專利名稱：具有交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)作用的醫(yī)藥組合物或飲食物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有2，3- 二氫-3， 5- 二羥基-6-甲基-4H-吡喃_4_酮，具有自律神 經(jīng)調(diào)節(jié)作用的醫(yī)藥組合物或飲食物。本發(fā)明還涉及具有交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)作用，進(jìn)而具有 能量代謝的促進(jìn)作用，用于治療與自律神經(jīng)活動(dòng)、或能量代謝相關(guān)的疾病或狀態(tài)、特別是肥 胖癥及/或其合并癥的上述醫(yī)藥組合物或飲食物。
背景技術(shù)：
為了維持生物體的恒常性，生物體具有自律神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)。其 中，因?yàn)樽月缮窠?jīng)系統(tǒng)從大腦的支配中比較獨(dú)立地、特別是無意識(shí)地自動(dòng)工作，所以賦予了 它這個(gè)名字，主要是在調(diào)節(jié)內(nèi)臟的功能。自律神經(jīng)系統(tǒng)中有交感神經(jīng)系統(tǒng)和副交感神經(jīng)系 統(tǒng)這2個(gè)系統(tǒng)，通過兩者的平衡受到控制。即身體在活動(dòng)時(shí)交感神經(jīng)的活動(dòng)占優(yōu)勢(shì)，全身 處于緊張狀態(tài)。相反，副交感神經(jīng)的活動(dòng)占優(yōu)勢(shì)時(shí)，身體的緊張得到解除，處于放松的狀態(tài) (非專利文獻(xiàn)1)。此外，交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)時(shí)，引起瞳孔擴(kuò)大、心跳過速、血壓升高、物質(zhì)代 謝，高血糖等，副交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)時(shí)，使消化吸收系統(tǒng)活躍，產(chǎn)生汗液、唾液的分泌等。還 知道白色脂肪組織及褐色脂肪組織的功能調(diào)節(jié)與自律神經(jīng)活動(dòng)相關(guān)，白色脂肪組織除交感 神經(jīng)活動(dòng)之外，其功能還通過血液中的激素來調(diào)節(jié)，褐色脂肪組織主要通過交感神經(jīng)活動(dòng) 來調(diào)節(jié)功能(非專利文獻(xiàn)2)。 另一方面，肥胖不僅在發(fā)達(dá)國(guó)家，在發(fā)展中國(guó)家也成為嚴(yán)重的健康障礙，需要采取 國(guó)際性措施，表示肥胖度的基準(zhǔn)的body mass index(BMI)為25以上的人中，伴隨著BMI的 增加，高血壓、高血糖、高中性脂肪血癥等各種疾病的患病率呈直線增加(非專利文獻(xiàn)3)。 此外，因肥胖而發(fā)病的大多種病態(tài)，并不僅通過肥胖度，也可通過內(nèi)臟脂肪的蓄積來判斷。
在這種背景下，世界各國(guó)都在開發(fā)、使用抗肥胖藥，并且已知這些藥物的副作用。 作為代表例，曲美(Sibutramine) (Knoll公司Meridia等)具有心跳次數(shù)增加、血壓升高的 可能性，對(duì)于患有肥胖者容易伴隨發(fā)生的癥狀高血壓癥、心絞痛、充血性心力衰竭、腦中風(fēng) 的患者，具有難于開處方的一面。此外，有時(shí)發(fā)現(xiàn)奧利司他(Roche公司的Xenical)有強(qiáng)烈 下泄、脂肪便的副作用。 在日本，作為抗肥胖藥，主要使用已報(bào)道的通過褐色脂肪組織的活性作用產(chǎn)生抗 肥胖效果的馬吲哚(Mazindol) (Sanorex)(非專利文獻(xiàn)4)、防風(fēng)通圣散。防風(fēng)通圣散含有 18種生藥，其中麻黃中含有1-麻黃素和d-偽麻黃堿，增強(qiáng)從交感神經(jīng)末梢釋放去甲腎上腺 素，使褐色脂肪組織的P-腎上腺素受體活化(非專利文獻(xiàn)5)。這些藥劑中也報(bào)道了副作 用，確認(rèn)馬吲哚(Mazindol)有口渴、便秘、惡心、睡眠障礙，防風(fēng)通圣散有肝損害。
特別是著眼于由乳酸菌產(chǎn)生的肥胖癥的治療效果時(shí)，已公開使用了乳酸菌的人參 根的發(fā)酵物所產(chǎn)生的肥胖抑制效果(專利文獻(xiàn)1)、以及由乳酸菌培養(yǎng)物產(chǎn)生的內(nèi)臟脂肪的 蓄積抑制效果(專利文獻(xiàn)2)等，但未發(fā)現(xiàn)具體對(duì)白色脂肪組織、及褐色脂肪組織的作用等。 此外，著眼于利用乳酸菌的自律神經(jīng)調(diào)節(jié)效果的健康功能改善方面時(shí)，僅發(fā)現(xiàn)了通便改善 效果(專利文獻(xiàn)3)，未發(fā)現(xiàn)對(duì)肥胖癥的效果。
另一方面，關(guān)于各種食品中含有的、且已知有多種合成方法的2，3-二氫-3，5-二
羥基-6_甲基-4H-吡喃-4-酮，僅知道其有酪氨酸酶抑制作用及黑素形成抑制作用(專利
文獻(xiàn)4)、以及抗氧化作用(專利文獻(xiàn)5)。 專利文獻(xiàn)1日本特開2004-201598 專利文獻(xiàn)2日本特開2004-99539 專利文獻(xiàn)3日本特開2004-155727 專利文獻(xiàn)4日本特開2006-28077 專利文獻(xiàn)5日本特開H04-1291 (專利2843639) 非專利文獻(xiàn)1荻原俊男等、巖波講座"現(xiàn)代醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)"第4巻生物體的調(diào)節(jié)體系， 1999 非專利文獻(xiàn)2日本臨床61巻增刊6， 288-294， 2003 非專利文獻(xiàn)3肥胖研究6 :4-17,2000 非專利文獻(xiàn)4Yoshida T， et al :Clin Exp Pharmacol Physio123 :476-482,1996 非專利文獻(xiàn)5日本臨床61巻增刊6， 649-654， 200
發(fā)明內(nèi)容
自律神經(jīng)紊亂及起因于此的健康障礙大量存在，雖然針對(duì)這些癥狀的每種癥狀進(jìn)
行治療，但未獲得控制作為根本原因的自律神經(jīng)活動(dòng)其自身的方法。針對(duì)不同癥狀的療法
雖然可暫時(shí)性地改善這種狀況，但復(fù)發(fā)的可能性、因自律神經(jīng)紊亂引發(fā)其他癥狀的可能性
高。因此，需要控制作為根本原因的自律神經(jīng)活動(dòng)其自身的醫(yī)藥品或飲食物。 此外關(guān)于肥胖癥或其合并癥的預(yù)防或治療藥物，現(xiàn)在廣泛使用的抗肥胖藥有副作
用，難于同時(shí)獲得其效果和低副作用、高安全性。此外，醫(yī)藥品的合成過程中，需要經(jīng)過其他
步驟的工序，并且需要加工成可容易地?cái)z取的片劑等形狀，所以成本增高成為問題。因此，
期望有飲食經(jīng)歷的安全的食品材料、來自食品的成分應(yīng)用于抗肥胖作用，強(qiáng)烈需要采用簡(jiǎn)
便的工藝從存在于自然界中的天然物質(zhì)中獲得的活性物質(zhì)。 進(jìn)而，基于能量消耗促進(jìn)的肥胖治療藥，目前為止尚未開發(fā)出來(日本臨床61巻 增刊6，686-691，2003)。發(fā)生肥大的脂肪組織和表現(xiàn)胰島素抵抗性之間的關(guān)連性逐漸得到 證明，認(rèn)為伴隨由肥大的脂肪細(xì)胞向具有正常功能的小型細(xì)胞的質(zhì)變的能量消耗促進(jìn)藥將 成為理想的肥胖治療藥?；谶@種構(gòu)思，期待通過使脂肪組織的交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)產(chǎn)生的 抗肥胖效果時(shí)，預(yù)測(cè)作為副作用血壓升高，但力求避免這種現(xiàn)象。如果使用具有飲食經(jīng)歷的 安全的食品材料、來自食品的成分，能夠提供具有這種特性的基于能量消耗促進(jìn)的抗肥胖 作用，則是理想的。 本發(fā)明的課題是，提供具有自律神經(jīng)活動(dòng)的調(diào)節(jié)作用、特別是交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn) 作用、進(jìn)而能量代謝的促進(jìn)作用，用于預(yù)防或治療肥胖癥或其合并癥的安全的組合物。
對(duì)于特定的乳酸菌的菌體，已確認(rèn)有抑制腎臟的交感神經(jīng)活動(dòng)、使胃的副交感神 經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)的作用(Tanida M， et al :Neurosci ence Letters389 :109-114,2005)。
本發(fā)明者為了解決上述課題進(jìn)行了精心研究，將使用大鼠的對(duì)自律神經(jīng)的直接作 用作為指標(biāo)，從乳酸菌培養(yǎng)上清中分離2， 3- 二氫-3， 5- 二羥基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮， 發(fā)現(xiàn)盡管該化合物具有使腎臟交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)的作用，但還具有使血壓降低的作用，進(jìn)
4而發(fā)現(xiàn)有使白色脂肪組織、褐色脂肪組織的交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)的作用。在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)該 化合物具有能量代謝促進(jìn)作用，完成了本發(fā)明。 即本發(fā)明涉及醫(yī)藥組合物或飲食物，其含有臨床上有效量的2，3-二氫-3，5-二 羥基_6-甲基-4H-吡喃-4-酮及作為醫(yī)藥或食品所允許的添加劑，具有自律神經(jīng)調(diào)節(jié)作 用。 本發(fā)明還涉及上述醫(yī)藥組合物或飲食物，其中，所述自律神經(jīng)調(diào)節(jié)作用為交感神 經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)作用。 本發(fā)明還涉及醫(yī)藥組合物或飲食物，其具有能量代謝的促進(jìn)作用。 本發(fā)明還涉及上述醫(yī)藥組合物或飲食物，其用于治療與自律神經(jīng)活動(dòng)、能量代謝
相關(guān)的疾病或狀態(tài)。 本發(fā)明還涉及上述醫(yī)藥組合物或飲食物，其中，所述與自律神經(jīng)活動(dòng)、能量代謝相 關(guān)的疾病或狀態(tài)為肥胖癥及/或其合并癥(例如糖尿病"耐糖能力障礙、高血脂癥、高血壓、 高尿酸血癥 痛風(fēng)、冠狀動(dòng)脈疾病(心肌哽塞、心絞痛等)、腦哽塞(腦血栓、短暫性腦缺血 發(fā)作等)、睡眠呼吸暫停綜合征、脂肪肝、整形外科疾病(變形性關(guān)節(jié)炎癥、腰椎癥等)、月經(jīng) 異常等)。 本發(fā)明還涉及上述醫(yī)藥組合物或飲食物，其含有具有2，3-二氫-3，5-二羥 基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮生產(chǎn)能力的微生物或其加工品。 本發(fā)明還涉及上述醫(yī)藥組合物或飲食物，其含有具有2，3-二氫-3，5-二羥 基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮生產(chǎn)能力的微生物的培養(yǎng)上清或其加工品。
本發(fā)明還涉及上述醫(yī)藥組合物或飲食物，其中，所述微生物為乳酸菌。
本發(fā)明還涉及上述醫(yī)藥組合物或飲食物，其中，所述乳酸菌屬于鏈球菌屬 (Stor印tococcus)、乳桿菌屬(Lactobacil lus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、片球菌 屬(Pediococcus)、雙歧桿菌屬(Bif idobacterium)、四體球菌屬(Tetragenococcus)、 魏斯氏菌屬(Weissella)、腸球菌屬(Enterococcus)、蜜蜂球菌屬(Melisscoccus)、乳 球菌屬(Lactococcus)、肉食桿菌屬(Carnobacterium)、漫游球菌屬(Vagococcus)、奇 異菌屬(Atopobium)、乳球形菌屬(Lactosphaera)、酒球菌屬(0enococcus)、乏養(yǎng)菌屬 (Abiotrophia) 、 Paralactobacillus屬、顆粒鏈菌屬(Gra皿licatella) 、 Atopobactor屬、 Alkal ibacterium屬或Olsenella屬。 本發(fā)明還涉及上述醫(yī)藥組合物或飲食物，其中，所述微生物屬于植物乳桿菌(優(yōu) 選植物乳桿菌SAM 2446株(FERM ABP-10438))或短乳桿菌(優(yōu)選短乳桿菌SAM 2447株 (FERM ABP-10439))。 本發(fā)明還涉及上述醫(yī)藥品組合物或飲食物的制造方法，其包括將具有2，3-二 氫-3， 5- 二羥基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮生產(chǎn)能力的微生物在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的工序。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及上述醫(yī)藥組合物或飲食物，其中，所述自律神經(jīng)調(diào)節(jié)作用為選 自腎臟交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)作用、副腎交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)作用、胃迷走神經(jīng)(副交感神經(jīng))活 動(dòng)抑制作用、白色脂肪組織的交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)作用及褐色脂肪組織交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)作 用中的1種以上的作用，優(yōu)選為全部的作用。 本發(fā)明進(jìn)一步涉及上述醫(yī)藥組合物或飲食物，其中，所述自律神經(jīng)調(diào)節(jié)作用不伴 隨血壓升高。
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本發(fā)明進(jìn)一步涉及上述醫(yī)藥組合物或飲食物，其具有能量代謝促進(jìn)作用及/或脂 肪燃燒促進(jìn)作用。 本發(fā)明進(jìn)一步涉及口服用的所述醫(yī)藥組合物。 本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有2， 3- 二氫-3， 5- 二羥基_6_甲基_4H_吡喃_4_酮作為有 效成分的自律神經(jīng)調(diào)節(jié)劑。 本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于制造醫(yī)藥組合物或飲食物的2，3-二氫-3，5-二羥 基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮的使用，所述醫(yī)藥組合物或飲食物治療與自律神經(jīng)活動(dòng)相關(guān)的 疾病或狀態(tài)。 本發(fā)明進(jìn)一步涉及與自律神經(jīng)活動(dòng)相關(guān)的疾病或狀態(tài)的治療方法，其包括將2， 3- 二氫-3， 5- 二羥基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮給藥。 本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有2， 3- 二氫-3， 5- 二羥基_6_甲基_4H_吡喃_4_酮作為有 效成分的能量代謝調(diào)節(jié)劑。 本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于制造醫(yī)藥組合物或飲食物的2，3-二氫-3，5-二羥 基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮的使用，所述醫(yī)藥組合物或飲食物治療與能量代謝相關(guān)的疾病 或狀態(tài)。 本發(fā)明進(jìn)一步涉及與能量代謝相關(guān)的疾病或狀態(tài)的治療方法，其包括將2，3-二 氫-3， 5- 二羥基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮給藥。 本發(fā)明進(jìn)一步涉及自律神經(jīng)調(diào)節(jié)方法，其包括將2，3-二氫-3，5-二羥基-6_甲 基-411-吡喃-4-酮給藥。 本發(fā)明進(jìn)一步涉及能量代謝調(diào)節(jié)方法，其包括將2， 3- 二氫-3， 5- 二羥基_6_甲 基-411-吡喃-4-酮給藥。 本發(fā)明中使用的2， 3- 二氫-3， 5- 二羥基-6-甲基_4H_吡喃_4_酮(2， 3-dihydro-3，5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one、以下簡(jiǎn)稱為"DDMP"。)用下式表
示
o 例如為下述實(shí)施例1中得到的化合物。含有DDMP的醫(yī)藥組合物或飲食物(以下 簡(jiǎn)稱為"組合物"。)，具有自律神經(jīng)活動(dòng)的調(diào)節(jié)作用、特別是交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)作用，進(jìn)而具 有能量代謝的促進(jìn)作用，特別是對(duì)于肥胖癥及/或其合并癥的治療有用。
DDMP是作為香氣成分而已知的麥芽酚(maltol)的類似化合物，已知其含有于 各種食品等中。例如含有于蜂膠、橡木桶、龍舌蘭、葡萄酒、白蘭地、牛奶、小甜餅干、白 樺蜜(birch syrup)、爆玉米花、草莓醬、廢糖蜜、黑砂糖等各種食品中。而且在葡萄酒 (Journal International des Sciences de laVigne et du Vin 32 :99-110， 1998)、白蘭 地(Priklanda BiokhimiyaiMikrobiologiya 15:902-908,1979)中，在陳化過程中增力口，
6在像木桶(Cutzachlzabelleet al. Journal of Agricultural and Food Chemistry45 : 2217-2224， 1997)、龍舌蘭(Lopez，M.G. ，et al. -Frontiers of FlavourScience :523-526， 2000)、 牛奶 (Pischetsrieder， Monica et al. :FoodResearch and Technology,208 : 172-177,1999)中通過美拉德反應(yīng)而生成。 因此，上述DDMP及含有DDMP的組合物，可從含有DDMP的食品、植物等、通過陳化、 加熱、美拉德反應(yīng)等生成了 DDMP的原料中獲得。在該物質(zhì)生成時(shí)，可加入采用同領(lǐng)域技術(shù) 人員公知的手段可適當(dāng)增加生成量的操作，例如在進(jìn)行美拉德反應(yīng)時(shí)為了高效生成化合 物，通常情況下可添加可參與美拉德反應(yīng)的物質(zhì)抗壞血酸等。 此外，如下述實(shí)施例所述，本發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)在乳酸菌(LactobacillusDlantar咖 SAM2446株(FERM ABP-10438))的培養(yǎng)后的培養(yǎng)基上清中含有DDMP。 對(duì)于從上述原料、培養(yǎng)上清等中分離DDMP的方法，可將該原料等直接分離，或者 在分離操作之前通過冷凍干燥、使用有機(jī)溶劑的液液分配萃取等進(jìn)行濃縮。其后的分離操 作，可根據(jù)需要通過超濾處理等進(jìn)行粗分離后，再通過使用反相色譜柱等的處理來進(jìn)行。上 述液液分配萃取、超濾處理、反相色譜柱處理等，可用同領(lǐng)域技術(shù)人員通常使用的方法進(jìn) 行。 DDMP也可通過合成獲得。作為合成方法，有將葡萄糖和13 _丙氨酸進(jìn)行加熱而 生成的方法(Nishibori S， et al. Journal of Agricultural and FoodChemistry 41 : 2374-2377， 1993)、將蔗糖和葡萄酒酵母進(jìn)行加熱而生成的方法(Mishiev， P.J. ， et al : Prikladnaya Biokhimiya i Mikrobiologiya17 :307-311， 1981)、將葡萄糖和哌啶進(jìn)行加 熱而生成的方法(Chen Yongkuan etal. :Huaxue Yanjiu Yu Yingyong 15 :45-47， 2003)、 使用葡萄糖、哌啶和巰基乙酸而生成的方法(Isabelle Cutzach et al. :J. Agric. Food Chem. 47 :1663-67， 1999)、將淀粉水解糖和L_精氨酸、谷氨酸、或淀粉水解糖和谷氨酸進(jìn)行 加熱而生成的方法(Song Wendong et al. :Fenxi Huaxue29 :620， 2001)等，對(duì)合成方法無 特別限制。 對(duì)于通過上述方法可獲得DDMP的確認(rèn)，例如可利用MS譜、NMR譜進(jìn)行。 本發(fā)明的組合物中含有的DDMP，例如可以如鹽酸鹽那樣的藥學(xué)上允許的鹽的形式
使用，也可以在體內(nèi)變?yōu)镈DMP的鹽(前藥)的形式使用。此外，可以是D體，也可以是L體，
還可以是消旋體。 DDMP也是作為食品添加物的香料而被確認(rèn)的安全物質(zhì)，已報(bào)道了黑素形成抑制效 果(專利文獻(xiàn)4)、以及食品的抗氧化作用(專利文獻(xiàn)5)，但其對(duì)自律神經(jīng)的作用、對(duì)交感神 經(jīng)的作用、能量代謝促進(jìn)作用、用于治療肥胖癥及/或其合并癥的作用，無任何報(bào)道。
本發(fā)明還提供含有具有DDMP生產(chǎn)能力的微生物或其加工品、含有該微生物的培 養(yǎng)上清或其加工品的上述醫(yī)藥組合物或飲食物。 在本說明書中，所謂"具有DDMP生產(chǎn)能力"，是指在有效條件下培養(yǎng)時(shí)生產(chǎn)DDMP。 有效條件，只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員可適當(dāng)確定。微生物的DDMP生產(chǎn)能力，將微生物(包括 微生物自身、微生物的干燥物、微生物的培養(yǎng)液、微生物的提取物等)例如使用LC、 MS、 NMR 等按照規(guī)定方法分析時(shí)，通過含有DDMP等來確認(rèn)。具有這種生產(chǎn)能力的微生物，也包括將 培養(yǎng)條件(培養(yǎng)基的組成、培養(yǎng)時(shí)的溫度條件、培養(yǎng)時(shí)的PH條件、培養(yǎng)密度等)進(jìn)行適當(dāng)調(diào) 整時(shí)具有DDMP生產(chǎn)能力的微生物。
7
上述微生物可以是從天然中采集的微生物，此外，以具有DDMP生產(chǎn)能力的方式設(shè) 計(jì)的突變體及/或重組體也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這種突變體及/或重組體包括使用相 同組成的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，與野生株相比為了提高DDMP的生產(chǎn)能力而設(shè)計(jì)的突變體及/ 或重組體。 這種具有DDMP生產(chǎn)能力的微生物，例如可以為乳酸菌、酵母、枯草菌等。作為 乳酸菌，例如可例舉屬于鏈球菌屬(Stor印tococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、明串 珠菌屬(Leuconostoc)、片球菌屬(Pediococcus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、四 體球菌屬(Tetragenococcus)、魏其jf氏菌屬(Weissella)、腸球菌屬(Enterococcus)、蜜 蜂球菌屬(Melisscoccus)、乳球菌屬(Lactococcus)、肉食桿菌屬(Carnobacteri咖)、 漫坊,球菌屬(Vagococcus)、奇異菌屬(Atopobium)、乳球形菌屬(Lactosphaera)、酒 球菌屬(0enococcus)、乏養(yǎng)菌屬(Abiotrophia) 、 Paralactobacillus屬、顆粒鏈菌 (Gra皿licatella) 、 Atopobactor屬、Alkalibacterium屬或Olsenella屬的微生物；作為 酵母，例如可例舉屬于假絲酵母屬(Candida)或酵母菌屬(Saccharomyces)的微生物；作為 枯草菌，可例舉屬于枯草桿菌屬(B. subutilis)的微生物。 特別優(yōu)選的微生物是屬于植物乳桿菌(Lactobacillus olantar咖)(講一歩特定 為植物乳桿菌SAM 2446株(FERM ABP-10438))及屬于短乳桿菌(Lactobacillus brevis) (進(jìn)一步特定為短乳桿菌SAM 2447株(FERMABP-10439))的乳酸菌。 本發(fā)明還提供包括將上述具有DDMP生產(chǎn)能力的微生物在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的工 序的上述醫(yī)藥品組合物或飲食物的制造方法。該微生物的培養(yǎng)，可將微生物接種在適當(dāng)?shù)?培養(yǎng)基上，根據(jù)微生物的種類，使用同領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來進(jìn)行。
例如對(duì)于微生物為乳酸菌時(shí)的培養(yǎng)以下做簡(jiǎn)略說明。培養(yǎng)基可使用例如瓊脂培養(yǎng) 基及/或液體培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中適當(dāng)添加期望濃度的同領(lǐng)域技術(shù)人員公知的碳源、氮源， 進(jìn)而根據(jù)需要添加無機(jī)離子、維生素類等微量營(yíng)養(yǎng)源。更加簡(jiǎn)便的是，例如可使用MRS培養(yǎng) 基等市售的培養(yǎng)基，可在其中進(jìn)一步加入添加物后而使用。制備培養(yǎng)基后，可使用適當(dāng)?shù)乃?或堿，將pH調(diào)整為6. 0 7. 0的范圍，使用高壓釜等進(jìn)行滅菌。 然后，將乳酸菌接種在培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)溫度10°C 45t:下，通常通過1 2天的
振蕩培養(yǎng)、靜置培養(yǎng)、培養(yǎng)槽中的工業(yè)培養(yǎng)、瓊脂培養(yǎng)基等的固體培養(yǎng)基上的培養(yǎng)等，可使
微生物在培養(yǎng)基中增殖。培養(yǎng)條件因使用的微生物的不同而不同，例如使Lactobacillus
Dlanta進(jìn)時(shí)，在37。C左右，可在p朋.5左右的MRS培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)1天。將這樣培養(yǎng)的
微生物根據(jù)需要進(jìn)行離心分離，進(jìn)而根據(jù)需要進(jìn)行過濾，可獲得培養(yǎng)上清。 如下述實(shí)施例所證明的那樣，將DDMP經(jīng)過十二指腸向大鼠給藥時(shí)，具有大鼠的腎
臟交感神經(jīng)活動(dòng)的亢進(jìn)效果，不會(huì)使血壓升高，進(jìn)而具有大鼠的胃迷走神經(jīng)(副交感神經(jīng))
活動(dòng)抑制效果，具有使大鼠的肩胛間褐色脂肪細(xì)胞組織的交感神經(jīng)活動(dòng)、及副睪丸周圍白
色脂肪組織的交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)的作用。也就是說，DDMP腸道抑制性地使交感神經(jīng)活動(dòng)
(腎臟、副腎)亢進(jìn)，抑制胃迷走神經(jīng)(副交感神經(jīng))活動(dòng)，進(jìn)而在不伴隨血壓升高的情況
下，使白色脂肪組織及褐色脂肪組織的交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)。 如下述實(shí)施例所證明的那樣，將DDMP強(qiáng)制性地經(jīng)口向大鼠胃內(nèi)給藥時(shí)，使大鼠的 氧消耗量增加。也就是說，DDMP具有能量代謝促進(jìn)作用。 作為評(píng)價(jià)自律神經(jīng)活動(dòng)的方法，可例舉心電圖計(jì)、血壓計(jì)、皮膚電反射、瞳孔徑測(cè)
8定等生物物理學(xué)的測(cè)定方法、血中兒茶酚胺濃度測(cè)定等生物化學(xué)的測(cè)定方法等。特別是使 用心電圖計(jì)分析心跳變化是常用的方法，但如下述實(shí)施例所述，本發(fā)明者通過可直接評(píng)價(jià) 給藥物質(zhì)對(duì)自律神經(jīng)活動(dòng)的影響的使用大鼠的方法，來評(píng)價(jià)DDMP對(duì)自律神經(jīng)活動(dòng)的作用。 本方法的特征在于，可分別分析給藥物質(zhì)對(duì)于支配各臟器、組織等的自律神經(jīng)的神經(jīng)活動(dòng) 的作用。進(jìn)而，該方法還具有下述優(yōu)點(diǎn)，即只要實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是活著的，可依次測(cè)定不同給藥物 質(zhì)的自律神經(jīng)調(diào)節(jié)作用。 下表表示了認(rèn)為與自律神經(jīng)的活動(dòng)相關(guān)的器官、激素、生物體活動(dòng)、和認(rèn)為自律神
經(jīng)對(duì)它們產(chǎn)生的影響以及預(yù)測(cè)的效果的一例。
[表1]
—- ----:交感神經(jīng)興奮副交感神經(jīng)興奮
胰臟胰島紫降低增加
胰高血糖素增加降低
副腎血糖升高降低
血壓升高降低
肝臟糖原分解合成
糖糖異生糖酵解系統(tǒng)亢進(jìn)
—糖合成—促進(jìn)糖利用
腎臟血壓升高降低
胃消化吸收降低促進(jìn)
—食欲降低(抗肥胖)—食欲促進(jìn)
皮膚血流量俾低升高
—保濕力提高(美容)
免疫能力降低升高
—NK活性提高
瞳孔散大縮小
脈搏增加減少
心臟血管系統(tǒng)促進(jìn)(面色蒼白)抑制(面色潮紅)
汗唾液分泌抑制分泌亢進(jìn) 由上表可知，自律神經(jīng)活動(dòng)密切影響著血糖調(diào)節(jié)、血壓調(diào)節(jié)、激素分泌調(diào)節(jié)、糖代 謝調(diào)節(jié)、胃液分泌調(diào)節(jié)、血流量調(diào)節(jié)、體溫調(diào)節(jié)等生物體的各種調(diào)節(jié)機(jī)構(gòu)。例如使交感神經(jīng) 活動(dòng)亢進(jìn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)在白色脂肪組織中有脂肪分解作用、在褐色脂肪組織中有產(chǎn)熱亢進(jìn)(非 專利文獻(xiàn)2)、在肝臟中有通過糖異生的糖合成、在胃中有消化吸收降低等的作用。此外，使 副交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)在肝臟中通過糖酵解系統(tǒng)的亢進(jìn)促進(jìn)糖利用、在胃中促進(jìn)食 欲、在皮膚中通過血流量的增加使保濕能力提高、在免疫功能方面通過NK活性提高使免疫 功能亢進(jìn)的作用。 特別是著眼于肥胖對(duì)策時(shí)，首先，已知與肥胖有關(guān)的脂肪中，內(nèi)臟脂肪比皮下脂肪 的代謝活性高，營(yíng)養(yǎng)過剩時(shí)快速引起脂肪合成，而且在運(yùn)動(dòng)時(shí)、營(yíng)養(yǎng)不足時(shí)脂肪合成和分解 活潑進(jìn)行。因此認(rèn)為，在蓄積有內(nèi)臟脂肪的個(gè)體中脂肪合成和分解活潑進(jìn)行，其結(jié)果作為 代謝產(chǎn)物的游離脂肪酸大量釋放出來。并且從內(nèi)臟脂肪釋放出來的游離脂肪酸具有通過 門靜脈直接流入肝臟的特征，過剩的游離脂肪酸的流入在抑制肝臟中的胰島素清除率的同 時(shí)，增強(qiáng)糖異生并使血糖升高，其結(jié)果誘發(fā)末梢內(nèi)胰島素抵抗性，認(rèn)為肥胖與耐糖能力障礙
9相關(guān)(Matsuzawa Y-Diabetes Metab Rev 13 :3-13,1997)。對(duì)于由肥胖引發(fā)的高血脂癥的發(fā)生機(jī)制，認(rèn)為是經(jīng)過由于從內(nèi)臟脂肪向肝臟流入過剩的游離脂肪酸所引起的脂肪合成基質(zhì)的增加，同時(shí)肝臟內(nèi)的脂質(zhì)合成相關(guān)蛋白質(zhì)基因表達(dá)的增強(qiáng)的機(jī)制，或者是經(jīng)過由于胰島素抵抗性所引起的外源性膽固醇吸收促進(jìn)的機(jī)制(Kuriyama H， et al :H印atology 27 :557-562，1998)。 從肥胖產(chǎn)生的原因來看，考慮脂肪組織的功能和自律神經(jīng)活動(dòng)的干擾時(shí)，在脂肪組織中存在作為脂肪能量?jī)?chǔ)藏庫的白色脂肪組織和將脂肪氧化 分解將能量以熱量的形式向體外發(fā)散的褐色脂肪組織。白色脂肪組織以內(nèi)臟組織周邊及皮下為中心在全身廣泛分布，是將攝取食物后的剩余能量以中性脂肪的形式儲(chǔ)存起來，必要時(shí)以脂肪酸和甘油的形式再供給全身的特殊化的器官。有報(bào)告指出，這些白色脂肪組織的脂肪分解能力降低以及褐色脂肪組織的活性降低是肥胖產(chǎn)生的原因(Nicholls， et al :Physiol Rev 64 :1_64，1984)。 自律神經(jīng)活動(dòng)參與白色脂肪組織及褐色脂肪組織的功能調(diào)節(jié)。白色脂肪組織除交感神經(jīng)活動(dòng)之外，其功能還通過血液中的激素來調(diào)節(jié)，褐色脂肪組織主要通過交感神經(jīng)活動(dòng)來調(diào)節(jié)功能(非專利文獻(xiàn)2)。通過白色脂肪組織的交感神經(jīng)活動(dòng)的亢進(jìn)促進(jìn)脂肪分解，通過褐色脂肪組織的交感神經(jīng)活動(dòng)的亢進(jìn)促進(jìn)脂肪氧化 分解，將能量以熱量的形式向體外擴(kuò)散。 在本說明書中，自律神經(jīng)調(diào)節(jié)作用包括交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)作用、交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)的抑制作用、交感神經(jīng)活動(dòng)抑制作用、副交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)作用、副交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)的抑制作用、副交感神經(jīng)活動(dòng)抑制作用，優(yōu)選選自交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)作用、副交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)的抑制作用及副交感神經(jīng)活動(dòng)抑制作用中的作用。更加特定為選自腎臟交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)作用、副腎交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)作用、胃迷走神經(jīng)(副交感神經(jīng))活動(dòng)抑制作用、白色脂肪組織的交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)作用及褐色脂肪組織交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)作用中的作用。
因?yàn)楸景l(fā)明的組合物含有DDMP，所以可用于與自律神經(jīng)活動(dòng)相關(guān)的疾病或狀態(tài)的治療，例如可用于因自律神經(jīng)紊亂容易引發(fā)的癥狀的氣喘、心悸、肩酸、頭痛、頭暈、焦慮癥、食欲不振、倦怠感、失眠等的治療。特別是對(duì)于通過使交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)可治療的疾病或狀態(tài)、例如肥胖癥的治療有用。此外，因?yàn)楸景l(fā)明的組合物抑制胃迷走神經(jīng)副交感神經(jīng)活動(dòng)，因此抑制食欲增加，進(jìn)而因?yàn)樵诓话殡S血壓升高的情況下，使白色脂肪組織及褐色脂肪組織的交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)，因此促進(jìn)這些脂肪組織中的脂肪分解，其結(jié)果抑制脂肪蓄積，對(duì)于肥胖癥及/或其合并癥(例如糖尿病 耐糖能力障礙、高血脂癥、高血壓、高尿酸血癥 痛風(fēng)、冠狀動(dòng)脈疾病(心肌哽塞、心絞痛等)、腦哽塞(腦血栓、短暫性腦缺血發(fā)作等)、睡眠呼吸暫停綜合征、脂肪肝、整形外科疾病(變形性關(guān)節(jié)炎癥、腰椎癥等)、月經(jīng)異常等)的治療有用。 本發(fā)明的組合物使白色脂肪組織的交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)，因此促進(jìn)脂肪分解，使褐色脂肪組織的交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)，因此使脂肪氧化 分解，將能量以熱量的形式向體外釋放，由此可見其對(duì)能量代謝的亢進(jìn)有效。能量代謝的亢進(jìn)，例如可通過生物體的氧消耗量的測(cè)定來評(píng)價(jià)。 在本說明書中，所謂對(duì)疾病或狀態(tài)進(jìn)行治療，包括防止該疾病或狀態(tài)的惡化、改善該疾病或狀態(tài)、以及預(yù)防該疾病或狀態(tài)。
10
含有DDMP的本發(fā)明的組合物含有臨床上有效量的DDMP。所謂臨床上有效量是用于調(diào)節(jié)自律神經(jīng)的臨床上有效的量。根據(jù)下述實(shí)施例的結(jié)果判斷，給藥0.5iig/kg以上的DDMP時(shí)可獲得充分的效果。特別是DDMP的給藥量無上限，考慮到特有的香味和經(jīng)濟(jì)性，通常優(yōu)選不大于50mg/kg左右。 本發(fā)明的組合物，為了充分發(fā)揮其效果，每次服用時(shí)期望含有DDMP0.5iig/kg 50mg/kg (優(yōu)選1 ii g/kg 10mg/kg、更優(yōu)選2 y g/kg 5mg/kg)，更加具體地說，以成人為對(duì)象時(shí)，每次服用時(shí)期望含有DDMP 30ii g 3000mg(優(yōu)選60ii g 600mg、更優(yōu)選為120ii g 300mg)。此外，在本發(fā)明的組合物中，每單位產(chǎn)品重量(g)可含有DDMP 0. 05 y g 5mg(優(yōu)選0. 1 ii g lmg、更優(yōu)選0. 2 ii g 0. 5mg)。此外，從其他觀點(diǎn)來看，每單位產(chǎn)品重量(g)可含有DDMP25 P g以上(優(yōu)選40 g以上、更優(yōu)選80 g以上)，此時(shí)的上限值，每單位產(chǎn)品重量(g)均可為例如0. 5mg、lmg、或5mg。 本發(fā)明的組合物，可直接使用含有DDMP的原料、具有DDMP生產(chǎn)能力的微生物、該微生物的培養(yǎng)上清、含有該微生物的培養(yǎng)物自身等，或者將上述物質(zhì)進(jìn)行提取"分離操作等處理，使用分離、純化后的產(chǎn)物，無特別限制。此外，也可用通常的殺菌、減壓濃縮、冷凍干燥等方法將上述物質(zhì)制成濃縮物、干燥粉體等加工品而使用。如果是不容易制成干燥粉體的濃縮物時(shí)，可將常用的糊精、高分子淀粉水解物或高分子肽等作為賦形劑使用從而形成干燥粉體。從作業(yè)性、保存性的觀點(diǎn)來看，優(yōu)選形成粉末。 本發(fā)明的組合物，根據(jù)目的可形成飲食物(包括食品、飲料、調(diào)味料、酒精飲料、功能食品等)及醫(yī)藥組合物的各種形態(tài)。例如使用DDMP、具有DDMP生產(chǎn)能力的微生物、該微生物的培養(yǎng)上清、加工品等，可提供飲食物、醫(yī)藥品。 作為本發(fā)明提供的飲食物，可例舉軟粘糖、含片、口香糖、酸奶、冰激淋、布丁、果凍、水羊羹、酒精飲料、咖啡飲料、果汁、果實(shí)飲料、碳酸飲料、清涼水飲料、牛奶、乳清飲料、乳酸菌飲料等各種飲食物。 此外，這些飲食物，可根據(jù)需要配合各種添加劑根據(jù)通常方法來制備。具體來說，在制備這些飲食物時(shí)，例如可適當(dāng)配合葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、山梨糖醇、甜菊糖、甜茶素、玉米漿、乳糖、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸、乳酸、L-抗壞血酸、dl-a _生育酚、異抗壞血酸鈉、甘油、丙二醇、甘油脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、脫水山梨糖醇脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯、阿拉伯膠、卡拉膠、酪蛋白、明膠、果膠、瓊脂、維生素B類、煙酸胺、泛酸鈣、氨基酸類、鈣鹽類、色素、香料、保存劑等通?？勺鳛槭称吩鲜褂玫奈镔|(zhì)，根據(jù)通常方法進(jìn)行制造。 在制備本發(fā)明所提供的醫(yī)藥品時(shí)，可根據(jù)需要配合各種添加劑，制成各種劑型的
醫(yī)藥品。例如可提供片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、糖漿劑、浸膏劑等口服醫(yī)藥品，或者軟膏、
眼軟膏、洗劑、乳膏、貼付劑、栓劑、點(diǎn)眼藥、點(diǎn)鼻藥、注射劑等非口服醫(yī)藥品。 這些醫(yī)藥品，可使用各種添加劑按照通常方法制造。使用的添加劑無特別限制，可
使用通常使用的添加劑。作為其例子，可例舉淀粉、乳糖、白糖、甘露醇、羧甲基纖維素、玉米
淀粉、無機(jī)鹽等固體載體；蒸餾水、生理鹽水、葡萄糖水溶液、乙醇等醇、丙二醇、聚乙二醇等
液體載體；各種動(dòng)植物油、白凡士林、石蠟、蠟類等油性載體等。 本發(fā)明的組合物含有DDMP作為有效成分，根據(jù)需要可進(jìn)一步含有醫(yī)藥組合物、飲食物中以往一直使用的其它有效成分。
例如為具有自律神經(jīng)調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)(交感神經(jīng)作用物質(zhì)、副交感神經(jīng)作用物質(zhì)等)、具有降低血壓作用的物質(zhì)、具有抗肥胖作用的物質(zhì)(具有食欲抑制系統(tǒng)剌激作用的物質(zhì)、作用于滿腹中樞的物質(zhì)、與能量代謝相關(guān)的物質(zhì)(例如！33受體作用物質(zhì)、具有能量消耗促進(jìn)作用的物質(zhì))等)，可含有同領(lǐng)域技術(shù)人員公知物質(zhì)的一種或組合含有多種。
進(jìn)而本發(fā)明的組合物含有具有DDMP生產(chǎn)能力的微生物或其加工品、含有其培養(yǎng)上清或加工品時(shí)，特別是可含有來自該微生物的上述物質(zhì)(具有自律神經(jīng)調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)、具有血壓降低作用的物質(zhì)、具有能量代謝促進(jìn)作用的物質(zhì)、具有抗肥胖作用的物質(zhì)等)。
此外，對(duì)于本發(fā)明的醫(yī)藥組合物或飲食物，可將其具體的用途(例如用于調(diào)節(jié)自律神經(jīng)、用于使交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)、用于抑制副交感神經(jīng)活動(dòng)、用于預(yù)防肥胖、用于治療肥胖癥、用于治療肥胖合并癥、用于促進(jìn)能量代謝、用于促進(jìn)脂肪燃燒、用于維持健康)及/或其具體的使用方法(例如攝取量、攝取次數(shù)、攝取方法)標(biāo)示出來。 如以上詳細(xì)說明的那樣，根據(jù)本發(fā)明，可提供調(diào)節(jié)作為與自律神經(jīng)活動(dòng)相關(guān)的疾病或狀態(tài)的根本原因的自律神經(jīng)活動(dòng)自身(特別是使交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn))的醫(yī)藥組合物、飲食物。特別是提供在不伴隨血壓升高的情況下，具有使白色脂肪組織、褐色脂肪組織的交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)作用的醫(yī)藥組合物、飲食物。進(jìn)而提供具有能量代謝促進(jìn)作用的醫(yī)藥組合物、飲食物。因此，可提供對(duì)于肥胖癥及/或其合并癥的治療兼?zhèn)湫Ч?、低副作?不升高血壓)、高安全性，且可簡(jiǎn)便地制造的醫(yī)藥組合物、飲食物。


圖1為實(shí)施例1中得到的2，3-dihydro-3，5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one的MS譜。 圖2為實(shí)施例1中得到的2， 3-dihydro-3， 5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4_one的醒R譜((a)為13C-醒R、 (b)為1H-醒R)。 圖3為表示實(shí)施例1中得到的2， 3-dihydro-3， 5-dihydroxy-6-methyl_4H-pyran-4-one對(duì)大鼠腎臟交感神經(jīng)活動(dòng)的亢進(jìn)效果的圖。 圖4為表示實(shí)施例1中得到的2， 3-dihydro-3， 5-dihydroxy-6-methyl_4H-pyran-4-one不使大鼠血壓升高的圖。 圖5為表示實(shí)施例1中得到的2， 3-dihydro-3， 5-dihydroxy-6-methyl_4H-pyran-4-0116對(duì)大鼠胃迷走神經(jīng)(副交感神經(jīng))活動(dòng)的抑制效果的圖。 圖6為表示實(shí)施例1中得到的2， 3-dihydro-3， 5-dihydroxy-6-methyl_4H-pyran
-4-0116對(duì)大鼠肩胛間褐色脂肪細(xì)胞組織的交感神經(jīng)活動(dòng)的亢進(jìn)效果的圖。 圖7為表示實(shí)施例1中得到的2， 3-dihydro-3， 5-dihydroxy-6-methyl_4H-pyran
-4-one對(duì)大鼠白色脂肪組織的交感神經(jīng)活動(dòng)的亢進(jìn)效果的圖。 圖8為實(shí)施例4中得到的2， 3-dihydro-3， 5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4_one對(duì)大鼠的能量代謝的促進(jìn)效果的圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例 以下，根據(jù)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。
12
本實(shí)施例以乳酸菌Lactobacillus olanta進(jìn)SAM 2446株(FE薩BP-10438)培養(yǎng)上清為初始原料，進(jìn)行分離處理，制備2， 3-dihydro-3， 5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one，分析2，3_dihydro_3，5_dihydroxy_6_methyl_4H_pyran_4_one對(duì)大鼠的自律神經(jīng)活動(dòng)的效果。 進(jìn)而，本實(shí)施例使用葡萄糖、哌啶和巰基乙酸，制備2， 3-dihydro-3， 5-dihydroxy-6_methyl_4H_py:ran_4_one，分析2， 3_dihydro_3， 5_dihydroxy_6_methyl_4H_py:ran_4_one對(duì)大鼠的能量代謝的效果。 進(jìn)而，本實(shí)施例使用DDMP制造醫(yī)藥品、及飲食物。 實(shí)施例1 :2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-4H-Dyran-4-one的制備(從乳if節(jié)咅測(cè)青條先U) 作為乳酸菌培養(yǎng)上清，使用將Lactobacillus olanta進(jìn)SAM 2446株(FERMABP-10438)在MRS培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)后得到的培養(yǎng)上清的冷凍干燥品。將Lactobacillus olanta進(jìn)SAM 2446株接種到滅菌后的MRS培養(yǎng)基中后，在37。C靜置培養(yǎng)1天。然后通過離心處理除去菌體，得到培養(yǎng)上清。使用得到的培養(yǎng)上清利用通常方法制備冷凍干燥品，作為初始原料。首先使用Ultrafiltration Membranes YM10 (Millipore公司制)對(duì)乳酸菌培養(yǎng)上清進(jìn)行超濾，得到通過膜的低分子組分。接著，使用DevelosilC30UG-5柱(野村化學(xué)株式會(huì)社制)，以在十二指腸內(nèi)給藥時(shí)對(duì)腎臟交感神經(jīng)活動(dòng)的影響為指標(biāo)，進(jìn)行色譜分離，得到2， 3_dihydro_3， 5_dihydroxy_6_methyl_4H_pyran_4_one。圖1及2是該化合物的MS及NMR測(cè)定數(shù)據(jù)。在該方法中2， 3-dihydro-3， 5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one的收率，每100ml乳酸菌培養(yǎng)上清為1. 78mg。 實(shí)施例2 :2，3-dihydro-3，5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one對(duì)大鼠,腎臟奪感神經(jīng)活動(dòng)、血壓、胃迷走神經(jīng)(副奪感神經(jīng))活動(dòng)的影響的評(píng)價(jià) 實(shí)驗(yàn)中使用在每12小時(shí)的明暗周期(8點(diǎn) 20點(diǎn)開燈)下、在24°C的恒溫動(dòng)物室內(nèi)飼養(yǎng)l周以上的體重約300g的Wistar系雄性大鼠。對(duì)于各種神經(jīng)實(shí)驗(yàn)，分別使用1只大鼠。使其自由攝取食餌(Oriental酵母、MF)及水。為了研究自律神經(jīng)的活動(dòng)，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天在絕食3小時(shí)后，在明期的中間時(shí)期用烏拉坦(urethane)麻醉下進(jìn)行開腹，采用T. Yamanoet al. ， Neurosci. Lett. 313 :78-82 (2001) 、 A. Niijima et al. ， Autonom. Neurosci.:Basic&Clinica197 :99-102(2002)及M. Tanida et al. ， Am. J. Physiol :Regulatory，Integrative and Comerative Physiology 288 :R447_R455 (2005)中記載的方法，測(cè)定將實(shí)施例1中得至U的2， 3-dihydro-3， 5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4_one在十二指腸內(nèi)給藥時(shí)對(duì)腎臟交感神經(jīng)活動(dòng)、胃迷走神經(jīng)(副交感神經(jīng))活動(dòng)及血壓產(chǎn)生的效果。即將支配腎臟的交感神經(jīng)、及支配胃的副交感神經(jīng)用銀電極鉤住，在左大腿動(dòng)脈中插入套管，使用傳感器測(cè)定血壓。此外，從手術(shù)開始至測(cè)定結(jié)束，在氣管中插入導(dǎo)管確保氣道，用保溫裝置保持體溫為(大鼠直腸溫)35.0士0.5t:。在十二指腸內(nèi)給藥按以下操作進(jìn)行，即用生理鹽水將實(shí)施例1中得至IJ的2，3-dihydro-3，5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one制成lOi! g/2ml，使用在十二指腸中插入的聚乙烯導(dǎo)管，以lml/min的給藥速度每1只分別給藥2ml 。將得到的神經(jīng)電活動(dòng)用電容式差動(dòng)放大器放大，用示波器進(jìn)行監(jiān)視，記錄在磁盤中。對(duì)于全部的神經(jīng)活動(dòng)，為了將其原始數(shù)據(jù)和背景噪音分離，使用限幅器和鑒別器轉(zhuǎn)變?yōu)闃?biāo)準(zhǔn)脈沖后進(jìn)行分析。放電頻率利用照度計(jì)以5秒復(fù)位時(shí)間在描筆式記錄器上表示。數(shù)據(jù)利用
13每5分鐘的平均5秒的發(fā)電頻率(pulse/5sec)的平均值來分析，將給藥前的值作為100%以百分率表示。將給藥生理鹽水的實(shí)驗(yàn)作為對(duì)照。 其結(jié)果，對(duì)照組中未發(fā)現(xiàn)對(duì)評(píng)價(jià)的全部自律神經(jīng)活動(dòng)產(chǎn)生的影B向，也未發(fā)現(xiàn)對(duì)血壓產(chǎn)生的影響。另一方面，給藥組中使腎臟交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)(圖3)，但血壓沒有升高(圖4)，胃迷走神經(jīng)(副交感神經(jīng))的活動(dòng)受到抑制(圖5)。 實(shí)施例3 :2,3_dihydro_3,5_dihydroxy_6_methyl_4H_Dyr￡m_4_one對(duì)大鼠的肩月甲l司她月旨隨麵織雄顯申紛舌動(dòng)、"晶瞎力細(xì)躺月旨鵬目織雄顯申紛舌云力白條卩向白勺刺介 使用與實(shí)施例2同樣的方法，采用上述實(shí)施例2公開的文獻(xiàn)中記載的方法，分析將實(shí)施例1中得至lj的2，3-dihydro-3，5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one在十二指腸內(nèi)給藥(10yg)時(shí)對(duì)副睪丸周圍白色脂肪組織交感神經(jīng)活動(dòng)及肩胛間褐色脂肪組織交感神經(jīng)活動(dòng)的效果。對(duì)于各種神經(jīng)實(shí)驗(yàn)，分別使用l只大鼠。 其結(jié)果，肩胛間褐色脂肪細(xì)胞組織的交感神經(jīng)活動(dòng)(圖6)、副睪丸周圍白色脂肪組織的交感神經(jīng)活動(dòng)(圖7)均亢進(jìn)。 實(shí)施例4 :2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-4H-Dyran-4-one的制備(用葡娜、卩底卩定雄紅齡成') 使用葡萄糖、哌啶和巰基乙酸(修改Isabelle Cutzach et al. :J. Agric. FoodChem. 47 :1663-67， 1999)，合成了 2， 3-dihydro-3， 5-dihydroxy-6-Methyl-4H-pyran-4-one。以下對(duì)文獻(xiàn)記載的合成法進(jìn)行簡(jiǎn)略說明。 在D-葡萄糖(600g、3. 33mol)和三乙胺(500mL、3. 60mol)的懸浮液中，在室溫下邊攪拌邊加入哌啶(329mL、3. 33mol)和乙酸(192mL、3. 33mol)，在70。C加熱攪拌1小時(shí)。然后放冷至室溫后，在冰箱內(nèi)放置一夜。將析出的固體用乙醇-丙酮(1 : 1)混合溶劑(4L)進(jìn)行洗滌、過濾。將此在35t:進(jìn)行加熱并減壓干燥，得到哌啶衍生物。
將得到的哌啶衍生物(176g、0. 711mol)的乙醇(1. 6L)溶液，在75"加熱攪拌下，用40分鐘滴入巰基乙酸(49. 6ml、0. 713mol)的乙醇(135mL)溶液，進(jìn)一步在75。C加溫?cái)嚢?0小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行減壓濃縮，得到粗2， 3-dihydro-3， 5-dihydroxy-6-methyl-4H-py屋-4-one。將得到的粗2， 3_dihydro_3， 5_dihydroxy_6_methyl_4H_pyr￡in_4_one提供給Daiso SP120-40/60-0DS-B (Dai so制)柱色譜法、CHP20P (三菱化學(xué)制)柱色譜法，得到精制的2，3_dihydro_3，5_dihydroxy_6_methyl_4H_pyr￡in_4_one標(biāo)準(zhǔn)品。
在上述合成法中，精制的2， 3_dihydro_3， 5_dihydroxy_6_methyl_4H_pyr￡in_4_one標(biāo)準(zhǔn)品的收率，每600g葡萄糖的精制2， 3-dihydro-3， 5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one標(biāo)準(zhǔn)品為6. 93g。 實(shí)施例5 :2，3_dihydro_3，5_dihydroxy_6_methyl_4H_pyr￡m_4_one的倉g暈代i射促講作用 對(duì)7周齡的SD大鼠(雄性)投給固體飼料(CE-2 :日本CLEA株式會(huì)社)，使其自由攝取水進(jìn)行預(yù)飼養(yǎng)1周，在12小時(shí)明暗周期下馴化。在將試樣給藥之前使馴化后的試驗(yàn)動(dòng)物絕食16小時(shí)，然后分成2組，分別強(qiáng)制性地經(jīng)口在胃內(nèi)給藥40ii g/8ml/kg體重的DDMP以及8ml/kg體重的注射用蒸餾水，給藥后60分鐘的氧消耗量用小動(dòng)物用代謝測(cè)量系統(tǒng)(MK-5000RQ2 :室町機(jī)械株式會(huì)社)測(cè)量。將DDMP給藥1只和給水1只的組合作為1次
14實(shí)驗(yàn)，計(jì)算作為5次組合的DDMP給藥組5只和給水組5只的平均值。 其結(jié)果，與給水組相比較，DDMP給藥組的氧消耗量增加。并且在給藥后用15 33分鐘觀察到其差別(圖8)。由此可確認(rèn)DDMP具有能量代謝促進(jìn)作用。
制造例1 :含有DDMP的醫(yī)藥品
片齊[J : 根據(jù)以下所示方法，制造含有DDMP的醫(yī)藥品(片劑)。 將實(shí)施例4中的得到的DDMP2g、乳糖296. 7g以及硬脂酸鎂1. 3g混合，通過用單沖壓片機(jī)壓片，制造直徑10mm、重量300mg的片劑。
顆粒劑 加入實(shí)施例4中得到的DDMP2g、乳糖296. 7g以及硬脂酸鎂1. 3g，進(jìn)行壓縮、粉碎、制粒，進(jìn)行過篩后得到20 50目的顆粒劑。
制造例2 :含有DDMP的飲食物 利用通常方法制造以下組成的含有DDMP的各種食品。
:0130] 冰激淋
:0131](組成) (重量份)
:0132] 鮮奶油(45%脂肪) 33.8
:0133] 脫脂奶粉 11.0
:0134] 細(xì)砂糖 14.8
:0135] 加糖卵黃 0.3
:0136] 香草精 0. 1
:0137] 水 39.998
:0138] DDMP 0.002
:0139] _
:0140] 總量 100.00
:0141] 果汁
:0142](組成) (重量份)
:0143] 冷凍溫州柑橘汁 5.0
:0144] 果糖葡萄糖液糖 11.0
:0145] 檸檬酸 0.2
:0146] L-抗壞血酸 0.02
:0147] DDMP 0.002
:0148] 香料 0.2
:0149] 色素 0. 1
:0150] 水 83.478
:0151] _
:0152] 總量 100.00
:0153] 乳酸菌飲料
:0154](組成) (重量份)
:0155] 乳固體成分21%發(fā)酵乳 14.76
15
果糖葡萄糖液糖 13.31 果膠 0.5 檸檬酸 0.08 香料 0. 15 水 71. 198 DDMP 0.002 _ 總量 100.00 酸奶(組成) (重量份) 鮮奶(3.4%脂肪) 80.0 鮮奶油(50%脂肪) 8.0 脫脂奶粉 1.5 水 7.498 發(fā)酵劑 3.0 DDMP 0.002 _ 總量 100.00 咖啡飲料(組成) (重量份) 細(xì)砂糖 8.0 脫脂奶粉 5.0 焦糖 0.2 咖啡提取物 2.0 香料 0. 1 聚甘油脂肪酸酯 0.05 食鹽 0.05 水 84.598 DDMP 0.002 _ 總量 100.00 酒精飲料(組成) (重量份) 50容量％乙醇 32.0 砂糖 8.4 果汁 2.4 DDMP 0.002 精制水 57. 198 _
16
總量 100.0 在實(shí)施例1中由乳酸菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基上清中得到的2，3-dihydro-3，5-dihydrox y-6-methyl-4H-pyran-4-one，具有腎臟交感神經(jīng)活動(dòng)的亢進(jìn)效果但不升高血壓，因此認(rèn)為 與通常的具有交感神經(jīng)活動(dòng)的亢進(jìn)效果的組合物相比，有可能對(duì)于作為肥胖癥的合并癥而 成為問題的高血壓癥的安全性高。其次，因?yàn)槠渚哂形该宰呱窠?jīng)(副交感神經(jīng))活動(dòng)抑制效 果，所以認(rèn)為有可能具有腸道抑制性地抑制食欲的效果。進(jìn)而因?yàn)槠渚哂惺辜珉伍g褐色脂 肪細(xì)胞組織的交感神經(jīng)活動(dòng)、以及副睪丸周圍白色脂肪組織的交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)的效果， 所以認(rèn)為有通過使脂肪燃燒作用亢進(jìn)，從而具有抗肥胖效果的可能性。此外，根據(jù)上述實(shí)施 例2及3的方法，具有只要實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是活著的，就可依次測(cè)定不同試樣的自律神經(jīng)調(diào)節(jié)作用 的優(yōu)點(diǎn)。 進(jìn)而判斷2，3-dihydro-3，5-dihydroxy-6-methyl-4H-py屋-4-one也使會(huì)糧代 話抗進(jìn)。由此表明，通過使用2， 3-dihydro-3， 5-dihydroxy-6-methyl-4H-py屋-4-one，可 提供對(duì)肥胖癥及/或其合并癥有效的醫(yī)藥組合物或飲食物。
1權(quán)利要求
醫(yī)藥組合物或飲食物，其特征在于，其含有臨床上有效量的2，3-二氫-3，5-二羥基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮及作為醫(yī)藥或食品所允許的添加劑，具有自律神經(jīng)調(diào)節(jié)作用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的醫(yī)藥組合物或飲食物，其中，所述自律神經(jīng)調(diào)節(jié)作用為交感 神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)作用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的醫(yī)藥組合物或飲食物，其具有能量代謝促進(jìn)作用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的醫(yī)藥組合物或飲食物，其用于治療與自律神經(jīng) 活動(dòng)、或能量代謝相關(guān)的疾病或狀態(tài)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的醫(yī)藥組合物或飲食物，其中，所述與自律神經(jīng)活動(dòng)、或能量代 謝相關(guān)的疾病或狀態(tài)為肥胖癥及/或其合并癥。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的醫(yī)藥組合物或飲食物，其含有具有2， 3- 二 氫_3， 5- 二羥基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮生產(chǎn)能力的微生物或其加工品。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的醫(yī)藥組合物或飲食物，其含有具有2， 3- 二 氫_3， 5- 二羥基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮生產(chǎn)能力的微生物的培養(yǎng)上清或其加工品。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的醫(yī)藥組合物或飲食物，其中，所述微生物為乳酸菌。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的醫(yī)藥組合物或飲食物，其中，所述乳酸菌屬于鏈球菌屬 (Stor印tococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、片球菌 屬(Pediococcus)、雙歧桿菌屬(Bif idobacterium)、四體球菌屬(Tetragenococcus)、 魏斯氏菌屬(Weissella)、腸球菌屬(Enterococcus)、蜜蜂球菌屬(Melisscoccus)、乳 球菌屬(Lactococcus)、肉食桿菌屬(Carnobacterium)、漫游球菌屬(Vagococcus)、奇 異菌屬(Atopobium)、乳球形菌屬(Lactosphaera)、酒球菌屬(0enococcus)、乏養(yǎng)菌屬 (Abiotrophia) 、 Paralactobacillus屬、顆粒鏈菌屬(Gra皿licatella) 、 Atopobactor屬、 Alkalibacterium屬或Olsenella屬。
10. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的醫(yī)藥組合物或飲食物，其中，所述微生物屬于植物乳桿 菌(優(yōu)選植物乳桿菌SAM 2446株(FERM ABP-10438))或短乳桿菌(優(yōu)選短乳桿菌SAM 2447 株(FERM ABP-10439))。
11. 權(quán)利要求1 10中任一項(xiàng)所述的醫(yī)藥組合物或飲食物的制造方法，其包括將具有 2， 3- 二氫-3， 5- 二羥基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮生產(chǎn)能力的微生物在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng) 的工序。
全文摘要
本發(fā)明將提供具有自律神經(jīng)活動(dòng)的調(diào)節(jié)作用、特別是交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)作用、進(jìn)而能量代謝促進(jìn)作用，用來預(yù)防或治療肥胖癥或其合并癥的安全組合物作為課題。提供含有2，3-二氫-3，5-二羥基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮的具有自律神經(jīng)調(diào)節(jié)作用、能量代謝調(diào)節(jié)作用的醫(yī)藥組合物或飲食物。
文檔編號(hào)A61K31/351GK101707910SQ20088001118
公開日2010年5月12日 申請(qǐng)日期2008年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月30日
發(fā)明者別府佳紀(jì), 小村啟, 櫓木智裕, 永井克也, 鶴岡伸夫 申請(qǐng)人:三得利控股株式會(huì)社