSudaT.Commitmentanddifferentiationofosteoclastprecursorcellsbythesequentialexpressionofc陽FmsandreceptoractivatorofnuclearfactorkappaB(RANK)receptors.1999.J,Exp.Med,190:1741-1754.JimiE.,Aoki，K.,Saito,H.,D'Acquisto,F.,May,M丄，Nakamura,I.,Sudo,T.,Kojima,T.，Okamoto，F(xiàn).，F(xiàn)ukushima,H.,Okabe,K.，Ohya,K.,andGhosh,S.SelectiveinhibitionofNF誦kappaBblocksosteoclastogenesisandpreventsinflammatorybonedestructioninvivo.2004.Nat.Med.10:617-624.Hoek,R.M.,Ruuls，S.R.,Murphy,C.A.,Wright,G丄，Goddard,R.,Zurawski,S.M,Blom,B.,Homola,M.E.,Streit，W.J"Brown,M.H.，Barclay,A.N.,Sedgwick,J.D.Down-regulationofthemacrophagelineagethroughinteractionwithOX2(CD200).2000.Science290:1768-1771.Yagi，M.,Miyamoto,T.,Sawatani，Y"Iwamoto,K"Hosogane,N.,Fujita，N.,Morita,K.,Ninomiya,K.,Suzuki,T.,Miyamoto,K.,Oike，Y"Takeya,M.,Toyama，Y"andSuda，T.DC-STAMPisessentialforcell-cellfusioninosteoclastsandforeignbodygiantcells.2005.J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onetal.,1995)。盡管A38L不像CD47—樣是實際的融合蛋白，A38L可能通過形成孔來促使Ca^進入細胞(Sandersonetal.，1996)。事實上，形成孔是寄生蟲進入宿主細胞的經(jīng)典策略(Kirbyetal.,1998)。當(dāng)然，過表達形成孔的P2Z/P2X7受體(針對ATP)會使細胞與細胞融合，但之后細胞會死亡。同樣，過表達CD47或A38L會使細胞死亡(Nishiyamaetal.,1997)。有一種可能性，一旦相對細胞的膜是緊密并生的(apposed)且穩(wěn)定的，那么CD47分子可能會產(chǎn)生刺激細胞與細胞融合的孔。雖然最后這一種可能性不太可靠，但它打開了有趣的研究方向。已經(jīng)在痘病毒、皰滲病毒和腺病毒所屬的雙鏈DNA病毒家族的部分但非所有成員中鑒定出了CD200樣基因(Chungetal.2002;Foster-Cuevasetal.2004)?，F(xiàn)在已知卡波西氏肉瘤相關(guān)性皰滲病毒(KSHV/HHV-8)-K14基因產(chǎn)物是CD200R的配體(chung，2002;foster-cuevas，2004)。類似地，M141R是編碼細胞表面蛋白質(zhì)的粘液瘤病毒基因，該蛋白質(zhì)與CD200有顯著氨基酸相似性，是歐洲兔發(fā)生粘液瘤病毒全身病變所需的(Camronetal.2005)。使用方法如介紹部分所述，破骨細胞是骨發(fā)育和重建所必需的，破骨細胞數(shù)目和/或活性提高會導(dǎo)致與全身性骨質(zhì)流失有關(guān)的疾病。因此，本發(fā)明提供了治療患者的方法，所述患者患有全身性骨質(zhì)流失相關(guān)性疾病，如骨質(zhì)疏松，或其它局部骨質(zhì)流失相關(guān)性疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和牙周病。因此，本發(fā)明提供了治療患癌癥且有骨轉(zhuǎn)移的患者的方法。乳腺癌和前列腺癌分別是女人和男人的主要癌癥死因，僅次于肺癌。在最早階段檢出時，早期檢測并治療這些癌癥使乳腺癌和前列腺癌的5年存活率分別高達98%和100%。然而，一開始就診斷出遠處轉(zhuǎn)移的患者的乳腺癌存活率卻低達26%,有遠處轉(zhuǎn)移的前列腺癌的存活率低達33%。骨骼是乳腺和前列腺癌轉(zhuǎn)移的優(yōu)選位置。很多其它常見癌癥，包括肺和腎的腫瘤、黑素瘤及多發(fā)性骨髓瘤都會侵入骨骼。治療性干擾骨轉(zhuǎn)移有四個主要的靶(A)腫瘤細胞自身，及(B)破骨性骨的重吸收；(C)成骨細胞活性；和(D)圍繞腫瘤細胞自身的特定骨的顯微環(huán)境。靶向破骨細胞構(gòu)成了針對侵入骨骼的所有腫瘤類型的已批準(zhǔn)臨床治療的基礎(chǔ)。對已有的骨轉(zhuǎn)移的現(xiàn)有臨床治療是治標(biāo)的。它們有效地降低了轉(zhuǎn)移，并提高了患者的生活品質(zhì)，但不會提高存活率?，F(xiàn)在我們也發(fā)現(xiàn)，多數(shù)種類的癌癥治療造成骨質(zhì)流失，有骨轉(zhuǎn)移的患者的主要病情是頑固性疼痛。調(diào)節(jié)巨噬細胞融合來阻止出現(xiàn)癌相關(guān)性骨轉(zhuǎn)移是必要的。參考文獻JohnM.ChirgwinandTheresaA.Guise.SkeletalMetastases:DecreasingTumorBurdenbyTargetingtheBoneMicroenvironment.JournalofCellularBiochemistry102:1333-1342(2007)夕卜源才幾體巨細月包(foreignbodygiantcell)多核巨細胞早就被當(dāng)作慢性炎癥的組織學(xué)特征標(biāo)志，慢性炎癥是由持續(xù)存在外來微生物、材料、病原體或其它未限定的病原而引起的。在慢性炎癥環(huán)境中，血單核細胞-衍生的巨噬細胞與巨噬細胞的融合構(gòu)成了多核巨細胞，其形成機制尚不清楚，生理原因也不確定。然而，在植入的生物材料上形成外源機體巨細胞，與材料降解及生物醫(yī)學(xué)設(shè)施失效有關(guān)，由此會導(dǎo)致針對生物醫(yī)學(xué)聚合物的不理想的慢性炎癥應(yīng)答。對巨噬細胞的融合進行調(diào)節(jié)，對于防止巨細胞對植入的用于感應(yīng)(sensing)或遞送分子的生物材料和設(shè)施產(chǎn)生有害作用，是必要的。參考文獻AmyK.McNally,JamesM.Anderson.Multinucleatedgiantcellformationexhibitsfeaturesofphagocytosiswithparticipationoftheendoplasmicreticulum.ExperimentalandMolecularPathology79:126—135(2005)因此，本發(fā)明提供了治療患巨細胞腫瘤的患者的方法。骨的巨細胞肺瘤(GCT)，也稱破骨細胞瘤，是一種原發(fā)的溶骨性骨瘤(boneneoplasm),其中單核的巨噬細胞/破骨細胞前體細胞和多核的破骨細胞樣巨細胞浸潤入腫瘤。GCT也出現(xiàn)在非骨性組織，如子宮中。雖然GCT的起源未知，但已經(jīng)報道GCT腫瘤細胞產(chǎn)生了能夠吸引破骨細胞及它們的前體的化學(xué)引誘物。已經(jīng)推測到GCT起源于單核細胞/巨噬細胞系細胞與它們自身或與腫瘤細胞融合。GCT通常為良性，但在局部卻發(fā)展迅速(aggressive),最常出現(xiàn)在長骨骺。GCT少見于其它骨性位置。骨GCT的轉(zhuǎn)移不常見，通常表現(xiàn)為無痛方式并可用外科手術(shù)治療。GCT更少見表現(xiàn)為更加發(fā)展迅速的表型。調(diào)控巨噬細胞融合來預(yù)防巨細胞腫瘤形成是必要的。參考文獻SkubitzKM,ManivelJCGiantcelltumoroftheuterus:casereportandresponsetochemotherapy.BMCCancer7:46.Review.(2007)本發(fā)明的組合物，可包含CD200/CD200R、激動劑、拮抗劑、基于CD200的生物治療劑、活化抗體或促進途徑活化的片段。為了治療用途，該組合物可以任何常用方式以常用劑型施用。施用途徑包括但不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、滑膜腔內(nèi)、輸注、舌下、經(jīng)皮、口服、局部或吸入途徑。優(yōu)選的施用模式是口服和靜脈內(nèi)施用。所述組合物可以單獨施用或與佐劑包括其它活性組分聯(lián)用，所述佐劑增強抑制劑的穩(wěn)定性、利于施用在某些實施方案中含有它們的藥物組合物、提高分散性(dissolutionordispersion)、提高抑制活性、提供輔助療法等等。這些組合療法有利地使用了常用藥物的較低劑量，從而避免了在多種單一療法(monotherapies)中應(yīng)用那些藥劑可能引發(fā)的毒性或不良副作用。上述組合物可以與常用藥物或其它佐劑以物理方式組成一種藥物組合物。然后可用單一劑型有利地一起施用這些組合物。在一些實施方案中，含有這些聯(lián)用組合物的藥物組合物包含至少約5°/。，更優(yōu)選至少約20。/。的組合物(w/w)或其組合。本發(fā)明組合物最適的百分比(w/w)可能發(fā)生改變，這在本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的范圍內(nèi)?？蛇x地，所述組合物可分開施用(連續(xù)地或并行的)。分開施用可以賦予劑量方案更大的靈活性。如上所述，本文所述組合物的劑型包括本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的可藥用載體及佐劑。這些載體及佐劑包括，例如離子交換劑、氧化鋁(alumina)、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白、緩沖物質(zhì)、水、鹽類或電解質(zhì)以及基于纖維素的物質(zhì)。優(yōu)選的劑型包括片劑、膠嚢劑、小膠嚢劑(caplet)、液體制劑(liquid)、溶液、混懸齊'J(suspension)、乳劑(emulsion)、4t劑、糖漿劑(syrup)、重建的粉末劑(reconstitutablepowder)、顆粒劑、栓劑和經(jīng)皮貼片。制備這些劑型的方法已知(參見例如H.C.Ansel和N.GPopovish，PharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems,5thed.，LeaandFebiger(1990))。劑量水平和要求是本領(lǐng)域公知的，也可由本領(lǐng)域一般技術(shù)人員從適合特定患者的現(xiàn)有方法和技術(shù)中選出。在一些實施方案中，對于70公斤的患者，劑量水平處于約1-1000mg/劑的范圍內(nèi)。盡管每天一劑可能足矣，但每天最多可施用5劑?？诜┬涂赡茏疃嘈枰?000mg/天。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解，需要較低還是較高的劑量取決于特定因素。例如，特定劑量和治療方案取決于如下因素，如患者的全身健康狀況(profile)、患者疾病的嚴重程度和病程或易感性、以及治療大夫的判斷。權(quán)利要求1.生物治療組合物，其包含CD200蛋白質(zhì)或其受體蛋白質(zhì)，或它們的片段，其中所述生物治療組合物活化或抑制CD200途徑。2.抗體或抗體結(jié)合位點，其有效結(jié)合CD200蛋白質(zhì)或其受體蛋白質(zhì)或片段，其中上述結(jié)合CD200或其受體的抗體或抗體結(jié)合位點抑制了破骨細胞的分化。3.抗體或抗體結(jié)合位點，其有效結(jié)合CD200蛋白質(zhì)或其受體蛋白質(zhì)或片段，其中上述結(jié)合CD200或其受體的抗體或抗體結(jié)合位點活化CD200途徑。4.治療疾病或病癥的方法，所述疾病或病癥選自骨質(zhì)疏+〉、佩吉特病(Paget，sdisease)、以骨骼作為優(yōu)選轉(zhuǎn)移位置的轉(zhuǎn)移癌、多核巨細胞起負面作用的疾病或病癥、及巨細胞胂瘤，所述方法包括給患者施用治療有效量的權(quán)利要求1的生物治療組合物或權(quán)利要求3的抗體，該生物治療組合物是CD200與其受體相互作用的激動劑。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述疾病或病癥選自骨質(zhì)疏松、佩吉特病、乳腺癌、前列腺癌、肺腫瘤、腎腫瘤、黑素瘤、多發(fā)性骨髓瘤及對植入進行反應(yīng)產(chǎn)生的慢性炎癥反應(yīng)。6.治療與全身性骨質(zhì)流失有關(guān)的疾病的方法，該方法包括給患者施用治療有效量的權(quán)利要求1的生物治療組合物或權(quán)利要求2的抗體，所述生物治療組合物抑制CD200與其受體的相互作用。7.權(quán)利要求6的方法，其中所述疾病選自骨質(zhì)疏松、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和牙周病。8.鑒定化合物的方法，該化合物抑制CD200與其受體在細胞中相互作用，該方法包含(l)使細胞接觸推定的調(diào)控化合物，其中所述細胞包含CD200及其受體蛋白質(zhì)；和(2)評估推定的調(diào)控化合物抑制CD200與其受體相互作用的能力。9.鑒定化合物的方法，該化合物是CD200與其受體在細胞中相互作用的激動劑，該方法包含(l)使細胞接觸推定的調(diào)控化合物，其中所述細胞包含CD200及其受體蛋白質(zhì)；和(2)評估推定的調(diào)控化合物活化CD200途徑的能力。全文摘要本發(fā)明公開了涉及CD200及其受體CD200R的方法和組合物，它們經(jīng)過破骨細胞分化來調(diào)控骨質(zhì)。文檔編號A61K39/395GK101687033SQ200880007956公開日2010年3月31日申請日期2008年1月10日優(yōu)先權(quán)日2007年1月11日發(fā)明者娟張,軍李,阿格尼斯·維格納瑞申請人:貝林格爾.英格海姆國際有限公司;耶魯大學(xué)