專利名稱：速效型核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在將核酸給予來自動物的細胞或生物時能將核酸 高效地轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)的、毒性低且安全性高的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物、 以及核酸轉(zhuǎn)運用組合物。
背景技術(shù)：
近年，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種在細胞內(nèi)發(fā)揮生理活
性功能的核酸。例如，已知siRNA ( small interfering RNA:小干涉RN A)可引起存在于細胞內(nèi)的靶基因的mRNA分解，阻礙靶基因表達(R NA interference: RNA干涉)。由RNA干涉產(chǎn)生的阻礙耙基因表達的 功能對緩解或治療由特定的基因或基因組的異常表達而引起的疾病有 用，故人們期待將siRNA開發(fā)用作治療藥。但是，為了將以siRNA為 首的核酸用作治療藥，重要的是使siRNA在靶細胞內(nèi)發(fā)揮功能，因此， 確立^f吏核酸有效地轉(zhuǎn)運至耙細胞內(nèi)的4支術(shù)必不可少。
作為將外源性核酸分子或基因轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)的技術(shù)，已知有利用載 體(運載體)的技術(shù)。運載體包括病毒性運載體和非病毒性運載體。病 毒性運載體顯示出高基因?qū)胄?，^f旦病原性、免疫原性、細胞毒性等 在安全性方面存在許多不明之處。因此期望開發(fā)安全性更高的非病毒運 載體。
目前為止，作為促進siRNA等核酸向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運的非病毒性核酸轉(zhuǎn) 運用載體，例如專利文獻1中公開了一種具有特定結(jié)構(gòu)的陽離子性脂 質(zhì)。但是，專利文獻l中公開的陽離子性脂質(zhì)具有在給予培養(yǎng)細胞或生 體時呈現(xiàn)毒性的缺點。另外，專利文獻2中，作為毒性較低、可將siRNA 轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)的載體組合物，公開了含有兩親性化合物及聚陽離子的組 合物。但是，即使是專利文獻2中公開的組合物，在將充分量的siRNA
4導入細胞內(nèi)時，由于其對細胞的毒性變得明顯，所以在安全性方面依然
存在問題。
以上述現(xiàn)有技術(shù)為背景，人們期待開發(fā)出毒性低、能夠使以siRNA 為代表的核酸高效率地轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物。 專利文獻l:特表2002 - 529439號公才艮 專利文獻2:特表2005 - 508394號公報

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的在于解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題。具體而 言，本發(fā)明的目的在于提供一種在將siRNA等核酸給予來自動物的細胞 或動物時能使核酸高效地轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)，且顯示出低毒性和高安全性的 核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物；并提供一種含有該載體組合物和核酸的核酸轉(zhuǎn) 運用組合物。另外，本發(fā)明的其他目的在于提供一種能以高安全性將核 酸高效地轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)的、向細胞內(nèi)導入核酸的方法。
本發(fā)明人等為了解決上述問題進行了潛心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)組合含有 (A) 二酰基磷脂酰膽堿、(B )膽固醇及/或其衍生物及(C )脂肪族 伯胺的組合物，毒性低、顯示出高安全性，且能有效地使核酸轉(zhuǎn)運至細 胞內(nèi)，作為核酸轉(zhuǎn)運用載體是有用的。另外發(fā)現(xiàn)，特別是通過將含有上 述成分(A) ~ (C)的組合物制成脂質(zhì)體形態(tài)進行使用，能夠同時具 有更加優(yōu)異的安全性及核酸導入性。本發(fā)明是基于上述發(fā)現(xiàn)，通過進一 步反復研究而完成的。
即，本發(fā)明提供下述發(fā)明
項1、 一種核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物，其特征在于，含有(A) 二酰 基磷脂酰膽堿、(B)選自膽固醇及其衍生物中的至少一種及(C)月旨
肪族伯胺。
項2、如項1所述的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物，其中，成分(A)為 ?；糠值奶荚訑?shù)為4 23的二酰基磷脂酰膽堿。
項3、如項1或2所述的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物，其中，成分(B)
為膽固醇。項4、如項1所述的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物，其中，成分(C)為 碳原子數(shù)為10 ~ 20的烷基胺。
項5、如項1所述的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物，其中，成分(A)是 選自二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿和二硬脂酰磷脂酰膽 堿中的至少一種，成分(B)為膽固醇，且成分(C)為硬脂胺。
項6、如項1所述的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物，其中，成分(A): (B)成分(C)成分的摩爾比為5~9: 1~5: 1。
項7、如項1所述的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物，是siRNA轉(zhuǎn)運用載體。
項8、如項1所述的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物，是由成分(A) ~ (C) 形成脂質(zhì)體膜的脂質(zhì)體制劑。
項9、 一種核酸轉(zhuǎn)運用組合物，含有核酸及項1所述的核酸轉(zhuǎn)運用 載體組合物。
項10、如項9所述的核酸轉(zhuǎn)運用組合物，其中，核酸為siRNA。 項ll、如項9所述的核酸轉(zhuǎn)運用組合物，是脂質(zhì)體制劑。
項12、 一種核酸導入方法，包括通過使項9所述的核酸轉(zhuǎn)運用組合
物與細胞接觸，使核酸導入細胞內(nèi)的步驟。
項13、如項12所述的核酸導入方法，其中，細胞為培養(yǎng)細胞、從
生物體分離得到的細胞或存在于生物體內(nèi)的細胞。
項14、含有(A) 二?；字Ｄ憠A、(B)選自膽固醇及其衍生
物中的至少一種及(C)脂肪族伯胺的組合物在制備核酸轉(zhuǎn)運用載體中
的應(yīng)用。
項15、如項14所述的應(yīng)用，其中，核酸轉(zhuǎn)運用載體為siRNA轉(zhuǎn)運
用載體。
點，即，能夠有效地將核酸轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)，在細胞內(nèi)能夠有效地發(fā)揮核 酸的有用功能，且毒性低、安全性高。因此，上述核酸轉(zhuǎn)運用載體組合 物及核酸轉(zhuǎn)運用組合物對治療由導入核酸引起的各種疾病、特別是治療 對用低分子化合物等難以治療的難治性疾病有用。
另外，特別是，由于本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物及核酸轉(zhuǎn)運用組合物能有效地抑制作為siRNA副作用的干擾素的表達誘導，所以特別 適用于將siRNA導入細胞內(nèi)。
進而，本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運用組合物可進行凍干處理，因此還具有可 在凍干狀態(tài)下保存的優(yōu)點。


為表示試驗例1的結(jié)果，即評價核酸轉(zhuǎn)運用組合物的細胞安 全性的結(jié)果的圖。為表示評價在試-驗例2中將各核酸轉(zhuǎn)運用組合物中的siRNA 導入細胞內(nèi)的結(jié)果的圖。圖2的縱軸表示每1個細胞的熒光強度的平均值。為表示評價在試驗例2中在核酸轉(zhuǎn)運用組合物中改變核酸轉(zhuǎn) 運用載體的構(gòu)成脂質(zhì)(DSPC、膽固醇和硬脂胺)濃度、將siRNA導入 細胞內(nèi)的結(jié)果的圖。為表示評價在試驗例3中含有siRNA的核酸轉(zhuǎn)運用組合物的 干擾素誘導抑制的結(jié)果的圖。
具體實施例方式
以下，詳細地i兌明本發(fā)明。 核酸轉(zhuǎn)運用載體
本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物的特征在于，含有(A) 二?；?脂酰膽堿、(B)膽固醇及/或其衍生物及(C)脂肪族伯胺。
本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物可以用作用于將核酸轉(zhuǎn)運(導入) 細胞內(nèi)的核酸載體。
本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物適用的核酸只要是必需轉(zhuǎn)運至細 胞內(nèi)的核酸即可，對核酸的種類及結(jié)構(gòu)沒有特別限定。作為該核酸的具 體例，可以舉出siRNA、 mRNA、 tRNA、 rRNA、 cDNA、 miRNA (微 RNA)、核酶、反義寡核苷酸、誘何寡核苷酸、質(zhì)粒DNA、肽核酸、 三鏈形成性寡核苷酸(Triplex Forming Oligonucleotide, TFO)、適體(aptamer)、基因等。其中，本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物具有抑制 作為siRNA的副作用的干擾素的表達誘導的有利特征，因此在將siRNA 向細月包內(nèi)轉(zhuǎn)運方面特別有用。本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運用載體適用的核酸可以 是來自人、動物、植物、細菌、病毒等的核酸，另外，也可以是通過化 學合成制備得到的核酸。進而，上述核酸可以是單鏈、雙鏈或三鏈中的 任一種，并且對其分子量也沒有特別限定。另外，在本發(fā)明中，核酸也 可以是被化學物質(zhì)、酶或肽修飾的核酸。在本發(fā)明中，核酸可以單獨使 用一種，另外，也可以適當?shù)亟M合兩種以上進行4吏用。
作為本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物中使用的二?；字Ｄ憠A
(以下有時也記作"成分(A)，，)，只要藥理學上允許即可，沒有特別 限定，例如可以舉出?；糠值奶荚訑?shù)為4~23的二?；字Ｄ?堿。需要說明的是，構(gòu)成該二酰基磷脂酰膽堿的兩個?；奶荚訑?shù)可 以斗目同也可以不同。
作為本發(fā)明中使用的二?；字Ｄ憠A的具體例，可以舉出二月桂 酰磷脂酰膽堿、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂 酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰膽堿、二亞油酰磷脂酰膽堿、肉豆蔻酰棕 櫚酰磷脂酰膽堿、肉豆蔻酰硬脂酰磷脂酰膽堿、棕櫚酰硬脂酰磷脂酰膽 堿、二丁酰磷脂酰膽堿、二己酰磷脂酰膽堿、二庚酰磷脂酰膽堿、二癸 酰磷脂酰膽堿、二苯二曱酰磷脂酰膽堿(diphthanoylphosphatidylcholin e) 、 二月桂基磷脂酰膽堿、二花生酰磷脂酰膽堿、二 (二十一烷?；? 磷脂酰膽堿、二芥酸酰磷脂酰膽堿、二花生四烯酸酰磷脂酰膽堿及雙(二 十三烷二酰基)磷脂酰膽堿(bis(tricosadinoyl)phosphatidylcholine)等。 其中，優(yōu)選可以舉出酰基部分的碳原子數(shù)為12~18的二?；字Ｄ?堿；更優(yōu)選舉出二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂 酰磷脂酰膽堿、肉豆蔻酰椋櫚酰磷脂酰膽堿、肉豆蔻酰硬脂酰磷脂酰膽 堿和棕櫚酰硬脂酰磷脂酰膽石威等酰基部分的石灰原子數(shù)為13 ~ 17的二酰 基磷脂酰膽堿；特別優(yōu)選舉出二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰 膽堿和二硬脂酰磷脂酰膽堿；最優(yōu)選舉出二硬脂酰磷脂酰膽堿。上述二 ?；字Ｄ憠A可以單獨使用一種，或者也可以組合兩種以上使用。
8作為本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物中使用的膽固醇及/或其衍生物(以下有時也記作"成分(B)")，只要藥理學上允許即可，沒有 特別限定。所謂膽固醇的衍生物，是指具有膽固醇骨架的陽離子性脂質(zhì)， 具體而言可以舉出3|3- [N- (N，， N，-二甲基氨基乙烷)-氨基曱酰 基]膽固醇(DC-Chol) 、 3(3- [N，， N，， N，-三甲基氨基乙烷]碘 化膽固醇(TC-Chol) 、 (N，， N-雙胍乙基氨基乙烷)氨基甲酰-膽 固醇(bis (g腿idinium) - tren - cholesterose) ( BGTC ) 、 N-膽甾烯 基氧基羰基-3， 7-二氮雜壬烷-1, 9-二胺、p-丙氨酸-二乙醇胺 -月旦固醇、N4-精胺膽固醇氨基曱酸酯(GL-67; N4-spermine choles teryl carbamate) 、 N [ N4 - 3 -氨基丙基亞精胺]膽固醇氨基曱酸酯(G L-78; N[N4 - 3 - aminopropylspermidine] cholesteryl carbamate) 、 N4 一升青胺月旦固醇甲酰胺(GL —90; N4-spermine cholesteryl carboxamide )、 N1, N8-雙(精氨酸曱酰胺)-N4-亞精胺膽固醇氨基曱酸酯(GL-9 5; N1， N8 - Bis ( argininc carboxamide) -N4- spermidine cholestery ca rbamate) 、 N- [N1, N4, N8 -三(3-氨基丙基)亞精胺]膽固醇氨 基甲酸酯(GL-96; N-[N1， N4， N8 — Tris ( 3 - aminopropyl) spermidi ne]cholesteryl carbamate)。在本發(fā)明中，作為優(yōu)選的成分(B),可以 舉出膽固醇。本發(fā)明作為成分(B)可以單獨使用膽固醇及其衍生物中 的一種，或者也可以組合兩種以上^f吏用。作為本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物中使用的脂肪族伯胺(以下有 時也記作"成分(C)"),只要藥理學上允許即可，沒有特別限定，例 如可以舉出烷基部分的碳原子數(shù)為10~20的烷基胺。作為本發(fā)明中使用的脂肪族伯胺的具體例，可以舉出月桂胺、肉豆 蔻胺、棕櫚胺、硬脂胺、油胺、癸酰胺、苯二曱酰胺(phthanoylamine) 等。其中，優(yōu)選舉出烷基部分的碳原子數(shù)為12~18的烷基胺；更優(yōu)選 舉出硬脂胺、油胺和椋櫚酰胺，特別優(yōu)選舉出硬脂胺。上述脂肪族伯胺 可以單獨^吏用一種，或者也可以組合兩種以上〗吏用。本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物可以組合含有上述成分(A) ~ (C)，從通過采用下述組合方案進一步提高核酸向細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運效率及低毒性的觀點考慮，優(yōu)選以下列舉的組合(A)?；糠值奶荚?數(shù)為4~23的二?；字Ｄ憠A、(B)膽固醇及/或其衍生物以及(C) 碳原子數(shù)為10 20的烷基胺的組合；更優(yōu)選(A)二肉豆蔻酰磷脂酰膽 堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿及/或二硬脂酰磷脂酰膽堿、(B)膽固醇、 以及(C)硬脂胺的組合。另外，在本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物中，對成分(A) ~ (C) 的配合比率，沒有特別限定，例如可以舉出成分(A):成分(B): 成分(C)的摩爾比為5~9: 1~5: 1，優(yōu)選為6 ~ 9: 1~4: 1，更優(yōu)選 為7 8: 2~3: 1。通過滿足上述比率，可以進一步提高核酸向細胞內(nèi) 的轉(zhuǎn)運效率及低毒性。另外，作為相對于本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運用載體的總量的成分(A) ~ (C)的總量，例如可以舉出1~100重量％、優(yōu)選為20~90重量％、 更優(yōu)選為30 ~ 70重量％ 。本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物除了上述成分(A) ~ (C)之外 還可以含有其他陽離子性脂質(zhì)。作為上述陽離子性脂質(zhì)，具體而言可以舉出角鯊胺(Squalamine) 、 3a, 7a, 12a-三(3-氨基丙氧基)- 5(3 -月旦烷-24- (N, N-雙(3 —氨基丙基)胺(3a, 7a， 12a — Tris(3- aminopropoxy) - 5(3 - cholan - 24 _ (N， N - bis ( 3 - aminopropyl) a mine) 、 3a, 7a, 12a-三(3-氨基丙氧基)-5(3-膽烷_24- (N-(N- (3-氨基丙基))-3-氨基丙基)-胺(3a， 7a, 12a-Tris(3 _ aminopropoxy) - 5b - cholan -24- (N- (N- (3- aminopropyl)) -3 - aminopropyl) — amine) 、 3a， 7a, 12a -三(3 -疊氮基丙氧基) -5p-膽烷-24- (N, N-雙(2-氰基乙基)胺)(3a， 7a, 12a-T ris ( 3 - azidopropoxy) _ 5b - cholan _ 24 - (N， N - bis ( 2 - cyanoethy 1) amine) ) 、 3a, 7a， 12a-三(3-疊氮基丙氧基)-5卩-膽烷-24- (N-(節(jié)氧基羰基)-N-(羥基丙基)-胺)(3a, 7a, 12a-Tr is ( 3 - azidopropoxy) - 5b - cholan - 24 - (N - (benzyloxycarbonyl)- N - ( 3 - hydroxypropyl) - amine))等甾族化合物結(jié)合的陽離子性 脂質(zhì)；傘狀精胺復合體(Umbrella - spermine conjugates )等膽酸結(jié)合的陽離子性脂質(zhì)；甾醇糖苷結(jié)合的陽離子性脂質(zhì)；甾類皂苷結(jié)合的陽離子 性脂質(zhì)；二曱基二 (十八烷基)溴化銨鹽(DDAB) 、 1， 2-二肉豆蔻 ?；?3-三甲基銨丙烷、1， 2-二油?；?3-三曱基銨丙烷(DOTA P) 、 1, 2-二油酰基-3-三曱基銨丙烷甲基硫酸鹽、1, 2-二棕櫚酰 基_3-三甲基銨丙烷、1, 2-二硬脂?；?3-三曱基銨丙烷、N- (1 -(2, 3-雙(油?；趸?丙基)-N, N， N-三甲基銨鹽酸鹽(D OTMA ) 、 二肉豆蔻?；趸趸u基乙基溴化銨鹽(DMRIE)、 二油?；趸趸u基乙基溴化銨(DORIE) 、 二曱基(二)十 二烷基溴化銨、N- (a-三曱基銨基乙酰基)-(二)十二烷基-D-谷氨酰胺鹽酸鹽、N- (a-三曱基銨基乙?；?-O, O，-雙-(1H， 1H, 2H, 2H-全氟癸基)-L-谷氨酰胺鹽酸鹽、0, O，-二(十二烷 ?；?-N- (a-三曱基銨基乙?；?二乙醇胺鹽酸鹽、曱基烯丙基二 (十二烷基)溴化銨、N-{p- (w-三曱基銨基丁基氧基)-苯曱酰 基}-二(十二烷基)-L-谷氨酰胺鹽酸鹽、9- (w-三曱基銨基丁 基)-3, 6-雙(十二烷?；??？ㄟ蜾寤铩⒍趸?十八烷基)銨 鹽酸鹽、N-w-三曱基銨基十二烷?；?二(十六烷基)-D-谷氨酰 胺溴化物、N-{p- (w-三曱基銨基己基氧基)-苯曱酰基}-二(十 四烷基)-L-谷氨酰胺溴化物、p- (w-三曱基銨基癸基氧基)-p， -辛氧基偶氮苯溴化物鹽(MC-1-0810) 、 p-(w- (b-羥基乙基) 二曱基-銨基-癸基氧基)-p，-辛氧基偶氮苯溴化物鹽(MC-3-08 10) 、 O， O，， 0"-三(十二烷?；?-N- (w-三甲基-銨基癸酰 基)-三(羥基曱基)氨基曱烷溴化物鹽(TC-1-12) 、 1， 2-二月 桂基-甘油-3-乙基磷酸膽堿、1, 2-二肉豆蔻酰基-甘油-3-乙基 磷酸膽堿、1, 2-二棕櫚?；?甘油-3-乙基磷酸膽堿、1， 2-二硬 脂?；鵢甘油-3 -乙基磷酸膽堿、1 ， 2 - 二油酰基-甘油-3 -乙基磷 酸膽堿、1 -棕櫚酰-2 -油?；?甘油-3 -乙基磷酸膽堿等季銨鹽型 陽離子性脂質(zhì)等。在本發(fā)明中，含有除成分(A) ~ (C)之外的其他陽離子性脂質(zhì) 時，作為該陽離子性脂質(zhì)的比例，只要不影響本發(fā)明的效果即可，沒有特別限定，可以舉出下述比例，即相對于100重量份上述成分(A) ~ (C)的總量，該陽離子性脂質(zhì)為1~10重量份、優(yōu)選為2 8重量份、 更優(yōu)選為4 ~ 6重量份。進而，根據(jù)需要本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物也可以含有油性基 劑。配合油性基劑，利用其特性，由此能控制核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物的 核酸導入效率。例如通過配合油性基劑調(diào)節(jié)核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物的比 重，可以控制細胞與核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物的接觸性，改善體外的導入 效率。另外，例如通過配合具有溫度感受性功能的基劑作為油性基劑， 能夠在規(guī)定的溫度條件下使核酸載體組合物的芯破碎，從而誘發(fā)細胞表 面的波動，提高核酸的導入效率。進而，例如通過配合具有外部刺激破 碎性的基劑作為油性基劑，可以通過外部刺激使核酸載體組合物的芯破 碎，從而誘發(fā)細胞表面的波動，提高核酸的導入效率。作為本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物中配合的油性基劑，例如可以 舉出全氟化碳、全氟戊烷、溴代全氟辛烷、全氟己烷、全氟三丁基胺、 大豆油、精制大豆油、氫化大豆油、大豆油非皂化物、角鯊烯、蓖麻油、 丁香油、失水山梨醇三油酸酯、松節(jié)油、紅花油、紅花油脂肪酸、油酸、 椰子油、菜子油、雜醇油、橄欖油、亞麻仁油、芝麻油、葉綠素油、巴 豆油、佛手油、雪^>油、；險油、茴香油、桉^"油、玉米油、熏衣草油、 香馬郁蘭油、檸檬油、棉籽油、蛋黃油、玫瑰花油、松油、杏仁油、花 生油、山茶油、白樟油、春黃菊油、桂皮油、薄荷油、酯化玉米油、生 姜油、羅馬春黃菊油、蛇油、留蘭香油、向日葵油、可可脂、小麥胚芽 油、氧化鋅油、氫化油、氫化植物油、輕質(zhì)液體石蠟、液體石蠟、中鏈 脂肪酸三甘油酯、貂油、苦橙油、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氫化蓖麻 油、聚氧乙烯氫化蓖麻油IO、聚氧乙烯氫化蓖麻油100、聚氧乙烯氫化 蓖麻油20、聚氧乙烯氫化蓖麻油40、聚氧乙烯氫化蓖麻油5、聚氧乙烯 氫化蓖麻油50、聚氧乙烯氫化蓖麻油60、蓖麻油聚烴氧酯35、操作油 等。在上述油性基劑中，全氟戊烷具有溫度感受性、具有在29.5。C下通 過沸騰氣化的特性。另外，全氟己烷、溴代全氟辛烷及全氟三丁基胺具 有下述特性，即具有外部刺激破碎性，在由超聲波照射產(chǎn)生的刺激等來自外部的刺激作用下，使載體組合物的芯產(chǎn)生空腔，使其破碎。當核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物含有該油性基劑時，作為該油性基劑的比 例，只要不妨礙本發(fā)明的效果即可，沒有特別限定，例如可以為下述比例，即相對于IOO重量份上述成分(A) ~ (C)的總量，該油性基材 為0.1 50重量份、優(yōu)選為1 30重量份、更優(yōu)選為5 20重量份。進而，根據(jù)需要本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物中也可以含有膜融 合性脂質(zhì)(輔助脂質(zhì))。通過含有上述膜融合性脂質(zhì)，可以進一步提高 核酸向細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運效率。作為上述膜融合性脂質(zhì)，例如可以舉二油酰 基磷脂酰乙醇胺、二油?；字Ｄ憠A、反式磷脂?；字；掖及?、 1, 2-雙(IO, 12-二十三烷二?；?-磷酸乙醇胺、1， 2-二反油酰 基磷酸乙醇胺、1， 2-二 (十六烷基)磷酸乙醇胺、1, 2-二己?；?酸乙醇胺、1, 2-二月桂酰基磷酸乙醇胺、1, 2-二亞油?；姿嵋掖?胺、1， 2-二肉豆蔻?；姿嵋掖及贰?， 2-二油?；姿嵋掖及贰?, 2-二棕櫚油?；姿嵋掖及贰?， 2-二棕櫚?；姿嵋掖及贰?， 2-二植烷酰磷酸乙醇胺、1, 2-二硬脂酰基磷酸乙醇胺、l-棕櫚酰基-2 -油?；姿嵋掖及?、1-棕櫚?；?2- (10， 12-二十三烷二酰基) 磷酸乙醇胺、1, 2-二油?；姿嵋掖及?N-己酰胺、1, 2-二棕櫚 酰基磷酸乙醇胺-N-己酰胺、N， N-二曱基-1, 2-二油?；姿嵋?醇胺、N, N-二曱基-l， 2-二棕櫚?；姿嵋掖及贰-十二烷?；?-1, 2-二棕櫚?；姿嵋掖及?、N-十二烷?；?1， 2-二油?；?酸乙醇胺、1, 2-二油?；姿嵋掖及?N-十二烷基胺、1, 2-二棕 櫚?；姿嵋掖及?N-十二烷基胺、1， 2-二油?；姿嵋掖及?N -戊二酰、1, 2-二棕櫚?；姿嵋掖及?N-戊二酰、1， 2-二油酰 基磷酸乙醇胺-N-乳糖、1， 2-二油?；姿嵋掖及?N-[4 (p-馬 來酰亞胺曱基)環(huán)己烷-羧酸鹽、二棕櫚?；姿嵋掖及?N-[4 (p -馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-羧酸鹽、1, 2-二棕櫚?；姿嵋掖及?N-[4 (p-馬來酰亞胺苯基)丁酰胺、1, 2-二油?；姿嵋掖及?N -[4 (p-馬來酰亞胺苯基)丁酸鹽]、N-曱基-l, 2-二油?；姿?乙醇胺、N-曱基-二棕櫚酰基磷酸乙醇胺、1， 2-二油?；姿嵋掖及?N-[3- (2-吡啶二石克)丙酸鹽、1, 2-二棕櫚?；姿嵋掖及?N-[3- (2-吡咬二碌J丙酸鹽、N-(琥珀酰)-1， 2-二油?；?酸乙醇胺、N-(琥珀酰)-1, 2-二棕櫚?；姿嵋掖及返取Ｆ渲?， 在本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物中優(yōu)選使用二油?；字Ｒ掖及?。 當核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物含有該膜融合性脂質(zhì)時，作為該膜融合性 脂質(zhì)的比例，只要不妨礙本發(fā)明的效果即可，沒有特別限定，可以舉出 下述比例，即相對于100重量份上述成分(A) ~ (C)的總量，該膜 融合性脂質(zhì)為1 ~ 500重量份、優(yōu)選為10 ~ 250重量份、更優(yōu)選為25 ~ 100重量份。
根據(jù)使用形態(tài)，本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物可以含有等滲劑、 賦形劑、稀釋劑、增稠劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、保存劑等各種添加劑；精 制水、糖水溶液、緩沖液、生理鹽水、高分子水溶液、RNase free水等 水性載體。上述添加劑和水性載體的配合量可以根據(jù)核酸轉(zhuǎn)運用載體的 使用形態(tài)適當?shù)卦O(shè)定。
本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物的形態(tài)只要能夠包含成為轉(zhuǎn)運至 細胞內(nèi)的對象的核酸即可，沒有特別限定，優(yōu)選脂質(zhì)體形態(tài)。
將本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物制成脂質(zhì)體形態(tài)時，上述成分 (A) ~ (C)及根據(jù)需要添加的其他脂質(zhì)形成脂質(zhì)體膜。制成脂質(zhì)體 形態(tài)時，可以為小單層脂質(zhì)體(smallunilamellar, vesicles: SUV)、大單 層月旨質(zhì)體(large unilamellar vesicles: LUV)、及多層月旨質(zhì)體(multilamellar vesicles: MLV)中的任一種。另外，對于其粒徑，可以根據(jù)轉(zhuǎn)運對象的 細胞種類等適當?shù)卦O(shè)定，例如可以舉出為SUV時粒徑為20~100nm、 為LUV時粒徑為200 ~ 1000nm、為MLV時粒徑為400 ~ 3500nm左右。 脂質(zhì)體的粒徑是根據(jù)動態(tài)光散射法而測定得到的。
脂質(zhì)體的制備及其粒徑的調(diào)節(jié)按照本領(lǐng)域公知的方法實施。即， 可以使用含有上述成分(A) ~ (C)的油相和水相(水性載體)，通 過薄膜法、逆向蒸發(fā)法、醚注入法、表面活性劑法、加熱法等形成脂質(zhì) 體。另外，可以通過^^壓法、French press法、均質(zhì)化法等調(diào)節(jié)粒徑。
本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物如下配制混合上述成分(A)、
14成分(B)及根據(jù)需要混合的其他成分，根據(jù)目的形態(tài)適當?shù)刂苿┗?br> 核酸轉(zhuǎn)運用組合物
酸。即，該核酸轉(zhuǎn)運用組合物用于將在該組合物內(nèi)含有的核酸導入作為 轉(zhuǎn)運對象的細胞內(nèi)。
核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物為脂質(zhì)體形態(tài)時，在該核酸轉(zhuǎn)運用組合物 中，核酸可以以被封入在脂質(zhì)體的內(nèi)水相中的狀態(tài)存在，或也可以以通 過離子鍵或疏水鍵鍵合在脂質(zhì)體膜的內(nèi)側(cè)或外側(cè)的狀態(tài)存在。另外，核 酸轉(zhuǎn)運用載體組合物為脂質(zhì)體以外的形態(tài)時，在該核酸轉(zhuǎn)運用組合物 中，只要核酸與核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物的配合成分通過離子鍵或疏水鍵 形成復合體即可。
本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運用組合物通過混合上述核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物 與核酸制成所期望的形態(tài)，或以任意順序混合核酸及上述核酸轉(zhuǎn)運用載 體組合物的配合成分制成所期望的形態(tài)而進行制備。
在本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運用組合物中，作為核酸與核酸轉(zhuǎn)運用載體組合 物的配合比率，根據(jù)使用的核酸或核酸轉(zhuǎn)運用載體的種類或為核酸轉(zhuǎn)運 對象的細胞的種類等而不同，例如可以舉出下述比例，即相對于核酸轉(zhuǎn)
運用載體組合物中所含的成分(A) ~ (C)的總量100重量份，核酸 為l.OxlO—5-1.0重量份、優(yōu)選為l.OxlO.4 ~ 1.0x10"重量份、更優(yōu)選為1.
0><10—3~ I.OXIO'2重量份。
另外，作為核酸轉(zhuǎn)運用組合物中含有的成分(A) ~ (C)的總量， 相對于該組合物的總量，例如可以舉出10~90重量％、優(yōu)選為30~80 重量％、更優(yōu)選為40~60重量％。
根據(jù)其使用形態(tài)，本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運用組合物可以含有等滲劑、賦 形劑、稀釋劑、增稠劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、保存劑等各種添加劑；精制 水、葡萄糖水溶液、緩沖液、生理鹽水等水性載體。上述添加劑和水性 載體的配合量可以根據(jù)核酸轉(zhuǎn)運用組合物的使用形態(tài)而適當?shù)卦O(shè)定。
在本發(fā)明中，作為轉(zhuǎn)運核酸的細胞，可以舉出培養(yǎng)細胞、從生物體 中萃取的細胞(包括株化的細胞)、存在于人等生物體內(nèi)的細胞等。作為本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運用組合物的使用狀態(tài)，只要能使適量的該核酸轉(zhuǎn)運用組合物與作為核酸導入對象的細胞接觸即可，沒有特別限定。例如，向人等生物體內(nèi)的細胞中轉(zhuǎn)運核酸時，例如可以舉出向組織中直
接注入；向靜脈、皮下、肌肉、腹腔、眼內(nèi)、消化器官內(nèi)、牙內(nèi)等注射；從鼻腔、口腔、肺等吸入給予；口服給予；通過皮膚的透皮給予；及通過口腔粘膜、陰道粘膜、眼粘膜、直腸粘膜、子宮粘膜的經(jīng)粘膜給予等。另外，在向培養(yǎng)細胞或從生物體萃取的細胞中轉(zhuǎn)運核酸時，可以舉出培養(yǎng)時將適量的核酸轉(zhuǎn)運用組合物預先加到培養(yǎng)基中，在該狀態(tài)下培養(yǎng)細胞的方法。需要說明的是，向培養(yǎng)細胞或從生物體萃取的細胞中轉(zhuǎn)運核酸時，即使在血清存在下也可以將核酸轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)。
另外，相對于作為核酸導入對象的細胞，本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運用組合物的使用量，根據(jù)使用的核酸種類、該核酸轉(zhuǎn)運用組合物的種類、作為對象的細胞的種類等適當?shù)卦O(shè)定。例如核酸的轉(zhuǎn)運對象為人體內(nèi)的細胞時，對期待通過給予核酸得到治療效果的患者可以給予治療有效量的本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運用組合物。
實施例
以下，基于實施例等詳細地說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限定于此。需要說明的是，在以下實施例等中，二硬脂酰磷脂酰膽堿記作"DSPC"、二棕櫚酰磷脂酰膽堿記作"DPPC"、 二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿記作"DMPC"。另外，在以下試驗例1及2中使用GL3-siRNA (相對于靶向螢火蟲熒光素酶的siRNA; Dharmacon公司，Boulder, CO， USA;有意義5，-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT、反義5， - UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT)作為siRNA。另夕卜，在試驗例3中，使用人MMP-9-siRNA (Samchully Pharm. Co" Ltd, Korea;有意義5'-CCAACUAUGACCAGGAUAAdTdT-3，，反義5， - UUAUCCUGGUCAUAGUUGGdTdT - 3，)作為siRNA。
實施例1含有DSPC的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物的配制
稱量DSPC、膽固醇和硬脂胺使其以摩爾比為DSPC:膽固醇硬脂胺=7: 3: 1,用茄型瓶使之溶解于氯仿中。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀使之減壓干燥，形成脂質(zhì)薄膜。向其中加入DEPC-處理水(Ambion公司制；Rnase free水)使以DSPC濃度計為30mg/mL后，用擠壓機通過lOOnm孔徑的膜來調(diào)節(jié)粒徑，制備為陽離子性脂質(zhì)體形態(tài)的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物。
實施例2含有DPPC的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物的制備
除使用DPPC代替DSPC之外，采用與上述實施例1同樣的方法，制備陽離子性脂質(zhì)體形態(tài)的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物。實施例3含有DMPC的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物的制備
除使用DMPC代替DSPC之外，采用與上述實施例1同樣的方法，制備陽離子性脂質(zhì)體形態(tài)的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物。實施例4含有DSPC的核酸轉(zhuǎn)運用組合物的制備
使用利用DEPC -處理水(Ambion公司制；Rnasefree水)將20xTris — EDTA ( TE)緩沖液(Invitrogen公司制)稀釋20倍的溶液，配制以2|iM的濃度含有siRNA的溶液(siRNA溶液)。然后，等量混合實施例1的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物與siRNA溶液，形成脂質(zhì)體復合物(復合體)，制備核酸轉(zhuǎn)運用組合物。實施例5含有DPPC的核酸轉(zhuǎn)運用組合物的制備
使用以DEPC -處理水(Ambion公司制；Rnasefree水)將20xTris-EDTA (TE)緩沖液(Invitrogen公司制)稀釋20倍的溶液，配制以2pM的濃度含有siRNA的溶液(siRNA溶液)。然后，等量混合實施例2的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物與siRNA溶液，形成脂質(zhì)體復合物(復合體)，配制核酸轉(zhuǎn)運用組合物。實施例6含有DMPC的核酸轉(zhuǎn)運用組合物的配制
使用利用DEPC -處理水(Ambion公司制；Rnasefree水)將20xTris _ EDTA ( TE)緩沖液(Invitrogen公司制)稀釋20倍的溶液，配制以2jiM的濃度含有siRNA的溶液(siRNA溶液)。然后，等量混合實施例3的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物與siRNA溶液，形成脂質(zhì)體復合物(復合體)，配制核酸轉(zhuǎn)運用組合物。試驗例1細胞安全性的評價試驗
利用MTS試驗法進行評價。MTS試驗利用Promega公司制的"CellTiter96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay"進4亍。具體而言，在96孔板上將A594細胞(ATCC， USA)以3.16xl()4cells/孔接種在200pL含有10容量％胎牛血清(FBS )的Dulbecco，s Modification ofEagle's培養(yǎng)基(DMEM)中，在37。C下培養(yǎng)24小時。用Hank's緩沖鹽溶液(HBSS )洗滌3次后，將培養(yǎng)基更換為不含F(xiàn)BS的DMEM，向每1孔中分別加入20pL上述實施例4 ~ 6的核酸轉(zhuǎn)運用組合物，在37°C 、5。/。C02條件下培養(yǎng)4小時。然后，將孔中的培養(yǎng)上清液更換為含有10容量。/。FBS的DMEM，進一步在37°C、 5%0)2條件下培養(yǎng)20小時。然后，向各孔中加入20]iL MTS (曱烷硫代磺酸酯)試劑及l(fā)OOpL含有10容量％ FBS的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)2小時后，測定在492nm處的吸光度，計算細胞存活率(cellviability)。需要說明的是，細胞存活率是以不添加核酸轉(zhuǎn)運用組合物在上述條件下培養(yǎng)時測定的490nm處的吸光度為100%計算得到的。
所得結(jié)果示于圖1。由圖l可知，實施例4~6的核酸轉(zhuǎn)運用組合物均顯示出低細胞毒性、高安全性。特別是，能夠確認使用DSPC或DPPC作為二酰基磷脂酰膽石咸的核酸轉(zhuǎn)運用組合物(實施例4或5 )的安全性明顯高。
試驗例2 siRNA向細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運效率的評價試驗
通過使用流式細胞儀測定標記在siRNA上的FITC的熒光強度來評價細胞內(nèi)導入。需要說明的是，本試驗使用的核酸轉(zhuǎn)運用組合物是使用在siRNA上預先進行FITC標記的siRNA配制得到的。具體而言，在24孔板上將A594細胞(ATCC， USA)以5xl()5cells/孔接種至500jaL含有10容量％ FBS的DMEM中，在37°C 、 5 % C02條件下培養(yǎng)24小時。用HBSS洗滌3次后，將培養(yǎng)基更換為不含F(xiàn)BS的DMEM，進一步向每1孔中分別加入0.05mL上述實施例4~6的核酸轉(zhuǎn)運用組合物，在37°C、 5%(^02條件下培養(yǎng)4小時。然后，將孔中的培養(yǎng)上清液更換為含有10容量。/。FBS的DMEM，進一步在37。C、 5%(302條件下培養(yǎng)20小時。將各孔用HBSS洗滌1次后，加入0.2mL CellScrubBuffer ( GeneTherapy Systems, Inc.制),在37。C、 5 %C02條件下培養(yǎng)15分鐘。進而，用HBSS洗滌2次后，使用胰蛋白酶剝?nèi)「街诳椎撞康募毎?，通過離心分離回收細胞，使所得細胞懸浮于HBSS中。使上述懸浮液通過41|im孔徑的膜。用流式細胞4義測定加入核酸轉(zhuǎn)運用組合物2小時后及24小時后的細胞的熒光強度。另外，作為對照，使用下述對照用核酸轉(zhuǎn)運用組合物，與上述相同地測定細胞的熒光強度，所述對照用核酸轉(zhuǎn)運用組合物如下制備以容量比l: 1混合用OptiMEM培養(yǎng)基將市售的常用作基因運載體的Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司制)稀釋至O.lmg/mL的溶液、和用TE緩沖液以2pM的濃度稀釋siRNA的siRNA溶液。
所得結(jié)果示于圖2。由上述結(jié)果可以確認，為實施例4~6的核酸轉(zhuǎn)運用組合物的任意一種的情況下，siRNA均能被高效地導入細胞內(nèi)。特別是，也能夠表明使用DSPC或DMPC作為二?；字Ｄ憠A的核酸轉(zhuǎn)運用組合物(實施例4及6),在加入2小時后siRNA向細胞內(nèi)的導入與市售的常用作基因運載體的Lipofectamine 2000相比較顯著，具有速效性優(yōu)異的有利特征。
另夕卜，使用DSPC、膽固醇和硬脂胺(以摩爾比計DSPC:膽固醇硬脂胺=7: 3: 1，以下，統(tǒng)稱為"核酸轉(zhuǎn)運用載體的構(gòu)成脂質(zhì)")，基于實施例1所述的方法制備DSPC的濃度為7.5 ~ 30mg/mL的核酸轉(zhuǎn)運用載體。然后，等量混合該核酸轉(zhuǎn)運用載體與含有200nM的siRNA的TE緩沖液，形成脂質(zhì)體復合物(復合體)，制備核酸轉(zhuǎn)運用組合物。使用上述制備得到的核酸轉(zhuǎn)運用組合物，采用與上述同樣的方法評價siRNA向細胞內(nèi)的導入。結(jié)果示于圖3。結(jié)果表明，如果改變核酸轉(zhuǎn)運用載體的構(gòu)成脂質(zhì)的濃度，則利用核酸轉(zhuǎn)運用組合物向細胞內(nèi)導入核酸的量相應(yīng)地發(fā)生變化。另外，表明核酸轉(zhuǎn)運用載體構(gòu)成脂質(zhì)為任何濃度時，導入siRNA的量在加入24小時后的值^f氐于在加入2小時后的值，并且在加入24小時后siRNA開始消失。即，由上述結(jié)果還可以確認，通過組合DSPC、膽固醇和硬脂胺用作核酸轉(zhuǎn)運用載體，可以在加入2小時
19后的短時間內(nèi)將siRNA轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)，速效性優(yōu)異。 試驗例3干擾素誘導抑制的評價試驗
在24孔板上將A594細胞(ATCC, USA)以5xl()5cells/孔接種在 500|iL含有10容量％ FBS的DMEM中，在37°C 、 5 % C02條件下培養(yǎng) 24小時。用HBSS洗滌3次后，向各孔中加入450pL不含F(xiàn)BS的DMEM 培養(yǎng)基，再向各孔中加入50pL上述實施例4的核酸轉(zhuǎn)運用組合物，在 37°C、 5。/。C02條件下培養(yǎng)4小時。然后，將孔中的培養(yǎng)上清液更換為 含有10容量。/。FBS的DMEM,進一步在37。C、 5%0)2條件下培養(yǎng)20 小時。進而，用HBSS洗滌3次后，使用胰蛋白酶剝?nèi)「街诳椎撞康?細月包，通過離心分離回收細胞。使用Rneasy Plus Mini (Qiagen^^司制) 從得到的細胞中萃取RNA,使用QutantiTect Reverse Transcription (Qiagen公司制)轉(zhuǎn)錄得到cDNA。利用所得cDNA、 QutantiTectPrimer Assay ( Qiagen公司制)和iCycler iQ ( Bio - RAD公司制)，通過實時 熒光定量PCR (real-time PCR)對作為干擾素誘導基因的IFIT-1的 mRNA進行定量。作為對照，使用下述對照用核酸轉(zhuǎn)運用組合物，與上 述同樣地定量IFIT-1的mRNA,所述對照用核酸轉(zhuǎn)運用組合物如下制 備以容量比l: 1混合用OptiMEM培養(yǎng)基將市售的常用作基因運載體 的Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司制)稀釋至0.1mg/mL的溶液、 和用TE緩沖液以濃度為2pM稀釋siRNA的siRNA溶液。用于定量校 正的管家基因使用18rRNA。另外，作為空白，不添加核酸轉(zhuǎn)運用組合 物在上述條件下定量IFIT - 1的mRNA。
所得結(jié)果示于圖4。使用DSPC的實施例4的核酸轉(zhuǎn)運用組合物與 使用Lipofect amine 2000的對照用核酸轉(zhuǎn)運用組合物相比，顯示出明 顯低的干擾素誘導。上述結(jié)果表明通過使用本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)運用組合 物，可以抑制作為siRNA的副作用的干擾素誘導。
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權(quán)利要求
1、一種核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物，其特征在于，含有(A)二?；字Ｄ憠A、(B)選自膽固醇及其衍生物中的至少一種及(C)脂肪族伯胺。
2、 如權(quán)利要求1所述的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物，其中，成分(A)為?；糠值奶荚訑?shù)為4~23的二酰基磷脂酰膽堿。
3、 如權(quán)利要求1或2所述的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物，其中，成分(B) 為膽固醇。
4、 如權(quán)利要求1所述的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物，其中，成分(C)為碳原子數(shù)為10 ~ 20的烷基胺。
5、 如權(quán)利要求1所述的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物，其中，成分(A)是選自二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽石威和二硬脂酰磷脂酰膽堿中的至少一種，成分(B)為膽固醇，且成分(C)為硬脂胺。
6、 如權(quán)利要求1所述的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物，其中，成分(A):成分(B):成分(C)的摩爾比為5~9: 1-5: 1。
7、 如權(quán)利要求1所述的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物，是siRNA轉(zhuǎn)運用載體u
8、 如權(quán)利要求1所述的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物，是由成分(A) ~(C) 形成脂質(zhì)體膜的脂質(zhì)體制劑。
9、 一種核酸轉(zhuǎn)運用組合物，含有核酸及權(quán)利要求1所述的核酸轉(zhuǎn)運用載體組合物。
10、 如權(quán)利要求9所述的核酸轉(zhuǎn)運用組合物，其中，核酸為siRNA。
11、 如權(quán)利要求9所述的核酸轉(zhuǎn)運用組合物，是脂質(zhì)體制劑。
12、 一種核酸導入方法，包括通過使權(quán)利要求9所述的核酸轉(zhuǎn)運用組合物與細胞接觸，使核酸導入細胞內(nèi)的步驟。
13、 如權(quán)利要求12所述的核酸導入方法，其中，細胞為培養(yǎng)細胞、從生物體分離得到的細胞或存在于生物體內(nèi)的細胞。
14、 含有(A) 二?；字Ｄ憠A、(B)選自膽固醇及其衍生物中的至少一種及(c)脂肪族伯胺的組合物在制備核酸轉(zhuǎn)運用載體中的應(yīng)用。
15、如權(quán)利要求14所述的應(yīng)用，其中，核酸轉(zhuǎn)運用載體為siRNA轉(zhuǎn)運用載體。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種在將siRNA等核酸給予來自動物的細胞或動物時能使核酸高效地轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)、且毒性低、安全性高的核酸轉(zhuǎn)運用載體、以及含有該載體與核酸的核酸轉(zhuǎn)運用組合物。本發(fā)明通過組合(A)二?；字Ｄ憠A、(B)選自膽固醇及其衍生物中的至少一種及(C)脂肪族伯胺，將其配合，制備核酸轉(zhuǎn)運用載體。另外，通過混合該核酸轉(zhuǎn)運用載體與核酸來制備核酸轉(zhuǎn)運用組合物。
文檔編號A61K31/7088GK101646443SQ20088001003
公開日2010年2月10日 申請日期2008年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月26日
發(fā)明者中野浩士, 豐福秀一, 平安幸, 竹內(nèi)洋文 申請人:竹內(nèi)洋文;大塚制藥株式會社