專(zhuān)利名稱(chēng)：脈絡(luò)膜血管新生的疫苗療法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于由脈絡(luò)膜新生血管形成導(dǎo)致的疾病(新生血管性黃斑病 變)的治療和/或預(yù)防的藥劑。此外，本發(fā)明還涉及脈絡(luò)膜新生血管形成的抑制劑。
背景技術(shù)：
起因于脈絡(luò)膜新生血管形成(CNV)的滲出型老化相關(guān)性黃斑變性(AMD) 在發(fā)達(dá)國(guó)家中是導(dǎo)致高度視力障礙的主要原因之一。目前已得到的證據(jù)顯 示，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在CNV的發(fā)生中扮演中心角色。例如有報(bào)告 稱(chēng)，抑制VEGF產(chǎn)生的化合物或抑制VEGF信號(hào)傳導(dǎo)途徑的化合物可以抑 制CNV。此外，有報(bào)告稱(chēng)，與包含光線(xiàn)力學(xué)療法在內(nèi)的傳統(tǒng)治療方法相比， 抗VEGF抗體顯示出更高的治療有效性。因而，近年來(lái)抗VEGF藥物成為 針對(duì)CNV的藥物療法的主要選擇。
VEGF信號(hào)傳導(dǎo)是由兩種受體酪氨酸激酶即VEGFR-1和VEGFR-2介導(dǎo) 的。上迷任何一種受體均在人CNV膜或?qū)嶒?yàn)小鼠CNV膜上表達(dá)。然而， 關(guān)于CNY中VEGFR-1信號(hào)傳導(dǎo)途徑的作用依然存在爭(zhēng)議。例如某項(xiàng)研究 報(bào)告稱(chēng)，通過(guò)口服施用抗體、基因敲除、siRNA來(lái)抑制VEGFR-1信號(hào)傳導(dǎo)， 從而抑制了 CNV。此外，其它研究報(bào)告稱(chēng)，在眼內(nèi)，通過(guò)VEGF或作為 VEGFR-2配體的胎盤(pán)生長(zhǎng)因子l(PIGFl)活化VEGFR-l,導(dǎo)致VEGFR-2被 SPARC活化，結(jié)果導(dǎo)致CNV被活化。
另一方面，關(guān)于VEGFR-2，普遍接受的觀點(diǎn)是VEGFR-2信號(hào)傳導(dǎo)的活 化可促進(jìn)CNV增殖。即可以認(rèn)為通過(guò)全身施用或局部施用抗VEGFR-2 藥或VEGFR-2抗體，玻璃體內(nèi)施用siRNA等以VEGFR-2為輩巴標(biāo)的新生血 管形成抑制策略，可以抑制VEGFR-2的信號(hào)傳導(dǎo)，從而也抑制CNY增殖。
然而，現(xiàn)在可利用的抗VEGF藥物存在必須以4周~6周間隔反復(fù)進(jìn)行 注射的問(wèn)題。此外，罹患眼內(nèi)炎或視網(wǎng)膜剝離等嚴(yán)重合并癥的風(fēng)險(xiǎn)較高。 因而，需要確立一種用于替代現(xiàn)有的抗VEGF藥物的新治療方法。已知在腫瘤組織中，使用了人VEGF受體2來(lái)源的肽的疫苗^"導(dǎo)出細(xì) 胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL),該細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞對(duì)表達(dá)VEGFR-2的內(nèi)皮 細(xì)胞顯示強(qiáng)力的細(xì)胞毒性(專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。然而，能夠在脈絡(luò)膜中誘導(dǎo)出細(xì)胞 毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的疫苗的存在是未知的。此外，與其他組織一樣，在 脈絡(luò)膜新生血管形成的機(jī)制也存在許多不明之處。
本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)如下。
專(zhuān)利文獻(xiàn)1 : WO/2004/02476
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的問(wèn)題
本發(fā)明正是鑒于上述情況而完成的，本發(fā)明所要解決的問(wèn)題是提供一 種以已知與脈絡(luò)膜新生血管形成相關(guān)的蛋白質(zhì)之一 VEGFR-2為靶標(biāo)的、用 于治療和/或預(yù)防由脈絡(luò)膜新生血管形成導(dǎo)致的疾病(新生血管性黃斑病變) 的藥劑。此外，本發(fā)明的課題是提供一種脈絡(luò)膜新生血管形成的抑制劑。 解決問(wèn)題的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明人在解決上述課題的過(guò)程中，注意到已知與脈絡(luò)膜新生血管形 成相關(guān)的一種蛋白質(zhì)——VEGFR-2。具體地，本發(fā)明人等嘗試了將以 VEGFR-2衍生肽為抗原的疫苗施用于表達(dá)人HLA-A*0201的^f莫型小鼠 (A2/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠)，并對(duì)該疫苗的效果進(jìn)行確認(rèn)。結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)， 以該肽為抗原的疫苗可抑制脈絡(luò)膜新生血管形成。
關(guān)于脈絡(luò)膜新生血管形成與VEGF之間的關(guān)聯(lián)已經(jīng)有許多報(bào)告。然而， 與其他組織 一樣，在脈絡(luò)膜新生血管形成的機(jī)制也存在許多不明之處， VEGFR-1、 VEGFR-2在新生血管形成中起怎樣的作用尚未闡明。特別是盡 管已經(jīng)有關(guān)于將VEGFR-1 、 VEGFR-2應(yīng)用于針對(duì)腫瘤的疫苗療法的報(bào)告，
本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為，盡管已知VEGFR-1、 VEGFR-2來(lái)源的肽疫苗可抑制 脈絡(luò)膜以外的新生血管，但在脈絡(luò)膜中未必會(huì)顯示相同效果。其中，本發(fā)
明人等在眾多候選當(dāng)中選擇VEGFR-2作為靶標(biāo)，進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 以VEGFR-2衍生肽為抗原的疫苗能夠抑制脈絡(luò)膜中的新生血管。而且還發(fā) 現(xiàn)以VEGFR-2衍生肽為抗原的疫苗，不僅對(duì)重癥患者有效，而且對(duì)屬于 視力比較良好的早期病例的患者也是有效的。即，本發(fā)明提供以下的〔1〕~ 〔36〕。
〔1 〕用于治療和/或預(yù)防由脈絡(luò)膜新生血管形成導(dǎo)致的疾病(新生血管性黃斑病變)的藥劑，其含有下述(a) (c)中任一項(xiàng)的肽中的至少1種作為有效成分
(a) 包含SEQ ID NO: 1~12中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的肽；
(b) 在SEQIDNO:1 6中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中取代、缺失、添加和/或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的肽，其中N末端起第2位的氨基酸為亮氨酸或曱硫氨酸、和/或C末端的氨基酸為纈氨酸或亮氨酸，并且該肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性、
(c) 在SEQIDNO:7 12中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中取代、缺失、添加和/或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的肽，其中N末端起第2位的氨基酸為苯丙氨酸、酪氨酸、曱硫氨酸或色氨酸，和/或C末端的氨基酸為苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或曱硫氨酸，并且該肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性。
〔2〕 〔1〕所述的藥劑，其中，由脈絡(luò)膜新生血管形成導(dǎo)致的疾病(新生血管性黃斑病變)選自滲出型老化相關(guān)性黃斑變性(滲出型加齢黃斑変性)、近視性黃斑變性、視網(wǎng)膜血管樣紋(網(wǎng)膜色素線(xiàn)條癥)、中心性滲出性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變、各種視網(wǎng)膜色素上皮病變、脈絡(luò)膜萎縮、無(wú)脈絡(luò)膜、
脈絡(luò)膜骨瘤。
〔3 〕用于治療和/或預(yù)防由脈絡(luò)膜新生血管形成導(dǎo)致的疾病(新生血管性黃斑病變)的疫苗，其含有下述(a)或(b)的肽中的至少l種作為有效成分
(a) 包含SEQ ID NO: 1~6中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的肽；
(b) 在SEQ ID NO:l~6中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列沖取代、缺失、添加和/或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的肽，該肽的N末端起第2位的氨基酸為亮氨酸或曱硫氨酸，和/或C末端的氨基酸為纈氨酸或亮氨酸，并且該肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性。
〔4 〕用于治療和/或預(yù)防由脈絡(luò)膜新生血管形成導(dǎo)致的疾病(新生血管性黃斑病變)的疫苗，其含有下述(a)或(b)的肽中的至少l種作為有效成分
(a) 包含SEQ IDNO:7 12中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的肽；
(b) 在SEQIDNO:7 12中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中取代、缺失、添加和/或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的肽，該肽的N末端起第2位的氨基酸為
7苯丙氨酸、酪氨酸、曱硫氨酸或色氨酸，和/或C末端的氨基酸為苯丙氨酸、
亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或曱硫氨酸，并且該肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性、
〔5〕 〔3〕所述的疫苗，其施用于HLA抗原為HLA-A02的受試者?！?〕 〔4〕所述的疫苗，其施用于HLA抗原為HLA-A24的受試者。〔7〕 〔5〕或〔6〕所述的疫苗，其中，由脈絡(luò)膜新生血管形成導(dǎo)致的
疾病(新生血管性黃斑病變)選自滲出型老化相關(guān)性黃斑變性、近視性黃斑變
性、視網(wǎng)膜血管樣紋、中心性滲出性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變、各種視網(wǎng)膜色素
上皮病變、脈絡(luò)膜萎縮、無(wú)脈絡(luò)膜、脈絡(luò)膜骨瘤。
〔8〕用于抑制脈絡(luò)膜新生血管形成的藥劑，其含有下述(a) (c)中任一
項(xiàng)所述的肽中的至少1種作為有效成分
(a) 包含SEQ ID NO:1 12中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的肽；
(b) 在SEQ IDNO:1 6中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中取代、缺失、添加和/或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的肽，該肽的N末端起第2位的氨基酸為亮氨酸或曱硫氨酸，和/或C末端的氨基酸為纈氨酸或亮氨酸，并且該肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性；
(c) 在SEQIDNO:7 12中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中取代、缺失、添加和/或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的肽，該肽的N末端起第2位的氨基酸為苯丙氨酸、酪氨酸、曱硫氨酸或色氨酸，和/或C末端的氨基酸為苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或曱硫氨酸，并且該肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性。
〔9〕用于抑制脈絡(luò)膜新生血管形成的疫苗，其含有下述(a)或(b)的肽中的至少1種作為有效成分
(a) 包含SEQ ID NO:l~6中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的肽；
(b) 在SEQ ID NO:l~6中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中取代、缺失、添加和/或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的肽，該肽的N末端起 2位的氨基酸為亮氨酸或曱硫氨酸，和/或C末端的氨基酸為纈氨酸或亮氨酸，并且該肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性。
〔10〕用于抑制脈絡(luò)膜新生血管形成的疫苗，其含有下述(a)或(b)的肽中的至少1種作為有效成分
(a)包含SEQIDNO:7 12中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的肽；(b)在SEQIDNO:7 12中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中取代、缺失、添加和/或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的肽，其中N末端起第2位的氨基酸為苯丙氨酸、酪氨酸、曱硫氨酸或色氨酸，和/或C末端的氨基酸為苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或曱石克氨酸，并且該肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性。
〔11〕 〔9〕所述的疫苗，其施用于HLA抗原為HLA-A02的受試者?！?2〕 〔10〕所述的疫苗，其施用于HLA抗原為HLA-A24的受試者?！?3 〕用于治療和/或預(yù)防由脈絡(luò)膜新生血管形成導(dǎo)致的疾病(新生血管
性黃斑病變)的方法，其包括給受試者施用含有下述(a) (c)中任一項(xiàng)所述的
肽中的至少l種作為有效成分的藥劑的步驟
(a) 包含SEQIDNO:1 12中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的肽；
(b) 在SEQIDNO:l 6中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中取代、缺失、添加和/或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的肽，其中N末端起第2位的氨基酸為亮氨酸或曱硫氨酸，和/或C末端的氨基酸為纈氨酸或亮氨酸，并且該肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性；
(c) 在SEQIDNO:7 12中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中取代、缺失、添加和/或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的肽，其中N末端起第2位的氨基酸為苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸，和/或C末端的氨基酸為苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或曱硫氨酸，并且該肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性。
〔14〕 〔13〕所述的方法，其中由脈絡(luò)膜新生血管形成導(dǎo)致的疾病(新生血管性黃斑病變)選自滲出型老化相關(guān)性黃斑變性、近視性黃斑變性、視網(wǎng)膜血管樣紋、中心性滲出性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變、各種視網(wǎng)膜色素上皮病變、脈絡(luò)膜萎縮、無(wú)脈絡(luò)膜、脈絡(luò)膜骨瘤。
〔15〕用于由脈絡(luò)膜新生血管形成導(dǎo)致的疾病(新生血管性黃斑病變)的治療和/或預(yù)防的方法，其包括給受試者施用含有下述(a)或(b)的肽中的至少1種作為有效成分的疫苗的步驟
(a) 包含SEQ IDNO:1 6中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的肽；
(b) 在SEQ ID NO:1 6中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中取代、缺失、添加和/或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的肽，其中N末端起第2位的氨基酸為亮氨酸或曱硫氨酸，和/或C末端的氨基酸為纈氨酸或亮氨酸，并且該肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性。
〔16〕用于治療和/或預(yù)防由脈絡(luò)膜新生血管形成導(dǎo)致的疾病(新生血管性黃斑病變)的方法，其包括給受試者施用含有下述(a)或(b)的肽中的至少1種作為有效成分的疫苗的步驟
(a) 包含SEQ ID NO:7~12中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的肽；
(b) 在SEQIDNO:7 12中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中取代、缺失、添加和/或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的肽，其中N末端起第2位的氨基酸為苯丙氨酸、酪氨酸、曱硫氨酸或色氨酸，和/或C末端的氨基酸為苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或曱硫氨酸，并且該肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性。
〔17〕 〔15〕所述的方法，其施用于HLA抗原為HLA-A02的受試者?！?8〕 〔16〕所述的方法，其施用于HLA抗原為HLA-A24的受試者。〔19〕 〔17〕或〔18〕所述的方法，其中，由脈絡(luò)膜新生血管形成導(dǎo)
斑變性、視網(wǎng)膜血管樣紋、中心性滲出性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變、各種視網(wǎng)膜色素上皮病變、脈絡(luò)膜萎縮、無(wú)脈絡(luò)膜、脈絡(luò)膜骨瘤。
〔20〕用于抑制脈絡(luò)膜新生血管形成的方法，其包括給受試者施用含有下述(a) (c)中任一項(xiàng)的肽中的至少1種作為有效成分的藥劑的步驟
(a) 包含SEQIDNO:1 12中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的肽；
(b) 在SEQ ID NO:1 6中任一項(xiàng)所示的氨基S吏序列中取代、缺失、添加和/或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的肽，其中N末端起第2位的氨基酸為亮氨酸或曱硫氨酸，和/或C末端的氨基酸為纈氨酸或亮氨酸，并且該肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性；
(c) 在SEQIDNO:7 12中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中取代、缺失、添加和/或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的肽，該肽的N末端起第2位的氨基酸為苯丙氨酸、酪氨酸、曱硫氨酸或色氨酸，和/或C末端的氨基酸為笨丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或曱硫氨酸，并且該肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性。
〔21〕用于抑制脈絡(luò)膜新生血管形成的方法，其包括給受試者施用含有下述(a)或(b)的肽中的至少1種作為有效成分的疫苗的步驟(a)包含SEQ IDNO:l-6中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的肽；200880012298.0
和/或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的肽，該肽的N末端起第2位的氨基酸為 亮氨酸或曱硫氨酸，和/或C末端的氨基酸為纈氨酸或亮氨酸，并且該肽具 有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性。
〔22〕用于抑制脈絡(luò)膜新生血管形成的方法，其包括給受試者施用含 有下述(a)或(b)的肽中的至少1種作為有效成分的疫苗的步驟
(a) 包含SEQ IDNO:7 12中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的肽；
(b) 在SEQIDNO:7 12中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中取代、缺失、添加 和/或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的肽，其中N末端起第2位的氨基酸為苯 丙氨酸、酪氨酸、曱硫氨酸或色氨酸，和/或C末端的氨基酸為苯丙氨酸、 亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或曱硫氨酸，并且該肽具有it導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì) 胞的活性。
〔23〕 〔21〕所述的方法，其施用于HLA抗原為HLA-A02的受試者。 〔24〕 〔22〕所述的方法，其施用于HLA抗原為HLA-A24的受試者。 〔25 〕下述(a) (c)中任一項(xiàng)所述的肽在制造用于治療和/或預(yù)防由脈絡(luò) 膜新生血管形成導(dǎo)致的疾病(新生血管性黃斑病變)的藥劑中的用途
(a) 包含SEQ ID NO:1 12中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的肽；
(b) 在SEQIDNO:1 6中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中取代、缺失、添加 和/或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的肽，其中N末端起第2位的氨基酸為亮 氨酸或曱硫氨酸，和/或C末端的氨基酸為纈氨酸或亮氨酸，并且該肽具有 誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性；
(c) 在SEQIDNO:7 12中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中取代、缺失、添加 和/或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的肽，其中N末端起第2位的氨基酸為苯 丙氨酸、酪氨酸、曱硫氨酸或色氨酸，和/或C末端的氨基酸為苯丙氨酸、 亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或曱硫氨酸，并且該肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì) 胞的活性。
〔26〕 〔25〕所述的用途，其中，由脈絡(luò)膜新生血管形成導(dǎo)致的疾病(新
網(wǎng)膜血管樣紋、中心性滲出性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變、各種視網(wǎng)膜色素上皮病 變、脈絡(luò)膜萎縮、無(wú)脈絡(luò)膜、脈絡(luò)膜骨瘤。
〔27〕下述(a)或(b)的肽在制造用于治療和/或預(yù)防由脈絡(luò)膜新生血管形成導(dǎo)致的疾病(新生血管性黃斑病變)的疫苗中的用途
(a) 包含SEQ ID NO: 1~6中任一項(xiàng)所示的氨基i^f列的肽；
(b) 在SEQ ID NO:l~6中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中取代、缺失、添加 和/或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的肽，其中N末端起第2位的氨基酸為亮 氨酸或曱硫氨酸，和/或C末端的氨基酸為纈氨酸或亮氨酸，并且該肽具有 誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性。
〔28〕下述(a)或(b)的肽在制造用于治療和/或預(yù)防由脈絡(luò)膜新生血管形 成導(dǎo)致的疾病(新生血管性黃斑病變)的疫苗中的用途
(a) 包含SEQIDNO:7 12中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的肽；
(b) 在SEQIDNO:7 12中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中取代、缺失、添加 和/或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的肽，該肽的N末端起第2位的氨基酸為 苯丙氨酸、酪氨酸、曱硫氨酸或色氨酸，和/或C末端的氨基酸為苯丙氨酸、 亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或曱硫氨酸，并且該肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì) 胞的活性。
〔29〕 〔27〕所述的用途，其中，所述疫苗用于施用給HLA抗原為 HLA-A02的受試者。
〔30〕 〔28〕所述的用途，其中，所述疫苗用于施用給HLA抗原為 HLA-A24的受試者。
〔31〕 〔29〕或〔30〕所述的用途，其中，由脈絡(luò)膜新生血管形成導(dǎo) 致的疾病(新生血管性黃斑病變)選自滲出型老化相關(guān)性黃斑變性、近視性黃 斑變性、視網(wǎng)膜血管樣紋、中心性滲出性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變、各種視網(wǎng)膜 色素上皮病變、脈絡(luò)膜萎縮、無(wú)脈絡(luò)膜、脈絡(luò)膜骨瘤。
〔32〕下述(a) (c)中任一項(xiàng)所述的肽在制造用于抑制脈絡(luò)膜新生血管形 成的藥劑中的用途
(a) 包含SEQ ID NO: 1 12中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的肽；
(b) 在SEQIDNO:l 6中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中取代、缺失、添加 和/或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的肽，其中N末端起第2位的氨基酸為亮 氨酸或曱硫氨酸，和/或C末端的氨基酸為纈氨酸或亮氨酸，并且該肽具有 誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性；
(c) 在SEQIDNO:7 12中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中取代、缺失、添加 和/或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的肽，其中N末端起第2位的氨基酸為苯
12丙氨酸、酪氨酸、曱硫氨酸或色氨酸，和/或C末端的氨基酸為苯丙氨酸、 亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或曱硫氨酸，并且該肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì) 胞的活性。
〔33〕下述(a)或(b)的肽在制造用于抑制脈絡(luò)膜新生血管形成的疫苗中 的用途
(a) 包含SEQ ID NO:l~6中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的肽；
(b) 在SEQIDNO:l 6中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中取代、缺失、添加 和/或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的肽，其中N末端起第2位的氨基酸為亮 氨酸或曱硫氨酸，和/或C末端的氨基酸為纈氨酸或亮氨酸，并且該肽具有 誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性。
〔34〕下述(a)或(b)的肽在制造用于抑制脈絡(luò)膜新生血管形成的疫苗中 的用途
(a) 包含SEQIDNO:7 12中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的肽；
(b) 在SEQIDNO:7 12中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中取代、缺失、添加 和/或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的肽，其中N末端起第2位的氨基酸為苯 丙氨酸、酪氨酸、曱硫氨酸或色氨酸，和/或C末端的氨基酸為苯丙氨酸、 亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或曱硫氨酸，并且該肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì) 胞的活性。
〔35〕 〔33〕所述的用途，其中，所述疫苗用于施用給HLA抗原為 HLA-A02的受試者。
〔36〕 〔34〕所述的用途，其中，所述疫苗用于施用于HLA抗原為 HLA-A24的受試者。
〔37 〕用于治療和/或預(yù)防由脈絡(luò)膜新生血管形成導(dǎo)致的疾病(新生血管 性黃斑病變)的下述(a) (c)中任一項(xiàng)所述的肽
(a) 包含SEQIDNO:1 12中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的肽；
(b) 在SEQIDNO:1 6中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中取代、缺失、添加 和/或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的肽，其中N末端起第2位的氨基酸為亮 氨酸或甲硫氨酸，和/或C末端的氨基酸為纈氨酸或亮氨酸，并且該肽具有 誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性；
(c) 在SEQIDNO:7 12中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中取代、缺失、添加 和/或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的肽，其中N末端起第2位的氨基酸為苯丙氨酸、酪氨酸、曱硫氨酸或色氨酸，和/或C末端的氨基酸為苯丙氨酸、
亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸，并且該肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)
胞的活性。
〔38〕 〔37〕所述的肽，其中，由脈絡(luò)膜新生血管形成導(dǎo)致的疾病(新 生血管性黃斑病變)選自滲出型老化相關(guān)性黃斑變性、近視性黃斑變性、視 網(wǎng)膜血管樣紋、中心性滲出性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變、各種視網(wǎng)膜色素上皮病 變、脈絡(luò)膜萎縮、無(wú)脈絡(luò)膜、脈絡(luò)膜骨瘤。
〔39〕用于治療和/或預(yù)防由脈絡(luò)膜新生血管形成導(dǎo)致的疾病(新生血管 性黃斑病變)的下述(a)或(b)的肽
(a) 包含SEQIDNO:卜6中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的肽；
(b) 在SEQ ID NO: 1 ~6中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中取代、缺失、添加 和/或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的肽，其中N末端起笫2位的氨基酸為亮 氨酸或曱硫氨酸，和/或C末端的氨基酸為纈氨酸或亮氨酸，并且該肽具有 誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性。
〔40〕用于治療和/或預(yù)防由脈絡(luò)膜新生血管形成導(dǎo)致的疾病(新生血管 性黃斑病變)的下述(a)或(b)的肽
(a) 包含SEQ ID NO:7~l2中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的肽；
(b) 在SEQIDNO:7 12中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中取代、缺失、添加 和/或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的肽，其中N末端起第2位的氨基酸為苯 丙氨酸、酪氨酸、曱硫氨酸或色氨酸，和/或C末端的氨基酸為苯丙氨酸、 亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或曱硫氨酸，并且該肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì) 胞的活性。
〔41〕 〔39〕所述的肽，其中，所述的疫苗用于施用給HLA抗原為 HLA-A02的受試者。
〔42〕 〔40〕所述的肽，其中，所述疫苗用于施用給HLA抗原為 HLA-A24的受試者。
〔43〕 〔41〕或〔42〕所述的肽，其中，由脈絡(luò)膜新生血管形成導(dǎo)致 的疾病(新生血管性黃斑病變)選自滲出型老化相關(guān)性黃斑變性、近視性黃斑 變性、視網(wǎng)膜血管樣紋、中心性滲出性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變、各種視網(wǎng)膜色 素上皮病變、脈絡(luò)膜萎縮、無(wú)脈絡(luò)膜、脈絡(luò)膜骨瘤。
〔44〕用于抑制脈絡(luò)膜新生血管形成的下述(a) (c)中任一項(xiàng)所述的肽(a) 包含SEQ IDNO:1 12中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的肽；
(b) 在SEQIDNO:1 6中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中取代、缺失、添加 和/或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的肽，其中N末端起第2位的氨基酸為亮 氨酸或曱硫氨酸，和/或C末端的氨基酸為纈氨酸或亮氨酸，并且該肽具有 誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性；
(c) SEQIDNO:7 12中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中取代、缺失、添加和 /或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的肽，其中N末端起第2位的氨基酸為苯丙 氨酸、酪氨酸、曱硫氨酸或色氨酸，和/或C末端的氨基酸為苯丙氨酸、亮 氨酸、異亮氨酸、色氨酸或曱硫氨酸，并且該肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞 的活性。
〔45〕用于抑制脈絡(luò)膜新生血管形成的下述(a)或(b)的肽
(a) 包含SEQIDNO:1 6中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的肽；
(b) 在SEQIDNO:1 6中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中取代、缺失、添加 和/或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的肽，其中N末端起第2位的氨基酸為亮 氨酸或曱硫氨酸，和/或C末端的氨基酸為纈氨酸或亮氨酸，并且該肽具有 誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性。
〔46〕用于抑制脈絡(luò)膜新生血管形成的下述(a)或(b)的肽
(a) 包含SEQIDNO:7 12中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的肽；
(b) 在SEQIDNO:7 12中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中取代、缺失、添加 和/或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的肽，其中N末端起第2位的氨基酸為苯 丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸，和/或C末端的氨基酸為苯丙氨酸、 亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或曱硫氨酸，并且該肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì) 胞的活性。 〔47〕 〔45〕所述的肽，其中，所述疫苗用于施用給HLA抗原為 HLA-A02的受試者。
〔48〕 〔46〕所述的肽，其中，所述疫苗用于施用給HLA抗原為 HLA-A24的受試者。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明顯示第7天時(shí)PBS施用組、IFA單獨(dú)施用組、肽疫苗接種組各 自的熒光眼底造影中來(lái)自脈絡(luò)膜新生血管的熒光的漏出指數(shù)的圖表。〖圖2]圖2為顯示第7天的PBS施用組、IFA單獨(dú)施用組、肽疫苗接 種組各自的熒光眼底造影的一個(gè)例子的照片。圖3為顯示第7天的PBS施用組、IFA單獨(dú)施用組、肽疫苗接 種組各自的熒光眼底造影中脈絡(luò)膜新生血管的截面面積的圖表。圖4顯示第7天的PBS施用組、IFA單獨(dú)施用組、肽疫苗接種 組各自的脈絡(luò)膜伸展標(biāo)本的一個(gè)例子的照片。
發(fā)明的
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明涉及含有VEGFR-2衍生肽作為有效成分，用于治療和/或預(yù)防由 脈絡(luò)膜新生血管形成導(dǎo)致的疾病(新生血管性黃斑病變)的藥劑(以下也稱(chēng)"本 發(fā)明的藥劑")。如上所述，本發(fā)明是基于本發(fā)明人等的下述發(fā)現(xiàn)以 VEGFR-2衍生肽為抗原的疫苗可有效地抑制脈絡(luò)膜新生血管形成。
人VEGFR-2的氨基酸序列是公知的，例如記載于美國(guó)專(zhuān)利第5,861,301 號(hào)。獲知該專(zhuān)利文獻(xiàn)所述的信息的本領(lǐng)域技術(shù)人員均可容易地獲得人 VEGFR-2。
本發(fā)明的藥劑中所含的VEGFR-2 ^f汙生肽優(yōu)選為9聚體或10聚體形式 的部分肽。作為這樣的肽，更具體地可以列舉
(a) 包含SEQ ID NO: 1~12中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的肽。 對(duì)于本發(fā)明的肽沒(méi)有特殊限制，只要其具有誘導(dǎo)針對(duì)VEGFR-2表達(dá)細(xì)
胞的CTL的活性即可。即，本發(fā)明的肽還包括
(b) 在SEQIDNO:1 6中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中取代、缺失、添加 和/或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的肽，其中該肽的N末端起第2位的氨基 酸為亮氨酸或曱硫氨酸，和/或C末端的氨基酸為纈氨酸或亮氨酸，并且該 肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性。而且，在肽的N末端和/或C末端還可 以添加1 2個(gè)氨基酸。
此外，本發(fā)明的肽還包括
(c) 在SEQIDNO:7 12中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中取代、缺失、添加 和/或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的肽，其中該肽的N末端起第2位的氨基 酸為苯丙氨酸、酪氨酸、曱硫氨酸或色氨酸，和/或C末端的氨基酸為苯丙 氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或曱硫氨酸，并且該肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒 性T細(xì)胞的活性。在對(duì)氨基酸殘基進(jìn)行修飾時(shí)，理想的是使之突變?yōu)楸３职被醾?cè)鏈的
性質(zhì)的其它氨基酸。例如，作為氨基酸側(cè)鏈的性質(zhì)，可以列舉如下疏水 性氨基酸(A、 I、 L、 M、 F、 P、 W、 Y、 V)、親水性氨基酸(R、 D、 N、 C、 E、 Q、 G、 H、 K、 S、 T)、具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸(G、 A、 V、 L、 I、 P)、 具有含羥基側(cè)鏈的氨基酸(S、 T、 Y)、具有含硫側(cè)鏈的氨基酸(C、 M)、具有 含羧酸以及酰胺側(cè)鏈的氨基酸(D、 N、 E、 Q)、具有含堿性基團(tuán)側(cè)鏈的氨基 酸(R、 K、 H)、以及具有含芳香族側(cè)鏈的氨基酸(H、 F、 Y、 W)(括號(hào)內(nèi)為氨 基酸的單字母符號(hào))。上述各組內(nèi)的氨基酸之間的取代稱(chēng)為保守取代。已知 具有對(duì)某個(gè)氨基酸序列實(shí)施1或數(shù)個(gè)氨基酸殘基的缺失、添加和/或用其它 氨基酸加以取代來(lái)進(jìn)行修飾而得到的氨基酸序列的多肽能夠保持其生物學(xué) 活性(Mark， D. F. et al.， Proc Natl Acad Sci USA (1984)81:5662-6; Zoller, M. J. and Smith, M., Nucleic Acids Res.( 1982) 10:6487-500; Wang, A. et al,， Science(1984)224:1431-3; Dalbadie-McFarland, G. et al" Proc Natl Acad Sci USA (1982)79:6409-13)。對(duì)于突變的氨基酸數(shù)沒(méi)有特殊限制，通常為7個(gè)以 內(nèi)，優(yōu)選為5個(gè)以?xún)?nèi)，更優(yōu)選為3個(gè)以?xún)?nèi)(例如2個(gè)以?xún)?nèi))。氨基酸序列的同 一性可以使用例如Karlin and Altschul的算法BLAST(Proc Natl Acad Sci USA (1993) 90: 5873-7)來(lái)確定。
而且，在本發(fā)明中，特別優(yōu)選包含SEQ ID NO:2所述的氨基酸序列的肽。
此外，本發(fā)明的肽可以通過(guò)基于氨基酸序列、從任意的位置開(kāi)始進(jìn)行
M/f吏用的合成方法在例3口 Peptide Synthesis, Interscience， New York, 1966; The Proteins, Vol 2, Academic Press Inc., New York, 1976; K、合成、丸
善(株)、1975; ^:7。于K合成O基礎(chǔ)t実験、丸善(株)、1985;醫(yī)薬品(D開(kāi)発 続第14巻.〃:/于K合成、広川書(shū)店、1991等文獻(xiàn)、以及國(guó)際公開(kāi) W099/67288號(hào)等公報(bào)中有所記載。
本發(fā)明的肽還可以采用公知的基因工程方法來(lái)合成?；蚬こ毯铣煞?法的一個(gè)例子是這樣的方法，即將插入了編碼目的肽的DNA的載體導(dǎo)入適 當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，來(lái)制備轉(zhuǎn)化細(xì)胞。通過(guò)從該轉(zhuǎn)化細(xì)胞回收產(chǎn)生的肽，可以 獲得本發(fā)明的肽。
此夕卜，本發(fā)明的肽也可以通過(guò)先制備融合蛋白質(zhì)、再用合適的蛋白酶將其分解來(lái)獲得。制備融合蛋白質(zhì)的方法可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的 方法，只要將編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸與編碼其它肽的多核苷酸以符合 閱讀框的方式連接起來(lái)，然后將其導(dǎo)入表達(dá)載體，在宿主中進(jìn)行表達(dá)即可。
作為用于與本發(fā)明的肽相融合的其它肽，可以使用例如FLAG (Hopp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6， 1204-1210)、 6個(gè)His (組氨酸)殘基構(gòu)成的6xHis、 10xHis、流感凝集素(HA)、人c-myc的片段、VSV-GP的片段、pl8fflV的 片段、T7標(biāo)簽、HSV標(biāo)簽、E標(biāo)簽、SV40T抗原的片段、lck標(biāo)簽、a-微管 蛋白的片段、B標(biāo)簽、蛋白C的片段等公知的肽。此外，本發(fā)明的肽還可 以是與GST(谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶)、HA(流感凝集素)、免疫球蛋白恒定區(qū)、(3-半乳糖苷酶、MBP (麥芽糖結(jié)合蛋白)等的融合蛋白質(zhì)的形式。通過(guò)將如此 制備的融合蛋白質(zhì)用適當(dāng)?shù)牡鞍酌高M(jìn)行處理，并回收目的肽，可以獲得本 發(fā)明的肽。肽的回收可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法、例如親和層析 等來(lái)進(jìn)行。
此外，本發(fā)明的肽具有通過(guò)在體外或體內(nèi)接觸具有抗原呈遞能力的細(xì) 胞而誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性(細(xì)胞性T細(xì)胞誘導(dǎo)活性)。特別是，本發(fā)明 的肽優(yōu)選具有與被認(rèn)為在日本人中大量表達(dá)的A-02或A-24型等HLA抗原 的高親和性。A-02或A-24型等HLA抗原分別包括A-0201 、 A-2402等亞型。 作為對(duì)HLA-AW201具有高結(jié)合親和性的肽，可以列舉出SEQ ID NO:l~6 的肽(WO/2004/024766)。
此外，本發(fā)明的肽不僅包括對(duì)HLA-A*0201具有高結(jié)合親和性的肽， 還包括對(duì)其它種類(lèi)的HLA抗原(例如HLA-A42402)具有高結(jié)合親和性的肽。 在這樣的肽中，例如作為對(duì)HLA-A*2402具有高結(jié)合親和性的肽，可以列 舉例如SEQ ID NO:7 12的肽。
如果某蛋白質(zhì)衍生的肽作為疫苗的有效性得以確認(rèn)，那么本領(lǐng)域技術(shù) 人員就能夠容易地從同一蛋白質(zhì)中尋找與HLA抗原結(jié)合親和性高的其它 肽、并確認(rèn)作為疫苗的效果。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以容易地從同一 蛋白質(zhì)中尋找與HLA-A*0201以外的HLA抗原具有高結(jié)合親和性的肽，并 開(kāi)發(fā)可適用于各種人種的疫苗。本領(lǐng)域技術(shù)人員中公知，若某蛋白質(zhì)衍生 的肽激活針對(duì)該蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)，那么同一蛋白質(zhì)衍生的與其它HLA抗 原顯示高親和性的肽只要具有誘導(dǎo)針對(duì)該蛋白質(zhì)CTL的活性，就也可以激 活針對(duì)該蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)。更具體地說(shuō)，當(dāng)VEGFR-2衍生肽(例如SEQ IDNO:2等)激活針對(duì)VEGFR-2的免疫反應(yīng)并抑制新生血管時(shí)，VEGFR-2衍生 的顯示與其它HLA抗原的高親和性的肽(例如顯示對(duì)HLA-A24的高親和性 的肽)只要具有針對(duì)VEGFR-2的CTL誘導(dǎo)活性，也可激活針對(duì)VEGFR-2的 免疫反應(yīng)并抑制新生血管，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員中公知的。
本發(fā)明的肽與HLA抗原之間的結(jié)合可以這樣測(cè)定分離細(xì)胞表面具有 HLA抗原的細(xì)胞例如樹(shù)狀細(xì)胞，采用常規(guī)方法測(cè)定肽對(duì)細(xì)胞的結(jié)合。
此外，還可以使用可在互聯(lián)網(wǎng)上利用的軟件例如記載于Parker K. C.， J. Immunol. 152， 163-75 (1994)中的軟件等，來(lái)在計(jì)算機(jī)上(in silico)計(jì)算各種肽 與HLA抗原之間的結(jié)合親和性。而且，與HLA抗原的結(jié)合親和性可以采 用例如Parker, K.C" J. Immunol" 152, 163-75 (1994); Nukaya， I" Int. J. Cancer, 80, 92-7 (1999)等所述的方法來(lái)測(cè)定。
在臨床上，可以通過(guò)預(yù)先調(diào)查需要治療的患者的HLA抗原類(lèi)型，適宜 地選擇出與之結(jié)合親和性高，或者抗原呈遞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL) 誘導(dǎo)活性高的肽。在本發(fā)明的肽中還包括采用這樣的方法選擇出的肽。
此外，在本發(fā)明中，所謂治療，是指在現(xiàn)實(shí)地發(fā)生由脈絡(luò)膜新生血管 形成導(dǎo)致的疾病(新生血管性黃斑病變)所特有的癥狀的患者中減輕所述癥 狀。在本發(fā)明中對(duì)于減輕的程度沒(méi)有特殊限定，即使程度甚為輕微，但只 要能減輕癥狀，就包含在本發(fā)明的治療的含義中。
此外，在本發(fā)明中，所謂預(yù)防，是指預(yù)先抑制由脈絡(luò)膜新生血管形成
抑制進(jìn)展的程度沒(méi)有特 i限制，即使程度甚為輕微，但只要能抑制進(jìn)展， 就包含在本發(fā)明的預(yù)防的含義中。
因脈絡(luò)膜中的新生血管而引起的疾病(新生血管性黃斑病變)的癥狀包 括視力下降。該癥狀是否減輕可以通過(guò)視力檢查來(lái)進(jìn)行判定。而且，可以 通過(guò)熒光眼底造影檢查或者使用光干涉斷層裝置檢查，來(lái)評(píng)價(jià)脈絡(luò)膜新生 血管的活動(dòng)性。
本發(fā)明的肽可以單獨(dú)地在治療和/或預(yù)防中使用。或者，也可以采用通 常使用的制劑學(xué)方法來(lái)制劑化。此時(shí)，除了本發(fā)明的肽之外，還可以適宜 包含通常在醫(yī)藥中使用的載體、賦形劑等。例如，可以以與水或者其它藥 學(xué)可接受的液體所成的無(wú)菌性溶液或懸濁液劑的注射劑的形式非口服地使 用。例如，可以考慮通過(guò)與藥理學(xué)上可接受的載體或者介質(zhì)，具體地有滅菌水或生理鹽水、植物油、乳化劑、混懸劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑、香味
劑、賦形劑、溶媒(vehicles)、防腐劑、粘合劑等適宜地組合，并以通常接受 的制藥實(shí)踐所要求的單位用量形式進(jìn)行混和，來(lái)進(jìn)行制劑。調(diào)節(jié)這些制劑 中的有效成分量以獲得指示范圍內(nèi)的適當(dāng)劑量。
本發(fā)明的肽可以作為單獨(dú)1種或2種以上的組合，用作能夠在生物體 內(nèi)誘導(dǎo)CTL的疫苗。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及含有VEGFR-2衍生肽作為有效 成分，用于治療和/或預(yù)防由脈絡(luò)膜新生血管形成導(dǎo)致的疾病(新生血管性黃 斑病變)的疫苗。通過(guò)施用本發(fā)明的肽，可以將該肽高密度地呈遞在抗原呈 遞細(xì)胞的HLA抗原中，并誘導(dǎo)出可與所呈遞的肽與HLA抗原的復(fù)合體特 異性反應(yīng)的CTL,從而提高針對(duì)脈絡(luò)膜中的血管內(nèi)皮細(xì)胞的攻擊力?；蛘?， 可以通過(guò)從患者提取樹(shù)突細(xì)胞，并用本發(fā)明的肽加以刺激，來(lái)獲得細(xì)胞表 面上存在本發(fā)明的肽的抗原呈遞細(xì)胞，將其再次施用于患者，在患者中誘 導(dǎo)CTL,從而提高針對(duì)靶標(biāo)細(xì)胞的攻擊力。
當(dāng)本發(fā)明的肽作為疫苗使用時(shí)，可以與佐劑 一起施用以建立有效的細(xì) 胞免疫，也可以與其它抗癌劑等有效A分一起施用，此外還可以4故成顆粒 狀的劑型來(lái)施用。佐劑可以使用文獻(xiàn)(Johnson AG., Clin. Microbiol. Rev., 7:277-289, 1994)所述的佐劑等。此外，還可以考慮脂質(zhì)體制劑、結(jié)合在數(shù)pm 直徑的珠子上的顆粒狀制劑、結(jié)合在脂質(zhì)上的制劑等。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要施用本發(fā)明的疫苗的患者(受試者)的癥 狀，來(lái)適宜地設(shè)計(jì)本發(fā)明的疫苗的施用方法、施用量、施用期間。本發(fā)明 的疫苗可以全身施用，也可以局部施用。全身施用包括例如口服施用、皮 內(nèi)施用、皮下施用、,爭(zhēng)脈注射。此外，局部施用包括例如施用于脈絡(luò)膜附 近。
此外，對(duì)于施用量沒(méi)有限定，包括例如0.001mg~l 000mg 、優(yōu)選 0.001mg 1000mg、更優(yōu)選0.1mg 10mg。此外，疫苗優(yōu)選數(shù)日至凄t月施用1 次，但不限于此。
本發(fā)明的藥劑對(duì)由脈絡(luò)膜新生血管形成導(dǎo)致的疾病(新生血管性黃斑病 變)是有效的。作為本發(fā)明的藥劑的對(duì)象的疾病沒(méi)有特殊限定，只要是由脈 絡(luò)膜新生血管形成導(dǎo)致的疾病(新生血管性黃斑病變)即可，優(yōu)選包括例如滲 出型老化相關(guān)性黃斑變性、近視性黃斑變性、視網(wǎng)膜血管樣紋、中心性滲 出性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變、各種視網(wǎng)膜色素上皮病變、脈絡(luò)膜萎縮、無(wú)脈絡(luò)膜、脈絡(luò)膜骨瘤等疾病所伴隨的新生血管性黃斑病變。此外，特別優(yōu)選滲 出型老化相關(guān)性黃斑變性。
本發(fā)明的藥劑在實(shí)施治療后發(fā)生視力急劇P爭(zhēng)低或嚴(yán)重并發(fā)癥(這是傳統(tǒng) 治療方法中存在的問(wèn)題)的風(fēng)險(xiǎn)較小。因而，本發(fā)明的藥劑不僅可以適用于 重癥患者，也適用于屬于視力較好的早期病例的患者。視力較好的早期病 例視網(wǎng)膜的病損輕微，因而經(jīng)過(guò)治療的視力預(yù)后可望遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于傳統(tǒng)的對(duì)進(jìn) 展病例進(jìn)行的治療。
本發(fā)明基于下述發(fā)現(xiàn)，即以VEGFR-2衍生肽為抗原的疫苗能夠通過(guò)誘 導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞活性(CTL)從而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞。因而，本發(fā)明提 供含有VEGFR-2衍生肽作為有效成分的脈絡(luò)膜新生血管形成的抑制劑。關(guān) 于VEGFR-2衍生肽的具體說(shuō)明如上述。而且，在本發(fā)明中，對(duì)于抑制的程 度沒(méi)有特殊限定，即使程度甚為輕微，只要能抑制新生血管形成，就包含 在抑制的含義中。
本發(fā)明的抑制劑可以以疫苗的形式使用。即，本發(fā)明提供含有VEGFR-2 衍生肽作為有效成分的用于抑制脈絡(luò)膜新生血管形成的疫苗。關(guān)于疫苗的 施用部位、施用方法、施用量等與疫苗相關(guān)的具體說(shuō)明如上述。
而且，本說(shuō)明書(shū)中引用的全部現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)，均作為參照并入本說(shuō)明 書(shū)中。
實(shí)施例
以下，援引實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明不受這些實(shí)施 例的限定。 〔方法〕 動(dòng)物
從CLEA Japan(東京，日本)獲得體重20g~25g的C57bl/6小鼠。全部實(shí) 驗(yàn)均基于動(dòng)物管理和使用的相關(guān)委員會(huì)、以及視覺(jué)和眼科研究會(huì)議的關(guān)于 在眼和視覺(jué)研究中使用的聲明來(lái)實(shí)施。實(shí)驗(yàn)中使用的小鼠表達(dá)人 HLA-A*0201。
抗原肽
將小鼠分為3組，在第0天以及第IO天兩次腋窩皮下接種PBS、免疫 佐劑(不完全弗氏佐劑；IFA)、或人VEGF受體2衍生的抗原肽與IFA的混
21懸物。所述肽是由人VEGFR-2的從第773位起的9個(gè)氨基酸VIAMFFWLL (SEQ ID NO:2)構(gòu)成的肽，已經(jīng)在腫瘤模型中確認(rèn)了其具有抗新生血管形成 作用。然后，在第20天，以(p200nm、 200mW、 0.02sec的條件，在兩眼的 各3個(gè)位置用半導(dǎo)體激光誘導(dǎo)CNV。 實(shí)-險(xiǎn)性CNV
實(shí)驗(yàn)性CNY按別處記載并加以若干變更的方法來(lái)制備。簡(jiǎn)單描述如下， 通過(guò)腹腔內(nèi)注射(lml/kg)鹽酸氯胺S同(Ketalar(注冊(cè)商標(biāo))、三共，東京，日本) 和鹽酸地西拉n秦(Celactal(注冊(cè)商標(biāo))，Bayer，東京，日本)的混合物(l:l)來(lái)實(shí) 施全身麻醉。為了實(shí)施光凝固，用0.5。/。托吡卡胺(Mydrin(注冊(cè)商標(biāo))M,參 天制藥，大阪，日本)l滴來(lái)擴(kuò)散瞳孔。對(duì)于每只眼睛，在視神經(jīng)乳頭周?chē)?的主要視網(wǎng)膜血管之間，使用二極管激光光凝固裝置(DC-3000(注冊(cè)商標(biāo))、 NIDEK，大阪，日本)和裂隙燈發(fā)生系統(tǒng)(SL150, Topcon，東京，日本)， 各進(jìn)行6次照射徑200mm、持續(xù)時(shí)間0.02秒、強(qiáng)度200mW的激光光凝固。
借助熒光素血管造影法進(jìn)行的CNV等級(jí)評(píng)價(jià)
在CNV誘導(dǎo)完成3天后(第23天)和7天后(第27天)，使用合計(jì) 只動(dòng)物，考察了對(duì)來(lái)自CNV病變的漏出的效果(第3天的對(duì)照組、低用量組 和高用量組的動(dòng)物分別為n=41只、34只和18只，第7天的對(duì)照組、^f氐用 量組和高用量組的動(dòng)物分別為n=51只、15只和10只)。在第3天和第7天， 在觀察者對(duì)施用毫不知情的情況下，按他處的記載采用熒光素?zé)晒庋鄣自?影法對(duì)病變進(jìn)行檢查。
使用脈絡(luò)膜平鋪片(flat mount)進(jìn)行的CNV尺寸測(cè)定
將合計(jì)36只小鼠用于脈絡(luò)膜平鋪片分析(第3天和第7天的各組的小鼠 數(shù)分別為11=4只和8只)。自激光處置起3天后和7天后，按以前的記載使 用脈絡(luò)膜平鋪片測(cè)定了 CNV病變的尺寸。對(duì)小鼠實(shí)施麻醉，用含50mg/ml 的FITC偶聯(lián)葡聚糖(4.4kDa， 50mg/kg體重；Sigma)的磷酸緩沖鹽水(PBS)lml 進(jìn)行灌流，然后摘取眼球，再除去角膜和晶狀體，小心地將整個(gè)視網(wǎng)膜從 視杯剝離。從赤道部的一端起切出放射狀的切痕，以鞏膜朝下的方式將視 杯平鋪在載玻片上。用熒光顯微鏡(01ympus DPSO)對(duì)平鋪后的視杯進(jìn)行觀 察，用CCD照相機(jī)拍攝圖像。使用軟件系統(tǒng)(StudioIite)將數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)， 從計(jì)算機(jī)鼠標(biāo)指定CNV區(qū)的輪廓，采用NIH的公開(kāi)圖像處理程序進(jìn)4亍了測(cè) 定。在統(tǒng)計(jì)分析方面，將病變尺寸進(jìn)行平均以對(duì)每個(gè)個(gè)體賦予1個(gè)值。數(shù)據(jù)以平均士標(biāo)準(zhǔn)差的形式來(lái)表示。 統(tǒng)計(jì)分析
熒光素?zé)晒庋鄣自煊霸u(píng)分采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。CNV 病變的尺寸先用ANOVA然后用Dunnet的因果(post hoc)檢驗(yàn)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。 在采用的所有形式的統(tǒng)計(jì)分析中，均以P<0.05的值作為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
倫理層面的者慮
按照東京大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)實(shí)施規(guī)程來(lái)努力地減輕小鼠的痛苦，但由于使 用了弗氏佐劑以更好地賦予免疫，因此Scientists Center for Animal Welfare
的痛苦分類(lèi)為C級(jí)。 〔結(jié)果〕 對(duì)CNV漏出的效果
在第3天，熒光素漏出的程度在對(duì)照組、低用量施用組和高用量施用 組之間未見(jiàn)差異。在第7天，與第3天相比，來(lái)自非施用組的CNV病變的 熒光素漏出增加。高用量組中來(lái)自CNV病變的熒光素漏出比對(duì)照少(
圖1、 2)。雖不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但低用量組動(dòng)物的CNV病變所顯示出的漏出也 少于對(duì)照組。
對(duì)CNV病變尺寸的效果
第3天的CNV病變尺寸在對(duì)照組、低用量組和高用量組之間未見(jiàn)差異， CNV平均病變尺寸在非施用組中第7天大于第3天。與對(duì)照組中的CNV病 變的尺寸相比，低用量組和高用量組中的CNV病變的尺寸顯著降低(圖3、 4)。
本發(fā)明人等顯示，肽VIAMFFWLL(9)(SEQIDNO:2)抑制VEGF的上調(diào)， 并抑制CNV增殖。已知VIAMFFWLL (SEQ ID NO:2)可調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。考 慮到CNV的活性是由炎癥過(guò)程介導(dǎo)的，并考慮到僅在第7天能夠觀察到在 體內(nèi)VIAMFFWLL(SEQ ID NO:2)對(duì)CNV生長(zhǎng)的抑制效杲，而在第3天卻 不能觀察到，認(rèn)為VIAMFFWLL(SEQIDNO:2)可能并非是通過(guò)抑制新生血 管形成本身來(lái)抑制CNV，而是對(duì)白血球浸潤(rùn)等免疫反應(yīng)產(chǎn)生影響，由此來(lái) 調(diào)節(jié)新生血管形成過(guò)程。
工業(yè)實(shí)用性
本發(fā)明-提供用于由脈絡(luò)膜新生血管形成導(dǎo)致 疾病(新生血管性黃斑病變)的治療和/或預(yù)防的藥劑(疫苗)。
傳統(tǒng)上，起因于脈絡(luò)膜中新生血管的疾病(新生血管性黃斑病變)的治療 方法有激光治療、光線(xiàn)力學(xué)療法、手術(shù)療法、藥物治療等。但是，激光治 療會(huì)導(dǎo)致中心視力降低，光線(xiàn)力學(xué)療法有對(duì)視力良好的病例實(shí)施治療后視 力急劇降低的案例，手術(shù)療法也存在外科侵入所帶來(lái)的術(shù)后合并癥的風(fēng)險(xiǎn)， 而藥物療法因?yàn)槭窍蜓蹆?nèi)注射，因而存在發(fā)生眼內(nèi)炎、視網(wǎng)膜剝離等嚴(yán)重 度合并癥的風(fēng)險(xiǎn)。在這樣的傳統(tǒng)治療中，因治療伴隨的副作用和合并癥而 導(dǎo)致視力降低的風(fēng)險(xiǎn)較高。因而難以對(duì)視力較好的早期病例進(jìn)行治療。
而另一方面，使用本發(fā)明的藥劑(疫苗)，至少不會(huì)出現(xiàn)眼局部的合并癥， 上述風(fēng)險(xiǎn)均應(yīng)不存在。因而，可以對(duì)視力較好的早期病例進(jìn)4亍治療。而且， 在視力較好的早期病例中，視網(wǎng)膜的病損輕微，因而，治療后的視力預(yù)后 可望遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于比傳統(tǒng)的相對(duì)于進(jìn)展病例進(jìn)行的治療。
此外，已知在本發(fā)明的疾病中，對(duì)側(cè)眼同樣發(fā)生新生血管的頻率很高。 但是，對(duì)側(cè)眼中新生血管的預(yù)防方法尚未建立。采用本發(fā)明的疫苗療法， 可望對(duì)于對(duì)側(cè)眼的預(yù)防性治療也具有效果。
權(quán)利要求
1.一種用于治療和/或預(yù)防由脈絡(luò)膜新生血管形成導(dǎo)致的疾病(新生血管性黃斑病變)的藥劑，該藥劑含有下述(a)～(c)中任一項(xiàng)所述的肽中的至少1種作為有效成分(a)包含SEQ ID NO1～12中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的肽；(b)在SEQ ID NO1～6中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中取代、缺失、添加和/或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的肽，其中N末端起第2位的氨基酸為亮氨酸或甲硫氨酸，和/或C末端的氨基酸為纈氨酸或亮氨酸，并且該肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性；(c)在SEQ ID NO7～12中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中取代、缺失、添加和/或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的肽，其中N末端起第2位的氨基酸為苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸，和/或C末端的氨基酸為苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸，并且該肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性。
2. 權(quán)利要求1所述的藥劑，其中，由脈絡(luò)膜新生血管形成導(dǎo)致的疾病(新 生血管性黃斑病變)選自滲出型老化相關(guān)性黃斑變性、近^f見(jiàn)性黃斑變性、視 網(wǎng)膜血管樣紋、中心性滲出性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變、各種視網(wǎng)膜色素上皮病 變、脈絡(luò)膜萎縮、無(wú)脈絡(luò)膜、和脈絡(luò)膜骨瘤。
3. —種用于治療和/或預(yù)防由脈絡(luò)膜新生血管形成導(dǎo)致的疾病(新生血 管性黃斑病變)的疫苗，其含有下述(a)或(b)的肽中的至少1種作為有效成分(a) 包含SEQ ID NO: 1 ~6中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的肽；(b) 在SEQIDNO:1 6中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中取代、缺失、添加 和/或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的肽，其中N末端起第2位的氨基酸為亮 氨酸或甲硫氨酸，和/或C末端的氨基酸為纈氨酸或亮氨酸，并且該肽具有 誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性。
4. 一種用于治療和/或預(yù)防由脈絡(luò)膜新生血管形成導(dǎo)致的疾病(新生血 管性黃斑病變)的疫苗，其含有下述(a)或(b)的肽中的至少l種作為有效成分(a) 包含SEQ ID NO:7 12中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的肽；(b) 在SEQIDNO:7 12中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中取代、缺失、添加 和/或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的肽，其中N末端起第2位的氨基酸為苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸，和/或C末端的氨基酸為苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或曱硫氨酸，并且該肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì) 胞的活性。
5. 權(quán)利要求3所述的疫苗，其施用于HLA抗原為HLA-A02的受試者。
6. 權(quán)利要求4所述的疫苗，其施用于HLA抗原為HLA-A24的受試者。
7. 權(quán)利要求5或6的疫苗，其中，由脈絡(luò)膜新生血管形成導(dǎo)致的疾病 (新生血管性黃斑病變)選自滲出型老化相關(guān)性黃斑變性、近視性黃斑變性、 視網(wǎng)膜血管樣紋、中心性滲出性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變、各種視網(wǎng)膜色素上皮 病變、脈絡(luò)膜萎縮、無(wú)脈絡(luò)膜、和脈絡(luò)膜骨瘤。
8. —種用于抑制脈絡(luò)膜新生血管形成的藥劑，其含有下述(a) (c)中任 一項(xiàng)的肽中的至少l種作為有效成分(a) 包含SEQIDNO:卜12中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的肽；(b) 在SEQ ID NO:1 6中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中取代、缺失、添加 和/或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的肽，其中N末端起第2位的氨基酸為亮 氨酸或曱硫氨酸，和/或C末端的氨基酸為纈氨酸或亮氨酸，并且該肽具有 誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性；(c) 在SEQIDNO:7 12中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中取代、缺失、添加 和/或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的肽，其中N末端起第2位的氨基酸為苯 丙氨酸、酪氨酸、曱硫氨酸或色氨酸，和/或C末端的氨基酸為苯丙氨酸、 亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或曱硫氨酸，并且該肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì) 胞的活性。
9. 用于抑制脈絡(luò)膜新生血管形成的疫苗，其含有下述(a)或(b)的肽中的 至少1種作為有效成分(a) 包含SEQ ID NO:l~6中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的肽；(b) 在SEQ ID NO:l~6中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中取代、缺失、添加 和/或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的肽，其中N末端起第2位的氨基酸為亮 氨酸或曱硫氨酸，和/或C末端的氨基酸為纈氨酸或亮氨酸，并且該肽具有 誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性。
10. 用于抑制脈絡(luò)膜新生血管形成的疫苗，其含有下述(a)或(b)的肽中 的至少1種作為有效成分(a)包含SEQ IDNO:7 12中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的肽；(b)在SEQIDNO:7 12中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中取代、缺失、添加 和/或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸而成的肽，其中N末端起第2位的氨基酸為苯 丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸，和/或C末端的氨基酸為苯丙氨酸、 亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或曱硫氨酸，并且該肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì) 胞的活性。
11.權(quán)利要求9所述的疫苗，其施用于HLA抗原為HLA-A02的受試者。
12.權(quán)利要求10所述的疫苗，其施用于HLA抗原為HLA-A24的受試者。
全文摘要
本發(fā)明人嘗試將已知與新生血管形成相關(guān)的蛋白之一VEGFR-2的衍生肽施用于表達(dá)人HLA-A*0201的模型小鼠(A2/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠)，研究了該肽是否具有疫苗效果。結(jié)果，本發(fā)明人成功地發(fā)現(xiàn)以該肽為抗原的疫苗可有效地抑制脈絡(luò)膜新生血管形成，從而完成了本發(fā)明。由此，本發(fā)明提供含有VEGFR-2來(lái)源的肽作為有效成分的用于治療和/或預(yù)防脈絡(luò)膜新生血管形成所導(dǎo)致的疾病的疫苗。
文檔編號(hào)A61K39/00GK101678065SQ200880012298
公開(kāi)日2010年3月24日 申請(qǐng)日期2008年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月16日
發(fā)明者玉置泰裕, 田原秀晃 申請(qǐng)人:腫瘤療法科學(xué)股份有限公司