專利名稱：包含nkt活化劑、cd40激動(dòng)劑和任選的抗原的佐劑組合,及其誘導(dǎo)細(xì)胞免疫協(xié)同增強(qiáng)的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上來說涉及協(xié)同佐劑組合，其上調(diào)免疫細(xì)胞表達(dá)CD70和促進(jìn)抗原特 異性細(xì)胞免疫。更特別地，本發(fā)明涉及具體的協(xié)同組合，包括自然殺傷T細(xì)胞(NKT)活化劑， 例如a -半乳糖苷神經(jīng)酰胺(a -Gal-Cer)或iGb3，和CD40激動(dòng)劑，例如拮抗性抗CD40抗 體或CD40L多肽或綴合物，和進(jìn)一步任選地，包括靶抗原。更進(jìn)一步本發(fā)明還提供了新的免 疫療法，包括給予這種協(xié)同佐劑組合或蛋白綴合物以提高抗原特異性細(xì)胞免疫，即CD8+免 疫。具體地說，也教導(dǎo)了包含這些佐劑組合和/或多肽綴合物的組合物作為免疫佐劑用于 治療各種慢性疾病，包括癌癥、傳染病、自身免疫病、過敏性或炎癥性疾病的用途。
背景技術(shù)：
身體抗微生物的防御系統(tǒng)以及身體抵抗其他慢性疾病例如影響細(xì)胞增殖的疾病 的防御物是通過先天免疫系統(tǒng)的早期反應(yīng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的遲發(fā)反應(yīng)介導(dǎo)的。先天免疫 包括識(shí)別例如是微生物病原體特征性的結(jié)構(gòu)的機(jī)制和在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不存在的機(jī)制。這 種結(jié)構(gòu)的實(shí)例包括細(xì)菌脂多糖(LPS)、病毒雙鏈DNA、和非甲基化CpG DNA核苷酸。先天免 疫反應(yīng)系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞包括中性白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)。除先天免疫 之外，脊椎動(dòng)物，包括哺乳動(dòng)物，具有進(jìn)化的免疫防御系統(tǒng)，其通過接觸傳染物而被剌激，和 每次連續(xù)接觸特定抗原，幅度和有效性增加。由于它適應(yīng)特異性感染或抗原損害的能力，這 個(gè)免疫防御機(jī)制已被描述為適應(yīng)性免疫。有兩種類型的適應(yīng)性免疫反應(yīng)，稱為體液免疫，包 括B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的抗體，和細(xì)胞免疫，由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)。 已經(jīng)描述過兩種類型的主要T淋巴細(xì)胞，CD8+細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(CTLs)和CD4輔 助細(xì)胞(Th細(xì)胞)。CD8+T細(xì)胞是效應(yīng)細(xì)胞，通過T細(xì)胞受體(TCR)識(shí)別由I類MHC分子呈 遞的例如感染病毒或細(xì)菌的細(xì)胞上的外來抗原。識(shí)別外來抗原時(shí)，CD8+細(xì)胞經(jīng)歷活化、成熟 和增殖過程。這個(gè)分化過程產(chǎn)生CTL克隆，其具有破壞顯示外來抗原的靶細(xì)胞的能力。另 一方面T輔助細(xì)胞參與在體液和細(xì)胞介導(dǎo)的兩種效應(yīng)免疫反應(yīng)形式中。至于體液或抗體免 疫反應(yīng)，B淋巴細(xì)胞通過與Th細(xì)胞相互作用而產(chǎn)生抗體。具體地說，細(xì)胞外抗原，例如循環(huán) 微生物被特異性抗原呈遞細(xì)胞(APCs)接受、加工、并與II類主要組織相容性復(fù)合體(MHC) 分子結(jié)合而呈遞給CD4+Th細(xì)胞。隨后這些Th細(xì)胞激活B淋巴細(xì)胞，引起抗體產(chǎn)生。相反， 細(xì)胞介導(dǎo)的或細(xì)胞的免疫反應(yīng)，發(fā)揮作用中和定居在細(xì)胞內(nèi)位置的微生物，例如靶細(xì)胞成 功感染后。外來抗原，例如微生物抗原，在感染細(xì)胞內(nèi)合成并與I類MHC分子結(jié)合重置于這 種細(xì)胞表面上。這種表位的呈遞引起上述CD8+CTLs受剌激，隨后被CD4+Th細(xì)胞剌激也是 這個(gè)過程。Th細(xì)胞由至少兩個(gè)不同的亞群，稱為為Thl和Th2細(xì)胞組成。Thl和Th2亞型 代表Th細(xì)胞兩極分化的群，它們?cè)诮佑|抗原后從共同的前體分化出。 每個(gè)T輔助細(xì)胞亞型分泌細(xì)胞因子，細(xì)胞因子促進(jìn)彼此相反的不同免疫效果并交 叉調(diào)節(jié)彼此的擴(kuò)展和作用。Thl細(xì)胞分泌大量細(xì)胞因子，例如干擾素(IFN) Y、腫瘤壞死因 子-a (TNF-a)、白介素-2(IL-2)和IL-12,和少量IL_4。 Thl結(jié)合細(xì)胞因子促進(jìn)CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)活性和最常伴發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)的抗細(xì)胞內(nèi)病原體的免疫反應(yīng)。相反，Th2 細(xì)胞分泌大量細(xì)胞因子，例如IL-4、 IL-13和IL-10，而分泌少量IFN-y ，并促進(jìn)抗體反應(yīng)。 Th2反應(yīng)與體液反應(yīng)特別相關(guān)，例如保護(hù)不受炭疽病的損害和消除蠕蟲感染。
所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)是Thl還是Th2驅(qū)動(dòng)的很大程度上取決于所涉及的病原體和細(xì) 胞環(huán)境中的因素，例如細(xì)胞因子。不能激活T輔助反應(yīng)，或正確的T輔助亞類，不僅可導(dǎo)致不 能產(chǎn)生足夠的反應(yīng)來對(duì)抗特定病原體，而且對(duì)于抗再感染產(chǎn)生的免疫力也低。很多傳染物 是細(xì)胞內(nèi)病原體，其中預(yù)期細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，以Thl免疫舉例說明，將在保護(hù)和/或治療中 起重要作用。此外，對(duì)于很多這些感染，已經(jīng)表明誘導(dǎo)不適當(dāng)?shù)腡h2反應(yīng)消極地影響疾病后 果。實(shí)例包括結(jié)核分枝桿菌、曼氏血吸蟲(S.mansoni)，以及起反作用的Th2樣占優(yōu)勢的免 疫反應(yīng)。瘤型麻風(fēng)(L印romatous l印rosy)看來特征是流行但不適當(dāng)?shù)腡h2樣反應(yīng)。HIV 感染代表另一個(gè)實(shí)例。在那里，已經(jīng)提示Thl樣細(xì)胞與其他Th細(xì)胞群的比值降低可能在疾 病癥狀進(jìn)展中起著決定性作用。 作為抗傳染物的保護(hù)措施，已經(jīng)開展了保護(hù)不受一些微生物損害的接種疫苗方
案?？箓魅拘圆≡w的接種疫苗方案常常受到疫苗免疫原性低、反應(yīng)類型不適當(dāng)(抗體對(duì)
細(xì)胞免疫)、缺乏引發(fā)長期免疫記憶能力和/或不能產(chǎn)生抗不同血清型給定病原體的免疫
的阻礙。目前接種疫苗策略的目標(biāo)是引發(fā)對(duì)給定血清型和很多普通病原體特異性的抗體，
例如病毒血清型或病原體。應(yīng)當(dāng)致力于復(fù)發(fā)基礎(chǔ)以監(jiān)測全世界流行哪個(gè)血清型。這樣的一
個(gè)實(shí)例是每年監(jiān)測出現(xiàn)的預(yù)期是主要傳染性菌株的流行性感冒A血清型。 為支持接種疫苗方案，已經(jīng)進(jìn)一步開發(fā)了支持抗特異性傳染病的免疫反應(yīng)產(chǎn)生的
佐劑。例如，鋁鹽已被用作相對(duì)安全和有效的疫苗佐劑以增強(qiáng)對(duì)某些病原體的抗體反應(yīng)。這
種佐劑的一個(gè)缺點(diǎn)是它們剌激細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)的效率相對(duì)低，和產(chǎn)生大部分偏向于Th2
的免疫反應(yīng)。 現(xiàn)在普遍認(rèn)可保護(hù)性免疫的產(chǎn)生不僅取決于接觸抗原，而且取決于抗原遇到的環(huán) 境。存在很多實(shí)例，其中新抗原引入非炎性環(huán)境中的宿主，產(chǎn)生免疫耐受性而不是長期免 疫，而在炎性物質(zhì)(佐劑)存在下接觸抗原卻誘導(dǎo)免疫。(Mondino et al. ， Proc. Natl. Acad. Sci. ，USA 93 :2245(1996) ;Pulendran et al. ，J.Exp.Med. 188 :2075(1998) ;Jenkins et al. ， Immunity 1 :443(1994) ;andKea潔y et al. ， Immunity 1 :327(1994))。
已知調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫的天然存在分子是CD40。 CD40是TNF受體亞家族的成員， 是細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)系列必需的，并是T細(xì)胞依賴性體液免疫的發(fā)展所需的(Aruffo et al. ， Cell 72 :291 (1993) ;Farrington et al. ， Proc Natl Acad Sci. ， USA 91 : 1099(1994) ;Renshaw et al. ， J Exp Med 180:1889(1994))。在其自然作用中，CD4+T細(xì) 胞上表達(dá)的CD40配體與DCs或B細(xì)胞上表達(dá)的CD40相互作用，促使APC激活增加，和伴 隨T細(xì)胞進(jìn)一步活化(Liu et al Seminl匪nol 9:235(1994) ;Bishop et al. ， Cytokine Growth Factor Revl4 :297(2003))。對(duì)于DCs, CD40結(jié)合體典型地通過TLRs引起類似于 剌激的反應(yīng)，例如活化標(biāo)記上調(diào)和產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子(Quezada et al. A皿u Rev Immunol 22:307(2004) ;0' Sullivan B and Thomas R CritRev Immunol 22:83(2003))。研究證 明了它在CD8反應(yīng)中的重要性，該研究表明APCs通過CD40受到剌激援救了缺乏CD4細(xì)胞 時(shí)CD4依賴性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)(Lefrancois et al. ， J Immunol. 164 :725(2000) ;Bennett et al.，Nature 393:478(1998) ;Ridge et al. ，Nature393 :474(1998) ;Schoenberger etal. ，Nature 393:474(1998)。這些發(fā)現(xiàn)引發(fā)了很多推測，在一些疾病環(huán)境下，單獨(dú)CD40激 動(dòng)劑可以潛在援救失敗的CD8+T細(xì)胞反應(yīng)。 然而其他研究已證明單獨(dú)CD40剌激不足以促進(jìn)長期免疫。在一些模型系統(tǒng)中， 單獨(dú)抗CD40治療不足以促進(jìn)長期免疫。在一些模型系統(tǒng)中，單獨(dú)抗CD40治療可以引起無 效炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生、抗原特異性T細(xì)胞缺失(Mauri et al. Nat Med 6:673(2001) ;Kedl etal.Proc Natl Acad Sci. ，USA 98 :10811(2001))和B細(xì)胞反應(yīng)終止(Erickson et al.， J Clin Invest 109:613(2002))。同樣，可溶三聚CD40配體已經(jīng)在臨床上用作CD40途徑 的激動(dòng)劑，和如此少的報(bào)道與單獨(dú)CD40剌激不能重新建立長期CD8+T細(xì)胞免疫的所有必要 信號(hào)的結(jié)論相一致(Vonderheide et al. ， J Clin Oncol 19:3280(2001))。
不同團(tuán)體已經(jīng)報(bào)道了各種激動(dòng)性抗體。例如，已報(bào)道一個(gè)mAb CD40.4(5c3) (PharMingen， San Diego California)使CD40和CD40L之間活化增加大約30-40 % 。 (Schlossman et al. ， LeukocyteTyping， 1995， 1 :547-556)。同樣，美國專利號(hào)6， 843， 989 中的Seattle遺傳學(xué)宣稱提供了使用激動(dòng)性抗人CD40抗體治療人類癌癥的方法。聲稱它 們的抗體傳遞剌激信號(hào)，該信號(hào)使CD40和CD40L的交互作用增強(qiáng)至少45%，和增強(qiáng)CD40L 介導(dǎo)的剌激，具有體內(nèi)致瘤活性。它們從S2C6獲得了這個(gè)抗體——激動(dòng)性抗人CD40抗體， 以前表明它給B淋巴細(xì)胞傳遞強(qiáng)烈的促生長信號(hào)(Paulie et al. ， 1989， J. Immunol. 142 : 590-595)。 由于CD40在先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中的活性，已經(jīng)探究了各種CD40激動(dòng)劑用作 疫苗佐劑和期望在細(xì)胞免疫增強(qiáng)的治療中。最近，據(jù)證實(shí)抗原結(jié)合一些TLR激動(dòng)劑和抗 CD40治療免疫(TLR/CD40激動(dòng)劑組合免疫)誘導(dǎo)強(qiáng)力CD8+T細(xì)胞擴(kuò)充，引出比兩種激動(dòng)劑 任何一種單獨(dú)免疫高10-20倍的反應(yīng)(Ahonen et al.，J Exp Med 199:775(2004))。這首 次證明了在沒有感染病毒或微生物物質(zhì)時(shí)，可以產(chǎn)生強(qiáng)力CD8+T細(xì)胞反應(yīng)。TLR/CD40激動(dòng) 劑組合免疫引出抗原特異性CD8+T細(xì)胞證明細(xì)胞溶解功能、y干擾素產(chǎn)生和對(duì)抗原挑戰(zhàn)的 繼發(fā)反應(yīng)增強(qiáng)。用TLR1/6、2/6、3、4、5、7和9激動(dòng)劑已經(jīng)表明抗CD40在誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞擴(kuò) 充中的協(xié)同活性。這提示TLR/CD40激動(dòng)劑組合免疫可以重新建立引發(fā)深入獲得性細(xì)胞免 疫所需的所有信號(hào)。 眾所周知NKT細(xì)胞是免疫調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞，其表達(dá)受非多態(tài)性CDld抗原呈遞分子 限制的T細(xì)胞受體。NKT細(xì)胞識(shí)別CDld呈遞糖脂——a -半乳糖苷神經(jīng)酰胺(a -Gal-Cer)。 一識(shí)別a -631-[61~，服1細(xì)胞就變活化并產(chǎn)生細(xì)胞因子，包括1卜4、1卜10、1卜13和1 ^ Y ， 和照這樣，它們可以通過促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌而上調(diào)或下調(diào)免疫反應(yīng)。缺乏NKT細(xì) 胞的小鼠對(duì)細(xì)菌感染更敏感和對(duì)一些腫瘤具有抗性，證明NKT細(xì)胞在宿主防御中的重要作 用。還表明了 a-Gal-Cer給予小鼠，NKT細(xì)胞活化，作為單一治療，可以增強(qiáng)對(duì)腫瘤的免 疫，獲得了有限的成功(Matsuyoshi， H. ， S. Hirata， Y. Yoshitake， Y. Motomura， D. Fuk麗， A. Kurisaki， T. Nakatsura， Y. Nishimura， and S. Senju. 2005. Therapeutic effect o falpha-galactosylcer咖ide-loaded dendriti ccells geneticallyengineered to express S1X/C(X21 along with tumor antigenagainst peritoneally disseminated tumor cells. Cancer Sci. 96 :889-896 ;Crowe， N. Y. ， J. M. Coquet, S. P. Berzins， K. Kyparissoudis， R. Keating, D. G. Pellicci， Y. Hayakawa， D. I. Godfrey, and M. J. Smyth. 2005. Differential antitumor immunitymediated by NKT cell subsetsin vivo. J. Exp. Med. 202 :1279-1288 ;Smyth， M. J. ， N. Y. Crowe， Y. Hayakawa， K. Takeda， H. Yagita， and D. I. Godfrey. 2002. NKT cells-conductors of tumor immunity Curr. Opin. Immunol. 14 :165-171)。 為了增加例如接種疫苗方案中或微生物感染過程中適應(yīng)性免疫反應(yīng)的有效性，因 此開發(fā)新的更有效的疫苗佐劑很重要。本發(fā)明滿足了這個(gè)需要并且也提供了其他優(yōu)點(diǎn)。以 前，本發(fā)明人報(bào)道了新的協(xié)同佐劑，包含toll樣受體(TLR)激動(dòng)劑和CD40激動(dòng)劑組合。 這些激動(dòng)劑組合引發(fā)細(xì)胞免疫的協(xié)同效應(yīng)。2004年7月22日公開的美國公開專利申請(qǐng) US20040141950中公開了這些協(xié)同佐劑及其預(yù)防和治療用途，該專利申請(qǐng)的全部內(nèi)容引入 這里作為參考。本發(fā)明涉及另一個(gè)協(xié)同佐劑組合的發(fā)現(xiàn)及其作為治療或預(yù)防性免疫增強(qiáng)組 合的用途。
發(fā)明概述 本發(fā)明涉及協(xié)同免疫佐劑，包括以下的組合(i)至少一種NKT活化劑，例如 a _半乳糖苷神經(jīng)酰胺(a -GalCer)或iGb3 ;和(ii)至少一種CD40激動(dòng)劑例如CD40激動(dòng) 性抗體或其片段，或CD40L多肽例如單聚或多聚(三聚)CD40L蛋白、CD40L蛋白片段或含 有CD40L的綴合物和(iii)任選地，抗原，期望引出針對(duì)該抗原的細(xì)胞免疫反應(yīng)。本發(fā)明進(jìn) 一步涉及這種組合作為免疫佐劑和治療期望增強(qiáng)T細(xì)胞免疫的病情的用途。
如下面詳細(xì)描述，可以將這些免疫組合給予需要這種治療的宿主，通過(i)誘導(dǎo) 比僅僅給予CD40激動(dòng)劑或NKT活化劑更高頻數(shù)的抗原特異性CD8+T細(xì)胞；(ii)誘導(dǎo)比僅 僅給予CD40激動(dòng)劑或NKT活化劑更大量的抗原特異性CD8+T細(xì)胞；和(iii)相對(duì)于僅僅給 予CD40激動(dòng)劑或NKT活化劑，腫瘤免疫力增強(qiáng)。 這些任選地可以進(jìn)一步包含抗原的免疫佐劑組合可以用于治療任何疾病或病情， 其中上面確定的細(xì)胞免疫反應(yīng)增強(qiáng)是治療期望的，尤其是傳染病，增殖性紊亂例如癌癥、過 敏、自身免疫紊亂、炎性紊亂，和其他慢性疾病，其中細(xì)胞免疫增強(qiáng)是期望的治療結(jié)果。本發(fā) 明的優(yōu)選應(yīng)用特別包括治療慢性疾病，例如癌癥。
附圖簡述

圖1含實(shí)驗(yàn)，其中顯示了抗CD40和a -GalCer組合給藥的效應(yīng)和這種給藥在體內(nèi) 協(xié)同增強(qiáng)抗原特異性T細(xì)胞的擴(kuò)充。 圖2含實(shí)驗(yàn)，其中量化了作為用抗CD40和a-GalCer組合免疫的結(jié)果的免疫反 應(yīng)。 圖3含實(shí)驗(yàn)，其中在用黑素瘤細(xì)胞免疫的小鼠中表明CD40/TLlf接種疫苗治療性 干擾全身黑素瘤。 圖4含實(shí)驗(yàn)，其中表明抗CD40和a -GalCer給藥在體內(nèi)誘導(dǎo)在DCs上表達(dá)CD70。 (在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，給小鼠注射下列組合2ug a -GalCer、50ug polyIC和/或50ug抗CD40腹 膜內(nèi)。在注射后18-20小時(shí)，取出脾)。 圖5含實(shí)驗(yàn)，其中表明a -GalCer/CD40免疫引發(fā)強(qiáng)力CD8+T細(xì)胞反應(yīng)，該反應(yīng)是 STAT4、 IFNy和IFNab非依賴性的，但是STAT1和T-bet非依賴性的。發(fā)明詳述 本發(fā)明涉及協(xié)同免疫佐劑組合的用途，該組合包含協(xié)同有效量的(i)至少一種自 然殺傷T細(xì)胞(NKT)活性劑例如a -半乳糖苷神經(jīng)酰胺(a -GalCer)或另一種NKT細(xì)胞活 性劑；(ii)至少一種CD40激動(dòng)劑和(ii)任選地，至少一種抗原。這些佐劑可以用于(i)擴(kuò) 充抗原特異性效應(yīng)CD8 T細(xì)胞和/或(ii)增強(qiáng)免疫反應(yīng)?；谝陨线@些協(xié)同佐劑可以預(yù) 防性和治療性用于治療具有下述病情的受試者，其中期望增強(qiáng)細(xì)胞免疫，例如癌癥及其他 增殖性紊亂、病毒及其他感染、自身免疫病、炎性疾病和過敏性紊亂。特別是，本主題協(xié)同佐 劑可以用作疫苗佐劑。因此這種疫苗佐劑的基本成分將是NKT細(xì)胞活化劑、CD40激動(dòng)劑和 如果批準(zhǔn)，添加腫瘤或傳染病抗原。這種發(fā)明將對(duì)任何情況有用，該情況下想要增強(qiáng)免疫反 應(yīng)，像癌癥或傳染病，或改變免疫反應(yīng)，像在自身免疫病中。 更具體地說，本發(fā)明提供了新的協(xié)同激動(dòng)性組合，包含NKT活化劑，例如a -半乳
糖苷神經(jīng)酰胺(a -Gal-Cer)或iGb3和CD40激動(dòng)劑(例如CD40L蛋白或片段或衍生物或
其多聚體，或結(jié)合CD40，優(yōu)選人類CD40的激動(dòng)性抗體或抗體片段)和任選的抗原。當(dāng)這些
佐劑組合給予宿主，優(yōu)選人類時(shí)，可以用于產(chǎn)生增強(qiáng)的抗原特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。 在優(yōu)選實(shí)施方案中，NKT活化劑是a-半乳糖苷神經(jīng)酰胺(a-Gal-Cer)、
isoglobotrihexosylceramide(iGb3)或可以剌激NKT的任何其他分子，例如CDld抗原呈遞
分子呈遞的其他糖脂。 本發(fā)明還提供了使用所述協(xié)同佐劑組合和含有其的載體給予宿主的方法，其中在 宿主中期望引發(fā)抗原特異性免疫反應(yīng)，例如有慢性疾病的人，例如癌癥或傳染性或過敏性 紊亂。 更進(jìn)一步，本發(fā)明還提供了包含所述新的協(xié)同NKT活化劑/CD40激動(dòng)劑組合的組 合物，其適于給予宿主以便引發(fā)增強(qiáng)的抗原特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。 特別地，本發(fā)明提供了新的免疫療法，包括將所述新的協(xié)同佐劑組合給予需要這 種治療的宿主以便引發(fā)增強(qiáng)的抗原特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，這些組合物 和綴合物將給予受試者，該受試者患有癌癥，感染，尤其是慢性傳染病，例如涉及病毒、細(xì)菌 或寄生蟲；或自身免疫病、炎性或過敏性病情，或存在發(fā)展為這些疾病的風(fēng)險(xiǎn)。特別地，在優(yōu) 選實(shí)施方案中，本發(fā)明可以用于引發(fā)抗黑素瘤的抗原特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。
因此，本發(fā)明開發(fā)了強(qiáng)效疫苗，對(duì)抗癌癥和其他增殖性疾病，例如自身免疫疾病， 過敏性紊亂，和炎性疾病以及慢性傳染病，涉及病毒、細(xì)菌、真菌或寄生蟲，其中有效的治療 需要NKT活化劑/CD40激動(dòng)劑組合免疫能夠產(chǎn)生的細(xì)胞免疫的數(shù)量和質(zhì)量。
發(fā)明應(yīng)用 本發(fā)明提供了新的佐劑組合，包含至少一種NKT活化劑、至少一種CD40激動(dòng)劑和 任選的抗原。本發(fā)明包括任何抗原與本主題NKT活化劑和CD40激動(dòng)劑結(jié)合使用，治療上期 望針對(duì)該抗原的細(xì)胞免疫反應(yīng)增強(qiáng)。在一些實(shí)施方案中，該抗原可以與NKT活化劑分開給 予，或宿主可以是自然接觸該抗原。在一些實(shí)施方案中，全部三個(gè)部分，即CD40激動(dòng)劑例如 抗CD40抗體，NKT活化劑和抗原，可以同時(shí)給予。另外，在一些實(shí)施方案中，全部三個(gè)部分， 即CD40激動(dòng)劑例如抗CD40抗體，NKT活化劑和抗原，可以以分開的分離實(shí)體共同給予。為 了達(dá)到期望的細(xì)胞免疫協(xié)同增強(qiáng)，優(yōu)選所有這些部分基本上同時(shí)給予。這些部分可以以任何順序給予。 示例性抗原包括但不限于細(xì)菌、病毒、寄生蟲、過敏原、自身抗原和腫瘤相關(guān)抗原。 特別地，該抗原可以包括蛋白抗原、肽、完整滅活生物體等等。 可以用在本發(fā)明中的抗原的具體實(shí)例包括來自以下的抗原甲型、乙型、丙型或 丁型肝炎、流感病毒、李斯特氏菌屬(Listeria)、肉毒桿菌(Clostridium botuli皿m)、肺 結(jié)核、兔熱病、重型天花(天花)、病毒性出血熱、鼠疫耶爾森氏菌(溫疫(plague))、HIV、 皰疹、乳頭狀瘤病毒，和與傳染物相關(guān)的其他抗原。其他抗原包括與腫瘤細(xì)胞相關(guān)的抗 原，與自身免疫病情、過敏和哮喘相關(guān)的抗原。這種抗原連同本主題激動(dòng)劑組合鞭毛蛋白 (Flagellin)和抗CD40抗體一起給予可以用在治療或預(yù)防性疫苗中提供抗這種病情的免 疫。 在一些實(shí)施方案中，該方法和組合物可用于治療存在感染風(fēng)險(xiǎn)或患有包括來自傳
染物的抗原引起的感染的個(gè)體。感染是指可歸因于宿主中存在外來生物體或在宿主內(nèi)復(fù)制
的物質(zhì)的疾病或病情。存在感染風(fēng)險(xiǎn)的受試者是傾向于發(fā)展為感染的受試者。這種個(gè)體可
以包括例如已知或懷疑接觸傳染性生物體或物質(zhì)的受試者。存在感染風(fēng)險(xiǎn)的受試者還可以
包括與對(duì)傳染物或生物體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力受損相關(guān)的病情的受試者，例如先天性或獲
得性免疫缺陷的受試者、經(jīng)歷放療或化療的受試者、燒傷損害的受試者、外傷性損傷的受試
者、進(jìn)行手術(shù)的受試者或其他侵入醫(yī)學(xué)或牙科步驟，或類似的免疫能力受損的個(gè)體。 可以用本發(fā)明的疫苗組合物治療或預(yù)防的感染包括細(xì)菌、病毒、真菌和寄生蟲。其
他不太普遍類型的感染還包括立克次體、支原體和引起羊癢病的物質(zhì)、牛海綿狀腦病(BSE)
和阮病毒病(例如kuru和早老癡呆癥(Creutzfeldt-Jacob disease))。感染人類的細(xì)菌、
病毒、真菌和寄生蟲的實(shí)例是眾所周知的。感染可以是急性的、亞急性的、慢性的或潛伏性
的，和也可以是局部的或全身性的。此外，在宿主中傳染性生物體的物質(zhì)的生活史的至少一
個(gè)時(shí)期期間，感染可以主要是細(xì)胞內(nèi)的或細(xì)胞外的。 可以使用本主題疫苗和方法進(jìn)行對(duì)抗的細(xì)菌感染包括革蘭氏陰性和革蘭氏陽性 細(xì)菌。革蘭氏陽性細(xì)菌的實(shí)例包括但不限于巴斯德氏菌屬種、葡萄球菌屬種和鏈球菌屬種。 革蘭氏陰性細(xì)菌的實(shí)例包括但不限于大腸桿菌、假單胞細(xì)菌屬種和沙門氏菌屬種。感染菌 的具體實(shí)例包括但不限于幽門螺旋桿菌、布氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi)、嗜肺軍團(tuán) 菌(Legionella pneumophilia)、分枝桿菌禾中(例如結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis)、鳥 分枝桿菌(M. avium)、胞內(nèi)分枝桿菌(M. intracellilare)、堪薩斯分枝桿菌(M. kansaii)、 登氏分枝桿菌(M. gordonae))、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、淋球菌 (Neisseria gonorrhoeae)、腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、單核細(xì)胞增 生李斯特氏菌(Listeriamonocytogeners)、化月農(nóng)性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、 (A組鏈球菌屬)、無乳鏈球菌(無乳鏈球菌)(B組鏈球菌)、鏈球菌屬(Str印tococcus) (viridans組)、類鏈球菌(Str印tococcusfaecalis)、牛鏈球菌(streptococcus bovis)、 鏈球菌屬(Streptococcus) (aenorobic禾中)、月市炎鏈球菌(Str印tococcuspneumoniae)、 至文病性彎曲桿菌(pathogenic Campylobacter)禾中、腸球菌屬(Enterococcus)、流 感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、炭疽桿菌(Bacillus anthracis)、白喉?xiàng)U 菌(Corynebacteriumdiptheriae)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、豬紅斑丹毒絲 菌(Erysipelothrix rhusiopathie)、 產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)、石皮傷風(fēng)桿菌(Clostridium tetani)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)、克雷 白氏桿菌(Klebsiellapneumoniae)、多殺巴其jf德氏菌(Pasteurella multocida)、 擬桿菌屬(Bacteroides)、具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)、念珠狀鏈桿菌 (Str印tobacillus moniliformis)、蒼白密螺旋體(Tr印o固apallidum)、雅司螺旋體 (Tr印o固a perte騰)、鉤端螺旋體(L印tospira)、立克次體(Rickettsia)禾口衣氏放線菌 (Actinomycesisraelii)。 引起人類感染的病毒的實(shí)例包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒科(例如人缺陷病毒，例 如HIV-1 (也稱為HTLV-III) 、 HIV-II、 LAC或IDLV-III/LAV或HIV-III和其他分離株例 如HIV-LP)、小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)(例如脊髓灰質(zhì)炎病毒、甲型肝炎、腸 道病毒、人類柯薩奇病毒、鼻病毒、埃可病毒)、杯狀病毒科(Calciviridae)(例如引起胃 腸炎的菌株)、披膜病毒科(Togaviridae)(例如馬腦脊髓炎病毒、風(fēng)疹病毒)、黃病毒科 (Flaviviridae)(例如登革熱病毒、腦炎病毒、黃熱病毒)、冠狀病毒科(例如冠狀病毒)、 彈狀病毒禾斗(Rhabdoviridae)(例如vesicular stomata病毒、狂犬病病毒)、絲狀病毒 科(Filoviridae)(例如埃博拉(ebola)病毒)、副粘病毒科(例如副流感病毒、腮腺炎 病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如流感病毒)、 布尼亞病毒科(B皿gaviridae)(例如漢坦病毒(Hataan virus) 、 b皿ga病毒、白蛉病毒 (phleoboviruses)禾口 Nairo病毒)、砂粒病毒禾斗(Arenaviridae)(出血熱病毒)、呼腸孤病 毒科(Reoviridae)(例如呼腸孤病毒、環(huán)狀病毒、輪狀病毒)、傳染性法氏囊病毒屬雙RNA病 毒科(Bimaviridae)、肝去氧核糖核酸病毒科(H印adnaviridae)(乙型肝炎病毒)、細(xì)小病 毒科(Parvoviridae)(細(xì)小病毒)、乳多空病毒科(Papovaviridae)(乳頭狀瘤病毒、多瘤病 毒)、腺病毒科(Adenoviridae)(腺病毒)、皰疹病毒科(Herpeviridae)(例如單純皰疹病 毒(HSV)I和11、水痘帶狀皰疹病毒、痘病毒)和虹彩病毒科(Iridoviridae)(例如非洲豬 瘟病毒)和未分類病毒(例如海綿狀腦病的致病物、丁型肝炎的致病物、非甲非乙型肝炎的 致病物(l類腸道傳播的；2類腸胃外傳播的，例如丙型肝炎)；諾沃克(Norwalk)和相關(guān)的 病毒和星狀病毒。 真菌的實(shí)例包括曲霉(Aspergillus spp.)、粗球孢子菌(Coccidoides immitis)、 新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、白色念珠菌(Candida albicans)及其他 念珠菌(Candida spp.)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatidis)、莢膜組織胞槳菌 (Histoplasmacapsulatum)、沙目艮衣原體(Chlamydia trachomatis)、諾卡氏菌(Nocardia spp.)禾口卡氏月市孢子蟲(Pneumocytis carinii)。 寄生蟲包括但不限于生于血液的和/或組織寄生蟲，例如田鼠巴貝蟲(Babesia microti)， Babesi divergans，溶組織內(nèi)阿米巴(Entomoeba histolytica)，蘭伯氏 賈第鞭毛蟲(Giarda lamblia)，熱帶利什曼原蟲(Leishmania tropica)，利什曼原 蟲(Xeishmaniaspp.)，巴西利什曼原蟲(Xeishmania braziliensis)，杜氏利什曼原蟲 (Leishmania donovdni)，惡性癥原蟲(Plasmodium falciparum)，三曰癥原蟲(Plasmodium malariae)，卵形癥原蟲(Plasmodiumovale)，間目癥原蟲(Plasmodium vivax)，岡U地 弓形蟲(Toxoplasmagondii)，岡比亞錐蟲(Trypanosoma gambiense)禾P羅得西亞錐蟲 (Trypanosoma rhodes iense)(非洲|維蟲病(African sle印ingsickness))，克氏維蟲 (Trypanosoma cruzi)(卡格氏病(Chagus' disease))和剛地弓形蟲，葉狀軟體蝸蟲(flatworms)禾口蟲回蟲(roundworms)。 注意本發(fā)明進(jìn)一步包括本主題綴合物治療增殖性疾病的用途，例如癌癥，和在優(yōu) 選實(shí)施方案中，治療黑素瘤的用途。癌癥是細(xì)胞不受控制生長的病情，其妨礙身體器官和系 統(tǒng)的正常功能。患有癌癥的受試者是該受試者體內(nèi)存在客觀可測量的癌細(xì)胞的受試者。存 在發(fā)展為癌癥的風(fēng)險(xiǎn)的受試者是傾向于發(fā)展為癌癥的受試者，例如基于家族史、遺傳傾向 性、受試者接觸放射線或其他致癌物質(zhì)。從它們的原始部位轉(zhuǎn)移并定居在重要器官中的癌 癥通過受影響器官的功能衰竭最終可以引起受試者死亡。造血系統(tǒng)癌癥，例如白血病，能夠 競爭掉受試者正常的造血空間，由此引起造血失敗(以貧血、血小板減少和中性粒細(xì)胞減 少的形式)，最終致命。 轉(zhuǎn)移是癌細(xì)胞的部位與原發(fā)腫瘤的位置不同，是由癌細(xì)胞從原發(fā)腫瘤播散到身體 其他部分引起的。在診斷原發(fā)腫瘤塊時(shí)，可監(jiān)測受試者轉(zhuǎn)移的存在。通過單獨(dú)的核磁共振 成像(MRI)、計(jì)算機(jī)斷層(CT)、掃描、血和血小板計(jì)數(shù)、肝功能研究、胸部X線和骨掃描加上 具體癥狀的監(jiān)測，或它們的組合使用常常探測到轉(zhuǎn)移。 根據(jù)本發(fā)明的佐劑組合和含有該組合的組合物可用于治療各種癌癥或存在發(fā)展 為癌癥風(fēng)險(xiǎn)的受試者，通過包含腫瘤相關(guān)抗原(TAA)或編碼DNA。這是在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的 抗原。這種癌癥的實(shí)例包括乳腺、前列腺、結(jié)腸、血癌例如白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病等 等。本發(fā)明的接種疫苗方法可用于剌激免疫反應(yīng)，通過抑制或延緩腫瘤生長或減小腫瘤尺 寸而治療腫瘤。腫瘤相關(guān)抗原也可以是主要由腫瘤細(xì)胞但并非只有腫瘤細(xì)胞表達(dá)的抗原。
另外的癌癥包括但不限于基底細(xì)胞癌、膽管癌、膀胱癌、骨癌、腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng) (CNS)癌癥、宮頸癌、絨毛膜癌、結(jié)腸直腸癌、結(jié)締組織癌、消化系統(tǒng)癌癥、子宮內(nèi)膜癌、食管 癌、眼癌、頭頸癌、胃癌、上皮瘤、腎癌、喉癌、肝癌、肺癌(小細(xì)胞、大細(xì)胞)、淋巴瘤包括霍奇 金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤；神經(jīng)母細(xì)胞瘤；口腔癌(例如唇、舌、口和咽)；卵巢癌；胰腺 癌；視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤；橫紋肌肉瘤；直腸癌；呼吸系統(tǒng)癌癥；肉瘤；皮膚癌；胃癌；睪丸癌；甲 狀腺癌；子宮癌；泌尿系統(tǒng)癌癥；以及其他癌腫和肉瘤。 根據(jù)本發(fā)明的佐劑組合和含有該組合的組合物還可以用于治療自身免疫病例如 多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、1型糖尿病、銀屑病或其他自身免疫紊亂。潛在可以用本發(fā)明 的疫苗和免疫佐劑治療的其他自身免疫病包括克羅恩氏病及其他炎癥性腸病，例如潰瘍性 結(jié)腸炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、自身免疫腦脊髓炎、重癥肌無力(MG)、橋本氏甲狀腺炎、肺 出血腎綜合征(Goodpasture' s syndrome)、天皰疫、突眼性甲狀腺腫(Graves disease)、 自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性血小板減少性紫癜、具有抗膠原抗體的硬皮病、混合型 結(jié)締組織病、多肌炎(polypyositis)、惡性貧血、特發(fā)性阿狄森病(idiopathic Addison' s disease)、自身免疫相關(guān)性不育癥、腎小球性腎炎(例如新月形腎小球腎炎、增生性腎小球 腎炎)、大皰性類天皰瘡、干燥綜合征、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、胰島素抵抗、自身免疫性糖尿病(1型 糖尿??；胰島素依賴型糖尿病)、自身免疫性肝炎、自身免疫性血友病、自身免疫性淋巴組 織增生綜合癥(ALPS)、自身免疫性肝炎、自身免疫血友病、自身免疫性淋巴組織增生綜合 癥、自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎(uveoretinitis)和吉-巴綜合征。最近，動(dòng)脈硬化和阿爾 茨海默氏病已經(jīng)被公認(rèn)為自身免疫病。因此，在本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案中，抗原可以是自身 抗原，針對(duì)該抗原宿主引發(fā)不需要的免疫反應(yīng)，該反應(yīng)促進(jìn)組織破壞和正常組織的損害。
根據(jù)本發(fā)明的佐劑組合和含有該組合的組合物也可以用于治療哮喘和過敏性和炎性疾病。哮喘是以氣道炎癥和狹窄和氣道對(duì)吸入物質(zhì)的反應(yīng)性增加為特征的呼吸系統(tǒng)紊亂。哮喘常常與變應(yīng)性或過敏性癥狀相關(guān)，盡管不是僅僅與之相關(guān)。過敏是對(duì)物質(zhì)(過敏原)獲得性的過敏癥。過敏性病情包括濕疹、過敏性鼻炎或鼻炎、枯草熱、支氣管性哮喘、蕁麻疹和食物變應(yīng)性及其他變應(yīng)性病情。過敏原是可以在易感受試者中誘導(dǎo)過敏性或哮喘反應(yīng)的物質(zhì)。存在很多過敏原，包括花粉、昆蟲毒液、動(dòng)物毛發(fā)皮屑、粉塵、真菌孢子和藥物。
自然和植物過敏原的實(shí)例包括下列屬特有的蛋白犬、塵螨屬、貓屬(Felis)、豕草(Ambrosia) 、Lotium、柳杉屬、鏈格孢屬、榿木、Ali皿s、樺屬、櫟屬(Quercus)、洋橄欖、蒿屬(Artemisia)、大蕉、墻草、小蠊屬、蜜蜂屬、柏木屬(Cupressus)、檜屬、金鐘柏(Thuya)、扁柏屬(Chamaecyparis)、大蠊(Periplanet)、冰草屬(Agopyron)、黑麥屬、小麥屬、鴨茅屬、羊茅屬(Festuca)、早熟禾屬、燕麥屬、絨毛草屬(Holcus)、黃花茅屬(Anthoxanthum)、燕麥草屬、剪股穎屬(Agrostis)、貓尾草(Phleum)、篛草(Phalaris)、雀稗屬、高粱屬和Bromis。 很清楚根據(jù)本發(fā)明的佐劑組合和包含該組合的組合物可以與其他療法組合治療具體病情，例如傳染病、癌癥或自身免疫病情。例如在癌癥的情況下，本發(fā)明方法可以與化療或放療組合。 組合物制備成疫苗的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。NKT活化劑、CD40激動(dòng)劑和任選的抗原的有效量可以通過經(jīng)驗(yàn)確定，但可以基于動(dòng)物模型中的免疫有效量確定。待考慮的因素包括抗原性、劑型、給藥途徑、給予的免疫劑的次數(shù)、個(gè)體的身體情況、體重和年齡等等。這種因素對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的并可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定(參見例如Paoletti and Mcl皿es， eds. ， Vaccines, fromConc印t to Clinic :A Guide to theDevelopment and ClinicalTesting of Vaccines for Human Use CRC Press (1999))。如這里公開的，很清楚本主題DNAs或蛋白綴合物可以單獨(dú)給予或連同其他佐劑一起給予。
本發(fā)明的佐劑可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法局部或全身給予，包括但不限于肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、口服或其他粘膜途徑。另外的途徑包括顱內(nèi)(例如腦池內(nèi)或心室內(nèi))、眶內(nèi)、眼、囊內(nèi)、脊柱內(nèi)和局部給藥。本發(fā)明的佐劑和疫苗組合物可以在適當(dāng)?shù)臒o毒藥物載體中給予，或可以配制在微膠囊或緩釋植入物中。如果期望，為了維持期望的細(xì)胞免疫反應(yīng)，本發(fā)明的免疫原性組合物可以多次給予。合適途徑、劑型和免疫接種程序可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。 在本發(fā)明的方法中，有些情況下抗原和NKT活化劑/CD40激動(dòng)劑綴合物可以分開給予或組合在相同制劑中給予。在有些情況下包括幾個(gè)抗原可能有用。這些組合物可以以達(dá)到期望細(xì)胞免疫協(xié)同增強(qiáng)的任何順序分開或組合給予。典型地，這些組合物在一個(gè)接一個(gè)短時(shí)間內(nèi)給予，即一個(gè)接一個(gè)大約幾個(gè)小時(shí)內(nèi)，更優(yōu)選大約半小時(shí)，在一些實(shí)施方案中，它們可以一個(gè)接一個(gè)在大約24-48小時(shí)內(nèi)共同給予。 在有些情況下，在佐劑中包括促進(jìn)親和純化的部分可能有益。這種部分包括不干擾佐劑組合功能的相對(duì)小的分子。做為選擇，標(biāo)記可以通過切割而去掉。這種標(biāo)記的實(shí)例
包括聚組氨酸標(biāo)記、血球凝集素標(biāo)記、麥芽糖酶結(jié)合蛋白、凝集素、谷胱甘肽-s轉(zhuǎn)移酶、抗
生物素蛋白等等。其他合適的親合標(biāo)記包括FLAG、綠色熒光蛋白(GFP)、myc等等。 本主題佐劑組合可以與生理可接受載體例如生理鹽水一起給予。該組合物還
可以包含另一種載體或賦形劑，例如緩沖液，例如檸檬酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽和碳酸氫鹽，氨基酸，尿素，乙醇，抗壞血酸，磷脂，蛋白質(zhì)例如血清白蛋白，乙二胺四乙酸，氯化鈉或其他鹽，脂質(zhì)體，甘露糖醇，山梨糖醇，甘油等等。根據(jù)相應(yīng)的給藥途徑，本發(fā)明的佐劑可以用多種方法配制。例如，可以制備液體制劑用于吞食或注射，可以制備凝膠用于吞食、吸入或局部施用。制備這種制劑的方法是熟知的并可以在例如"Remington' sPharmaceuticalSciences， 〃 18th Ed. ， Mack Publishing Company, Easton Pa. 中找至Ll。
本發(fā)明還包括基于DNA的疫苗?？删幋a期望抗原和/或CD40佐劑的這些DNAs可以作為裸DNA給予，或可以包含在表達(dá)載體中給予。此外，本主題核酸序列可以在移植物移植前導(dǎo)入移植物的細(xì)胞。這個(gè)DNA優(yōu)選被人源化以促進(jìn)在人類受試者中表達(dá)。
本主題佐劑組合可以進(jìn)一步包含"標(biāo)記"或"報(bào)道子"。標(biāo)記或報(bào)道分子的實(shí)例包含P內(nèi)酰胺酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、腺苷脫氨酶、氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶、二氫葉酸還原酶、潮霉素B-磷酸轉(zhuǎn)移酶、胸苷激酶、lacz和黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶等。
可用來促進(jìn)本主題佐劑或抗原表達(dá)的原核和真核細(xì)胞包括例如微生物、植物和動(dòng)物細(xì)胞，例如，原核生物例如大腸桿菌、枯草桿菌等等，昆蟲細(xì)胞例如Sf21細(xì)胞，酵母細(xì)胞例如酵母、假絲酵母、克盧費(fèi)氏酵母、裂殖酵母屬(Schizzosaccharomyces)和畢赤氏酵母，和哺乳動(dòng)物細(xì)胞例如C0S、 HEK293、 CH0、 BHK、 NIH 3T3、 HeLa等等。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地選擇用于特定表達(dá)系統(tǒng)的合適成分，包括適于期望細(xì)胞或生物體的表達(dá)載體、啟動(dòng)子、選擇性標(biāo)記等等。各種表達(dá)系統(tǒng)的選擇和使用可以在例如Ausubel etal. ， 〃 CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York,N. Y. (1993);禾口Po騰ls et al.，Cloning Vectors :A LaboratoryMa皿al" :，1985 S聊l.(1987).中找到。還提供了包含和表達(dá)本主題DNA構(gòu)建體的真核細(xì)胞。
在細(xì)胞移植的情況下，細(xì)胞可以通過移植程序或用導(dǎo)管介導(dǎo)的注射程序通過血管壁給予。有些情況下，細(xì)胞可以通過釋放到脈管系統(tǒng)而給予，通過該系統(tǒng)，細(xì)胞隨后被血流分配和/或移動(dòng)到周圍組織中。 對(duì)本發(fā)明有用的"NKT活化劑或激動(dòng)劑"包括本領(lǐng)域通常已知的所有NKT細(xì)胞的活化劑或激動(dòng)劑。NKT活化劑或激動(dòng)劑的實(shí)例包括例如US20060211856和US20060052316中公開的神經(jīng)酰胺和其他糖脂化合物，這兩篇公開的專利申請(qǐng)的全部內(nèi)容引入作為參考。例如這包括a -半乳糖苷神經(jīng)酰胺、a _葡糖基神經(jīng)酰胺、磷脂酰肌醇(phosphatidylinisitol)和葡基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinisitol)和所引用專利中公開的作為NKT活化劑的和本領(lǐng)域已知的各種其他糖脂化合物和衍生物。也參見Parekh et al. ， Crit. Rev.Immunol. 25)3) :183-213(2005);和Parekh et al. ， J Immunol. 173(1) :3693-706(2006)，兩篇參考文獻(xiàn)的全部內(nèi)容也引入這里作為參考。 如所指出用于對(duì)本發(fā)明的"CD40激動(dòng)劑"優(yōu)選地包括特異性結(jié)合CD40的激動(dòng)性抗CD40抗體或其片段，優(yōu)選鼠或人CD40或CD40L蛋白、衍生物、多聚體例如三聚CD40L綴合物。本文使用的術(shù)語"抗體"使用其最廣義，以包括多克隆和單克隆抗體，以及其抗原結(jié)合片段。這包括Fab、F(ab' )2、Fd和Fv片段。 此外，術(shù)語"抗體"包括天然抗體以及非天然存在抗體，例如單鏈抗體、嵌合抗體、雙功能和人源化抗體。本發(fā)明優(yōu)選使用的是嵌合、人源化和完全人抗體。合成嵌合、人源化、CDR-移植的、單鏈和雙功能抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。此外，CD40特異性抗體是普遍已知和可得到的，和通過用CD40抗原，優(yōu)選人CD40免疫適當(dāng)?shù)乃拗骺梢灾苽洹?br> 很清楚本文提供的本發(fā)明定義中也提供了基本上不影響本發(fā)明各種實(shí)施方案活性的改動(dòng)。
實(shí)施例 CD40激動(dòng)劑與a -GalCer在誘導(dǎo)抗原_特異性CD8反應(yīng)中的協(xié)同作用。 下列實(shí)驗(yàn)揭示了 NKT a -半乳糖苷神經(jīng)酰胺(a -GalCer)與抗CD40抗體協(xié)同擴(kuò)充
具有裂解功能的CD8細(xì)胞，類似于以前用TLR激動(dòng)劑所觀察到的。CD40激動(dòng)劑和a -GalCer
組合給予誘導(dǎo)高水平的細(xì)胞免疫。
實(shí)施例1 抗CD40和a -GalCer組合給予在體內(nèi)協(xié)同增強(qiáng)抗原特異性T細(xì)胞的擴(kuò)充。
這個(gè)實(shí)施例涉及圖1包含的實(shí)驗(yàn)。其中，500ug卵白蛋白、100ug抗CD40、100ugS-27609(TLR7激動(dòng)劑)、4 uga-GalCer以圖中指出的組合靜脈注射給予小鼠。五天后，進(jìn)行使用Siinfekl脈沖的靶的標(biāo)準(zhǔn)CTL試驗(yàn)，如以前描述。指出試劑給予后第6天，四聚體染色劑測定OVA特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)量，如以前所述，以及在體外再剌激后產(chǎn)生IFN y的抗原特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)量。 圖1中的結(jié)果令人驚奇地證明新抗原(OVA)與CD40激動(dòng)劑(抗CD40)和TLR激動(dòng)劑(S-27609)或抗CD40和a -GalCer組合給予誘導(dǎo)高水平OVA特異性CD8+T細(xì)胞(由四聚體染色劑測定，使用0VA-H-2b四聚體)和重新恢復(fù)了 OVA特異性CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生IFN- a的反應(yīng)。
實(shí)施例2 作為使用抗CD40和a -GalCer組合免疫結(jié)果的定量免疫反應(yīng)(基于圖1中的數(shù)據(jù))和CD40激動(dòng)劑與a -GalCer在誘導(dǎo)保護(hù)性抗腫瘤免疫中的協(xié)同作用的證明。
因?yàn)榻o予抗CD40/ a -GalCer/OVA或抗CD40/609/0VA與使用單獨(dú)的物質(zhì)作為單一療法相比，在增加抗原特異性CD8+T細(xì)胞總數(shù)量方面有效得多，聯(lián)合治療被測試作為在黑素瘤鼠模型中誘導(dǎo)治療性免疫的有效方法。使用抗CD40和TLR*或a -GalCer的最初研究證明這個(gè)活化劑連同肽或完整蛋白的組合給藥弓I出極其高(CD8+T細(xì)胞中四聚體+T細(xì)胞>5%)頻數(shù)的抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞。然后我們想探究是否可以引出高頻數(shù)"自我反應(yīng)性或腫瘤反應(yīng)性"T細(xì)胞以保護(hù)不受同源腫瘤的影響。酪氨酸酶相關(guān)蛋白_2(TRP-2)是參與黑色素合成的蛋白并已用作免疫療法的黑素瘤相關(guān)抗原。TRP-2在正常黑色素細(xì)胞和黑素瘤中表達(dá)和已經(jīng)被鑒定為CTLs識(shí)別的人腫瘤抗原，和隨后被鑒定為B16黑素瘤的腫瘤排斥抗原。已經(jīng)描述了人和小鼠的CD8+T細(xì)胞肽表位。為測試使用CD40/TLR平臺(tái)是否可以誘導(dǎo)抗自我反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞，用50ug雜環(huán)形式TRP-2 ( A V肽；TRP_2 (SVYDFFVWL)，抗CD40和TLR7*或抗CD40和a -GalCer (和每一種單一療法)腹膜內(nèi)免疫已給予B16黑素瘤(四天前)的小鼠。 圖2中的結(jié)果表明根據(jù)給予腫瘤后21天后肺轉(zhuǎn)移的數(shù)量來判定，抗CD40/TLR/ A V或抗CD40/a-GalCer/AV組合使用提供了最有效的治療性保護(hù)。a-GalCer和AV提供了一些預(yù)防性保護(hù)。然而，根據(jù)我們其他治療的經(jīng)驗(yàn)，與接受a-GalCer/AV治療的小鼠相比，使用抗CD40/ a -GalCer/ A V引起那些鼠存活率增加。 體內(nèi)殺死試驗(yàn)還提示組合療法(OVA/抗CD40/ a -GalCer)也比測試的任何單一療法(抗CD40/0VA或a -GalCer/OVA或TLR/OVA)更有效(見圖2)。
實(shí)施例3 CD40/TLR*接種疫苗治療性干擾全身黑素瘤。 這個(gè)實(shí)施例涉及圖3包含的實(shí)驗(yàn)。在圖3包含的這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，靜脈注射100kB16-F10腫瘤細(xì)胞后四天免疫B6小鼠(4只/組)。特別地，使用以下指出的物質(zhì)組合免疫小鼠抗CD40(100ug/小鼠，腹膜內(nèi))、S27609 (TLR7*) (100ug) 、 A V-肽(100ug)或a-GalCer (4ug)靜脈注射。給予腫瘤(使用+4天介入方案)后二十天，取出肺(見典型照片，圖3頂部)和肉眼計(jì)算定量肺轉(zhuǎn)移數(shù)量(見圖3的底圖)。
實(shí)施例4 抗CD40抗體和a -GalCer在體內(nèi)誘導(dǎo)DCs表達(dá)CD70。 在圖4包含的實(shí)驗(yàn)中，用下列組合注射小鼠2uga-GalCer、50ug polyIC和/或50ug抗CD40，腹膜內(nèi)。然后，注射后18-20小時(shí)，取出脾。膠原酶消化脾，染色CDllc+并用CD8+和CD8-(CDllb+)DCs分析。 這個(gè)圖中的結(jié)果出乎意料地揭示了 CD70的表達(dá)僅在從CD40激動(dòng)劑和a -GalCer組合給予的小鼠獲得的樹突細(xì)胞上誘導(dǎo)出。 本發(fā)明人以前報(bào)道了僅當(dāng)抗CD40和TLR激動(dòng)劑組合給予時(shí)，體內(nèi)樹突狀細(xì)胞表面上表達(dá)CD70增加。此外，我們已表明CD70表達(dá)是抗原特異性CD8+T細(xì)胞隨后擴(kuò)充所必需的。 相當(dāng)出乎意料地，用本主題新的協(xié)同佐劑組合給予觀察到了相似的結(jié)果。特別地，和類似于用TLR和CD40激動(dòng)劑所見到的協(xié)同作用，抗CD40和a -GalCer組合給藥也見到了 DCs上CD70上調(diào)。如圖4所示，僅當(dāng)給予抗CD40和TLR激動(dòng)劑(polyIC)時(shí)，或抗CD40和a -GalCer時(shí)，觀察到CD8+和CD8_CDllc+DCs上CD70表達(dá)顯著增加。
實(shí)施例5 a -GalCer/CD40免疫引出強(qiáng)力CD8+T細(xì)胞反應(yīng)，它是STAT4、IFN y禾P IFNab非依賴性的，但是STAT1和Tbet依賴性的。 轉(zhuǎn)錄信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)劑和活化劑(STAT)蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的很多方面。STAT1參與由于I型或II型干擾素引起的信號(hào)來上調(diào)基因。在對(duì)IFN-y剌激的反應(yīng)中，STAT1與STAT3形成與GAS(干擾素-y活化序列)啟動(dòng)子元件結(jié)合的同源二聚體或異源二聚體；在對(duì)IFN-a或IFN-P剌激的反應(yīng)中，STAT1與STAT2形成可結(jié)合ISRE (干擾素剌激反應(yīng)元件)啟動(dòng)子元件的異源二聚體。IL-12在細(xì)胞免疫中的作用主要由STAT-4轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)。STAT-4對(duì)IL-12活性是必不可少的。T-bet是轉(zhuǎn)錄因子的T-box家族成員，調(diào)節(jié)CD4(TH)淋巴細(xì)胞中承載的譜系。這部分是有活化IFN- y而進(jìn)行的。T-bet是控制CD4和NK細(xì)胞產(chǎn)生I FN所需的，而不是CD8細(xì)胞。 在圖5所含實(shí)驗(yàn)中，靜脈注射50ug抗CD40 (FGK45) 、2ug a -GalCer和2Q0ug完整卵白蛋白免疫小鼠(wtB6或wt B6/129F1' s和K0)。七天后，殺死小鼠并分離PBLs和脾 細(xì)胞，用Kb/ova MHC四聚體染色，以鑒定ova特異性CD8+T細(xì)胞，如前所述(Sanchez et al. 2007Journal of Immunology)。所示點(diǎn)圖針對(duì)所有活的CD8+B220-細(xì)胞，和關(guān)于表面標(biāo) 記KLRG1方面顯示了四聚體+和_細(xì)胞的表型。顯示的數(shù)字表示總CD8+T細(xì)胞中四聚體+ 的百分比。顯示的點(diǎn)圖是PBL，但是脾反映出類似的趨勢。這個(gè)實(shí)驗(yàn)表明a-GalCer/CD40 免疫引發(fā)強(qiáng)力CD8+T細(xì)胞反應(yīng)，是STAT4、IFN y和IFNab非依賴性的，但是STAT1和T-bet 依賴性的。
結(jié)論 至少根據(jù)圖1-5中實(shí)驗(yàn)所含的結(jié)果，CD40激動(dòng)劑連同抗原和觸發(fā)NK_T細(xì)胞的激 動(dòng)劑(a-GalCer)組合給藥誘導(dǎo)出增高超過這些激動(dòng)劑單獨(dú)給予的免疫(引發(fā)免疫協(xié)同效 應(yīng))。與單獨(dú)任何激動(dòng)劑，有或者沒有抗原時(shí)相比，CD40激動(dòng)劑和a -GalCer組合引起更高 頻數(shù)的抗原特異性CD8+T細(xì)胞，更多數(shù)量的抗原特異性CD8+T細(xì)胞并增加抗腫瘤免疫。
因此，CD40激動(dòng)劑和NK-T細(xì)胞活化劑，如a -GalCer組合使用，會(huì)充當(dāng)強(qiáng)力疫苗 平臺(tái)，引發(fā)抗腫瘤和傳染病的保護(hù)性細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。 本文引用的期刊、專利和其他出版物的各種參考文獻(xiàn)包括現(xiàn)有技術(shù)并如同完全列 出一樣引入作為參考。 本發(fā)明進(jìn)一步由隨后的權(quán)利要求限定。
權(quán)利要求
佐劑組合，其引發(fā)T細(xì)胞免疫的協(xié)同效應(yīng)，包含(i)至少一種CD40激動(dòng)劑；(ii)至少一種NKT活化劑；和(iii)任選地，至少一種期望的抗原。
2. 權(quán)利要求1的佐劑組合，其中NKT活化劑是a -半乳糖苷神經(jīng)酰胺(a -GalCer)或 iGb3。
3. 權(quán)利要求1的佐劑組合，其中CD40激動(dòng)劑是抗CD40抗體或抗體片段或CD40L蛋白、 衍生物、片段，或其多聚體或包含CD40L的綴合物。
4. 權(quán)利要求3的佐劑組合，其中所述免疫球蛋白是嵌合免疫球蛋白。
5. 權(quán)利要求3的佐劑組合核酸構(gòu)建體，其中所述免疫球蛋白是人源化免疫球蛋白。
6. 權(quán)利要求3的佐劑組合，其中所述免疫球蛋白是人免疫球蛋白。
7. 權(quán)利要求3的佐劑組合，其中所述免疫球蛋白是單鏈免疫球蛋白。
8. 權(quán)利要求3的佐劑組合，其中所述免疫球蛋白包含人重鏈和輕鏈恒定區(qū)。
9. 權(quán)利要求3的佐劑組合，其中所述免疫球蛋白選自IgGl、IgG2、IgG3和IgG4組成的組。
10. 權(quán)利要求3的佐劑組合，其中所述免疫球蛋白由編碼免疫球蛋白輕鏈的核酸序列 和編碼免疫球蛋白重鏈的核酸序列所編碼，它們與同一啟動(dòng)子可操作連接。
11. 權(quán)利要求10的佐劑組合，其中所述免疫球蛋白輕鏈和免疫球蛋白重鏈序列中間插 入IRES。
12. 權(quán)利要求1的佐劑組合，其中所述抗原是病毒、細(xì)菌、真菌或寄生蟲抗原。
13. 權(quán)利要求1的佐劑組合，其中所述抗原是人抗原。
14. 權(quán)利要求13的佐劑組合，其中所述人抗原是癌抗原、自身抗原或其他人抗原，它的 表達(dá)與慢性人疾病相關(guān)或參與其中。
15. 權(quán)利要求12的佐劑組合，其中所述病毒抗原對(duì)選自下組的病毒是特異性的HIV、 皰疹、乳頭狀瘤、埃博拉、小核糖核酸病毒(picorna)、腸道病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、禽 流感病毒、狂犬病病毒、VSV、登革熱病毒、肝炎病毒、鼻病毒、黃熱病毒、bunga病毒、多瘤病 毒、冠狀病毒、風(fēng)疹病毒、?？刹《?、痘病毒、水痘帶狀皰疹、非洲豬瘟病毒、流感病毒和副流 感病毒。
16. 權(quán)利要求12的佐劑組合，其中所述細(xì)菌抗原源自于選自下組的細(xì)菌沙門氏菌 屬(Samonella)、埃希氏菌屬(Escherichia)、假單胞細(xì)菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬 (Bacillus)、弧菌屬(Vibrio)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、螺旋桿菌屬(Heliobacter)、 歐文氏菌屬(Erwinia)、包柔氏螺旋體屬(Borrelia)、粘土桿菌屬(Pelobacter)、梭菌 屬(Clostridium)、沙雷氏菌屬(Serratia)、黃單胞菌屬(Xanothomonas)、耳卩爾森氏菌 屬(Yersinia)、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholdia)、李斯特氏菌屬(Listeria)、志賀氏 菌屬(Shigella)、巴斯德氏菌屬(Pasteurella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、棒桿菌屬 (Corynebacterium)禾口鏈球菌屬(Streptococcus)。
17. 權(quán)利要求12的佐劑組合，其中所述寄生蟲抗原源自于選自下組的寄生蟲巴貝蟲屬(Babesia)、內(nèi)阿米巴屬(Entomoeba)、利什曼原蟲屬(Leishmania)、癥原蟲屬 (Plasmodium)、錐蟲屬(Trypanosoma)、弓形蟲屬(Toxoplasma)、賈第蟲屬(Giarda)、口十狀軟f本蟲咼蟲(flat worms)禾口蟲回蟲(round worms)。
18. 權(quán)利要求12的佐劑組合，其中所述真菌抗原源自于選自下組的真菌曲霉菌屬 (Aspergillus)、球抱菌屬(Coccidoides)、隱球菌屬(Cryptococcus) 、 Candida Nocardia、 月市囊蟲屬(Pneumocystis)和衣原體屬(Chlamydia)。
19. 權(quán)利要求1的佐劑組合，其中抗原是選自下組的人癌癥所表達(dá)的癌抗原前列腺 癌、胰腺癌、腦癌、肺癌(小或大細(xì)胞)、骨癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、睪丸癌、皮膚癌、 淋巴瘤、白血病、結(jié)腸癌、甲狀腺癌、宮頸癌、頭和頸癌、肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)癌和膽囊癌。
20. 權(quán)利要求l的佐劑組合，其中抗原是自身抗原，其表達(dá)與自身免疫病相關(guān)。
21. 包含根據(jù)權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)的佐劑組合的重組微生物。
22. —種引發(fā)抗原特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)的方法，其通過給予根據(jù)權(quán)利要求1-20任一項(xiàng) 的佐劑組合或包含所述佐劑組合的組合物。
23. 權(quán)利要求22的方法，其中所述給藥引起下列至少一個(gè)(i) 誘導(dǎo)比僅僅給予CD40激動(dòng)劑或NKT活化劑更高頻數(shù)的抗原特異性CD8+T細(xì)胞；(ii) 誘導(dǎo)比僅僅給予CD40激動(dòng)劑或NKT活化劑更大量的抗原特異性CD8+T細(xì)胞；禾口(iii) 相對(duì)于僅僅給予CD40激動(dòng)劑或NKT活化劑，腫瘤免疫力增強(qiáng)。
24. 權(quán)利要求23的方法，其中抗原選自病毒抗原、細(xì)菌抗原、真菌抗原、自身抗原、過敏 原和癌抗原。
25. 權(quán)利要求24的方法，其中抗原是HIV抗原。
26. 權(quán)利要求25的方法，其中HIV抗原是gag或env。
27. 權(quán)利要求24的方法，其中抗原是人腫瘤表達(dá)的抗原。
28. 權(quán)利要求24的方法，其中抗原是黑素瘤表達(dá)的抗原。
29. 權(quán)利要求23的方法，其中所治療的疾病選自癌癥、過敏癥、炎性疾病、傳染病和自 身免疫病。
30. 權(quán)利要求29的方法，其中所治療的疾病是黑素瘤。
31. 權(quán)利要求23的方法，其中傳染病由病毒、細(xì)菌、真菌或寄生蟲引起。
32. 權(quán)利要求31的方法，其中病毒是HIV。
33. 權(quán)利要求30的方法，其中所述給藥引起下列至少一種(i) 弓I發(fā)相對(duì)于單獨(dú)給予CD40激動(dòng)劑或NKT活化劑或激動(dòng)劑實(shí)質(zhì)上增強(qiáng)的初級(jí)和記憶 CD8+T細(xì)胞反應(yīng)；(ii) 誘導(dǎo)抗原特異性CD8+T細(xì)胞指數(shù)級(jí)擴(kuò)充；禾口(iii) 在CD4缺陷宿主中產(chǎn)生與正常(非CD4缺陷)宿主可比的保護(hù)性免疫反應(yīng)。
全文摘要
公開了佐劑組合，包含至少一種NKT活化劑例如α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺(α-Gal-Cer)或iGb3，CD40激動(dòng)劑和任選的抗原。也提供了這些免疫佐劑用于治療各種慢性疾病例如癌癥的用途。
文檔編號(hào)A61K45/00GK101730546SQ200880013233
公開日2010年6月9日 申請(qǐng)日期2008年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月25日
發(fā)明者C·阿霍寧, R·諾勒 申請(qǐng)人:Immurx公司