專利名稱：：基質(zhì)金屬蛋白酶-10(mmp-10)用于血栓溶解治療的用途的制作方法基質(zhì)金屬蛋白酶-10(MMP-10)用于血栓溶解治療的用途發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及包含基質(zhì)金屬蛋白酶-10(MMP10)且更具體地為MMP-10及纖溶酶原激活劑組合的藥物組合物及其用于血栓溶解療法和治療的用途。現(xiàn)有技術(shù)止血系統(tǒng)是負(fù)責(zé)維持循環(huán)流并防止因血管發(fā)病而出血的系統(tǒng)。生理止血同時(shí)受促進(jìn)凝血和纖維蛋白形成以及促成其降解或纖維蛋白溶解兩種機(jī)制控制。凝血的過分激活或纖維蛋白溶解的缺陷引起阻塞血管的血塊形成(血管內(nèi)血栓形成)，導(dǎo)致缺血和壞死。然而，纖溶亢進(jìn)的總體情形將促成出血。具有動脈血栓形成性質(zhì)的心血管病是當(dāng)今病死的主要原因。在該組疾病范圍內(nèi)，血栓形成過程是發(fā)生主要臨床重大急性心血管事件例如急性心肌梗死(MI)或腦血管意外(中風(fēng))的主要機(jī)制。因此，一般來說，用于治療腦血管意外和血栓性事件的所有策略必須促使受血塊阻塞的動脈通道重新通暢(reroute),從而恢復(fù)血流流向組織，由此防止任何更大的損傷。這通常稱為血栓溶解治療。已知纖維蛋白溶解是血栓溶解的基本生化過程，血栓溶解治療首先尋求促進(jìn)將血塊網(wǎng)羅在一起的纖維蛋白網(wǎng)的降解。已知纖維蛋白溶酶是催化纖維蛋白溶解和降解的酶，完成快速溶解血塊的第一目標(biāo)就是使纖維蛋白溶酶產(chǎn)生最大化。為此目的，在1980年就提出了能夠激活纖維蛋白溶酶原(無活性的酶原)轉(zhuǎn)化為活性纖維蛋白溶酶的如下纖溶酶原激活劑的用途組織纖溶酶原激活劑(tPA)、尿激酶纖溶酶原激活劑(uPA)或其它相似激活劑。Baker[Clin.Appl.Thrombosis/Hemostasis,2002;8:291-314]對血栓溶解治療現(xiàn)有技術(shù)和溶血栓劑的使用或進(jìn)展、其臨床應(yīng)用以及優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了綜述。Baker還在該文中列出理想的溶血栓劑應(yīng)該具有的特點(diǎn)l)快速起作用的血栓溶解，以快速恢復(fù)動脈或靜脈血流；2)纖維蛋白特異性，以便纖維蛋白溶解僅局限于系統(tǒng)纖維蛋白溶解下降的急性血栓區(qū)域；3)作用時(shí)間持久；4)血塊特異性，以防止對纖維蛋白原、涉及凝血的其它蛋白產(chǎn)生影響，且不改變初期止血(primaryhemostasis);5)無副4乍用；和6)4氐成本。在急性心肌梗死和急性腦血管缺血(中風(fēng))情況下，血栓溶解治療的成功使得患者存活率提高，并使得缺血組織功能更好地恢復(fù)[WhiteHD等；N.Engl.J.Med"1987;317:850-855];[SuwanwelaN和KoroshetzWJ;Annu.Rev.Med.,2007;58:89-106]。不幸的是，纖維蛋白溶解治療并未取得成功而且有副作用。幾乎40%的急性心肌梗死患者不響應(yīng)纖維蛋白溶解治療，因而其不能實(shí)現(xiàn)最佳地使血栓阻塞的動脈重新通暢[ArmstrongPW和CollenD;Circulation,2001;103:2862-2866]。為了解決該問題，目前用初期經(jīng)皮血管成形術(shù)(primarypercutaneousangi叩lasty)來代替藥物血栓溶解，因?yàn)榫徒档退劳雎省⒃俟Ｈ统鲅?，再灌注治療比血栓溶解治療更有效。然而，在很多情況下不可能使用血管成形術(shù)(沒有可用的血液動力學(xué)實(shí)驗(yàn)室或地理距離太遠(yuǎn))，那么就要進(jìn)行血栓溶解治療。因此，期望開發(fā)使改進(jìn)血栓溶解療效成為可能的新的治療策略，例如，入院前的纖維蛋白溶解治療、新的溶血栓劑(替奈普酶(tenecteplase))或新的藥物組合(即將纖溶劑降低到一半劑量并增加GPnb/IIIa血小板受體阻滯劑[BrouwerMA等，Heart,2004;90:581-588])。由于出血并發(fā)癥(尤其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)出血和大出血(majorhemorrhage))，因而還存在與纖維蛋白溶解治療有關(guān)的相當(dāng)高的死亡率，死亡率為2%-14%。在急性腦血管缺血情況下，在癥狀發(fā)作后的頭3個(gè)小時(shí)內(nèi)用重組tPA進(jìn)行血栓溶解治療是唯一經(jīng)證明其本身有一定效果的方案。不幸的是，在25%-30%病例中該治療不成功，血塊不能溶解，被阻塞的動脈不能通透。另外，tPA治療具有很高的出血并發(fā)癥百分率(高達(dá)5%會引起癥狀性出血)，很多醫(yī)生都擔(dān)心這種并發(fā)癥。由于該原因，大部分原本能受益于該治療的患者不能接受該治療。與給予tPA有關(guān)的另一問題潛在地比出血風(fēng)險(xiǎn)更嚴(yán)重，那就是對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性，這多次成為治療失敗的原因[ChengT.等，Nat.Med.，2006;12:1278、1285]。因此，降低給予tPA的出血風(fēng)險(xiǎn)能改變對該藥安全性的理解并增加其用途。因此，仍有必要繼續(xù)選擇有可能通過降低治療中風(fēng)所需劑量來直接或間接降低tPA毒性的治療劑和組合。已知存在可直接降解纖維蛋白原和纖維蛋白的不同于纖維蛋白溶酶的酶，還對它們用于血栓溶解治療的潛在用途進(jìn)行了研究。這些酶包括白細(xì)胞內(nèi)源性蛋白酶(彈性蛋白酶和組織蛋白酶G)、蛇毒蛋白酶或水蛭蛋白酶或來自某些細(xì)菌的蛋白酶。在EP1060747中，闡述了纖溶性基質(zhì)金屬蛋白酶的用途，該酶對于蛋白水解性裂解和降解纖維蛋白和纖維蛋白原表現(xiàn)出顯著活性。這些纖溶性金屬蛋白酶包括MMP-2(明膠酶A)、MMP-3(溶基質(zhì)蛋白酶l(stromelysinl))、MMP-7(溶基質(zhì)蛋白(matrilysin))、MMP-9和非常獨(dú)特的膜型基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-MT1。幾個(gè)月后，Bini等匯編并進(jìn)一步闡述了這些相同的發(fā)現(xiàn)[Biochemistry，1999;38:13928-13936]。然而，在這些和以后的其它著述中都沒有提供有關(guān)這些纖溶性基質(zhì)金屬蛋白酶在溶解和降解形成血栓的纖維蛋白方面的有效性的資料，所述有效性是指用于更快速地溶解血塊，或甚至用于對降解涉及系統(tǒng)纖維蛋白原的血塊中的纖維蛋白提供更大的選擇性。本發(fā)明目的是提供用于血栓溶解治療的備選治療組合物和組合，它們借助于選擇性降解纖維蛋白來促進(jìn)血塊溶解，并有助于使與其它血栓溶解治療有關(guān)的副作用(出血、毒性等)最小化。附圖筒述圖l.以405nm處的吸光率值與以分鐘記的實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間比較來給出復(fù)鈣血漿(recalifiedplasma)濁度試驗(yàn)。A:曲線圖顯示單獨(dú)血漿(對照)血塊形成(最大吸光率)或在MMP-10(200nM)或MMP-3(200nM)存在下血塊形成的差異。B:曲線圖描繪復(fù)鈣血漿在以下情況下纖維蛋白血塊的形成和溶解存在單獨(dú)的或與MMP-10(200nM)聯(lián)合的tPA纖溶酶原激活劑(30U/ml)和uPA(135U/ml),還有存在與tPA(30U/ml)聯(lián)合的等劑量MMP-3(200nM)。圖2.顯示由tPA(1U/ml)和MMP-10(200nM)單獨(dú)或彼此加在一起聯(lián)合產(chǎn)生的溶解面積的聚合纖維蛋白平板。圖3.顯示在不同tPA劑量(20、25和30U/ml)下，纖維蛋白血塊溶解時(shí)間的差別的濁度試驗(yàn)。與單獨(dú)激活劑比較，MMP-10(200nM)和tPA(20U/ml)的組合縮短了溶解時(shí)間。圖4.用溶基質(zhì)蛋白酶熒光底物^r測MMP-10(100nM)血漿活性。(MAb)的濃度。IgG同種型對照抗體用作對照。圖5.在存在或不存在抑制MMP-10活性的單克隆抗體(MAb)和同種型對照抗體(IgG)下，用MMP-10(200nM)進(jìn)行血漿復(fù)鈣濁度試驗(yàn)。圖6.闡明在存在或不存在抑制MMP-10活性的單克隆抗體(MAb)和同種型對照抗體(IgG)下，由tPA(1U/ml)和MMP-10(200nM)產(chǎn)生的溶解面積差異的纖維蛋白平板。發(fā)明詳述本發(fā)明首先涉及基質(zhì)金屬蛋白酶-10(MMP-10)在制備用于血栓溶解療法和治療的藥物中的用途或應(yīng)用。MMP-10或溶基質(zhì)蛋白酶-2位于第11號染色體上，由諸如內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等不同細(xì)胞類型表達(dá)[MadlenerM和WernerS;Gene,1997;202:75-81]。已知它可被纖維蛋白溶酶、激肽釋放酶、類胰蛋白酶、彈性蛋白酶和組織蛋白酶G激活，并可降解范圍廣泛的胞外基質(zhì)底物，例如聚集蛋白聚糖、彈性蛋白、纖連蛋白、明膠、層粘連蛋白、生腱蛋白C(tenascin-C)、玻連蛋白(vitronectin)和II、III、IV、IX、X和XI型膠原。另外，MMP-10可激活其它基質(zhì)金屬蛋白酶，例如proMMP-l、-3、-7、-8和-9[NakamumH等，Eur.J.Biochem"1998;253:67-75]。同樣已知MMP-10參與不同生理過程，例如骨生長或傷口愈合。還發(fā)現(xiàn)它在糖尿病性視網(wǎng)膜病變患者的角膜中過表達(dá)，并與某些類型的癌癥以及淋巴瘤有關(guān)。不同的體外研究顯示，在角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)物中，可由生長因子(角質(zhì)形成細(xì)胞的表皮生長因子或TGF-(3)以及由促炎細(xì)胞因子(TNF-a,IL-lp)兩者同時(shí)誘導(dǎo)MMP-10的表達(dá)[RechardtO等，J.Invest.Dermatol"2000;115:778-787];[LideQ等；Invest.Ophthalmol.Vis.Sci,2003;44:2928-2936]。在本發(fā)明先前的出版物中，還闡述了MMP-10的以下方面-可能是血管風(fēng)險(xiǎn)的炎性生物標(biāo)志[MonteroI等；J.Am.Coll.Cardiol"2006;47:1369-1378][OrbeJ等；J.Thromb.Haemost.;2007;5:91-97];-可在于三維膠原蛋白凝膠中形成毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞中誘導(dǎo)產(chǎn)生，通過激活MMP-1使其參與毛細(xì)血管形成的退行[SaundersWB等；J.Cell.Sci"2005;118:2325-2340];和-其對于維持細(xì)胞內(nèi)聯(lián)結(jié)(intracellularbond)起主要作用，這種聯(lián)結(jié)使得在血管發(fā)生和重建過程中保持血管的完整性[ChangS等；Cell,2006;126:321-334]。在本發(fā)明中，業(yè)已試驗(yàn)了MMP-10和MMP-3對人血漿血塊的形成和溶解的作用以及對聚合的纖維蛋白降解的其它體外模型的作用。發(fā)明人已能證實(shí)MMP-10沒有任何直接溶血栓活性，且其本身不能降解纖維蛋白原或纖維蛋白。預(yù)料不到的是，發(fā)明人證實(shí)了在血栓溶解激活劑尤其是纖溶酶原激活劑存在下，MMP-10促進(jìn)纖維蛋白血塊的溶解并縮短溶解時(shí)間。因此，MMP-10作為其它血栓溶解激活劑的溶血栓作用促進(jìn)劑或輔助劑起作用。與此相反，纖溶性基質(zhì)金屬蛋白酶例如MMP-3，對纖維蛋白和纖維蛋白原具有直接的蛋白水解活性，其本身不能縮短由血栓溶解激活劑提供的血塊溶解時(shí)間。在本發(fā)明上下文中，"血栓溶解治療，，應(yīng)理解為在血栓性起因的缺血的臨床狀況中，為再灌注或借助裂解或快速溶解阻塞循環(huán)并危害器官功能的血塊來恢復(fù)血流所尋求的治療。具體而言，這些臨床狀況包括急性心肌梗死、腦血栓(更具體的是急性腦梗死或中風(fēng))以及其它靜脈血栓栓塞(即肺栓塞或深度靜脈血栓)和外周動脈血栓形成的血栓溶解治療。更具體地說，本發(fā)明涉及MMP-10和纖溶酶原激活劑在制備用于通過同時(shí)、分開或序貫給藥來進(jìn)行的血栓溶解治療及療法的藥物或藥物組合物中的用途或應(yīng)用。在本發(fā)明上下文中，纖溶酶原激活劑是通過切割纖維蛋白溶酶原的Arg560和Val1561之間的肽鍵來激活無活性的纖維蛋白溶酶原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白溶酶的化合物。具體而言，這些纖溶酶原激活劑包括尿激酶(uPA)、組織纖溶酶原激活劑(tPA)、鏈激酶和葡萄球菌激酶。在本發(fā)明一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述纖溶酶原激活劑為tPA。在另一具體實(shí)施方案中，所述纖溶酶原激活劑為uPA。在再一具體實(shí)施方案中，前述纖溶酶原激活劑的衍生物或片段可作為纖溶酶原激活劑使用，它們保留其裂解和激活纖維蛋白溶酶原的能力，由此有效促進(jìn)MMP-10的作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員自己可容易地了解該作用，即例如通過體外血塊形成和溶解試驗(yàn)，例如本發(fā)明實(shí)施例i_4中所述的那些試驗(yàn)來了解該作用。Longstaff和Thelwell[FEBSLetters,2005;579:3303-3309]綜述了某些纖溶酶原激活劑當(dāng)前的用途或進(jìn)展，技術(shù)人員可從中選擇將它們與本發(fā)明MMP-10聯(lián)合使用。有利的情況是，由于不與循環(huán)中的纖維蛋白原/纖維蛋白起作用和能夠促進(jìn)纖溶酶原激活劑的作用，因而MMP-10可以通過保持溶解血塊的功效但不引起系統(tǒng)纖維蛋白溶解，來減少溶血栓劑的劑量，原來的溶血栓劑的劑量將引起很高幾率的與出血有關(guān)的并發(fā)癥。同樣地，這可以降低因用藥物例如tPA進(jìn)行血栓溶解治療而產(chǎn)生的毒性。本發(fā)明另一方面還涉及藥物組合，其包含與可藥用賦形劑或溶媒單獨(dú)混合或混合在同一個(gè)組合物中的MMP-10和纖溶酶原激活劑。所述組合中的纖溶酶原激活劑可為上文提及的那些中的任何一種。前述組合在任何上文所述的前述臨床狀況中用于哺乳動物尤其是人類的血栓溶解療法和治療。所述藥物組合中的MMP-10和纖溶酶原激活劑的來源不是本發(fā)明的關(guān)鍵方面?；钚猿煞挚赏ㄟ^借助重組或基因工程改造方法或任何其它常規(guī)技術(shù)從生物流體或組織提取并純化來獲得?？赏瑫r(shí)、分開或序貫給予所述藥物組合中的活性成分，-現(xiàn)情況(借助常規(guī)藥理學(xué)檢測和臨床檢測來確定)而定。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案，活性成分(MMP-10和纖溶酶原激活劑)可包含在一個(gè)某種藥物組合物中。在其它情況下，所述活性成分可包含在分開的藥物組合物中，其中的每一種活性成分在其自己的容器中與可藥用賦形劑或溶媒混合。含活性成分的藥物組合物，不管是含一種還是多種活性成分，可調(diào)配為固體形式(即在小瓶中呈凍干形式，隨后在合適的溶液中再配制)，或也可為液體形式。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，這些含活性成分的組合物組成用于血栓溶解療法或治療的藥盒，其可任選裝有其它組分，例如具有用于再配制活性成分的溶液的容器、插管(cannulas)、具有用于靜脈內(nèi)施用的生理血清的點(diǎn)滴袋(dripbag)和使用說明書等。含活性成分的藥物組合物可按任何合適途徑給予，例如口服、胃腸外、直腸或局部，為此其將包含調(diào)配所需給藥形式所需要的可藥用賦形劑和溶媒。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，給藥為例如通過靜脈內(nèi)注射胃腸外給予，或通過用于在血塊附近的原位給藥的導(dǎo)管插入術(shù)來局部給予。當(dāng)分開給予藥物組合時(shí)，兩種活性成分也可同時(shí)包含在適于通過不同途徑給予的藥物組合物中?？纱嬖谟诒景l(fā)明提供的藥物組合的組合物中的MMP-10和纖溶酶原激活劑的量可在寬廣的范圍內(nèi)變化，但總是在治療有效量范圍內(nèi)。用于每一血栓溶解治療方案的本發(fā)明藥物組合的組合物的劑量將視多種因素而定，包括患者年齡、狀況、待治療的臨床病癥的嚴(yán)重程度、給藥途徑及頻率和在各個(gè)病例中將要給予的纖溶酶原激活劑的種類。在一個(gè)典型實(shí)施方案中，纖溶酶原激活劑的量和劑量將比當(dāng)MMP-10不包括在治療組合中時(shí)所用的同樣的纖溶酶原激活劑的量和劑量更低。在另一方面，MMP-10的量將根據(jù)人們希望達(dá)到的效果來調(diào)整通過保持纖溶酶原激活劑的劑量來得到更好的溶解血栓效果；或降低纖溶酶原激活劑的劑量保持溶解血栓的效果。本發(fā)明另一方面涉及已經(jīng)闡述的用于血栓溶解治療的本發(fā)明藥物組合或藥盒。本發(fā)明另外方面還涉及療法和血栓溶解治療的方法，其由給予患者治療有效量的MMP-10組成。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述方法還由通過同時(shí)、分開或序貫給藥來給予纖溶酶原激活劑組成。任何前述藥物組合物及組合可用于該方法中。以下實(shí)施例闡明本發(fā)明，不應(yīng)該理解為對其范圍的限制。發(fā)明實(shí)施例本實(shí)施例闡明了MMP-10和MMP-3基質(zhì)金屬蛋白酶直接或與如下某些纖溶酶原激活劑(尿激酶(uPA)和組織纖溶酶原激活劑(tPA))聯(lián)合對纖維蛋白溶解活性和血栓溶解活性的作用。以下物質(zhì)用于實(shí)施例-重組MMP-IO，作為含20%-30%成熟的48kDa酶的58kDa酶獲4尋(R&DSystems,910-MP，Abingdon，UK),用TCNB緩沖液再配制(50mMTris-HCl、pH7.5、10nMCaCl2、150mMNaCl、0.05%Brij35)。-重組MMP-3,作為52kDa的酶獲得(R&DSystems,513-MP,Abingdon，UK)，在含12.5nMTris、5nMCaCl2、0.025%Brij35和50%甘油的溶液中提供。-尿激酶(uPA)(VedimPharmaSA;628602,Barcelona,Spain)。-重組纖溶酶原組織激活劑(tPA)(BoerhingerIngelheim;985937Actilyse,Ingelheim,Germany)。為了評估溶血栓活性，按照vondernBorne等先前所述方案[Blood:1995;86:3035-3042]用濁度法來監(jiān)測血漿樣品中纖維蛋白血塊的形成和溶解。另一方面，為了評估纖維蛋白溶解活性，按照Edward所述方法[J.Clin.Path.,1972;25:335-337]在纖維蛋白板上進(jìn)行檢測。實(shí)施例1:MMP-10和MMP-3對血塊形成和溶解的作用如上文中先前所述，借助vondarnBorne等所述方法，評估了MMP-0和MMP-3對止血系統(tǒng)的作用。在該方法中，評估血塊形成和溶解期間濁度/吸光率的變化，作為這兩個(gè)過程時(shí)間長短的指示。在血塊形成和溶解階段，用光度讀數(shù)器讀取405nm處的吸光率來測定濁度，我們所用的光度讀數(shù)器是ELISA讀數(shù)器(FluostarOptima,BMGLabtech)。濁度/吸光率增加表示纖維蛋白血塊形成，同時(shí)該參數(shù)減小表示血塊溶解。為了形成血塊，使75pl檸檬酸鹽血漿、75|ilHEPES緩沖液(25mMHEPES、137mMNaCl、3.5mMKC1、6mMCaCl2、1.2mMMgCI2和0.1%BSA、pH:7.5)和10piCaCl2150mM在微孔板中混合。讓該板孵育到37。C,每30秒在405nM處測量吸光率，測2小時(shí)。為了研究MMP-10對血塊形成的作用，將激活的MMP-10(50、100和200nM)加入到原始血漿和HEPES緩沖液的混合物中。在將MMP-10用于實(shí)驗(yàn)之前，通過在37。C熱處理1小時(shí)來使其激活。在平行試驗(yàn)中，也分析MMP-3(200nM)對血塊形成的作用。在該情況下,先用1mM乙酸對氨基苯汞(p-aminophenylmercuryacetate)(APMA,164610,EMDBiosciences,Lajolla，USA)在37。C作用24小時(shí)來激活MMP-3。如圖1A所示，MMP-10在血塊形成速度或在用任何所用劑量達(dá)到的最大濁度方面不引起任何變化(表1)。然而，MMP-3使得所形成的血塊的最大吸光率/法度下降50%,很可能是由于其對纖維蛋白原的直接蛋白水解作用。這些結(jié)果顯示，與對MMP-3所闡述的不同，MMP-10不改變血塊形成速率，對于纖維蛋白原未表現(xiàn)出任何纖維蛋白溶解活性。然后，進(jìn)行了纖維蛋白血塊溶解速率的研究，最后，如同上文中剛剛所述部分，使用存于HEPES緩沖液中的復(fù)鈣血漿，向其同時(shí)加入MMP-10(或根據(jù)具體情況可為MMP-3)、纖溶酶原激活劑，以便在濁度測定開始時(shí)選擇30U/ml的組織纖溶酶原激活劑(tPA)或135U/ml尿激酶(uPA)。在劑量-響應(yīng)研究之前測定待使用的tPA和uPA的濃度，其中所選擇的劑量為在2小時(shí)(2h)期間內(nèi)完全溶解纖維蛋白血塊的劑量。如圖1B和表1所示，MMP-10在缺乏tPA和uPA時(shí)不引起纖維蛋白血塊的溶解，而在tPA或uPA激活劑存在下，其導(dǎo)致纖維蛋白血塊溶解速率顯著提高。用所試驗(yàn)的最大MMP-10劑量(200nM),在tPA存在下溶解時(shí)間(一半血塊溶解的時(shí)間)縮短15分鐘(52.9分鐘對68.3分鐘，pO.Ol)，在uPA存在下縮短5分鐘(42分鐘對47.5分鐘，p<0.05)。在tPA存在下，這種溶解時(shí)間的減少為縮短20。/Q,用uPA則縮短10%。與此相反，MMP-3在tPA存在下不改變血塊溶解速率。這些發(fā)現(xiàn)表明，與MMP-3所不同的是，MMP-10不能消化纖維蛋白但能提高纖溶酶原激活劑的纖維蛋白溶解作用和纖維蛋白溶解(tPA或uPA)。由于不具有作用于內(nèi)源纖維蛋白溶解的能力，MMP-10將防止或減弱出血發(fā)作，這使它成為用作血栓溶解治療輔助劑的良好候選者。表1.在纖溶酶原激活劑(tPA或uPA)存在下纖維蛋白血塊溶解時(shí)間(以分4中表示)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實(shí)施例2:MMP-10對纖維蛋白降解的作用根據(jù)前述Edward的方法，通過測量聚合纖維蛋白板上產(chǎn)生的暈圈面積或溶解面積來進(jìn)行纖維蛋白溶解作用的研究。用于37。C存于巴比妥緩沖液(BioWhittaker,12-624E，Cambrex，MD，USA)的6mg/ml人纖維蛋白原溶液(Sigma,F3879,SaintLouis,MO，USA)制備纖維蛋白板，將該溶液過濾，并向其加入等體積CaCl2(50mM)。將該溶液(6ml)與1個(gè)國際單位(NIH單位)凝血酶(EnzymeResearchLab;HT1200a，Swansea,UK)混合，使其聚合6小時(shí)。為了評估其對纖維蛋白溶解的能力，將tPA(1U/ml)、MMP-10(200nM)或二者組合加入到不同的纖維蛋白板中。如圖2所示，MMP-10單獨(dú)不引起聚合纖維蛋白溶解，同時(shí)tPA產(chǎn)生明顯的暈圏。然而，tPA和MMP-10組合顯著增加聚合纖維蛋白溶解面積(188.6%)，這一事實(shí)確證與作為纖溶劑的纖溶酶原激活劑聯(lián)用的MMP-10具有促進(jìn)纖維蛋白溶解的作用。實(shí)施例3:聯(lián)合給予MMP-10和溶血栓劑(tPA或uPA)對血塊溶解的作用基于MMP-10對涉及tPA的溶解作用有影響，提出了這樣的問題確定MMP-10是否能降低tPA(其引起出血和神經(jīng)毒性相關(guān)問題)劑量，以及確定是否能將MMP-10用作輔助劑以達(dá)到同樣的溶血栓效果。在按照上文實(shí)施例1所述的方法進(jìn)行的濁度試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)，與tPA聯(lián)合的MMP-10(200nM)的存在，可使tPA劑量降低33%(從30到20U/ml)，而達(dá)到同樣的血塊溶解時(shí)間(圖3,表1)。該結(jié)果表明，在需要血栓溶解治療的受試者中，MMP-10通過同時(shí)降低tPA劑量來提供增加纖維蛋白溶解和血塊溶解的方法，因此，使得由tPA引起的出血和毒性相關(guān)問題最小化。實(shí)施例4:用抗MMP-10抗體抑制由tPA引起的血塊纖維蛋白溶解和血塊溶解才艮據(jù)實(shí)施例1和2的結(jié)果，通過在有(1:2比率)和沒有封阻MMP-10活性的單克隆抗體(R&Dsystems,MAB9101，Abingdon,UK)存在下，或在以與所述抗體同樣濃度的IgG2B鼠同種型對照抗體(eBioscience,16-4732，美國加利福尼亞州的圣地亞哥)存在下，同時(shí)加入不同劑量的活性MMP-IO，來進(jìn)行MMP-IO對由tPA引起的血塊纖維蛋白溶解的影響的特異性的分析。預(yù)先在用抗MMP-10抗體(R&DSystems,Clonl10343)覆蓋的微盤(microdish)上，使用溶基質(zhì)蛋白酶熒光底物(MCA-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nval-Trp-Arg-Lys-[DNP]-NH2)(R&DSystems;ES002,Abingdon,UK)進(jìn)行MMP-10活性測試，分析了封阻酶活性的酶:抗體比率[Lombard等；Biochimie,2005;87:265-272)。在分光熒光計(jì)(SpectraMAXGeminiXS,MolecularDevices,美國加利福尼亞州)上測量熒光(320nm激發(fā)光和405nM發(fā)射光)1小時(shí)，發(fā)現(xiàn)1:2比率完全抑制活性酶濃度(圖4)。由于在抗MMP-10抗體存在下效果相反，該結(jié)果顯示MMP-10對纖維蛋白溶解的輔助作用是特異性的。當(dāng)加入所述抗體封阻血漿MMP-10內(nèi)源活性(endogenousactivity)時(shí)，這種效果非常顯著(圖5)。結(jié)果顯示當(dāng)血漿中不存在MMP-10時(shí)，即使在tPA或uPA存在下，也將防止纖維蛋白血塊溶解(表1)。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了聚合纖維蛋白板試驗(yàn)。如圖6所示，在抗MMP-10抗體存在下，由tPA:MMP-10組合引起的溶解面積減少了(91.2%對188:6%),而對照抗體沒有這種作用(184.6%)。該數(shù)據(jù)證實(shí)了用MMP-10抑制劑抗體封阻纖維蛋白血塊的藥理學(xué)溶解。權(quán)利要求1.基質(zhì)金屬蛋白酶-10即MMP-10在制備用于血栓溶解治療的藥物中的用途。2.權(quán)利要求1的用途，其特征在于所述藥物還包含纖溶酶原激活劑。3.權(quán)利要求2的用途，其特征在于所述藥物組分被同時(shí)、分開或序貫給予。4.權(quán)利要求2的用途，其特征在于所述纖溶酶原激活劑選自tPA組織纖溶酶原激活劑、uPA尿激酶激活劑、鏈激酶、葡萄球菌激酶和保留其激活纖維蛋白溶酶原能力的所述纖溶酶原激活劑的衍生物或片段。5.權(quán)利要求4的用途，其特征在于所述纖溶酶原激活劑選自tPA或保留其激活纖維蛋白溶酶原能力的tPA衍生物或片段。6.權(quán)利要求5的用途，其特征在于所述纖溶酶原激活劑為tPA。7.權(quán)利要求4的用途，其特征在于所述纖溶酶原激活劑選自uPA或保留其激活纖維蛋白溶酶原能力的uPA衍生物或片段。8.權(quán)利要求7的用途，其特征在于所述纖溶酶原激活劑為uPA。9.同時(shí)、分開或序貫給予的聯(lián)合藥物，其特征在于所述聯(lián)合藥物包括與可藥用賦形劑或溶媒混合的基質(zhì)金屬蛋白酶-10即MMP-10和纖溶酶原激活劑。10.權(quán)利要求9的聯(lián)合藥物，其特征在于所述基質(zhì)金屬蛋白酶-10即MMP-10與所述纖溶酶原激活劑分開或處于同一組合物中。11.權(quán)利要求9或10的聯(lián)合藥物，其特征在于所述纖溶酶原激活劑選自tPA組織纖溶酶原激活劑、uPA尿激酶、鏈激酶、葡萄球菌激酶或保留其激活纖維蛋白溶酶原能力的所述纖溶酶原激活劑的衍生物或片段。12.權(quán)利要求11的聯(lián)合藥物，其特征在于所述纖溶酶原激活劑選自tPA或保留其激活纖維蛋白溶酶原能力的tPA衍生物或片段。13.權(quán)利要求12的聯(lián)合藥物，其特征在于所述纖溶酶原激活劑為tPA。14.權(quán)利要求11的聯(lián)合藥物，其特征在于所述纖溶酶原激活劑選自uPA或保留其激活纖維蛋白溶酶原能力的uPA衍生物或片段。15.權(quán)利要求14的聯(lián)合藥物，其特征在于所述纖溶酶原激活劑為uPA。16.—種藥盒，其特征在于所述藥盒包含所述基質(zhì)金屬蛋白酶-10即MMP-10和纖溶酶原激活劑，所述基質(zhì)金屬蛋白酶-10和纖溶酶原激活劑作為聯(lián)合藥物以同時(shí)、分開或序貫給藥用于血栓溶解治療。17.權(quán)利要求16的藥盒，其特征在于所述基質(zhì)金屬蛋白酶-10即MMP-10與所述纖溶酶原激活劑分開或處于同一個(gè)組合物中。18.權(quán)利要求16的藥盒，其特征在于所述纖溶酶原激活劑選自tPA組織纖溶酶原激活劑、uPA尿激酶激活劑、鏈激酶、葡萄球菌激酶和保留其激活纖維蛋白溶酶原能力的所述纖溶酶原激活劑的衍生物或片段。19.權(quán)利要求18的藥盒，其特征在于所述纖溶酶原激活劑選自tPA或保留其激活纖維蛋白溶酶原能力的tPA衍生物或片段。20.權(quán)利要求19的藥盒，其特征在于所述纖溶酶原激活劑為tPA。21.權(quán)利要求18的藥盒，其特征在于所述纖溶酶原激活劑選自uPA或保留其激活纖維蛋白溶酶原能力的uPA衍生物或片段。22.權(quán)利要求21的藥盒，其特征在于所述纖溶酶原激活劑為uPA。23.用于血栓溶解治療的權(quán)利要求9-15中任一項(xiàng)的聯(lián)合藥物或權(quán)利要求16-22中任一項(xiàng)的藥盒。全文摘要本發(fā)明涉及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-10)在制備用于血栓溶解治療的藥物組合物中的用途，對于所述組合物還可能含有纖溶酶原激活劑。另外，本發(fā)明涉及所述藥物組合物用于血栓性疾病的治療。文檔編號A61K38/48GK101678089SQ200880013936公開日2010年3月24日申請日期2008年2月11日優(yōu)先權(quán)日2007年2月26日發(fā)明者J·A·帕拉莫弗南德茨,J·A·羅德里古茨加西亞,J·奧貝洛帕特圭,R·瑟拉諾瓦加斯申請人:西馬生物醫(yī)學(xué)計(jì)劃公司