專利名稱：抗ramp3抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與降鈣素受體樣受體相關(guān)的受體活性修飾蛋白(RAMP)結(jié)合的抗體及其片段。
背景技術(shù)：
降鈣素肽家族通過G蛋白偶聯(lián)膜受體(GPCR)起作用。已經(jīng)克隆了降鈣素受體 基因。它與典型識(shí)別調(diào)解肽(分泌素、胰高血糖素、VIP)的家族“B”中的GPCR同源。降 鈣素受體的同源物降鈣素受體樣受體(CRLR，也稱作CL)已經(jīng)被確定(人461aa;大鼠/ 小鼠 463aa)，與降鈣素受體具有 55% 同源性(Njuki 等，Clin. Sci. 85，385-388 (1993)； Chang 等，Neuron 11,1187-1195 (1993) ；Fluhmann 等，Biochem. Biophys. Res. Comun. 206, 341-347 (1995) ；Kapas 等，J. Biol. Chem. 270，25344-25347 (1995))。CRLR單獨(dú)不能轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)腎上腺髓質(zhì)素(AM)應(yīng)答的信號(hào)，因?yàn)樾枰猂AMP (降鈣素受 體活性修飾蛋白)的存在來誘導(dǎo)CRLR的配體特異性，結(jié)合和活化。RAMP是預(yù)測(cè)大小為 14，000-17, OOOOKd的小內(nèi)在膜蛋白家族。RAMP由約120個(gè)氨基酸組成，具有約100個(gè)氨基 酸的大的胞外結(jié)構(gòu)域；單個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域以及約10個(gè)氨基酸的短的胞內(nèi)區(qū)。已表明CRLR能夠作為CGRP受體或AM受體起作用，這取決于RAMP家族成員RAMP 1-3的表達(dá)。RAMP家族的三個(gè)成員RAMP1、2和3引起CRLR的不同配體特異性，因此RAMPl+CRLR = CGRP 受體RAMP2+CRLR = AM 受體RAMP3+CRLR = AM 受體。RAMP 1、2和3的序列可如下獲得RAMP I-GenBank 登錄號(hào) NM_005855 ；RAMP 2-GenBank 登錄號(hào) NM_005854 ;UniGene ID Hs. 155106RAMP 3-GenBank 登錄號(hào) NM_005856 ;UniGene ID Hs. 25691。W02004/050834中公開了與RAMP2結(jié)合并可用于治療癌癥的多克隆抗體。所述抗 體對(duì)RAMP2胞外結(jié)構(gòu)域的區(qū)域而產(chǎn)生，該RAMP2胞外結(jié)構(gòu)域認(rèn)為是CRLR結(jié)合RAMP2的關(guān)鍵。由于此類抗RAMP抗體能夠在治療和診斷中具有高度潛在的應(yīng)用，因此需要另外 的抗RAMP抗體。本發(fā)明的發(fā)明人分離并鑒定了另外的抗RAMP抗體。特別是，已經(jīng)證明這些抗體抑 制癌細(xì)胞增殖，并可用于預(yù)防癌癥。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供分離的抗體，所述抗體能夠結(jié)合CRLR受體的 受體活性修飾蛋白(RAMP)，該抗體為IgG、IgA或IgM同種型。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的第一方面的抗體是IgG同種型。所述抗體可以是亞 類IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。優(yōu)選地，所述抗體是IgGl同種型。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的第一方面的抗體是IgA同種型。所述抗體可以是亞類IgAl或IgA2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的第一方面的抗體是IgM同種型。本發(fā)明的第一方面的抗體可以是單體、二聚體、三聚體、四聚體或五聚體多肽。所述抗體可以能夠結(jié)合RAMP1、RAMP2或RAMP3。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體能夠結(jié)合 RAMP3。本發(fā)明的抗體可以是RAMP拮抗劑或激動(dòng)劑或所述受體的天然或人工配體活性的 增強(qiáng)劑。本發(fā)明的抗體可以作為RAMP拮抗劑起作用。本文公開的數(shù)據(jù)可表明所述抗體可 以一方面抑制RAMP和CRLR之間的相互作用或者抑制RAMP/CRLR相關(guān)復(fù)合物和配體例如腎 上腺髓質(zhì)素之間的相互作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是IgM同種型抗RAMP3抗體且 是RAMP拮抗劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是IgGl同種型抗RAMP3抗體且是RAMP拮 抗劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體作為RAMP激動(dòng)劑起作用。本文公開的數(shù)據(jù)可表 明所述抗體可以在一個(gè)實(shí)施方案中所述抗體是IgGl同種型抗RAMP3抗體且是AM作用的 RAMP激動(dòng)劑或RAMP增強(qiáng)劑。本發(fā)明的第二方面提供分離的抗體，所述抗體能夠結(jié)合CRLR受體的受體活性修 飾蛋白(RAMP)，該抗體包含選自以下的結(jié)合結(jié)構(gòu)域i)包含由圖Ia中所示序列代表的核酸序列組成的核酸分子編碼的氨基酸序列的 結(jié)合結(jié)構(gòu)域；ii)包含由圖Ib中所示序列代表的核酸序列組成的核酸分子編碼的氨基酸序列 的結(jié)合結(jié)構(gòu)域；iii)包含由圖Ic中所示序列代表的核酸序列組成的核酸分子編碼的氨基酸序列 的結(jié)合結(jié)構(gòu)域；iv)包含由圖Id中所示序列代表的核酸序列組成的核酸分子編碼的氨基酸序列 的結(jié)合結(jié)構(gòu)域；ν)包含與以上(i)、(ii)、(iii)或(iv)中定義的核酸分子雜交的核酸分子編碼 的氨基酸序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域；vi)包含由作為(i)、(ii)、(iii)、(iv)或(ν)中定義的核酸序列的遺傳密碼的結(jié) 果簡(jiǎn)并的核酸編碼的氨基酸序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。第三方面，本發(fā)明提供分離的抗體，所述抗體能夠結(jié)合CRLR受體的受體活性修飾 蛋白(RAMP)，該抗體包含選自以下的結(jié)合結(jié)構(gòu)域
i)包含由圖2a中所示序列代表的核酸序列組成的核酸分子編碼的氨基酸序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域；ii)包含由圖2b中所示序列代表的核酸序列組成的核酸分子編碼的氨基酸序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域；iii)包含由圖2c中所示序列代表的核酸序列組成的核酸分子編碼的氨基酸序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域；iv)包含由圖2d中所示序列代表的核酸序列組成的核酸分子編碼的氨基酸序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域；
ν)包含與以上(i)、(ii)、(iii)或(iv)中定義的核酸分子雜交的核酸分子編碼 的氨基酸序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和vi)包含由作為(i)、(ii)、(iii)、(iv)或(ν)中定義的核酸序列的遺傳密碼的結(jié) 果簡(jiǎn)并的核酸編碼的氨基酸序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，本發(fā)明提供分離的抗體，所述抗體能夠結(jié)合CRLR的受體活 性修飾蛋白，該抗體包含以下結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或者兩個(gè)i)包含由圖Ia中所示序列代表的核酸序列組成的核酸分子編碼的氨基酸序列的 結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和/或ii)包含由圖2a中所示序列代表的核酸序列組成的核酸分子編碼的氨基酸序列 的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選方面，提供分離的抗體，所述抗體能夠結(jié)合CRLR的受體活 性修飾蛋白，該抗體包含以下結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或者兩個(gè)i)包含由圖Ib中所示序列代表的核酸序列組成的核酸分子編碼的氨基酸序列的 結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和/或ii)包含由圖2b中所示序列代表的核酸序列組成的核酸分子編碼的氨基酸序列 的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。所述核酸分子可以在嚴(yán)格雜交條件下與圖Ia至d或2a至d中所示的核酸序列 或與其互補(bǔ)鏈退火。嚴(yán)格雜交/漂洗條件在本領(lǐng)域中熟知。例如，在60°C下在0. lxSSC， 0. 1% SDS中漂洗后穩(wěn)定的核酸雜交體。本領(lǐng)域熟知如果核酸序列已知?jiǎng)t可以計(jì)算最適雜 交條件。例如，雜交條件可以通過進(jìn)行雜交的核酸的GC含量來確定。請(qǐng)參見Sambrook等 (1989)Molecular Cloning ；ALaboratory Approach。用于計(jì)算在具體同源性的核酸分子之 間實(shí)現(xiàn)雜交所需的嚴(yán)格條件的一般公式是Tm = 81. 5"C +16. 6Log[Na+] +0. 41[% G+C]-0. 63(% 甲酰胺)。本發(fā)明的另一方面提供分離的抗體，所述抗體能夠結(jié)合CRLR受體的受體活性修 飾蛋白(RAMP)，該抗體包含選自以下的結(jié)合結(jié)構(gòu)域i)包含基本上由圖Ia中所示序列代表的氨基酸序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域；ii)包含基本上由圖Ib中所示序列代表的氨基酸序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域；iii)包含基本上由圖Ic中所示序列代表的氨基酸序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和iv)包含基本上由圖Id中所示序列代表的氨基酸序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。另一方面，本發(fā)明提供分離的抗體，所述抗體能夠結(jié)合CRLR受體的受體活性修飾 蛋白(RAMP)，該抗體包含選自以下的結(jié)合結(jié)構(gòu)域i)包含基本上由圖2a中所示序列代表的氨基酸序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域；ii)包含基本上由圖2b中所示序列代表的氨基酸序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域；iii)包含基本上由圖2c中所示序列代表的氨基酸序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和iv)包含基本上由圖2d中所示序列代表的氨基酸序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明優(yōu)選的方面，提供分離的抗體，所述抗體能夠結(jié)合CRLR的受體活性修飾 蛋白，該抗體包含以下結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或者兩個(gè)i)包含基本上由圖Ia中所示序列代表的氨基酸序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和/或
ii)包含基本上由圖2a中所示序列代表的氨基酸序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
在本發(fā)明優(yōu)選的方面，提供分離的抗體，所述抗體能夠結(jié)合CRLR的受體活性修飾蛋白，該抗體包含以下結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或者兩個(gè)i)包含基本上由圖Ib中所示序列代表的氨基酸序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和/或ii)包含基本上由圖2b中所示序列代表的氨基酸序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含含有氨基酸序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該氨基酸 序列基本上如選自圖3中代表的那些氨基酸序列的氨基酸序列所述。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含含有氨基酸序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該氨基酸 序列基本上如選自圖4中代表的那些氨基酸序列的氨基酸序列所述。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含含有氨基酸序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該氨基酸 序列基本上如選自圖5中代表的那些氨基酸序列的氨基酸序列所述。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含含有氨基酸序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該氨基酸 序列基本上如選自圖6中代表的那些氨基酸序列的氨基酸序列所述。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含含有氨基酸序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該氨基酸 序列基本上如選自圖7中代表的那些氨基酸序列的氨基酸序列所述。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含含有氨基酸序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該氨基酸 序列基本上如選自圖8中代表的那些氨基酸序列的氨基酸序列所述。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含含有氨基酸序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該氨基酸 序列基本上如選自圖9中代表的那些氨基酸序列的氨基酸序列所述。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含含有氨基酸序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該氨基酸 序列基本上如選自

圖10中代表的那些氨基酸序列的氨基酸序列所述。本發(fā)明包括包含多個(gè)具有相同或不同的序列或其組合的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體。該或 各多肽可以被人抗體骨架負(fù)載。例如，一個(gè)或多個(gè)結(jié)合區(qū)可以取代整個(gè)人抗體或其可變區(qū) 的 CDR。第四方面，本發(fā)明提供包含第二方面的抗體和第三方面的抗體的組合或結(jié)合。所 述抗體可以是Fv、(Fab’)2或scFV抗體片段。本發(fā)明的抗體可以帶有可檢測(cè)的或功能性標(biāo)記物。另一方面，本發(fā)明提供分離的核酸，所述核酸包含編碼本發(fā)明第一方面、第二方 面、第三方面或第四方面的抗體的序列，以及制備本發(fā)明抗體的方法，所述方法包括在引起 所述抗體表達(dá)的條件下表達(dá)所述核酸并回收所述抗體。根據(jù)本發(fā)明的抗體可用于人或動(dòng)物體的治療、預(yù)防或診斷方法中，所述方法例如 治療增殖性障礙例如在患者(優(yōu)選人)中的腫瘤的方法，所述方法包括給予所述患者有效 量的本發(fā)明的抗體。本發(fā)明還提供本發(fā)明的抗體用于醫(yī)藥以及本發(fā)明的抗體在制備用于診 斷或治療增殖性障礙例如腫瘤的藥物中的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的抗體還可以用于治療或預(yù)防患者(優(yōu)選人)中的炎癥性障礙的方法 中，所述方法包括給予所述患者有效量的本發(fā)明的抗體。本發(fā)明還提供本發(fā)明的抗體在制 備用于治療炎癥性障礙的藥物中的應(yīng)用。本文所用的術(shù)語“抗體”指免疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子的免疫學(xué)活性部分， 即含有特異性結(jié)合抗原的抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子，不論是天然或部分或全部合成產(chǎn)生的。該 術(shù)語還包括具有結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽或蛋白，所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域是抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或與抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域同源。這些可以來自天然來源，或者它們可以部分或全部合成產(chǎn)生。抗體的 實(shí)例是含有抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域例如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd的片段以及二體(diabody)。抗體可以是多克隆或單克隆的。優(yōu)選地，所述抗體是單克隆抗體，本文可以指 “mab”?？赡懿捎脝慰寺』蚱渌贵w，并使用重組DNA技術(shù)制備保留原抗體特異性的其他 抗體或嵌合分子。這些技術(shù)可以包括將編碼抗體免疫球蛋白可變區(qū)或互補(bǔ)決定區(qū)(CDR) 的DNA引入不同的免疫球蛋白的恒定區(qū)或恒定區(qū)加骨架區(qū)中。參見例如EP-A-184187、GB 2188638A或EP-A-239400。雜交瘤或其他產(chǎn)生抗體的細(xì)胞可以進(jìn)行基因突變或其他改變， 該基因突變或其他改變可以或可以不改變產(chǎn)生的抗體的結(jié)合特異性。因?yàn)榭贵w可以通過多種方式修飾，因此術(shù)語“抗體”應(yīng)理解作包括具有所要求特異 性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何抗體或物質(zhì)。因此，該術(shù)語涵蓋抗體片段，抗體衍生物、功能等價(jià)物 和同源物，人源化抗體，包括任何含有免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽，無論是天然或完全或 部分合成的。因此，包括含有與其他多肽融合的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域或等價(jià)物的嵌合分 子。EP-A-0120694和EP-A-0125023中描述了嵌合抗體的克隆和表達(dá)。人源化抗體可以是 具有非人例如鼠抗體的可變區(qū)以及人抗體的恒定區(qū)的修飾抗體。制備人源化抗體的方法 在例如美國專利5225539中描述。已表明全抗體的片段可以表現(xiàn)結(jié)合抗原的功能。結(jié)合 片段的實(shí)例是(i)由VL、VH、CL和CHI結(jié)構(gòu)域組成的Fab片段；(ii)由VH和CHl結(jié)構(gòu)域 組成的Fd片段；(iii)由單個(gè)抗體的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(iv)由VH結(jié)構(gòu)域組 成的 dAb 片段(Ward, Ε. S.等，Nature 341 :544_546 (1989) ； (ν)分離的 CDR 區(qū)；(vi)含有 兩個(gè)連接的Fab片段的F(ab' )2 二價(jià)片段；(vii)單鏈Fv分子(scFv)，其中VH結(jié)構(gòu)域和 VL結(jié)構(gòu)域通過允許該兩個(gè)結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成抗原結(jié)合位點(diǎn)的肽接頭連接(Bird等，Science 242 423-426(1988) ；Huston 等，PNAS USA 85 :5879_5883 (1988)) ； (viii)雙特異性單鏈 Fv二聚體(PCT/US92/09965)；以及(ix)通過基因融合構(gòu)建的“二體”、多價(jià)或多特異性片段 (W094/13804 ；P. Hollinger 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :6444_6448 (1993))。二體是多肽的多聚體，各個(gè)多肽包含第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域，所述第一結(jié)構(gòu)域 包含免疫球蛋白輕鏈的結(jié)合區(qū)，所述第二結(jié)構(gòu)域包含免疫球蛋白重鏈的結(jié)合區(qū)，該兩個(gè) 結(jié)合域(例如通過肽接頭)連接但是不能彼此結(jié)合形成抗原結(jié)合位點(diǎn)抗原結(jié)合位點(diǎn)通 過多聚體中的一個(gè)多肽的第一結(jié)合域與多聚體中另一個(gè)多肽的第二結(jié)合域結(jié)合來形成 (W094/13804)。
本發(fā)明的抗體可以是對(duì)于至少兩個(gè)不同抗原具有特異性的多特異性抗體。盡管 此類分子通常與兩個(gè)抗原結(jié)合(即雙特異性抗體)，但是在本發(fā)明中的術(shù)語“多特異性抗 體”包括對(duì)兩個(gè)或多個(gè)(例如三個(gè))抗原具有特異性的抗體。多特異性抗體可能是全長(zhǎng)抗 體或所述抗體的片段(例如F(ab' )2雙特異性抗體)。在使用雙特異性抗體的情況下，這 些可以是常規(guī)的雙特異性抗體，其可以以多種方式((Hollinger&Winter，Current Opinion Biotechnol. 4 446-449 (1993)))制備，例如化學(xué)地制備或者從雜交瘤制備，或者可以是以 上提及的雙特異性抗體片段中的任何一種?？梢詢?yōu)選使用scFv 二聚體或二體而不是全抗 體?？梢詢H使用可變結(jié)合域而沒有Fc區(qū)構(gòu)建二體和scFv，有力地降低抗獨(dú)特型反應(yīng)的作 用。雙特異性抗體的其他形式包括Traunecker等，EMBO Journal 10 =3655-3659 (1991)中 描述的單鏈〃 Janusins"。所述雙特異性抗體還包括異源偶聯(lián)(heteroconjugate)抗體，其中一個(gè)抗體與抗生物素蛋白偶聯(lián)，而另一個(gè)與生物素偶聯(lián)等(美國專利4，676，980、WO 91/00360、W092/200373和EP 03089)4, 676，980?？捎糜谥苽渌霎愒磁悸?lián)抗體的交聯(lián)劑 是眾所周知的，例如在美國專利4，676，980中描述。與雙特異性全抗體相對(duì)，雙特異性二體也可以使用，因?yàn)樗鼈兛扇菀椎貥?gòu)建并在大腸桿菌(E.coli)中表達(dá)。適宜結(jié)合特異性的二體(以及許多其他多肽例如抗體片段) 可以使用噬菌體展示(W094/13804)從庫中容易地選擇。如果二體的一個(gè)臂保持恒定，例如 具有針對(duì)抗原X的特異性，則可以制備其中其他臂變化且選擇合適特異性的抗體的庫?！翱乖Y(jié)合結(jié)構(gòu)域”或“結(jié)合結(jié)構(gòu)域”是抗體的一部分，其包含特異性結(jié)合抗原的一 部分或全部且與抗原的一部分或全部互補(bǔ)的區(qū)域。當(dāng)抗原是大的的情況下，抗體可以僅結(jié) 合抗原的特定部分，該部分稱為表位?？乖Y(jié)合結(jié)構(gòu)域可以通過一個(gè)或多個(gè)抗體可變結(jié)合 域提供。抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以包含抗體輕鏈可變區(qū)(VL)和抗體重鏈可變區(qū)(VH)?！胺蛛x的”指其中本發(fā)明的抗體或編碼該抗體的核酸根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選處于的狀態(tài)。 抗體和核酸通常不合或基本不含它們天然相關(guān)的物質(zhì)例如它們?cè)谒鼈兊奶烊画h(huán)境中或制 備(該制備通過體外或體內(nèi)進(jìn)行的重組DNA技術(shù)進(jìn)行)它們的環(huán)境(例如細(xì)胞培養(yǎng))中 存在的其他多肽或核酸?？贵w和核酸可以用稀釋劑或助劑配制且以實(shí)際的目的仍為分離 的-例如，如果用于包埋微量滴定板用于免疫測(cè)定法時(shí)，抗體通常與凝膠或其他載體一起 混合，或者當(dāng)用于診斷或治療時(shí)，與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑一起混合?？贵w可以天然 地或通過異源真核細(xì)胞糖基化，或者它們可以(例如如果通過在原核細(xì)胞中表達(dá)生產(chǎn))是 非糖基化的。“基本上...代表的”是指結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與圖Ia至d、圖2a至d或圖 3至10中所示的氨基酸序列所代表的氨基酸序列相同或者高度同源?！案叨韧础卑ㄋ霭被嵝蛄信c圖Ia至d、圖2a至d或圖3至10中代表的氨 基酸序列具有至少70%的相同性。優(yōu)選地，所述氨基酸序列將與圖Ia至d、圖2a至d或圖 3至10中代表的氨基酸序列具有至少80%的相同性，更優(yōu)選80%相同性，更優(yōu)選至少90% 的相同性，還更優(yōu)選至少95%的相同性，例如98%的相同性。如本文所述，“治療”包括能夠有益人或非人動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物的任何療法。哺乳 動(dòng)物、鳥和其他動(dòng)物可以被治療，所述動(dòng)物包括狗、貓或家畜，例如馬、牛和羊。所述治療可 以是存在的病癥或可以是預(yù)防性的(預(yù)防性治療)。如本文所述，“腫瘤”是組織的異常生長(zhǎng)。其可以是局限性的(良性)或侵襲鄰近 組織(惡性)或遠(yuǎn)處組織(轉(zhuǎn)移)。腫瘤包括引起癌癥的贅生物生長(zhǎng)，包括食管的、結(jié)直腸 的、胃的、乳房的和子宮內(nèi)膜的腫瘤，以及癌性組織或細(xì)胞系，包括但不限于白血病細(xì)胞。如 本文所用，“腫瘤”在其范圍內(nèi)還包括子宮內(nèi)膜異位。可以根據(jù)本發(fā)明治療的腫瘤的實(shí)例包 括皮膚、肺、縱隔、心包、前列腺、乳房、結(jié)腸和直腸、肝、胰腺、腦、顱內(nèi)結(jié)構(gòu)、眼、睪丸、卵巢、 子宮、子宮頸、腎臟、甲狀腺、膀胱、胃腸道、血液組織、骨、關(guān)節(jié)或結(jié)腸的腫瘤。如本文所述，“炎癥性障礙”包括選自以下的障礙動(dòng)脈粥樣硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié) 炎、骨關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)、紅斑狼瘡、硬皮病、干燥綜合征、多發(fā)性和皮肌炎、血管炎、腱炎、滑膜 炎、細(xì)菌性心內(nèi)膜炎、骨髓炎、銀屑病、肺炎、纖維化肺泡炎、慢性支氣管炎、支氣管擴(kuò)張、肺 氣腫、硅肺病、塵肺病、結(jié)核病、潰瘍性結(jié)腸炎、克隆氏病、慢性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng) 根神經(jīng)病、慢性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病、多發(fā)性硬化癥、格林_巴利綜合征以及重癥肌無力、乳房炎、蹄葉炎、喉炎、慢性膽囊炎、橋本氏甲狀腺炎、腕管綜合征以及炎癥性乳房 疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述炎癥性障礙可以是移植后組織或器官排斥的結(jié)果、在特定的 實(shí)施方案中，所述炎癥性障礙選自動(dòng)脈粥樣硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、膿毒癥以及 多發(fā)性關(guān)節(jié)炎。本發(fā)明在其范圍內(nèi)還包括具有如圖la-d或2a_d中所述的氨基酸序列的多肽、具 有如圖la-d或2a_d中所述的氨基酸序列的多核苷酸以及具有與此基本上相同的序列，例 如與此具有70%、80%、85%、90%、95%或99%相同性。兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核酸序列 的百分比相同性通常通過比對(duì)用于最適比較目的的序列(例如可以在第一序列中引入間 隔用于與第二序列進(jìn)行最佳比對(duì))并比較在相應(yīng)位置的氨基酸殘基或核苷酸來確定?！白罴?比對(duì)”是導(dǎo)致最高百分比相同性的兩個(gè)序列的比對(duì)。百分比相同性通過比較所述序列中相 同氨基酸殘基或核苷酸的數(shù)目(即％相同性=相同位置數(shù)目/總位置數(shù)目xlOO)來確定。在兩個(gè)序列之間的百分比相同性的確定可以通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的數(shù) 學(xué)算法完成。用于比較兩個(gè)序列的數(shù)學(xué)算法的實(shí)例是在Karlin和Altschul (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873_5877 中修改的 Karlin 和 Altschul (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 2264-2268 算法。Altschul 等(1990) J. MoI. Biol. 215 403-410 的 NBLAST 和 XBLAST程序引入該算法。可用BLAST程序，分值=100，字長(zhǎng)=12進(jìn)行BLAST核苷酸研究 以獲得與本發(fā)明的核酸分子同源的核酸序列?？捎肵BLAST程序，分值=100，字長(zhǎng)=3進(jìn)行 BLAST蛋白研究以獲得與本發(fā)明的蛋白分子同源的氨基酸序列。為獲得用于比較目的的間 隔比對(duì)，可以如 Altschul 等(1997)Nucleic Acids Res. 25 :3389_3402 中所述利用 Gapped BLAST?；蛘撸梢允褂肞SI-Blast進(jìn)行迭代研究，檢測(cè)分子之間的遠(yuǎn)緣關(guān)系(Id.)。當(dāng)使用 BLAST,Gapped BLAST以及PSI-Blast程序時(shí)，可以使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的 默認(rèn)參數(shù)。參見http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov.。用于比較序列的數(shù)序算法的另一個(gè)實(shí)例 是Myers和Miller，CABIOS (1989)的算法。作為GCG序列比對(duì)軟件包一部分的ALIGN程序 (版本2.0)引入該算法。本領(lǐng)域已知的用于序列分析的其他算法包括如Tore 11 i s和Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci.，10 :3_5 中描述的 ADVANCE 和 ADAM ；以及 Pearson 和 Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85 2444-8中描述的FASTA。在FASTA中，ktup是設(shè)定研究敏感性和 速度的對(duì)照選項(xiàng)。 本發(fā)明在其范圍內(nèi)還包括包含結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體，該結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含選自圖Ia 至d或2a至d所代表的氨基酸序列的氨基酸序列或其變體，其中所述變體序列通過至少一 個(gè)氨基酸殘基的添加、取代或缺失來改變而對(duì)抗體的生物學(xué)功能沒用實(shí)質(zhì)性影響。本文所用的多肽的“變體”包括氨基酸序列與參比多肽不同的多肽。一般而言，不 同是有限的以使得參比與變體的序列非常相似并且在許多區(qū)域是相同的。變體多肽可以通 過一個(gè)或多個(gè)可以以任何組合存在的取代、添加、缺失、截短而使氨基酸序列不同。優(yōu)選的 變體是與參比多肽在保守氨基酸取代不同的那些變體。所述取代是由另一個(gè)類似特征的氨 基酸取代給定氨基酸的那些。氨基酸的以下非限制性列出認(rèn)為是保守替換(類似的)a) 丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸；b)谷氨酸和天冬氨酸；c)天冬酰胺和谷氨酰胺；d)精氨酸和賴 氨酸；e)異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和纈氨酸以及f)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供包含一對(duì)基于基本上分別如圖la-d和2a_d所述的VH和VL區(qū)的氨基酸序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體?；谶@些序列之一的單個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域構(gòu)成本 發(fā)明的另一方面。在基于基本上如圖la-d中所述的VH區(qū)的氨基酸序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的情 況下，所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以用作靶向試劑，因?yàn)橐阎庖咔虻鞍譜H結(jié)構(gòu)域能夠以特異方式結(jié)合目標(biāo)抗原。 在任何單鏈特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域的情況下，這些結(jié)構(gòu)域可以用于篩選能夠形成兩結(jié) 構(gòu)域抗體的互補(bǔ)結(jié)合域，該兩結(jié)構(gòu)域抗體在體內(nèi)具有與本文所公開的單克隆抗體一樣或相 等的特性。這可以通過噬菌體展示篩選方法使用W092/01047中所公開的所謂的等級(jí)雙重組 合方法(hierarchical dual combinatorial approach)獲得，在等級(jí)雙重組合方法中含H 或L鏈克隆的單個(gè)集落用于感染編碼另一鏈(L或H)的完整克隆庫并根據(jù)噬菌體展示技術(shù) 例如該參考文獻(xiàn)中描述的那些來選自所獲得的兩鏈抗體。該技術(shù)還在Marks等，同前中公 開。本發(fā)明的抗體另外還可以包括抗體恒定區(qū)或其部分。例如，基于圖2a_d中所示 的VL區(qū)的抗體可以在其C末端連接于抗體輕鏈恒定區(qū)包括人CK或C#鏈。類似地，基于圖 la-e中所示的VH區(qū)的抗體可以在其C末端連接于整個(gè)免疫球蛋白重鏈或其部分，所述免疫 球蛋白重鏈來自任何抗體同種型，例如IgG、IgA、IgE和IgM以及任何同種型亞類。盡管本發(fā)明的抗體本身表明在預(yù)防癌癥細(xì)胞增殖中是有效的，但是它們另外可以 被功能性標(biāo)記物標(biāo)記。功能性標(biāo)記物包括設(shè)計(jì)靶向至癌癥部位以引起其破壞的物質(zhì)。此類 功能性標(biāo)記物包括毒素例如蓖麻毒素以及酶例如細(xì)菌性羧肽酶或硝基還原酶，它們能夠?qū)?前藥轉(zhuǎn)化為活性藥。另外，抗體可以連接或與化學(xué)治療性劑或毒性劑例如卡奇霉素或放射 性標(biāo)記物例如90Y或11結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體能夠抑制人腎上腺癌(SW-13)細(xì)胞的增殖至少 10%，其中所述抑制使用MTT細(xì)胞增殖測(cè)定法測(cè)量。優(yōu)選地，所述抗體能夠調(diào)節(jié)例如干擾 RAMP-3和CRLP的相互作用。典型地，所述抗體能夠抑制增殖至少12%。在一些實(shí)施方案中，所述抗體可以能夠 抑制增殖至少20%，任選地至少25%。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體可以能夠抑制增殖 至少30 %，任選地至少40 %。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)用腎上腺髓質(zhì)素刺激時(shí)，所述抗體能夠降低或抑制人MG63 骨肉瘤細(xì)胞中cAMP的產(chǎn)生至少約15%，例如至少15%、16%、17%、18%和19%。在一些 實(shí)施方案中，所述抗體可以能夠抑制cAMP產(chǎn)生至少約20 %，例如21 %、22 %或25 %。典型 地，所述抗體能夠調(diào)節(jié)RAMP-3和CRLP的相互作用。本發(fā)明的抗體可以通過化學(xué)合成全部或部分產(chǎn)生。所述抗體可以根據(jù)已經(jīng)很 好建立的標(biāo)準(zhǔn)液相或優(yōu)選固相肽合成方法容易地制備，所述方法的一般描述可廣泛地 獲得(參見例如 J. M. Stewart 和 J. D. Young, Solid Phase P印tideSynthesis，第 2 版， Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984) ；Μ. Bodanzsky 禾口 A. Bodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York(1984)；以及 Applied Biosystems 430A Users Manual, ABI Inc. , Foster City, California),或者它們可以通 過液相方法或通過固相、液相和溶液化學(xué)的任何組合，例如通過先完成相應(yīng)的肽部分，然后 如果需要和適宜，在去除存在的任何保護(hù)基后通過經(jīng)相應(yīng)的碳酸或磺酸或其活性衍生物的反應(yīng)引入殘基X來制備。制備根據(jù)本發(fā)明的抗體的另一方便方法是通過使用在表達(dá)系統(tǒng)中的核酸來表達(dá) 編碼其的核酸。本發(fā)明另外提供編碼本發(fā)明的抗體的分離的核酸。核酸包括DNA和RNA。在優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供編碼如上所定義的本發(fā)明的抗體的核酸。所述核酸的實(shí)例在la-d和 2a-d中顯示。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定仍提供本發(fā)明的抗體的此類核酸的取代、缺失和/ 或添力口。本發(fā)明還提供包含至少一種上述核酸的質(zhì)粒、載體、轉(zhuǎn)錄或表達(dá)盒形式的構(gòu)建體。 本發(fā)明還提供重組宿主細(xì)胞，其包含上述一種或多種構(gòu)建體。如上所述，編碼本發(fā)明的抗體 的核酸構(gòu)成本發(fā)明的一方面，制備抗體的方法也一樣，所述方法包括從編碼核酸的表達(dá)。表 達(dá)可以通過在適宜的條件下培養(yǎng)含有核酸的重組宿主細(xì)胞來獲得。表達(dá)產(chǎn)生后，可以使用 任何合適的技術(shù)分離和/或純化抗體，然后適宜時(shí)使用。用于在多種不同的宿主細(xì)胞中克隆和表達(dá)多肽的系統(tǒng)眾所周知。合適的宿主細(xì)胞 包括細(xì)菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母和桿狀病毒系統(tǒng)?，F(xiàn)有技術(shù)中可獲得的用于表達(dá)異源多肽的 哺乳動(dòng)物細(xì)胞系包括中國倉鼠卵巢細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、幼倉鼠腎細(xì)胞、NSO小鼠黑色素瘤細(xì)胞 等。常用的優(yōu)選細(xì)菌宿主是大腸桿菌。原核細(xì)胞例如大腸桿菌中抗體和抗體片段的表達(dá)在 本領(lǐng)域已很好地建立。綜述參考見例如Pluckthun，BiolTechnology 9 :545_551 (1991)。培 養(yǎng)物中真核細(xì)胞中的表達(dá)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言也可以獲得作為抗體生產(chǎn)的選擇，參見 最近綜述，例如 Reff, Curr. Opinion Biotech. 4 :573_576 (1993) ；Trill 等，Curr. Opinion Biotech. 6 :553_560(1995)?？梢赃x擇或構(gòu)建包含合適的調(diào)控序列的合適的載體，所述調(diào)控序列包含啟動(dòng)子序 列、終止子序列、聚腺苷酸化序列、增強(qiáng)子序列、標(biāo)記基因以及其他適宜的序列。適宜地，載體可以是質(zhì)粒，病毒，例如噬菌體或噬菌粒。進(jìn)一步詳細(xì)信息，參見例 如 Sambrook 等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual 第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)。用于操作核酸，例如制備核酸構(gòu)建體、誘變、測(cè)序、將DNA引入 細(xì)胞中以及基因表達(dá)和蛋白分析的多種已知技術(shù)和操作方案在Ausubel等編著，Short Protocols in Molecular Biology，第 2 版，John ffiley&Sons (1992)中已經(jīng)詳細(xì)描述。因此，本發(fā)明的另一方面提供含有本文公開的核酸的宿主細(xì)胞。另一方面提供包 括將所述核酸引入宿主細(xì)胞中的方法。所述引入可以采用任何可獲得的技術(shù)。對(duì)于真核細(xì) 胞，合適的技術(shù)可以包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-Dextran、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染以及使用 逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他病毒例如牛痘病毒或者用于昆蟲細(xì)胞的桿狀病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)。對(duì)于細(xì)菌細(xì) 胞，合適的技術(shù)可以包括氯化鈣轉(zhuǎn)化、電穿孔和使用細(xì)菌噬菌體的轉(zhuǎn)染。所述引入可以在引 起或允許核酸表達(dá)例如通過在基因表達(dá)條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞后進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸整合入宿主細(xì)胞的基因組(例如染色體)中。整 合可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過包含啟動(dòng)基因組重組的序列來促進(jìn)。本發(fā)明還提供包括在表達(dá)系統(tǒng)中使用如上所述構(gòu)建體以表達(dá)上述抗體或多肽的 方法。診斷方法本發(fā)明的抗體可以用于診斷人或動(dòng)物受試者中的腫瘤的方法中。
編碼RAMP的基因顯示在特定癌組織中表達(dá)增加。RAMP的表達(dá)可以在方法例如蛋白質(zhì)印跡、ELISA方法或組織學(xué)染色中使用本發(fā)明的抗體在組織或細(xì)胞中檢測(cè)。在使得形成 免疫復(fù)合物的條件下使來自受試者的組織的樣品(例如活檢樣品或血液樣品)與本發(fā)明的 抗體接觸。樣品中RAMP的存在或其量可以通過測(cè)定樣品是否與所述抗體結(jié)合來確定。以 此方法，可以進(jìn)行癌癥的診斷、癌癥的進(jìn)展或治愈的監(jiān)測(cè)，以及診斷的預(yù)測(cè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于檢測(cè)在生物樣品中腫瘤或炎癥性障礙存在的 方法，所述方法包括使所述生物樣品與本發(fā)明的抗體接觸并檢測(cè)相對(duì)于在陰性對(duì)照或在來 自正常健康受試者的生物樣品中檢測(cè)到的抗體結(jié)合而言抗體結(jié)合的增加的步驟。本發(fā)明還提供本發(fā)明的抗體在體內(nèi)診斷方法中的應(yīng)用。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā) 明提供用于檢測(cè)受試者中腫瘤或炎癥性障礙的存在的方法，所述方法包括給予所述受試者 本發(fā)明的抗體并檢測(cè)相對(duì)于在陰性對(duì)照或正常健康受試者中檢測(cè)到的抗體結(jié)合而言抗體 結(jié)合的增加的步驟。所述抗體可以被標(biāo)記或與其他分子綴合以輔助診斷性成像或其他檢測(cè)。例如，可 以制備123-碘放射性標(biāo)記抗體用于通過單光子發(fā)射斷層掃描和計(jì)算機(jī)斷層掃描(SPECT/ CT)閃爍掃描檢測(cè)。這些方法可以與其他診斷和成像技術(shù)組合，例如可以進(jìn)行18F-氟脫氧 葡糖(18FDG)正電子發(fā)射斷層掃描和計(jì)算機(jī)斷層掃描。這些技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言 是已知的，并在Birchler 等，Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Volume 136, Issue 4，Pages 543-548)中例示。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供監(jiān)測(cè)受試者中的治療方案的腫瘤或炎癥性障礙 的進(jìn)展的方法，所述方法包括從所述受試者分離生物樣品，使所述生物樣品和本發(fā)明的抗 體接觸，并檢測(cè)相對(duì)于陰性對(duì)照或來自正常健康受試者的生物樣品中檢測(cè)到的抗體結(jié)合相 比抗體結(jié)合的增加的步驟。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供監(jiān)測(cè)受試者中的治療方案的 腫瘤或炎癥性障礙的進(jìn)展的方法，所述方法包括給予所述受試者本發(fā)明的抗體并檢測(cè)相對(duì) 于陰性對(duì)照或正常健康受試者中檢測(cè)到的抗體結(jié)合而言抗體結(jié)合的增加的步驟。 要檢測(cè)的生物樣品可以包括來自受試者的任何組織例如活檢組織(例如來自例 如本文所描述的腫瘤的組織或體液(例如血液))。當(dāng)在診斷中使用時(shí)，抗體可以用可檢測(cè)的標(biāo)記物標(biāo)記，所述可檢測(cè)的標(biāo)記物例如 放射性標(biāo)記物例如I或99Tc，其可使用抗體成像領(lǐng)域中已知的常規(guī)化學(xué)與本發(fā)明的抗體連 接。標(biāo)記物還包括酶標(biāo)記物例如辣根過氧化物酶。標(biāo)記物還包括化學(xué)部分例如生物素，其 可以通過與特定的關(guān)聯(lián)的可檢測(cè)部分例如標(biāo)記的抗生物素蛋白結(jié)合來被檢測(cè)。產(chǎn)品、藥物組合物和治療性應(yīng)用本發(fā)明的抗體可以單獨(dú)給予或與其他治療組合同時(shí)或順序給予，這取決于要治療 的病癥。因此，本發(fā)明還提供產(chǎn)品，所述產(chǎn)品含有本發(fā)明的抗體和活性劑作為組合配制物用 于同時(shí)、分開或順序使用治療腫瘤?；钚詣┛梢园ɑ焺┗蚣?xì)胞毒性劑，包括5-氟尿嘧 啶、順鉬、絲裂霉素C、奧沙利鉬和他莫西芬，它們可以與本發(fā)明的抗體協(xié)同起作用。其他活 性劑可以包括合適劑量的止痛藥例如非留體抗炎藥(例如阿斯匹林、撲熱息痛、布洛芬或 酮洛芬)或鴉片類例如嗎啡或抗嘔吐藥。盡管不希望被理論所束縛，但是本發(fā)明的抗體與活性劑協(xié)同增強(qiáng)殺腫瘤能力可能 不是由于免疫效應(yīng)機(jī)制，而可能是抗體與細(xì)胞表面RAMP結(jié)合的直接結(jié)果。
本發(fā)明的抗體通常以藥物組合物的形式給予，所述藥物組合物除抗體外還可以包 含至少一種成分。除活性成分外，所述藥物組合物還可以包含藥學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋 齊U、載體、緩沖劑、穩(wěn)定劑或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他物質(zhì)。所述物質(zhì)應(yīng)該是無毒性的，并 且不應(yīng)干擾所述活性成分的效力。載體或其他物質(zhì)的精確性質(zhì)取決于給藥途徑，給藥途徑 可以是口服或注射，例如靜脈內(nèi)。設(shè)想通常途徑的全身注射(例如靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)或皮下注射)是治 療性給予所述組合物的主要途徑，但是局部注射或者通過導(dǎo)管或其他外科管的局部給藥也 可以使用，通過留置貯存微型泵或其他緩慢釋放裝置進(jìn)行的局部注射或輸注也可以使用。 局部給藥可以進(jìn)入含有靶組織的病理性組織或進(jìn)入含有靶組織的體腔中。這些腔的實(shí)例可 以包括腦室、滑膜關(guān)節(jié)或胸膜腔。液體制劑在從粉末制劑復(fù)制后可以使用。對(duì)于靜脈內(nèi)注射或在患病部位的注射，所述活性成分將是不含熱原且具有適宜的 PH、等張性和穩(wěn)定性的腸胃外可接受的含水溶液的形式。本領(lǐng)域相關(guān)的技術(shù)人員使用例如 等張載體例如氯化鈉注射液、林格注射液、乳酸鹽林格注射液能夠很好地制備合適的溶液。 如果需要，可以包含防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、抗氧化劑和/或其他添加劑。用于口服給藥的藥物組合物可以為片劑、膠囊劑、散劑或液體形式。片劑可以包含 固體載體例如凝膠或助劑。液體藥物組合物通常包含液體載體例如水、石油、動(dòng)物或植物 油、礦物油或合成油?？梢园睇}水溶液、葡萄糖或其他糖類溶液或二醇類例如乙二醇、丙二醇或 聚乙二醇。在所述制劑是液體的情況下，其可以例如是含有非磷酸鹽緩沖劑PH 6. 8-7. 6的 生理鹽溶液或凍干粉劑。所述組合物還可以經(jīng)微球、脂質(zhì)體、其他微顆粒遞送系統(tǒng)或緩釋制劑置于某些組 織包括血液中來給予。緩釋載體的合適實(shí)例包括共享品形式的半透性聚合物基質(zhì)，例如栓 劑或微膠囊?？芍踩牖蛭⒛z囊緩釋基質(zhì)包括聚交酯(美國專利3，773，919 ；EP-A-0058481)， L-谷氨酸和丫1^-谷氨酸乙酯共聚物(5丨(1111￡111等，8丨叩0171^1^ 22(1) :1985)，聚(2-羥基乙 基-甲基丙烯酸酯)或乙烯基乙酸乙烯酯(Langer等，J. Biomed. Mater. Res. 15 167-277， 1981，以及 Langer，Chem. Tech. 12 :98_105，1982)。通過眾所周知的方法:DE3.218，121A ；Epstein 等，PNAS USA,82 :3688_3692， 1985 ；Hwang 等，PNAS USA,77 :4030_4034，1980 ；EP-A-0052522 ；E-A-0036676 ； EP-A-0088046 ；EP-A-0143949 ；EP-A-0142541 JP-A-83-11808；美國專利 4,485, 045 和 4，544，545制備含多肽的脂質(zhì)體。 通常地，脂質(zhì)體是小(約200-800埃)單層類型，其中脂質(zhì)含量大于約30mol. %膽 固醇，所選的比例用于多肽滲漏的最適速率的調(diào)整。所述組合物可以以局部的方式給予腫瘤部位或其他期望的部位或者可以以靶向 腫瘤或其他細(xì)胞的方式遞送。所述組合物優(yōu)選以“治療有效量”給予個(gè)體，該治療有效量足以向所述個(gè)體顯示益 處。實(shí)際的給藥量以及給藥速率和時(shí)間-進(jìn)程取決于要治療的性質(zhì)和嚴(yán)重程度。治療的描 述，例如劑量的確定等在普通醫(yī)生以及其他醫(yī)務(wù)人員的職責(zé)內(nèi)，通?？紤]要治療的疾病、個(gè) 體患者的狀態(tài)、遞送的部位、給藥方法以及醫(yī)生所知的其他因素。本發(fā)明的組合物與存在的 腫瘤，特別是癌癥的治療以及在最初的治療或手術(shù)后這些病癥的復(fù)發(fā)的預(yù)防特別相關(guān)。以上提及的技術(shù)和方案的實(shí)例可以在Remington' s Pharmaceutical Sciences，第16版， Oslo, A. (ed)，1980 中找到。最適劑量可以由醫(yī)生基于多個(gè)參數(shù)包括例如年齡、性別、體重、要治療的病癥的嚴(yán)重程度、給予的活性成分以及給藥途徑來確定。一般而言，多肽和抗體的血清濃度使得受體 飽和是期望的。超過約0. InM的濃度通常是足夠的。例如，100mg/m的抗體劑量提供約8天 約20nM的血清濃度。組合物的劑量將取決于抗體的性質(zhì)，例如其結(jié)合活性以及體內(nèi)血漿半衰期、所述 制劑中多肽的濃度、給藥途徑、給藥部位和速率、所述患者臨床耐受性、患者贏患的病癥等， 這些在熟練醫(yī)生所知的范圍內(nèi)。本發(fā)明還涉及用于增強(qiáng)針對(duì)癌癥的保護(hù)性免疫應(yīng)答的最適 免疫方案。根據(jù)本發(fā)明的抗體或組合物可用于治療、延遲和/或預(yù)防增殖性障礙例如腫瘤至 例如抑制血管生成或癌細(xì)胞增殖。根據(jù)本發(fā)明要治療的腫瘤的具體實(shí)例包括肺、顱內(nèi)(包括腦)和皮膚腫瘤。優(yōu)選 顱內(nèi)腫瘤，例如腦腫瘤。肺腫瘤或癌癥可以分類為小細(xì)胞癌、腺癌、大細(xì)胞癌、細(xì)支氣管肺泡 癌、鱗癌以及良性腫瘤?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明治療任何肺腫瘤。皮膚腫瘤或癌可以分類為黑色 素瘤、口腔鱗癌和畸胎瘤。顱內(nèi)和腦腫瘤可以分類為膠質(zhì)瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、 垂體腺瘤、生長(zhǎng)激素瘤、催乳素瘤、腦膜瘤、星形細(xì)胞瘤以及脈絡(luò)叢癌。腎上腺腫瘤可以分類 為腎上腺皮質(zhì)癌、嗜鉻細(xì)胞瘤、醛固酮瘤。所述腫瘤可以是眼腫瘤。要治療的腫瘤可以選自骨肉瘤、腎上腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、前列腺腫瘤、乳房腫瘤 和間皮瘤。要治療的腫瘤可以是腦腫瘤，例如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤。要治療的腫瘤可以是腎上腺腫瘤，例如腎上腺皮質(zhì)癌。要治療的腫瘤可以是間皮瘤。要治療的腫瘤可以是骨腫瘤，例如骨肉瘤。要治療的腫瘤可以是前列腺腫瘤。要治療的腫瘤可以是乳房腫瘤。要治療的腫瘤可以是結(jié)腸腫瘤。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于治療腫瘤的本發(fā)明的抗體是RAMP (例如RAMP 3)拮抗劑。要治療的其他增殖性障礙可以包括過度角化。根據(jù)本發(fā)明的抗體或組合物可以用于治療、延遲和/或預(yù)防炎癥性障礙，例如 本文所定義的炎癥性障礙。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于治療炎癥性障礙的本發(fā)明的抗體是 RAMP (例如RAMP 3)拮抗劑。根據(jù)本發(fā)明的抗體或組合物可以用于治療、延遲和/或預(yù)防心血管病癥，例如促 進(jìn)血管生成和血管發(fā)生。心血管病癥的特定實(shí)例可以包括心臟衰竭、中風(fēng)(特別是中風(fēng)后 血管再形成)、冠心病、血管性疾病、心肌梗死(特別是心肌梗死后血管再形成)以及糖尿病 性血管病變，特別是視網(wǎng)膜病變。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于治療心血管病癥的本發(fā)明的抗體 是RAMP (例如RAMP 3)激動(dòng)劑。根據(jù)本發(fā)明的抗體或組合物還可以用于治療選自骨質(zhì)疏松、肥胖、膿毒癥和創(chuàng)傷 的病癥的治療。如本文所述，術(shù)語“創(chuàng)傷”包括潰瘍和損害，例如皮膚創(chuàng)傷如切傷或燒傷以 及與此相關(guān)的病癥。本發(fā)明的抗體或組合物可以用于刺激增殖和組織生長(zhǎng)例如通常的傷口愈合。這可以包括愈合促進(jìn)劑可能具有益處的手術(shù)后皮膚創(chuàng)傷的愈合，皮膚或組織缺失的 開放性皮膚創(chuàng)傷的愈合，由于糖尿病、床上休息患者的褥瘡或其他原因引起的潰瘍的愈合， 延遲組織修復(fù)例如骨折的延遲或不結(jié)合的愈合，有或沒有手術(shù)的損傷后軟骨和關(guān)節(jié)組織的 修復(fù)，腱損傷例如跟腱撕裂以及馬中的腱損傷的愈合。其他適應(yīng)癥將包括組織缺失例如骨 質(zhì)疏松發(fā)生的治療。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于治療高血壓、肥胖、創(chuàng)傷和骨質(zhì)疏松的本發(fā)明 的抗體是RAMP(例如RAMP 3)激動(dòng)劑。或者，用于治療骨質(zhì)疏松的抗體可以是RAMP(例如 RAMP 3)拮抗劑。 在本申請(qǐng)的整個(gè)說明書和權(quán)利要求書中，詞語“包括”和“包含”以及該詞語的不 同形式是指“包括但不限于”，不意欲(和不)排除其他部分、添加物、組分、整數(shù)或步驟。在本申請(qǐng)的整個(gè)說明書和權(quán)利要求書中，單數(shù)包括復(fù)數(shù)，除非上下文要求。特別 地，在使用不定冠詞的情況下，說明書要理解為涵蓋復(fù)數(shù)以及單數(shù)，除非上下文要求。與本發(fā)明特定方面、實(shí)施方案或?qū)嵤├嚓P(guān)描述的特征、整數(shù)、特點(diǎn)、化合物、化學(xué) 部分或基團(tuán)要理解為適用于本文描述的任何其他方面、實(shí)施方案或?qū)嵤├?，除非與此不相 容。圖la-d顯示單克隆抗RAMP 3抗體的重鏈可變區(qū)的核酸和氨基酸序列；圖2a_d顯示單克隆抗RAMP 3抗體的氫鏈可變區(qū)的核酸和氨基酸序列；圖3至6顯示單克隆抗RAMP 3抗體的重鏈的氨基酸序列；圖7至10顯示單克隆抗RAMP 3抗體的氫鏈的氨基酸序列；圖11為測(cè)試多克隆抗RAMP-3抗體的調(diào)節(jié)腎上腺髓質(zhì)素增加人MG63骨肉瘤細(xì)胞 中的cAMP的作用的能力。所有抗體降低腎上腺髓質(zhì)素的作用；圖12顯示單克隆抗體體外對(duì)SW-13細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。檢測(cè)單克隆抗RAMP-3抗體 誘導(dǎo)SW-13(腎上腺癌細(xì)胞)增殖抑制的能力。1 50濃度等于約5ng/孔終濃度；圖13顯示體外單克隆抗體HBlO對(duì)U87細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。腫瘤細(xì)胞以2000個(gè)細(xì) 胞接種在96孔板中，加入為2X 10-7的AM以及劑量范圍的抗體。作為對(duì)照，加入非哺乳動(dòng) 物IgG抗體。該治療方案每2天進(jìn)行一次。在第4天，制備細(xì)胞用于MTT測(cè)定ATTC。圖14顯示評(píng)價(jià)在不同濃度的抗體JF2存在下U-87成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系的增殖速 率的MTT測(cè)定(培養(yǎng)8天后)。圖15顯示評(píng)價(jià)在不同濃度的抗體JB3存在下U-87成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系的增殖速 率的MTT測(cè)定(培養(yǎng)8天后)。圖16顯示評(píng)價(jià)在不同濃度的抗體JB3存在下MDA-MB-436-GFP乳癌細(xì)胞系的增殖 速率的MTT測(cè)定(培養(yǎng)8天后)。圖17顯示評(píng)價(jià)在不同濃度的抗體JF2存在下MDA-MB-436-GFP乳癌細(xì)胞系的增殖 速率的MTT測(cè)定(培養(yǎng)8天后)。圖18顯示評(píng)價(jià)在10 μ g濃度的抗體JB3存在下PC_3前列腺癌細(xì)胞系的增殖速率 的MTT測(cè)定(培養(yǎng)8天后)。圖19顯示評(píng)價(jià)在10 μ g濃度的抗體JF2存在下PC_3前列腺癌細(xì)胞系的增殖速率 的MTT測(cè)定(培養(yǎng)8天后)。圖20顯示評(píng)價(jià)在10 μ g濃度的抗體JB3存在下SAOS骨肉瘤細(xì)胞系的增殖速率的 MTT測(cè)定(培養(yǎng)8天后)。
圖21顯示評(píng)價(jià)在10 μ g濃度的抗體JB3和JF2存在下HCTl 16結(jié)腸癌細(xì)胞系的增 殖速率的MTT測(cè)定(培養(yǎng)8天后)。圖22顯示評(píng)價(jià)在抗體JB3和JF2存在下U-87成膠質(zhì)細(xì)胞瘤癌細(xì)胞系中的 caspase-3標(biāo)記物的水平的凋亡測(cè)定。圖23顯示評(píng)價(jià)在抗體JB3和JF2存在下MDA-MB_436_GFP乳癌細(xì)胞系中的 caspase-3標(biāo)記物的水平的凋亡測(cè)定。圖24代表注射入⑶1裸鼠右肋腹中的MDA-MB-436-GFP的腫瘤體積，該OTl裸鼠 用JF2抗體和對(duì)照處理6周。圖25代表注射入⑶1裸鼠右肋腹中的MDA-MB-436-GFP的腫瘤重量，該OTl裸鼠 用JF2抗體和對(duì)照處理6周。圖26顯示注射入裸鼠右肋腹的MDA-MB-436-GFP癌細(xì)胞系的熒光性。圖27顯示處理6周后從裸鼠中去除的腫瘤的組織切片。實(shí)施例-本發(fā)明現(xiàn)將進(jìn)一步通過以下非限制性實(shí)施例進(jìn)行描述材料和方法RAMP胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)蛋白的產(chǎn)牛RAMP的ECD區(qū)通過使用來自Novagen Toyobo的KOD熱啟動(dòng)DNA聚合酶試劑盒進(jìn) 行高保真PCR反應(yīng)來產(chǎn)生。模板DNA從購買的人腦cDNA樣品(Ambion)獲得。該反應(yīng)進(jìn)行兩次，使用以下引物進(jìn)行第一次反應(yīng)以分離比整個(gè)RAMPE⑶更大的區(qū) 域RAMPl正向CGAGCGGACTCGACTCGGCAC反向CTTCCTAGGGTGGCGGTGGCCRAMP2正向GTC CGC CTC CTC CTT CT GCT反向AAG TGG AGT AAC ATG GTT ATT GTRAMP3
正向AGC CAT GGA GAC TGG AGC GCT GC反向GTG GCC CAG TAG CTG GAG ATT GGC第二次PCR反應(yīng)使用來自用以上引物進(jìn)行的反應(yīng)的產(chǎn)物。使用以下引物，這些引 物具有EcoRl和BamHl限制性位點(diǎn)插入其中RAMPl正向GCGAATTCCTGCCAGACCACCAG
反向GTGGATCCTACCGGGCCCGGGACARAMP2
正向GCG AAT TCA ATC CCC ACG AGG CCC TGG CTC AGC C反向CAG GAT CCTACA AGA GTG ATG AGG AAG GGG ATGRAMP3正向CAG AATT TCC AGA GCA GGC CGC TGC AAC CAG ACA G反向GTG GAT CCC ACC ACC AGG CCA GCC ATG GCG ACA GT進(jìn)行產(chǎn)物的基因組測(cè)序以確切檢測(cè)產(chǎn)品。從前面這點(diǎn)來看，E⑶蛋白稱做“插入 物”，除非另外指出。蛋白純化表達(dá)和純化ECD肽。該蛋白使用谷光甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)基因融合系統(tǒng)進(jìn)行純 化?？贵w產(chǎn)牛E⑶肽的抗體使用以下方案產(chǎn)生。小鼠和大鼠免疫方案進(jìn)行以下免疫方案產(chǎn)生針對(duì)RAMP-3胞外結(jié)構(gòu)域的抗體在免疫前從小鼠取免疫前血清。四只小鼠用相應(yīng)于RAMP-3胞外結(jié)構(gòu)域的肽注射102030405060GCPRAGGCNE TGMLERLPLC GKAFADMMGK VDVffKffCNLS EFIVYYESFT NCTEMEANW70809099GCYffPNPLAQ GFITGIHRQF FSNCTVDRVH LEDPPDEVL用4次另外的注射以大約每月的間隔進(jìn)行加強(qiáng)注射。取來自小鼠的樣品放血分 離含多克隆抗體的血清。使用的佐劑是弗氏佐劑(第一次注射弗氏完全佐劑，然后其余 期間用弗氏不完全佐劑)?？梢宰⑸鋰X動(dòng)物中的總體積是0. 2ml (對(duì)于小鼠優(yōu)選不超過 0. Iml)。其一半是抗原，一半是佐劑，因此抗原應(yīng)該是足夠濃度的以提供所要求的最大注射 0. Iml或0. 05ml的毫克數(shù)。蛋白質(zhì)印跡方案使用抗體的蛋白質(zhì)印跡探測(cè)原E⑶肽的印跡，與分子大小標(biāo)記物以雙份重復(fù)泳道 跑電泳?？贵w1和2顯示與在14KDa預(yù)期大小處的蛋白帶的清楚結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)?？?體3顯示在相同大小處的非常強(qiáng)的結(jié)合，而AB4在該實(shí)驗(yàn)中沒有檢測(cè)到(數(shù)據(jù)未顯示)?？贵w阻斷可能性為檢測(cè)抗體與RAMP結(jié)合的能力，進(jìn)行測(cè)定以確定抗體的阻斷可能性 用IOpmol AM處理人MG63骨肉瘤細(xì)胞，測(cè)定cAMP反應(yīng)(方法如以上所述，例如使 用 cAMP 熒光偏振(FP)Biotrak 免疫測(cè)定法(AmershamBiosciences))。(如果檢測(cè) RAMP-I試劑，則該測(cè)定法還可以使用CGRP作為配體進(jìn)行以檢測(cè)該試劑的阻斷能力)·所述細(xì)胞用抗體預(yù)處理1小時(shí)·施用AM的EC5tl劑量(IOpmol)，并測(cè)定cAMP反應(yīng)。
使用多克隆檢測(cè)它們調(diào)節(jié)腎上腺髓質(zhì)素增加人MG63骨肉瘤細(xì)胞中cAMP的作用的 能力。單克降抗體產(chǎn)牛使用第3只小鼠制備單克隆抗體。該用于制備單克隆抗體的方法已經(jīng)被Kohler和 Milstein 在 Nature 256,495-497(1975)中公開，還被在 Schwartz 編輯的 Compendium of Immunology V. II, 1981 中的 Donillard 禾口 Hoffman, “ BasicFacts about Hybridomas“ 所公開，這些文獻(xiàn)引入本文作為參考。篩選克隆并基于不與肽上的GST標(biāo)簽結(jié)合來選擇。在這些克隆中，獲得ELISA數(shù) 據(jù)，選出最好的5個(gè)用于進(jìn)一步的工作?？贵w同種型使用同種型試劑盒IsoStrip (Roche Diagnostics GmbH)測(cè)定單克隆抗體的同種 型的特征。所述單克隆抗體的同種型如下CD12-IgG-IgGl 亞型HBlO-IgG-IgGl 亞型JF2-IgG_IgGl 亞型JB3-IgMCC2-IgA增殖測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)在無菌條件下在Nimclon處理的組織培養(yǎng)塑料物上進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。用于該項(xiàng)目的 U-87成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞(ATCC noHTB-14)在具有10%胎牛血清(Gibco)和5%青霉素/鏈 霉素抗生素(Sigma)的標(biāo)準(zhǔn)EMEM(Earle極限必需培養(yǎng)基)培養(yǎng)基(Gibco)中培養(yǎng)。凍存 的細(xì)胞在37°C下解凍2分鐘。然后細(xì)胞立即轉(zhuǎn)移至具有IOml培養(yǎng)基的75cm2瓶中。培養(yǎng) 物在37°C和5% CO2下培養(yǎng)以達(dá)到匯合。培養(yǎng)基每三天更換，然后細(xì)胞在達(dá)到80-90%匯合 后傳代培養(yǎng)。細(xì)胞用PBS(Gibco)洗滌以去除血清的存在，因?yàn)檠宕嬖谧鳛橐鹊鞍酌傅囊?制劑起作用。加入3mll0%胰蛋白酶EDTA(Sigma)以從瓶上移去細(xì)胞層。允許胰蛋白酶化 在37°C下發(fā)生15分鐘以有利于分散。在顯微鏡下觀察瓶以確認(rèn)細(xì)胞與瓶分離。將6-8ml 培養(yǎng)液加入瓶中并輕輕吸出細(xì)胞。將細(xì)胞以IOOOrpm離心3分鐘，并去除上清液，將得到的 細(xì)胞小丸重懸于Iml培養(yǎng)基中，并以1 6比例傳代培養(yǎng)入適宜數(shù)量的瓶中(對(duì)于細(xì)胞培 養(yǎng)材料參考附錄la)。培養(yǎng)板的制備在標(biāo)準(zhǔn)條件(如上所述)下培養(yǎng)U87成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞。使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板 (Hawksley)計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)，并使用以下等式計(jì)算濃度平均細(xì)胞計(jì)數(shù)(5平方) 總細(xì)胞計(jì)It/ml = --將細(xì)胞濃度調(diào)整到2000個(gè)細(xì)胞/50 μ 1。將以上細(xì)胞配制物50 μ 1接種在透明的96孔板(Costar，polystyrene, Flatbottom)中。實(shí)驗(yàn)條件對(duì)各抗體進(jìn)行兩組增殖研究。一組用于研究在內(nèi)源性腎上腺髓質(zhì)素存在下抗體對(duì) 增殖的作用，而另一組用于研究在外源添加的腎上腺髓質(zhì)素的存在下抗體的作用。在PBS 中制備不同濃度的抗體以獲得孔終濃度為10 μ g、1 μ g、lOOng、10ng、lng、100pg、IOpg和 Ipg0每個(gè)抗體的每種濃度進(jìn)行重復(fù)6次。在兩組中均使用該劑量范圍。將腎上腺髓質(zhì)素 加入適宜組中至孔終濃度為200nM。使用5-氟尿嘧啶(Fluka)作為用于增殖降低的陽性對(duì) 照(IOOmM)。還制備PBS對(duì)照。然后將培養(yǎng)板在標(biāo)準(zhǔn)條件下孵育。每2天進(jìn)行抗體和對(duì)照 的更換和再給藥。還以類似的方式計(jì)算小鼠抗GST抗體濃度反應(yīng)，因?yàn)槠涫菍?shí)驗(yàn)的抗體對(duì) 照。測(cè)定程序?yàn)闄z測(cè)接種的細(xì)胞的一致性，進(jìn)行12-24小時(shí)研究。在2、4、6和8天進(jìn)行另外的 時(shí)間點(diǎn)。用于進(jìn)行增殖測(cè)定的試劑盒是MTT細(xì)胞增殖測(cè)定(ATCC)。在各時(shí)間點(diǎn)，將10μ1 MTT試劑加入所有的孔中，保持在37°C下孵育2小時(shí)。2小時(shí)后，將100μ 1 MTT去污劑加入 孔中，孵育過夜并避光搖動(dòng)。在595nM(Spectramax M5e)處使用軟件softmax Pro 5. 2. X 100035讀板的吸光度。使用MTT測(cè)定法(關(guān)于該測(cè)定法的細(xì)節(jié)參見www. lRcpromochem-atcc. com)測(cè)定 Sff-13和U87 (成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系)細(xì)胞的增殖/存活。凋亡測(cè)定使用Caspase-3測(cè)定試劑盒(Sigma)進(jìn)行凋亡測(cè)定。(關(guān)于所要求的材料參考附 錄Ic)細(xì)胞制備在標(biāo)準(zhǔn)條件下制備U-87細(xì)胞。將2 X IO7細(xì)胞的細(xì)胞溶液制在2ml培養(yǎng)基中，懸 浮在聚丙烯管中。實(shí)驗(yàn)條件各處理用2 X IO7細(xì)胞。治療組為抗體處理的細(xì)胞(各抗體)、抗Fas抗體、抗體和 腎上腺髓質(zhì)素處理的細(xì)胞、空白和腎上腺髓質(zhì)素處理的細(xì)胞。陽性對(duì)照是抗Fas單克隆抗 體(MBL)。使用的抗體終濃度是10g，而對(duì)于抗Fas抗體是500ng?？笷as抗體是IgM抗體， 具有溶細(xì)胞活性，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。將在2ml培養(yǎng)基中的處理的細(xì)胞懸浮液在37°C和5% CO2氣氛下孵育3小時(shí)。測(cè)定程序
根據(jù)在所述方案中給出的標(biāo)準(zhǔn)說明使用17兆歐姆水制備試劑盒中給出的測(cè)定緩 沖液和裂解緩沖液。孵育3小時(shí)后，將細(xì)胞在4°C下以600g離心5分鐘。丟棄懸浮液，并將 細(xì)胞重懸于Iml PBS中。使用上述條件再離心細(xì)胞一次，丟棄懸浮液。將細(xì)胞小丸重懸于 200 μ 1 Ix裂解緩沖液中，并在冰上孵育20分鐘。將裂解的細(xì)胞在4°C下以20，OOOg離心15分鐘。然后，如圖6中所示，將細(xì)胞裂解物放置在96孔平底培養(yǎng)板中，并培養(yǎng)過夜。使用軟件 softmax Pro 5. 2. 36，在 405nm(Spectramax M5e)處讀取吸光度。動(dòng)物研究用于異種移植的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)將MDA-MB-436-GFP細(xì)胞在含有青霉素(50U/ml)、鏈霉素(50 μ g/ml)、谷氨酰胺 (lmg/ml)并補(bǔ)充有10%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細(xì)胞在濕度5% C02/95%空氣氣 氛下培養(yǎng)，每2天給一次新鮮血清，常規(guī)監(jiān)測(cè)支原體污染。使用胰蛋白酶EDAT溶液收集對(duì) 數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞。所有培養(yǎng)基成分購買自Invitrogen Life Technologies。動(dòng)物條件動(dòng)物工作在謝菲爾德大學(xué)的動(dòng)物設(shè)施中進(jìn)行。使用雄性4至5周齡CDl裸鼠(nu/ nu)。小鼠適應(yīng)環(huán)境，并在溫度控制的房間中在層流凈化罩下在無菌的籠子里各組四個(gè)或更 少進(jìn)行豢養(yǎng)，12小時(shí)光/12小時(shí)黑暗的時(shí)間表，并喂以高壓消毒的食品以及自由飲水。治療和異種移植⑶1 (nu/nu)裸鼠用MDA-MB_436_GFP乳癌細(xì)胞植入。為細(xì)胞植入，在培養(yǎng)基中培 養(yǎng)的MDA-MB-436-GFP用PBS洗滌，分散在0.05%的胰蛋白酶溶液中并重懸。離心(在8°C 下，1000rpm，3分鐘)后，將細(xì)胞小丸重懸在PBS中，調(diào)整終濃度至3X IO7個(gè)細(xì)胞/ml，并將 懸浮液置于冰上。將部位用乙醇清潔后，將0. Iml (0. 5 X IO6個(gè)細(xì)胞)懸浮液皮下注射入裸 鼠的右肋腹。用數(shù)字游標(biāo)卡尺(部位)測(cè)量腫瘤，使用公式寬X長(zhǎng)X高X0. 52(對(duì)于橢圓 形)確定腫瘤體積，這些測(cè)量每周兩次。允許腫瘤發(fā)展21天，隨機(jī)地將動(dòng)物分成三組。一 組(η = 8)每周的每星期二和星期五接受腹膜內(nèi)注射作為于PBS中的體積為0. 2ml的懸浮 液的JB3抗體(200 μ g純化的IgG)。作為對(duì)照，一組(n = 8)接受無關(guān)抗體(相同同種型 的IgG，該抗體的滅火形式)，而另一組(η = 8)接受相當(dāng)?shù)膯为?dú)載體(PBS)注射。在所示 的時(shí)間進(jìn)行方案1。腫瘤切片麻醉后從小鼠切除腫瘤，并固定在10%福爾馬林鹽水溶液中。將腫瘤切片包埋在 石蠟中(標(biāo)準(zhǔn)操作方案)。過整個(gè)腫瘤體以5μπι進(jìn)行切片。各個(gè)標(biāo)本切片用蘇木精和曙紅 (Η&Ε)染色，并用玻璃蓋玻片固定。MM測(cè)試的所有多克隆抗體降低了腎上腺髓質(zhì)素對(duì)cAMP產(chǎn)生的作用。在圖11中顯示 的結(jié)果表明針對(duì)RAMP-3產(chǎn)生的多克隆抗體抑制MG63細(xì)胞cAMP產(chǎn)生至少15%。產(chǎn)生的各單克隆抗體誘導(dǎo)SW-13細(xì)胞的增殖抑制在12-45 %范圍內(nèi)，參見圖 12 (1 50的濃度等于約5毫微克/孔的終濃度)。測(cè)試的單克隆抗體之一 HBlO增加U87細(xì)胞的增殖(參見圖13)。隨抗體的劑量增 力口，吸光度的水平亦增加，因此對(duì)于增殖水平表明該抗體的激動(dòng)劑作用。圖14顯示評(píng)價(jià)在不同濃度的抗體JF2存在下U-87成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系的增殖速 率的MTT測(cè)定(培養(yǎng)8天后)。與對(duì)照相比，10 μ g劑量的抗體JF2產(chǎn)生增殖的顯著降低， 這代表增殖40%的降低。圖15顯示評(píng)價(jià)在不同濃度的抗體JB3存在下U-87成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系的增殖速 率的MTT測(cè)定(培養(yǎng)8天后)。
與對(duì)照相比，所有劑量的抗體JB3產(chǎn)生增殖的顯著降低，這代表所有劑量下增殖 35%的降低。這表明EC50低于Ipg。圖16顯示評(píng)價(jià)在不同濃度的抗體JB3存在下MDA-MB_436_GFP乳癌細(xì)胞系的增殖 速率的MTT測(cè)定(培養(yǎng)8天后)。與對(duì)照相比，所有劑量的抗體JB3產(chǎn)生增殖的顯著降低， 不過沒有觀察到劑量反應(yīng)。IOng產(chǎn)生29%的最大降低，不過該反應(yīng)與其他治療組沒有顯著差異。圖17顯示評(píng)價(jià)在不同濃度的抗體JF2存在下MDA-MB_436_GFP乳癌細(xì)胞系的增殖 速率的MTT測(cè)定(培養(yǎng)8天后)。與對(duì)照相比，劑量1 μ g和10 μ g的抗體JF2產(chǎn)生增殖的 顯著降低。IOyg產(chǎn)生12%的最大降低。圖18顯示評(píng)價(jià)在10 μ g濃度的抗體JB3存在下PC_3前列腺癌細(xì)胞系的增殖速率 的MTT測(cè)定(培養(yǎng)8天后)。與對(duì)照相比，劑量IOyg的抗體JB3在外源性添加的腎上腺髓 質(zhì)素存在或不存在下均產(chǎn)生增殖的顯著降低。IOyg產(chǎn)生57%的增殖降低。圖19顯示評(píng)價(jià)在10 μ g濃度的抗體JF2存在下PC_3前列腺癌細(xì)胞系的增殖速率 的MTT測(cè)定(培養(yǎng)8天后)。與對(duì)照相比，劑量IOyg的抗體JF3在外源性添加的腎上腺髓 質(zhì)素存在或不存在下均產(chǎn)生增殖的顯著降低。10 μ gJF2在腎上腺髓質(zhì)素存在下產(chǎn)生37% 的增殖降低，而在外源性添加的腎上腺髓質(zhì)素不存在下產(chǎn)生22 %降低。圖20顯示評(píng)價(jià)在10 μ g濃度的抗體JB3存在下SAOS骨肉瘤細(xì)胞系的增殖速率的 MTT測(cè)定(培養(yǎng)8天后)。與對(duì)照相比，劑量IOyg的抗體JF3在外源性添加的腎上腺髓質(zhì) 素存在下產(chǎn)生增殖的顯著降低，但是在外源性添加的腎上腺髓質(zhì)素不存在下沒有觀察到顯 著的降低。IOyg JB3在腎上腺髓質(zhì)素存在下產(chǎn)生34%的增殖降低。圖21顯示評(píng)價(jià)在10 μ g濃度的抗體JB3和JF2存在下HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞系的增 殖速率的MTT測(cè)定(培養(yǎng)8天后)。與對(duì)照相比，劑量IOyg的抗體JB3產(chǎn)生增殖的顯著 降低，不過JF2沒有產(chǎn)生增殖的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著降低。10μ gJB3在腎上腺髓質(zhì)素存在下產(chǎn)生 27%的增殖降低。圖22代表凋亡的水平，通過測(cè)量caspase-3凋亡標(biāo)記物的水平進(jìn)行。在10 μ g濃 度的抗體JB3和JF2存在下U-87成膠質(zhì)細(xì)胞瘤癌細(xì)胞系均顯示caspase-3水平的顯著增 加以及它們對(duì)于凋亡。治療組代表caspase-3的26%增加水平。圖23代表凋亡的水平，通過測(cè)量caspase-3凋亡標(biāo)記物的水平進(jìn)行。在10 μ g濃 度的抗體JB3和JF2存在下MDA-MB-436-GFP乳癌細(xì)胞系，僅JB3顯示caspase-3水平的顯 著增加以及它們對(duì)于凋亡。JB3治療組代表caspase-3的59%增加水平。圖24代表注射入⑶1裸鼠右肋腹中的MDA-MB-436-GFP的腫瘤體積，該OTl裸鼠 用JF2抗體和對(duì)照處理6周。對(duì)照組均顯示在3周后大的腫瘤體積增加，而在治療組的生 長(zhǎng)速率相當(dāng)大地減慢。在對(duì)照組中的誤差棒在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中均是大的，而治療組中誤差始終 是小的。圖25代表注射入⑶1裸鼠右肋腹中MDA-MB-436-GFP的腫瘤重量，該OTl裸鼠用 JF2抗體和對(duì)照處理6周。在死后稱取腫瘤重量，并使用腫瘤體積計(jì)算回去。對(duì)照組顯示從 最初的時(shí)間點(diǎn)重量就增加，而治療組顯示較緩慢的增加直至4周重量增加，不過仍是低于 對(duì)照組。圖26顯示注射入裸鼠右肋腹的MDA-MB-436-GFP癌細(xì)胞系的熒光性。
圖27顯示處理6周后從裸鼠中去除的腫瘤的組織切片。切片用H&E染色，這些圖 片是腫瘤的代表。 在對(duì)照組中，較多的血管是可見的(紅色箭頭)，而較少面積的壞死細(xì)胞。 在治療組中有較少的血管以及大面積的壞死前細(xì)胞，由上面的黃色環(huán)表示。
權(quán)利要求
一種分離的抗體，所述抗體能夠結(jié)合CRLR的受體活性修飾蛋白(RAMP)，該抗體是IgG、IgA或IgM同種型。
2.權(quán)利要求1所述的抗體，其中所述抗體是IgG同種型。
3.權(quán)利要求1所述的抗體，其中所述抗體是IgA同種型。
4.權(quán)利要求1所述的抗體，其中所述抗體是IgM同種型。
5.任一前述權(quán)利要求1所述的抗體，其中所述抗體能夠結(jié)合RAMP1、RAMP2或RAMP3。
6.權(quán)利要求5所述的抗體，其中所述抗體能夠結(jié)合RAMP3。
7.任一前述權(quán)利要求所述的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
8.任一前述權(quán)利要求所述的抗體，其中所述抗體是RAMP拮抗劑。
9.權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體是RAMP激動(dòng)劑。
10.一種分離的抗體，所述抗體能夠結(jié)合CRLR受體的受體活性修飾蛋白(RAMP)，該抗 體包含選自以下的結(jié)合結(jié)構(gòu)域i)包含基本上由圖Ia中所示序列代表的氨基酸序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域； )包含基本上由圖Ib中所示序列代表的氨基酸序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域；iii)包含基本上由圖Ic中所示序列代表的氨基酸序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和iv)包含基本上由圖Id中所示序列代表的氨基酸序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
11.權(quán)利要求10所述的抗體，其中所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域或各結(jié)合結(jié)構(gòu)域由人抗體骨架負(fù)載。
12.—種分離的抗體，所述抗體能夠結(jié)合CRLR受體的受體活性修飾蛋白(RAMP)，該抗 體包含選自以下的結(jié)合結(jié)構(gòu)域i)包含基本上由圖2a中所示序列代表的氨基酸序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域； )包含基本上由圖2b中所示序列代表的氨基酸序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域；iii)包含基本上由圖2c中所示序列代表的氨基酸序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和iv)包含基本上由圖2d中所示序列代表的氨基酸序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
13.權(quán)利要求12所述的抗體，其中所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域或各結(jié)合結(jié)構(gòu)域由人抗體骨架負(fù)載。
14.一種抗體，其包含相互結(jié)合的權(quán)利要求10或11中任一項(xiàng)所述的抗體和權(quán)利要求 12或13中任一項(xiàng)所述的抗體。
15.一種分離的抗體，所述抗體能夠結(jié)合CRLR的受體活性修飾蛋白，該抗體包含以下 結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或者兩個(gè)i)包含基本上由圖Ia中所示序列代表的氨基酸序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和/或 )包含基本上由圖2a中所示序列代表的氨基酸序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
16.一種分離的抗體，所述抗體能夠結(jié)合CRLR的受體活性修飾蛋白，該抗體包含以下 結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或者兩個(gè)i)包含基本上由圖Ib中所示序列代表的氨基酸序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和/或 )包含基本上由圖2b中所示序列代表的氨基酸序列的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
17.權(quán)利要求15或16中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域或各結(jié)合結(jié)構(gòu)域由人 抗體骨架負(fù)載。
18.任一前述項(xiàng)權(quán)利要求所述的抗體，該抗體用于醫(yī)藥。
19.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)所述的抗體和藥學(xué)上可接受的 賦形劑、稀釋劑、載體、緩沖劑或穩(wěn)定劑。
20.一種用于治療患者的腫瘤的方法，所述方法包括給予所述患者有效量的權(quán)利要求 1至17中任一項(xiàng)所述的抗體。
21.權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)所述的抗體在制備用于治療腫瘤的藥物中的用途。
22.權(quán)利要求20所述的方法或權(quán)利要求21所述的用途，其中所述腫瘤選自骨肉瘤、腎 上腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、前列腺腫瘤、乳房腫瘤、結(jié)腸腫瘤和間皮瘤。
23.權(quán)利要求22所述的方法或用途，其中所述顱內(nèi)腫瘤是成膠質(zhì)細(xì)胞瘤。
24.權(quán)利要求22所述的方法或用途，其中所述腫瘤是腎上腺癌。
25.權(quán)利要求22所述的方法或用途，其中所述腫瘤是間皮瘤。
26.權(quán)利要求22所述的方法或用途，其中所述腫瘤是骨腫瘤。
27.權(quán)利要求26所述的方法或用途，其中所述骨腫瘤是骨肉瘤。
28.權(quán)利要求26所述的方法或用途，其中所述腫瘤是前列腺腫瘤。
29.權(quán)利要求26所述的方法或用途，其中所述腫瘤是乳房腫瘤。
30.權(quán)利要求26所述的方法或用途，其中所述腫瘤是結(jié)腸腫瘤。
31.權(quán)利要求22至30中任一項(xiàng)所述的方法或用途，其中所述抗體如權(quán)利要求1至8中 任一項(xiàng)所述。
32.—種產(chǎn)品，其包含權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)所述的抗體和活性劑作為組合配制物 用于同時(shí)、分開或順序治療腫瘤的用途。
33.一種用于治療患者的炎癥性障礙的方法，所述方法包括給予所述患者有效量的權(quán) 利要求1至17中任一項(xiàng)所述的抗體。
34.權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)所述的抗體在制備用于治療炎癥性障礙的藥物中的用途。
35.一種用于治療患者的心血管病癥的方法，所述方法包括給予所述患者有效量的權(quán) 利要求1至17中任一項(xiàng)所述的抗體。
36.權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)所述的抗體在制備用于治療心血管病癥的藥物中的用途。
37.一種用于治療患者的骨質(zhì)疏松的方法，所述方法包括給予所述患者有效量的權(quán)利 要求1至17中任一項(xiàng)所述的抗體。
38.權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)所述的抗體在制備用于治療骨質(zhì)疏松的藥物中的用途。
39.一種核酸，其編碼權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)所述的抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供能夠結(jié)合CRLR受體的受體活性修飾蛋白(RAMP)的分離的抗體，該抗體是IgG、IgA或IgM同種型。
文檔編號(hào)A61P29/00GK101842390SQ200880013626
公開日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2008年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月25日
發(fā)明者G·O·理查德, T·M·斯佩里 申請(qǐng)人:麥迪樂醫(yī)療有限公司