專利名稱：：用于預(yù)防和治療自身免疫病的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明包含涉及免疫和醫(yī)藥相關(guān)組合物及方法。具體地，本發(fā)明涉及用于診斷和治療自身免疫病特別是糖尿病的診斷及治療方法。2
背景技術(shù)：
：抗原免疫接種可用于在自身免疫作用中誘導(dǎo)T細(xì)胞耐受。施用自身抗原性蛋白或肽的溶液在自身免疫病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭锌蓽p輕自身免疫作用的發(fā)生和/或發(fā)展(Wraith等，1989;Metzler和Wraith,1993;Liu和Wraith，1995;Anderton和Wraith，1998;Karin等，1994)。但是，利用相似策略的有限的人臨床試驗(yàn)幾乎亳無例外的遭遇失敗(Weiner,1993;Trentham等,1993;McKown等，1999;Pozzilli等，2000;Group,D.P.T.-T.D.S.2002;Kappos等，2000;Bielekova等，2000)。這表明對治療選擇和條件的指導(dǎo)原則尚不完善，因此不適用于人體。自發(fā)器官特異性自身免疫病是由針對多種抗原中眾多表位的復(fù)雜應(yīng)答所引起的，其以隨機(jī)且經(jīng)常是無法預(yù)測的順序自發(fā)出現(xiàn)。下述情況增加了這一復(fù)雜性識別相同表位的淋巴細(xì)胞克隆在寬的親合力范圍內(nèi)結(jié)合抗原/主要組織相容性復(fù)合物(MHC)分子，其強(qiáng)度與致病潛力相關(guān)(Amrani等，2000;Santamaria,2001;Liblau等，2002)。因此，任何預(yù)防自身免疫病的免疫接種策略的結(jié)局都有可能受到所選自身抗原、劑量、治療周期以及施用途徑及形式的影響。6小鼠中的I型糖尿病(T1D)與自身反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞有關(guān)。非肥胖糖尿病(nonobesediabetic,NOD)小鼠發(fā)生非常類似于人T1D的T1D形式，這是由于識別越來越多自身抗原的T細(xì)胞對胰腺P細(xì)胞的選擇性破壞造成的(Lieberman和DiLorenzo，2003)。盡管T1D的發(fā)生明顯需要CD4+細(xì)胞的參與，但是有強(qiáng)有力的證據(jù)證明T1D是CD8+T細(xì)胞依賴性的(Santamaria，2001;Liblau等，2002)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)NOD小鼠中的相當(dāng)一部分胰島相關(guān)CD8+細(xì)胞利用CDR3恒定的Val7-Ja42+TCR，被稱為"8,3國TCR樣，，(Santamaria等，1995;Verdaguer等，1996;Verdaguer等，1997;DiLorenzo等，1998)。這些識別MHC分子Kd情況中模擬表位NRP-A7(4吏用組合肽文庫確定)的細(xì)胞(Anderson等，1999)已經(jīng)是最早的NOD胰島CD8+浸潤物的重要成分(DiLorenzo等，1998;Anderson等，1999;Amrani等，2001)，是致糖尿病的(Verdaguer等，1996;Verdaguer等，1997)，并且靶向來自胰島特異性葡萄糖-6-磷酸酶催化亞勤目關(guān)蛋白(islet-specificglucose-6-phosphatasecatalyticsubunit-relatedprotein,IGRP)的肽(Lieberman，2003)---種功能未知的蛋白質(zhì)(Arden等，1999;Martin等，2001)。識別該肽(101^2。6.214，類似于NRP-A7)的CD8+細(xì)胞在循環(huán)中非常常見(>1/200CD8+cells)(Lieberman等，2003;Trudeau等，2003)。值得注意的是，在NOD小鼠中從胰島炎itA到糖尿病總是伴隨著循環(huán)中IGRP2Q6-w反應(yīng)性CD8+群體的周期性擴(kuò)增(Trudeau等，2003)，還伴隨著其胰島相關(guān)對應(yīng)物的親合力成熟(Amrani等，2000)。最近，有報道稱NOD小鼠中胰島相關(guān)CD8+細(xì)胞識別多個IGRP表位，表明IGRP是CD8+細(xì)胞的主要自身抗原，至少在小鼠T1D中如此(Han等，2005)。NOD胰島相關(guān)CD8+細(xì)胞，特別是在疾病過程中早期發(fā)現(xiàn)的那些細(xì)胞也識別胰島素表位(InsB15_23(Wong等，1999))。相關(guān)研究已經(jīng)提示，某些I類HLA等位基因(即HLA-A*0201)提供了對人TlD的易感性(Fennessy等，1994;Honeyman等，1995;Tait等，1995;Nejentsev等，1997;Nakanishi等，1999;Robles等，2002)。病理研究顯示，新近診斷患者的胰島炎病變主要由(I類HLA限制的)CD8+T細(xì)胞組成(Bottazzo等,1985;Atkinson和Maclaren，1990;Castano和Eisenbarth，19卯；Hanninen等，1992;Itoh等，1993;Somoza等，1994;Atkinson和Maclaren,1994;Moriwaki等，1999;Imagawa等，2001)，這也是通過胰腺同系移植(來自同卵雙胞胎)或同種移植(來自相關(guān)皿)治療的患者中的主要細(xì)胞類群(Sibley等，1985;Santamaria等，1992)。在人和小鼠T1D中，胰島素都是抗體和CD4+應(yīng)答的關(guān)鍵把標(biāo)(Wong等，1999;Palmer等，1983;ChentoufiandPolychronakos，2002;Toma等，2005;Nakayama等，2005;Kent等，2005)。;胰島移植受體(Pinkse等，2005)和自發(fā)疾病病程(Toma等，2005)中，人胰島素B^^位MnsB10-18都被HLA-A1201呈遞給自身反應(yīng)性CD8+細(xì)胞。另外，從小鼠前胰島素原1或2中已鑒定出四種另外的肽，其被來自HLA-A*0201背景下的HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因小鼠的胰島相關(guān)CD8+T細(xì)胞所識別。由與T1D易感性基因座IDDM7(2q31)重疊基因(位于染色體2q28-32(Martin等，2001))所編碼的IGRP(Pociot和McDermott,2002;Owerbach,2000)最近也已經(jīng)被鑒定為人T1D中可能相關(guān)的P細(xì)胞自身抗原(Takaki等，2006)。人IGRP的兩個HLA-A*0201結(jié)合表位(hlGRP228.236和hlGRP26^73)被來自表達(dá)HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因的小鼠I類MHC缺陷型NOD小鼠的胰鳥相關(guān)CD8+細(xì)胞所識另U(Takaki等，2006)。值得注意的是，這些"人源化，'HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因小鼠的胰島相關(guān)CD8+T細(xì)胞對于HLA-A*0201陽性人胰島來說具有細(xì)胞毒性(Takaki等，2006)?？赏ㄟ^擴(kuò)增低親合力自身反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞來預(yù)防NOD小鼠中的T1D。施用可溶性肽(不含佐劑)是誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞耐受的有效方式(Aichele等，1994;Toes等，1996)。之前，有報道顯示使用可溶性NRP-A7治療前糖尿病NOD小鼠通過選擇性缺失表i^t肽/MHC具有最高親合力的TCR克隆型而減弱了IGRP2()6_214反應(yīng)性CD8+亞群的親合力成熟(Amrani等，2000)。這些結(jié)果增加以下可能性即NRP-A7的抗T1D活性也是通過激發(fā)"低親合力"(有可能是抗糖尿病發(fā)病的)克隆代替"高親合力克隆型位置(niche)"(NRP-A7治療使該位置空出來)所介導(dǎo)。為了檢驗(yàn)這一猜想，鑒定了對IGRP2。6-2M反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞具有部分、全部或超級拮抗活性的改變的肽配體(alteredpeptideligand，APL)，并且在寬劑量范圍內(nèi)對其抗T1D活性進(jìn)行比較。使用中等劑量中等親合力APL(NRP-A7)或高劑量低親合力APL(NRP-I4)進(jìn)行的長期處理提供了針對T1D的保護(hù)。這與低親合力IGRP2Q6-214A>^&CD8+T細(xì)胞的局部積累(以犧牲其缺失的高親合力對應(yīng)物為代價)相關(guān)。意外地，使用高劑量高親合力APL(NRP-V7)或天然配體(IGRP2?！?4)進(jìn)行的長期處理僅僅提供部分保護(hù)。令人驚奇的是，這些小鼠的胰島幾乎不含IGRP2。6_214反應(yīng)性CD8+細(xì)胞，而識別其它IGRP表位的CD8+細(xì)胞群卻有所增加。這使我們推斷，當(dāng)其促^f吏乾器官淋巴細(xì)胞位置被非致病低親合力克隆占據(jù)時，自身免疫病的肽療法可能是最為有效的(Han等，2005),該預(yù)測得到了數(shù)學(xué)模型的支持(Maree等，2006)。令人遺憾的是，僅在很窄的APL劑量和親合力(針對靶標(biāo)TCR)范圍內(nèi)具有此結(jié)局，表明肽療法不適合于預(yù)防或治療T1D。因此，仍然需要用于治療糖尿病以及其它自身免疫病的其它組合物和相關(guān)方法。
發(fā)明內(nèi)容用肽來治療患者是困難的，因?yàn)閷τ贗GRP來說，每劑需要數(shù)毫克肽。還考慮在顆粒上遞送抗原/MHC復(fù)合物(例如肽/MHC/顆粒復(fù)合物，無共刺激分子)。發(fā)現(xiàn)這些復(fù)合物比單獨(dú)的肽更具有致耐受性。本申請的一些方面和實(shí)施方案包括發(fā)現(xiàn)治療自身免疫作用的新模式。傳統(tǒng)上，已使用疫苗來擴(kuò)增能提供針對病原體或癌癥的保護(hù)的T細(xì)胞，或者清除能夠造成自身免疫作用的T細(xì)胞。本發(fā)明的一些方面涉及新型"疫苗"，其選擇性誘導(dǎo)具有抗自身免疫性質(zhì)的自身反應(yīng)性CD8+細(xì)胞擴(kuò)增，同時清除具有致病(自身免疫性)性質(zhì)的自身反應(yīng)性CD8十細(xì)胞，以上兩者均根據(jù)T細(xì)胞的抗原特異性來實(shí)現(xiàn)?？棺陨砻庖咦陨矸磻?yīng)性CD8十T細(xì)胞(抗致病性CD8+細(xì)胞)以組織特異性(在自發(fā)募集到靶組織之后)但是非抗原特異性(例如局部抑制其它自身免疫性T細(xì)胞應(yīng)答)的方式抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞應(yīng)答。結(jié)果，使用此類疫苗進(jìn)行的治療既可以預(yù)防和/或減輕TlD，也可以^吏高血糖NOD小鼠恢復(fù)到正常血糖水平或降低其血糖水平，而不造成普遍性免疫抑制。此策略可用于治療其它T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病，并且可能能夠預(yù)防胰島移植后的T1D復(fù)發(fā)。本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及根據(jù)T細(xì)胞的抗原特異性選擇性減少或擴(kuò)增T細(xì)胞。因此，本發(fā)明可用于減少或消除識別自身抗原的T細(xì)胞(例如P細(xì)胞特異性T細(xì)胞)。由此，本發(fā)明可用于預(yù)防、治療或減輕自身免疫病例如IDDM。另外，本發(fā)明可用于擴(kuò)增期望的T細(xì)胞，例如識別肺瘤抗原的T細(xì)胞，以預(yù)防、治療和/或減輕這些T細(xì)胞所對抗的疾病。本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及診斷、預(yù)防或治療自身免疫病的方法，其包括以足以擴(kuò)增非致病或抗致病性自身反應(yīng)性T細(xì)胞的量將抗原/MHC/顆粒復(fù)合物施用給受試者。對于與基質(zhì)偶聯(lián)的MHC或MHC樣分子的情況，抗原包括但不限于全部或部分的肽、核酸、碳水化合物、脂類或者調(diào)節(jié)T細(xì)胞或T細(xì)胞群體活性的其它分子或化合物。本發(fā)明的一些實(shí)施方案包括致耐受性顆粒，其包括與抗原-MHC復(fù)合物偶聯(lián)的微米顆?；蚣{米顆粒?？乖?MHC復(fù)合物可直接或通過接頭與顆粒相連。微米顆?；蚣{米顆?？砂鄠€層，其繼而可包含多個組分(例如帶有其它可以更易于偶聯(lián)到抗原-MHC復(fù)合物的分子(例如鏈霉親和素或親和素或其它已知用于將其部分附著在納米顆粒上的分子)之涂層或殼的金屬芯核)。在一些方面中，微米顆?；蚣{米顆粒包含選自下列項(xiàng)的材料硒化鎘、鈦、二氧化鈦、錫、氧化錫、硅、二氧化硅、鐵、氧化鐵、銀、鎳、金、銅、鋁、鋼、鈷鉻合金、鈦合金、透磷鉀石、磷酸三鈣、氧化鋁、二氧化硅、氧化鋯、鉆石、聚苯乙烯、硅橡膠、聚碳酸酯、聚氨酯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、聚酯、聚醚和聚乙烯。在另一些方面中，微米顆粒或納米顆粒是金屬或者磁性或超順磁性顆粒。金屬納米顆?？捎梢韵聵?gòu)成Au、Pt、Pd、Cu、Ag、Co、Fe、Ni、Mn、Sm、Nd、Pr、Gd、Ti、Zr、Si和In前體，它們的二元合金、三元合金以及金屬間化合物。關(guān)于微米顆?；蚣{米顆粒生產(chǎn)的相關(guān)組合物及方法的討論參見美國專利7，332，586、7,326,399、7,326,399、7,060,121、6,929,675、6,846,474、6,712,997、6,688,494，其通過參考以整體并入本文。本發(fā)明的一些方面包括涉及抗原性組合物的方法和組合物，所述抗原性組合物包含多肽、肽、核酸、碳水化合物、脂類和其它引起或誘導(dǎo)抗原性應(yīng)答或免疫應(yīng)答之分子(通常稱為抗原)的部分、片段或表位。在一些具體方面中，所述抗原來源于自身反應(yīng)性抗原和/或其復(fù)合物，是自身反應(yīng)性抗原和/或其復(fù)合物，或者是自身反應(yīng)性抗原和/或其復(fù)合物的模擬物。肽抗原包括但不限于hInsB1(M8(HLVEALYLV(SEQIDNO:l))、hIGRP228-236(LNIDLLWSV(SEQIDNO:2))、hIGRP265-273(VLFGLGFAI(SEQIDNO:3))、IGRP206—214(VYLKTNVFL(SEQIDNO:4))、NRP-A7(KYNKANAFL(SEQIDNO:6))、NRP-I4(KYNIANVFL(SEQIDNO:7))、NRP-V7(KYNKANVFL(SEQIDNO:8))、YA1/Db(FQDENYLYL(SEQIDNO:9))和/或INSB15_23(LYLVCGERG(SEQIDNO:IO))，以及美國專利乂>開20050202032中公開的肽和蛋白質(zhì)，其通過參考以整體并入本文。在一些方面中，用于治療T1D的肽抗原是GAD65114.123，VMNILLQYVV(SEQID纖14);GAD65536-545,RMMEYGTTMV(SEQIDNO:15);GFAP143151，NLAQTDLATV(SEQIDNO:16);GFAP214222，QLARQQVHV(SEQIDNO:17);IA-2172180，SLSPLQAEL(SEQIDNO:18);IA-!2482-"0,SLAAGVKLL0EQIDNO:19);IA-!2805813，VIVMLTPLV(SEQIDNO:20);ppIAPPsl3，KLQVFLIVL(SEQIDNO:21);ppIAPP917,FLIVLSVAL(SEQIDNO:22);IGRP152160，F(xiàn)LWSVFMLI(SEQIDNO:23);IGRP211—219，NLFLFLFAV(SEQIDNO:24);IGRP215—223，F(xiàn)LFAVGFYL(SEQIDNO:25);IGRP222-230,YLLLRVLNI(SEQIDNO:26);IGRP228-236，LNIDLLWSV(SEQIDNO:2);IGRP265—273,VLFGLGFAI(SEQIDNO:3);IGRP293-301，RLLCALTSL(SEQIDNO:27);胰島素原L21o，ALWMRLLPL(SEQIDNO:28);胰島素原L3u，LWMRLLPLL(SEQIDNO:29);胰島素原L614，RLLPLLALL(SEQIDNO:30);胰島素原B5_14，HLCGSHLVEA(SEQIDNO:31);胰島素原bio-is，HLVEALYLV(SEQIDNO:l);胰島素原B1422，ALYLVCGER(SEQIDNO:32);胰島素原B15.24，LYLVCGERGF(SEQIDNO:33);胰島素原B17-25，LVCGERGFF(SEQIDNO:34);胰島素原B1827，VCGERGFFYT(SEQIDNO:35);胰島素原B2。-27，GERGFFYT(SEQIDNO:36);胰島素原B21-29，ERGFFYTPK(SEQIDNO:37);胰島素原B25C1，F(xiàn)YTPKTRRE(SEQIDNO:38);胰島素原B27C5，TPKTRREAEDL(SEQIDNO:39);胰島素原C2028，SLQPLALEG(SEQIDNO:40);胰島素原c25-33，ALEGSLQKR(SEQIDNO:41);胰島素原C29A5,SLQKRGIVEQ(SEQIDNO:42);胰島素原Ai-i。，GIVEQCCTSI(SEQIDNO:43);胰島素原A21。，IVEQCCTSI(SEQIDNO:44);胰島素原A122。，SLYQLENYC(SEQIDNO:45)或其組合。在另一些方面中，可以4吏用與多發(fā)性硬化(multiplesclerosis,MS)有關(guān)的肽抗原，其包括MAG287-295，SLLLELEEV(SEQIDNO:46);MAG509517，LMWAKIGPV(SEQIDNO:47);MAG556-564，VLFSSDFRI(SEQIDNO:48);MBP110118，SLSRFSWGA(SEQIDNO:49);MOG114122,KVEDPFYWV(SEQIDNO:50);MOG166175，RTFDPHFLRV(SEQIDNO:51);MOG172—180,FLRVPCWKI(SEQIDNO:52);MOG179_188，KITLFVIVPV(SEQIDNO:53);MOG188196，VLGPLVALI(SEQIDNO:S4);MOG181189，TLFVIVPVL(SEQIDNO:55);MOG205214，RLAGQFLEEL(SEQIDNO:56);PLP80-88，F(xiàn)LYGALLLA(SEQIDNO:57)或其組合。在一些方面中，抗原-MHC復(fù)合物可以交聯(lián)到微米顆?；蚣{米顆粒上。將微米顆?；蚣{米顆粒綴合到抗原-MHC復(fù)合物上的一種非限制性方法包括(a)將抗原-MHC復(fù)合物與交聯(lián)劑反應(yīng)，由此形成抗原-MHC-交聯(lián)劑復(fù)合物，以及(b)將微米顆?；蚣{米顆粒與步驟(a)的復(fù)合物反應(yīng)。在一個實(shí)施方案中，所述方法包括在進(jìn)行步驟(b)之前將步驟(a)的復(fù)合物濃縮。在另一個實(shí)施方案中，所述交聯(lián)劑包括異雙功能交聯(lián)劑。在又一個實(shí)施方案中，所述交聯(lián)劑包括DOTA-馬來酰亞胺(4-馬來酰亞胺基丁酰胺基苯基-DOTA)、SMPT(4-琥珀酰亞胺基氧H^-a-甲基-a-(2-聯(lián)硫基吡咬)甲苯-)、磺基-LC-SMPT(磺基琥珀酰亞胺基-6-(a-甲基-a-(2-硫基吡咬)苯乙酰胺)己酸酯、Traut試劑(2-亞皋J^克烷鹽酸鹽)或其任意組合。對將復(fù)合物與微米顆粒或納米顆粒綴合的討論，請參見美國專利公開20070059775;美國專利4,671,958、4,659,839、4,414,148、4,699,784;4,680,338;4,569,789;4,589,071;7186814和5543391,歐洲專利申請No.188,256。自身免疫病可包括但不限于糖尿病、移植排斥、多發(fā)性硬化、卵巢早衰、硬皮病、口眼干燥綜合征(Sjogren'sdisease)、狼掩、白瘋風(fēng)(vilelego)、禿頭癥(脫發(fā))、多腺性衰竭、格雷夫斯氏病(Grave，sdisease)、甲狀腺功能減退、多肌炎、天皰瘡、克羅恩病、結(jié)腸炎、自身免疫性肝炎、垂體機(jī)能減退、心肌炎、艾迪生病、自身免疫性皮膚病、葡萄膜炎、惡性貧血、甲狀旁腺功能減退和/或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在一些方面中，抗原/MHC/顆粒復(fù)合物的肽組分來自或者設(shè)計自要通過治療來檢測、調(diào)節(jié)或減輕的自身免疫應(yīng)答中所涉及的自身抗原或自身抗原表位或者其模擬物。在一些方面中，所述自身抗原是受試者的某些細(xì)胞(例如胰腺P細(xì)胞)所表達(dá)的蛋白質(zhì)、碳水化合物或者脂類的片段、表位或肽，包括但不限于IGRP、胰島素、GAD或IA-2蛋白的片段。已經(jīng)鑒定了針對多種自身免疫病的多種這樣的蛋白質(zhì)或表位。所述自身抗原可以是來源于第二內(nèi)分泌或神經(jīng)分泌組分(例如胰島周圍施旺氏細(xì)胞等)的肽、碳水化合物、脂類等。在本發(fā)明的另一些方面中，抗原/MHC/顆粒復(fù)合物的MHC組分是經(jīng)典的或非經(jīng)典的I類MHC或II類MHC多肽組分。所述I類MHC可包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G分子的全部或一部分，特別是HLA-A分子的全部或一部分，例如HLA-A*0201I類MHC分子。非經(jīng)典I類MHC組分可包括CD1樣分子。II類MHC組分可包括HLA-DR、HLA-DQ或HLA-DP的全部或部分。在一些方面中，抗原/MHC復(fù)合物與基質(zhì)共價或非共價偶聯(lián)或結(jié)合(抗原/MHC/顆粒復(fù)合物)。所述基質(zhì)通常是微米顆?；蚣{米顆粒。特別的，所述顆粒包含金屬，例如鐵或鐵氧化物。本發(fā)明的肽可以與基質(zhì)化學(xué)偶聯(lián)，特別是通過化學(xué)或肽接頭連接。CD1分子是非經(jīng)典MHC分子的一個實(shí)例。非經(jīng)典MHC分子的特征在于物種之間是非多態(tài)性的、保守的，并具有窄且深的疏水配體結(jié)合口袋。這些結(jié)合口袋能夠?qū)⑻侵土字蔬f給自然殺傷T(NKT)細(xì)胞。NKT細(xì)胞代表了共表達(dá)NK細(xì)胞標(biāo)志物和半恒定T細(xì)胞受體(TCR)的一個獨(dú)特的淋巴細(xì)胞群體。它們參與與許多種疾病有關(guān)的免疫應(yīng)答的調(diào)控。在一些實(shí)施方案中，通過該治療擴(kuò)增的T細(xì)胞已被疾病過程預(yù)先活化，并且具有記憶表型。在一個方面中，T細(xì)胞來自以低親合力識別靶表位的自身反應(yīng)性前體。可以通過四聚體結(jié)合測定等來測定親合力。在另一個方面中，抗原/MHC/顆粒復(fù)合物在目的自身免疫性疾病的臨床癥狀出現(xiàn)之前、之后或者之前和之后施用。在又一個方面中，所述方法可包括這樣的步驟，其包括在治療之前和/或之后評估自身免疫病的生物學(xué)參數(shù)，例如受試者血糖水平。本發(fā)明的方法還可包括評估受試者的自身免疫狀態(tài)，包括評估任何自身反應(yīng)性免疫應(yīng)答。在一些方面中，T細(xì)胞是CD4+或CD8+T細(xì)胞或NKT(NKT)細(xì)胞。本發(fā)明的另一些實(shí)施方案包括擴(kuò)增非致病性或抗致病性自身反應(yīng)性T細(xì)胞的方法，其包括以足以剌激非致病性或抗致病性自身反應(yīng)性T細(xì)胞擴(kuò)增的量施用抗原/MHC/顆粒復(fù)合物。在一些方面中，T細(xì)胞是CD8+或CD4+T細(xì)胞或NKT細(xì)胞。在又一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括為受試者細(xì)胞(例如胰島細(xì)胞)提供針對自身免疫應(yīng)答(特別是致病性自身免疫應(yīng)答)之保護(hù)的方法，其包括以足以抑制對細(xì)胞或包含該細(xì)胞之組織的破壞的量對受試者施用抗原/MHC/顆粒復(fù)合物，其中所述抗原或其所來源的抗原性分子來自與細(xì)胞相關(guān)的自身抗原。在又一個實(shí)施方案中，本發(fā)明包括診斷自身免疫作用的方法，其包括評估作為活躍自身免疫作用指示的非致病性或抗致病性CD8+或CD4+T細(xì)胞應(yīng)答的治療i秀導(dǎo)擴(kuò)增。本發(fā)明的一些實(shí)施方案可包括預(yù)防、減輕或治療同種異體或自身免疫應(yīng)答對移植組織的排斥，這通過以足以擴(kuò)增非致病性或抗致病性自身反應(yīng)性T細(xì)胞的量或者足以誘導(dǎo)識別移植組織或器官所表達(dá)同種抗原或自身抗原的非致病性或抗致病性細(xì)胞發(fā)生擴(kuò)增的量向受試者施用與基質(zhì)有效偶聯(lián)的抗原/MHC復(fù)合物(即抗原/MHC/顆粒復(fù)合物)。本發(fā)明的一些實(shí)施方案提供了通過防止細(xì)胞死亡或殺傷來增加或維持哺乳動物中預(yù)定類型的功能性細(xì)胞(例如胰島細(xì)胞)數(shù)量的方法。在一些實(shí)施方案中，該方法用于治療期望發(fā)生內(nèi)源性細(xì)胞和/或組織再生的自身免疫病。這些自身免疫病包括但不限于糖尿病、多發(fā)性硬化、卵巢早衰、硬皮病、口眼干燥綜合征(Sjogren'sdisease)、狼瘡、白斑病、禿頭癥(脫發(fā))、多腺性衰竭、格雷夫斯氏病(Grave'sdisease)、甲狀腺功能減退、多肌炎、天皰瘡、克羅恩病、結(jié)腸炎、自身免疫性肝炎、垂體機(jī)能減退、心肌炎、艾迪生病、自身免疫性皮膚病、葡萄膜炎、惡性貧血、甲狀旁腺功能減退、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。本發(fā)明的一個方面提供了新的兩組分治療方法，以消除已有的自身免疫反應(yīng)，同時重新建立(re-educating)免疫系統(tǒng)。抗原/MHC/顆粒復(fù)合物指例如微米顆粒或納米顆粒的表面上呈遞肽、碳水化合物、脂類或者抗原性分子或蛋白質(zhì)(即自身肽或自身抗原)的其它抗原性區(qū)段、片段或表位。本文所用的"抗原"指可誘導(dǎo)受試者中免疫應(yīng)答或非致病性細(xì)胞擴(kuò)增的分子的全部、部分、片段或區(qū)段。在某些方面中，抗原/MHC/顆粒復(fù)合物不需要與佐劑一起施用就能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，例如抗體應(yīng)答。在某些實(shí)施方案中，抗原/MHC/顆粒復(fù)合物可以與公知的多克隆和單克隆抗體技術(shù)聯(lián)合使用，以在較少使用或不使用佐劑的情況下產(chǎn)生抗體。"殺傷"意為通過凋亡或壞死使得細(xì)胞死亡。凋亡或壞死可通過任何細(xì)胞死亡途徑介導(dǎo)。"自身免疫細(xì)胞"包括例如成體脾細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和骨髓來源的細(xì)胞，例如哺乳動物的缺陷型抗原呈遞細(xì)胞，所述細(xì)胞針對該自身免疫細(xì)胞所來源的生物體具有活性。"模擬物"是給定配體或肽的類似物，其中所述類似物與所述配體基本上類似。"基本上類似"意為所述類似物具有類似于所述配體的結(jié)合語，只是該模擬物具有一個或多個官能團(tuán)或修飾，總計占所述配體分子量的少于約50%、少于約40%、少于約30%或者少于約20%。"有效量"是足夠達(dá)到預(yù)期目的(例如對T細(xì)胞活性或T細(xì)胞群的調(diào)節(jié))的量。如本文詳細(xì)所述，有效量或劑量取決于目的和所述抗原，并且其可根據(jù)本公開內(nèi)容來確定。"自身反應(yīng)性T細(xì)胞"是識別"自身抗原，，(含有該T細(xì)胞的同一個體所產(chǎn)生并含有的分子)的T細(xì)胞。"致病性T細(xì)胞，，是對含有該T細(xì)胞的受試者有害的T細(xì)胞。而非致病性T細(xì)胞對受試者無顯著危害，抗致病性T細(xì)胞減少、減輕、抑制或消除致病性T細(xì)胞的危害。在權(quán)利要求書和/或說明書中使用時，術(shù)語"抑制"、"減少"或"防止"或者這些術(shù)語的任何變化包括任何可測量的降低或完全抑制，以達(dá)到預(yù)期結(jié)果。在權(quán)利要求書和/或說明書中與術(shù)語"包括/包含"一起使用時，沒有數(shù)詞^務(wù)飾的名詞可表示"一個"，也可以與"一個或多個"、"至少一個"以及"一個或多于一個"的意思相同。本申請通篇中，術(shù)語"約"用于表示數(shù)值包括用于測定該值的設(shè)備或方法之誤差的標(biāo)準(zhǔn)差。權(quán)利要求書中術(shù)語"或"用于表示"和/或"，除非明確說明表示僅僅擇一選擇或者所述擇一選擇彼此互斥，盡管本公開內(nèi)容支持表示僅僅擇一選擇以及"和/或"的定義。如本說明書和權(quán)利要求書中所使用的，詞語"包含/含有"(以及任何形式的變化)、"具有"(以及任何形式的變化)或者"包括，，(以及任何形式的變化)是開放式的，并且不排除其它未提及的要素或方法步驟。下述詳細(xì)說明將進(jìn)一步明確本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)。但是，應(yīng)理解，所述詳細(xì)說明和具體實(shí)施例盡管給出了本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案，但是僅以舉例形式給出，這是因?yàn)橥ㄟ^此詳細(xì)說明本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)的多種變化和修飾對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是很明顯的。下述附圖構(gòu)成本說明書的一部分，其用于進(jìn)一步說明本發(fā)明的某些方面。可通過參考這些附圖中的一幅或多幅結(jié)合本文所述的具體實(shí)施方案的詳細(xì)描述而更好地理解本發(fā)明。圖1A-C，與固體結(jié)合的肽/MHC復(fù)合物的致耐受特性。將與固體結(jié)合的肽/MHC復(fù)合物靜脈內(nèi)注射進(jìn)8.3-NOD小鼠誘導(dǎo)了T細(xì)胞清除(圖1A),使得未清除的抗原活化的(圖IB)CD8+T細(xì)胞對離體抗原刺激低應(yīng)答(圖1C)。圖2，在年幼NOD小鼠中全身施用NRP-V7/Kd-np導(dǎo)致糖尿病保護(hù)。在4、6和8周齡時以及其后每三周直至32周齡，向NOD小鼠靜脈內(nèi)注射7.5mg的NRP-V7/Kd-np。85%的NRP-V7/Kd-np處理動物(n=21)在32周齡時保持無糖尿病，而在對照-np處理組(n=25)和未處理組(n=65)中分別是36%和23%。圖3，以放射性標(biāo)記的肽/MHC包被的納米顆粒在全身給藥24小時內(nèi)的生物分布。圖4，NRP-V7/Kd-np和生物素化np處理的NOD小鼠中以及未處理NOD小鼠中(分別n-5、5和10)血清細(xì)胞因子水平。每周用兩劑各個np注射10周齡NOD雌性小鼠，持續(xù)5周。最后一次注射后6小時收集血清，對其進(jìn)行使用Luminex珠陣列技術(shù)的20重細(xì)胞因子分析。圖5A-5E,在年幼NOD小鼠中全身施用NRP-V7/Kd-np導(dǎo)致了四16聚體陽性CD8+T細(xì)胞的擴(kuò)增。圖5A，相比于對照-np處理動物(血和胰島分別是n-4和21)，NRP-V7/Kd-np處理擴(kuò)增外周血(n=4)中和胰島浸潤物(n=ll)中CD8+T細(xì)胞群中的NRP-V7/Kd四聚體陽性細(xì)胞。圖5B，胰島中擴(kuò)增的四聚體陽性T細(xì)胞以低親合力結(jié)合肽/MHC。NRP-V7/Kd-np處理動物中Kd=10.21±1.65nM,而對照動物中Kd=4.42±0.87nM(分別為n=5和12)。圖5C和圖5D，NRP-V7/Kd-np的保護(hù)性作用是劑量依賴性(圖5C)，并且對應(yīng)于外周血中NRP-V7/Kd四聚體陽性細(xì)胞擴(kuò)增的程度(圖5D)。按照相同的注射方案(如上所述)，用完全(7.5嗎/注射)、1/5(1.5嗎/注射)或1/20(0.375將/注射)劑量的np注射動物(分別為n=21、12和13)。圖5E，NRP-V7/Kd四聚體+CD8+T細(xì)胞的擴(kuò)增依賴于注射數(shù)(n=10)。用10劑完全劑量的NRP-V7/Kd-np以每周兩次注射10周齡NOD雌性小鼠。在4次和10次注射后對動物取血，測定血液中NRP-V7/Kd-四聚體陽性細(xì)胞的百分比。圖6A-6C，同源CD8+T細(xì)胞對肽/MHC包被的np的特異性才聶取。圖6A和圖6B，17.4cx/8.3(3-NOD(圖6A)或17.6a/8.3p-NOD(圖6B)小鼠不處理，或者用單次注射相當(dāng)于10倍完全劑量的NRP-V7/Kd-np進(jìn)行處理，20小時后處死。根據(jù)np-相連FITC焚光團(tuán)的MFI，評估4CD8+、CD4+、CDllc+和CDllb+以及B220+細(xì)胞的np結(jié)合(每個細(xì)胞株的n=l)。圖6C，NOD小鼠不處理，或者從10周齡開始每周用兩次全劑量NRP-V7/Kd-np進(jìn)行處理，持續(xù)5周，在最后一次np注射后20小時處死。根據(jù)np-相連FITC熒光團(tuán)的MFI，評估脾CD8+、CD4+、CDllc十和CDllb+細(xì)胞的np結(jié)合(n=2)。注意到僅在CD8+T細(xì)胞亞群中出現(xiàn)熒光標(biāo)記細(xì)胞的小峰。圖7A-7D，在年幼NOD小鼠中全身施用DMK138-146/Db-np導(dǎo)致選擇性擴(kuò)增DMK^46反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞并提供糖尿病保護(hù)。圖7A，相比于對照動物(n=3)，按照與圖5所示相同的方案用DMK138_146/Db-np處理的NOD小鼠顯示出外周血(n=ll)和胰島浸潤物(n=13)中DMK138_146/Db四聚體陽性CD8+T細(xì)胞的擴(kuò)增。圖7B，以72%的DMK138_146/Db-np處理的動物在32周齡保持未患糖尿病(n=18)。圖7C和圖7D，四聚體陽性CD8+細(xì)胞的擴(kuò)增是抗原特異性的。DMK138-146/Db-np處理不擴(kuò)增NRP-V7/Kd四聚體陽性細(xì)胞(血液n=4和11，胰島n=21和11)(圖7C)，NRP-V7/Kd-np處理不擴(kuò)增DMK138_146/Db四聚體+細(xì)胞(血液n=3和4，腹島:n=3和2)(圖7D)。圖7E，納米顆粒處理小鼠中外周血CD8+T細(xì)胞的代表性FACS語。從4周齡開始，小鼠每2-3周接受一次納米顆粒的靜脈內(nèi)注射。這些樣品來自治療結(jié)束時(約32周齡)的小鼠。圖8,在用分別以NRP-V7/Kd或DMK138.146/Db包被的納米顆粒處理后，IGRP2。6.2"或DMKm46反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞向胰烏的募集增強(qiáng)。從4周齡開始，每2-3周一次，用納米顆粒靜脈內(nèi)注射小鼠。這些樣品來自治療結(jié)束時(約32周齡)的小鼠。對胰島相關(guān)CD8+T細(xì)胞測定應(yīng)答于以IGRP2。6_214、DMK138_146或胰島素-L(INS-L)脈沖刺激的抗原呈遞細(xì)胞的IFN-Y產(chǎn)生。INS-L用作對照(對于IGRP和INS-L特異性應(yīng)答，NRP-V7/Kd-np處理組n=8、DMK138.146/Db-np處理組n=5、對照-np處理組11=8,DMK特異性應(yīng)答組i^3)。圖9A-9F，在糖尿病發(fā)作時給藥的話，NRP-V7/Kd-np和DMK138-146/Db-np治療逆轉(zhuǎn)了高血糖。圖9A，接受np處理的急性糖尿病NOD小鼠的存活。用TUM/Kd-np(n=9)、NRP-V7/Kd-np(n=ll)或DMK138-146/Db-np(n=ll)每周兩次善脈內(nèi)處理達(dá)到或超過10.5mM血糖的動物，直至認(rèn)為動物的血糖持續(xù)正常(血糖水平保持在10.5mM閾值以下達(dá)連續(xù)4周)。圖9B-圖9D，用NRP-V7/Kd-np(圖9B)、DMK138-146/Db-np(圖9C)和TUM/Kd-np處理的個體動物的jfa4t曲線(圖9D)。圖9E，^處理方案持續(xù)過程中計算出的每個處理組的平均*水平。圖9F,用20嗎/天的抗-CD3MAb(克隆2C11)處理連續(xù)5天的個體動物的血糖曲線。圖10，處理撤除后的結(jié)局。圖IOA，np處理撤除后的不同時間點(diǎn)外周血中四聚體陽性細(xì)胞的積累和減少。NRP-V7/Kd-np和DMK138.146/Db-np處理的動物都顯示在處理撤除后顯示出外周中相應(yīng)的四聚體陽性CD8+T細(xì)胞群的逐漸消失。圖IOB，在處理撤除后，治愈的NOD小鼠中的糖尿病復(fù)發(fā)。在撤除處理的動物中對糖尿病進(jìn)行監(jiān)測直至至少50周齡。圖IOC，處理撤除后，各個NRP-V7/Kd-np處理和治愈動物的血糖曲線。圖IOD，處理撤除后，各個DMK^46/Db-np-處理和治愈動物的血糖曲線。圖11A-11D，治愈小鼠中的葡萄糖耐受。圖IIA，相比于未處理對照，在50周齡時治愈小鼠的急性糖尿病IPGTT(上圖IPGTT葡萄糖曲線；下圖曲線下面積分析；糖尿病未處理n=7，非糖尿病未處理n=5;NRP-V7/Kd-np處理組n=4;DMK138146/Db-np處理組n=5)。圖11B,NRP-V7/Kdnp處理的小鼠相比于糖尿病和非糖尿病未處理對照的餐后血清胰島素水平(分別為n=7、9和7)。圖11C，NRP-V7/Kd-np和DMK138_146/Dbap處理的小鼠相對于糖尿病和非糖尿病未處理對照的IPGTT血清胰4素水平(n=4、7和5)。圖11D，NRP-V7/Kd-np處理(n=5)和未處理(n=6)動物在50周齡時的體重。圖12,肽/MHC-包被的納米顆粒可有效"區(qū)分"高親合力和低親合力自身反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞。不同的TCR轉(zhuǎn)染體與NRP-V7/Kd包被的珠子一起孵育5或30分鐘，然后用抗CD8mAb染色。柱狀圖表示在與珠子一起孵育后的所示時間形成CD8帽的細(xì)胞百分比。圖13A-13C，低親合力自身反應(yīng)性17.6a/8.3pCD8+T細(xì)胞是抗致糖尿病的。圖13A，17.6a/8.3|5-NOD(n=95)與17.4a/8.3p畫NOD小鼠(n=598)的糖尿病頻率。圖13B,Tg小鼠中的胰島炎得分(17.6a/8.3p-NODn=6，17.4a/8.3p-NODn=3)。圖13C,NOD(n=56)與LCMV畫NOD(n=10)中的糖尿病頻率。圖14A-14B，17.6(1/8.3|5101的發(fā)育生物學(xué)。圖14A，在Tg小鼠中，17.6a/8.3|3與17,4a/8.3pTCR的發(fā)育生物學(xué)。上圖是代表性的脾細(xì)胞CD4和CD8點(diǎn)狀圖。下圖是用NRP-V7/Kd四聚體染色的CD8+T細(xì)胞的比較。圖14B，RAG-2-/-Tg小鼠中17.6a/8.3(5和17.4a/8.3pTCR的發(fā)育生物學(xué)。上圖是代表性的脾細(xì)胞CD4和CD8點(diǎn)狀圖。下圖是用NRP-V7/Kd四聚體染色的CD8+T細(xì)胞的比較。圖15，17.6a/8.3p-NOD.RAG-2-/-(n=13)和17,4a/8.3p-NOD.RAG-2-/-小鼠(n=106)中的糖尿病頻率。圖16A-16B，在TCRa-/-Tg小鼠中17.6a/8.3p和17,4a/8.3pTCR的發(fā)育生物學(xué)。圖16A，上圖是代表性的脾細(xì)胞CD4和CD8點(diǎn)狀圖。下圖是用NRP-V7/Kd四聚體染色的CD8+T細(xì)胞的比較。圖16B，17.6a/8.3p-NOD.TCRa-/-(n=14)和17.4a/8.鄧-NOD.TCRa畫/國小鼠(n=28)中的糖尿病頻率。點(diǎn)狀圖FACS圖中的值對應(yīng)于每個象限中的細(xì)胞百分比，柱狀圖中的值對應(yīng)于染色陽性的細(xì)胞百分比(平均值士SE)。圖17A-17J,17.6a/8.3(5CD8+T細(xì)胞自發(fā)分化為有調(diào)控功能的記憶T細(xì)胞。圖17A,來自17.6a/8.3p-NOD.TCR(W國對17.4a/8.3|5-NOD.TCRa-/-小鼠的脾CD8+T細(xì)胞的代表性FACS詳。圖17B，TCRa-/-Tg小鼠的脾(對于17.6a/8.3p-NOD.TCRa-/-，n=12;對于17.4a/8.3p-NOD.TCRa-/-，n=9)、PLN(對于17.6a/83p-NOD.TCRa-/，n=9;對于17.4a/8.3p-NOD.TCRa-/-，n=6)和BM(對于17.6a/8,3|5-NOD.TCRa-/-,n=4;對于17.4a/8.3(3-NOD.TCRa-/-，n=3)中CD44hiCD122+CD8+T細(xì)胞的百分比(平均值±SE)。小鼠是9-18周齡。圖17C，來自用NRP-V7/Kd四聚體相對于抗CD122抗體染色的l.6a/8.3p-NOD.TCRa-A小鼠的脾CD8+T細(xì)胞的代表性FACS鐠。值是5次不同實(shí)驗(yàn)的平均值士SE。圖17D，來自17.6a/8.3(5-NOD.TCRa-/jJ、鼠的幼稚(naiive)脾CD8+T細(xì)胞和記憶脾CD8十T細(xì)胞的表型分析。數(shù)據(jù)代表針對每個標(biāo)志物的至少兩次實(shí)驗(yàn)。圖17E，來自TCRa-/-Tg小鼠的CD8+CD4-胸腺細(xì)胞和CD8+脾細(xì)胞中CD122染色的比較。數(shù)據(jù)代表四次實(shí)驗(yàn)。圖17F，來自1^1101-/-18小鼠的脾CD8+T細(xì)胞對BrdU的#^。圖17G，上圖來自Tg小鼠的脾CD8十T細(xì)胞應(yīng)答于細(xì)胞因子IL-2和IL-15(均為100ng/ml)增殖的代表性FACS鐠。下圖來自17.6(1/8.3(5-1^00.1^1^-/-小鼠的幼稚€08+T細(xì)胞和記憶CD8+T細(xì)胞應(yīng)答于不同濃度IL-2和IL-15的擴(kuò)增倍數(shù)。數(shù)據(jù)代表至少三次實(shí)驗(yàn)。圖17H,來自17.401/8.3|5-]\00.1^1101-/-小鼠的脾幼稚€08+T細(xì)胞以及來自17.6a/8.3p-NOD.TCRa-Z-小鼠的幼稚及記憶CD8+T細(xì)胞應(yīng)答于lug/mlNRP-A7DC脈沖刺激的DC的24和48小時后IFN-y產(chǎn)生。圖171,應(yīng)答于以lug/mlNRP-A7脈沖刺激的DC,6小時后，來自17.4a/8.3p-NOD.TCRa-/-小鼠的脾幼稚CD8+T細(xì)胞相對于來自17.6(1/8.3&-00.1^11(1-/-小鼠的幼稚€08+T細(xì)胞和記憶CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)IFN-y染色。圖17J,在不同時間點(diǎn)，應(yīng)答于lug/mlNRP-A7脈沖刺激的DC，IL-2產(chǎn)生和增殖。圖17H和圖17J中的數(shù)據(jù)代表四次實(shí)驗(yàn)，圖171中的數(shù)據(jù)代表三次實(shí)驗(yàn)。圖18，CFSE標(biāo)記的17.4a/8.3(5CD8+T細(xì)胞的增殖。存在來自于17.601/8.3|3-]\00.1^(1-/-小鼠的幼稚€08+T細(xì)胞和記憶CD8+T細(xì)胞時(上圖)，或者來自17.4a/8.3p-NOD和LCMV-NOD小鼠的幼稚CD8+T細(xì)胞時(下圖)，CFSE標(biāo)記的17.4a/8.3|3CD8+T細(xì)胞應(yīng)答于NRP-A7脈沖刺激的DC的增殖。數(shù)據(jù)代表至少五次實(shí)驗(yàn)。圖19，記憶17.6a/8.3|5CD8+T細(xì)胞殺傷抗原脈沖刺激的APC。圖19A,來自17.4(*/8.3|5-1^00.1^1^-/-小鼠的新分離幼稚CD8+T細(xì)胞和來自2017.6a/8.3p-NOD.TCRa-/"、鼠的幼稚CD8+T和記憶CD8+T細(xì)胞抗NRP-A7和TUM脈沖刺激的BMDC的體外細(xì)胞毒性。數(shù)據(jù)代表三次實(shí)驗(yàn)。用1fig/mlNRP-A7或TUM脈沖刺激并用["Cr-鉻酸鈉標(biāo)記的純化BMDC。效應(yīng)細(xì)胞:耙標(biāo)細(xì)胞的比例=8:1(40000效應(yīng)細(xì)胞:5000乾細(xì)胞)。8小時后收獲上清液。圖19B,體內(nèi)細(xì)胞毒性測定以1:1的比例將NRP-A7脈沖刺激的(CFSE,或TUM脈沖刺激的(CFSEhi)B細(xì)胞(上圖)或新分離的脾和LNDC(下圖)注射進(jìn)Tg宿主。使用抗B220或抗CDllcMACS珠分離B細(xì)胞或新DC(來自脾和LN)，用10jig/ml肽脈沖刺激2小時，洗滌，用CFSE(TUM:3fiMCFSE、NRP國A7:0.3nMCFSE)在37。C標(biāo)記3分鐘，洗滌三次，將來自每個群體的4-5xl(^個細(xì)胞注射進(jìn)宿主。18小時后，處死小鼠，對脾細(xì)胞進(jìn)行FACS分析。圖20A-20D,NRP-V7/Kd-np或DMK138-146/Db-np擴(kuò)增的四聚體陽性CD8+細(xì)胞具有抑制活性。圖20A，擴(kuò)增的處-￥7/1^四聚體陽性€08+細(xì)胞表達(dá)高水平的CD44,它們之中的一個亞群還表達(dá)CD122(對照和NRP-V7/Kd的n=7和4)。圖20B,擴(kuò)增的四聚體陽性細(xì)胞應(yīng)答于抗原刺激而分泌IFNy，但不分泌IL-2。分選NRP-V7/Kd四聚體陽性和陰性CD8十脾細(xì)胞，將20000個分選的細(xì)胞與10000個BM來源樹突細(xì)胞在lpg/mLNRP-V7肽存在下培養(yǎng)。24小時時收集培養(yǎng)上清液，測定24小時至48小時的[3印-胸苷摻入。圖20C，np擴(kuò)增的NRP-V7/Kd或DMK138-146/Db四聚體陽性CD8+T細(xì)胞體外抑制17.4a/8.3P-CD8+T細(xì)胞擴(kuò)增。用FACS分選NRP-V7/Kd或DMK138.146/Db四聚體陽性或陰性CD8+T細(xì)胞，用平板結(jié)合的抗CD3MAb預(yù)'激活或者直接與NRP-V7或NRP-V7/DMK138.146肽脈沖刺激的BMDC—起過夜培養(yǎng)。將CFSE標(biāo)記的17.40/8.3(3-CD8+報告T細(xì)胞以一個抑制細(xì)胞/一個報告細(xì)胞的比例加入共培養(yǎng)物，48小時后評估CFSE稀釋物。顯示了3個實(shí)驗(yàn)的代表性譜。圖20D，圖20C中所示體外抑制實(shí)驗(yàn)的總結(jié)。圖21A-21C，肽/MHC包被的納米顆粒擴(kuò)增之前存在的低親合力記憶T細(xì)胞。圖21A，TUM/Kd-np不擴(kuò)增TUM/Kd四聚體陽性細(xì)胞(脾中，n=7和9).圖21B,在糖尿病抗性810.11-2"小鼠中脾、胰腺淋巴結(jié)、骨髓和外周血中NRP-V7/Kd-np不擴(kuò)增NRP-V7/Kd四聚體陽性細(xì)胞。用全劑量NRP-V7/Kd-np—周兩次連續(xù)五周注射10周齡H-2g7小鼠，測定四聚體陽性細(xì)胞的頻率(NRP-V7/Kd-np處理組n-4、對照組n-5)。圖21C，以叩處理擴(kuò)增的NRP-V7/Kd四聚體陽性細(xì)胞在糖尿病發(fā)作上最有效。這里比較了從4周齡(n=9)、10周齡(n=10)或糖尿病發(fā)作時(n=3)開始接受了10次全劑量NRP-V7/Kd-np的動物外周血中四聚體+細(xì)胞百分比。圖22A-22C,NRP-V7/Kd-np和DMK138-146/Db-np處理的保護(hù)作用需要擴(kuò)增之前存在的低親合力四聚體陽性CD8+T細(xì)胞。圖22A，]\00.1010>詣9飾213,/10構(gòu)建體示意圖。圖22B，在兩個不同NOD,IGRPk209a/f213a"^小鼠中，胰島相關(guān)CD8+T細(xì)胞對每個IGRP表位的IFNy應(yīng)答。圖22C，在NRP-V7/Kd-np處理的NOD.IGRPk2。9a/f213a1^13小鼠(n=8)的脾、骨髓、胰腺淋巴結(jié)和外周血中沒有NRP-V7/Kd四聚體陽性CD8+細(xì)胞的擴(kuò)增。發(fā)明詳述目前的觀察結(jié)論(Han等，2005)認(rèn)為，想要在自身免^^應(yīng)中有效，肽療法必須靼向多種表位特異性。本發(fā)明人認(rèn)為用肽完成這一任務(wù)是非常不實(shí)際的，因?yàn)閮HIGRP就需要每個劑量數(shù)毫克的肽。由于在與固定在APC上的MHC分子連接時，肽的致耐受性高得多(即在較低的量時)(Miller等1979)，所以認(rèn)為全身性遞送顆粒上的抗原/MHC復(fù)合物例如肽/MHC復(fù)合物(不含共刺激分子)可能比單獨(dú)的肽有更高的致耐受性。這一想法是從最初用于對胰島炎癥進(jìn)行成像的試劑的可用性演化而來。本發(fā)明人尋求特異性遞送適于對循環(huán)8.3樣CD8+T細(xì)胞進(jìn)行磁共振(MR)成像的探針(由NRP-V7/Kd復(fù)合物包被的鐵氧化物納米顆粒)(Moore等，2004)。具體地，本發(fā)明人考慮將這些顆粒用幾種不同的抗原/MHC復(fù)合物包被，作為誘導(dǎo)將多種T細(xì)胞特異類型的同時清除至T1D發(fā)生所需閾值之下的方式。將這些納米顆粒用于耐受誘導(dǎo)的一個特征是它們的原型已被批準(zhǔn)用于人的MRI研究。令人驚奇的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，由抗原/MHC復(fù)合物包被的納米顆粒(抗原/MHC/顆粒復(fù)合物)在非常低劑量下(對應(yīng)于0.6嗎肽)有效且一致地擴(kuò)增在APL處理小鼠中提供T1D保護(hù)的低親合力自身反應(yīng)性CD8+細(xì)胞類型(Han等，2005;Maree等，2006)。另一個驚人的發(fā)現(xiàn)是，這些納米顆粒似乎擴(kuò)增之前已存在的記憶自身反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞庫(即它們不從新誘導(dǎo)記憶T細(xì)胞)。這些之前已存在的細(xì)胞庫主要(如果不是全部)由低親合力(非致病性/抗致病性)自身免疫性CD8+克隆型構(gòu)成。這些T細(xì)胞的髙親合力對應(yīng)物(具有致病活性)在體內(nèi)不以記憶細(xì)胞形式存活，可能(但是不將本發(fā)明限于任何特定理論)是因?yàn)樗鼈冊陂L期暴露于它們的內(nèi)源靶標(biāo)P細(xì)胞自身抗原后，發(fā)生活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。另一個意外發(fā)現(xiàn)是，這些顆粒不需要一定靶向到自身反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞的優(yōu)勢群體才能有效用包被有次要肽/MHC復(fù)合物的納米顆粒獲得類似結(jié)果。另外，此技術(shù)不需要設(shè)計具有確定親合力的APL(與使用肽時不同)，因此有可能容納任何靶抗原或肽/MHC靶標(biāo)。此技術(shù)的多種特性之一是它可以恢復(fù)新診斷出T1D的NOD小鼠的正常血糖，其恢復(fù)速率至少相當(dāng)于(如果不是更好的話)用抗CD3mAb治療所獲得的結(jié)果，所述抗CD3mAb治療是在臨床試驗(yàn)中顯示出一些前景的非抗原特異性方法(Herold等，2002;Keymeulen等，2005)。本發(fā)明人制備了自身抗原/MHC復(fù)合物，其在與鐵氧化物顆粒相結(jié)合遞送時，在非常低劑量(對應(yīng)于0.6嗎肽)下有效且一致地擴(kuò)增對自身免疫病提供保護(hù)的CD8+細(xì)胞類別。本發(fā)明的組合物可用于擴(kuò)增之前已存在的記憶自身反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞庫(即，它們看來不能夠從頭誘導(dǎo)記憶T細(xì)胞)。這些之前存在的細(xì)胞庫主要(如果不是全部的話)由低親合力(非致病/抗致病性)自身反應(yīng)性CD8+克隆型構(gòu)成。這些T細(xì)胞的高親合力對應(yīng)物(具有致病活性)在體內(nèi)不以記憶細(xì)胞形式存活，而主要以幼稚T細(xì)胞形式存在。幼稚T細(xì)胞沒有共刺激的情況下接觸自身抗原/MHC/顆粒復(fù)合物后，發(fā)生細(xì)胞死亡，因此本發(fā)明既清除幼稚的致病T細(xì)胞，又?jǐn)U增抗致糖尿病記憶T細(xì)胞。所迷組合物不需要靶向自身反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞優(yōu)勢群體才能有效。在某些實(shí)施方案中，所述組合物和方法可用于誘導(dǎo)自身反應(yīng)性T細(xì)胞耐受。I.藥物組合物和施用本發(fā)明包括預(yù)防或減輕自身反應(yīng)性疾病的方法。由此，本發(fā)明考慮在多個實(shí)施方案中使用"疫苗"或免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑。提出適用于疫苗的組合物可以由自身反應(yīng)性分子(包括自身反應(yīng)性蛋白及其片段)制備。本發(fā)明包括可用于誘導(dǎo)或調(diào)節(jié)針對自身反應(yīng)性抗原(例如多肽、肽、碳水化合物、脂類或其它分子或分子片段)以及針對這些自身免疫應(yīng)答所致疾病或病癥的免疫應(yīng)答的組合物。本發(fā)明的組合物通?？赏ㄟ^注射胃腸外施用，例如，靜脈內(nèi)、皮下23或肌內(nèi)。適用于其它施用模式的其它制劑包括口服制劑?？诜苿┌ǔＫ玫馁x形劑，例如藥用級甘露糖、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。這些組合物采用溶液劑、混懸劑、片劑、丸劑、膠嚢劑、持續(xù)釋放制劑或粉劑的形式，并含有約10%至約95%的活性成分，優(yōu)選約25%至約70%。通常，本發(fā)明的組合物在具有治療有效性和免疫調(diào)節(jié)性的量，以相容于給藥制劑的形式施用。待施用的量取決于待治療受試者。需要施用的活性成分的精確劑量取決于執(zhí)業(yè)醫(yī)師的判斷。但是，合適的劑量從每次施用10納克至數(shù)百納克級別或者微克級別的抗原/MHC/顆粒復(fù)合物。合適的初次施用和加強(qiáng)方案也是多樣的，但是通常為初次施用，然后是后續(xù)施用。應(yīng)用的方式可以多種多樣。任何施用疫苗的常規(guī)方法都可以應(yīng)用。認(rèn)為這些包括在固體生理可接受基質(zhì)上或者在生理可接受分散體系中經(jīng)口施用，通過注射胃腸外施用，等等。抗原/MHC/顆粒復(fù)合物的劑量取決于施用途徑，并且可以根據(jù)受試者的體型大小和健康狀況而改變。在許多例子里，會期望多次施用肽/MHC/顆粒復(fù)合物，最多約或者最少約3、4、5、6、7、8、9、IO或更多次。所述施用通常間隔2天至12周，更通常間隔1周至2周。間隔0,5-5年定期加強(qiáng)(通常2年)對于維持免疫系統(tǒng)的狀況來說是理想的。施用過程之后可以是對自身反應(yīng)性免疫應(yīng)答和T細(xì)胞活性的測定。A.組合療法本發(fā)明的組合物和相關(guān)方法(特別是抗原/MHC/顆粒復(fù)合物的施用)還可聯(lián)合傳統(tǒng)療法的施用一起應(yīng)用。它們包括但不限于施用免疫抑制或調(diào)節(jié)療法或治療。在一個方面中，考慮抗原/MHC/顆粒復(fù)合物與細(xì)胞因子治療聯(lián)合使用?；蛘?，抗原/MHC/顆粒復(fù)合物施用可以在其它治療之前或之后進(jìn)行，其間間隔數(shù)分鐘到數(shù)周。在一些實(shí)施方案中，其它藥劑和/或抗原/MHC/顆粒復(fù)合物分別施用，一般可以確保每次遞送之間不會超過一定的間隔，使得所述藥劑和抗原/MHC/顆粒復(fù)合物仍能夠發(fā)揮對所述受試者的有利聯(lián)合作用。在這些實(shí)例中，設(shè)想可以將兩種形式彼此在約12-24小時之內(nèi)施用，更優(yōu)選地，彼此在約6-12小時之內(nèi)施用。在一些情況下，可能期望將施用時間段顯著延長，但是各次施用間間隔數(shù)天(2、3、4、5、6或7)至數(shù)周(1、2、3、4、5、6、7或8)。可以利用多種組合，例如抗原/MHC/顆粒復(fù)合物施用是"A"，另一藥劑是"B":A/B/AB/A/BB/B/AA/A/BA/B/BB/A/AA/B/B/BB/A/B/BB/B/B/AB/B/A/BA/A/B/BA/B/A/BA/B/B/AB/B/A/AB/A/B/AB/A/A/BA/A/A/BB/A/A/AA7B/A/AA/A/B/A本發(fā)明的肽-MHC復(fù)合物組合物將按照此類化合物的一般方案施用給患者/受試者，并考慮其毒性(如果有的話)。預(yù)計按照需要來重復(fù)治療周期。還考慮可以將多種標(biāo)準(zhǔn)療法例如水化療法(hydration)與所述療法聯(lián)合應(yīng)用。B.藥物組合物在一些實(shí)施方案中，將藥物組合物施用給受試者。本發(fā)明的不同方面包括將有效量的抗原/MHC/顆粒復(fù)合物組合物施用給受試者。另外，這些組合物可以與免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑聯(lián)合施用。這些組合物一般溶解或分散在可藥用栽體或水介質(zhì)中。短語"可藥用"指在施用給動物或人時不產(chǎn)生有害的、變應(yīng)性的或其它不良的反應(yīng)的分子實(shí)體和組合物。如本文所用的，"可藥用載體"包括任何及所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等等。用于藥物活性物質(zhì)的這些介質(zhì)和試劑是本領(lǐng)域公知的。除了與所述活性成分不相容的常規(guī)介質(zhì)或試劑之外，均考慮將其用于免疫原性和治療組合物。本發(fā)明的活性化合物可配制成用于胃腸外施用，例如配制成用于通過靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或者甚至腹膜內(nèi)途徑的注射。在本發(fā)明公開的教導(dǎo)下，含有調(diào)節(jié)受試者免疫疾病的抗原/MHC/顆粒復(fù)合物的含水組合物的制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。通常，這些組合物可被制備成注射劑液體溶液或混懸液；也可以制備成適用于注射之前通過加入液體而制備溶液或混懸液的固體形式;所述制劑還可以是乳化劑。適用于注射應(yīng)用的藥物形式包括無菌水溶液或分散系；包括芝麻油、花生油或丙二醇水溶液的制劑；以及用于臨時制備無菌注射溶液或混懸液的無菌粉劑。在所有情況下，所述形式必須是無菌的，并且必須是易于注射程度的流體。其還應(yīng)該是在制備和儲存條件下穩(wěn)定的，并且必須被保護(hù)以抵抗微生物例如細(xì)菌和真菌的污染作用。所述組合物可被配制成中性或鹽形式。可藥用鹽包括酸加成鹽(與所述蛋白質(zhì)的游離氨基形成)，它是與無機(jī)酸形成的，例如鹽酸或磷酸，或者有機(jī)酸，例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等等。與游離羧基形成的鹽可以來自于無機(jī)堿，例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵，以及有機(jī)堿，例如異丙基胺、三甲基胺、組氨酸、普魯卡因等等。載體還可以是溶劑或分散介質(zhì)，其含有例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)、其合適混合物，以及植物油?？赏ㄟ^例如使用包衣(例如卵磷脂)、通過維持所需粒徑(對于分散體系的情況)，以及通過使用表面活性劑，來保持合適的流動性?？梢酝ㄟ^多種抗菌劑和抗真菌劑(例如對羥基苯曱酸酯類、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等等)來防止微生物的作用。在許多情況下，優(yōu)選包括等滲劑，例如糖或氯化鈉。可通過使用吸收吸附劑的組合物例如單硬脂酸鋁和明膠來得到注射用組合物的延長吸收。可如下制備無菌注射液將所需量的活性化合物摻入按照需要具有多種其它上文所列成分的合適溶劑，然后過濾除菌。一般來說，通過將多種無菌活性成分加入到含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和選自上文所列的所需其它成分的無菌載體來制備分散體系。若是用于制備無菌注射用溶液的無菌粉劑，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，其產(chǎn)生所述活性成分的粉末，加上來自其之前除菌過濾溶液的任何其它所需成分。本發(fā)明組合物的施用通常通過任何常用途徑來實(shí)現(xiàn)。其包括但不限于正位、皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)或者靜脈內(nèi)注射。在一些實(shí)施方案中，疫苗組合物可以被吸入(例如美國專利6,651,655,其通過參考并入本文)。根據(jù)預(yù)定目的確定治療或預(yù)防組合物的有效量。術(shù)語"單位劑量"或"劑量"指適用于受試者的物理上分散的單位，每個單位含有預(yù)定量的組合物，其經(jīng)計算產(chǎn)生上文在論及施用時(即合適的途徑和方案)所述的所需作用。由治療次數(shù)和單位劑量決定的待施用量取決于期望的結(jié)果和/或保護(hù)。組合物的精確量還取決于執(zhí)業(yè)醫(yī)師的判斷，對于每個個體來說都是特有的。影響劑量的因素包括受試者的身體和臨床狀態(tài)、施用途徑、預(yù)定治療目標(biāo)(是減輕癥狀還是治愈)，以及特定組合物的效力、穩(wěn)定性和毒性。在制備后，溶液以與給藥制劑相容的形式以治療或預(yù)防有效量施用。所述制劑以多種給藥形式容易地施用，例如上文所述的注射用溶液類型。c.體外或離體施用如本文所述，術(shù)語"體外施用"指對從受試者中取出的細(xì)胞或者位于受試者之外的細(xì)胞進(jìn)行操作，包括但不限于培養(yǎng)細(xì)胞。術(shù)語"離體施用"指已在體外進(jìn)行過操作的細(xì)胞接著被施用給受試者。術(shù)語"體內(nèi)施用"包括所有在受試者體內(nèi)進(jìn)行的操作，包括施用。在本發(fā)明的一些方面中，所述組合物可以體外、離體或體內(nèi)施用。在一些體外實(shí)施方案中，自體T細(xì)胞與本發(fā)明組合物一起孵育。然后所述細(xì)胞用于體外分析，或者用于離體施用。II.MHC復(fù)合物抗原，包括來源于抗原性物質(zhì)(包括但不限于肽、碳水化合物、脂類或本發(fā)明的經(jīng)典和非經(jīng)典MHC分子所呈遞的其它分子)的區(qū)段、片段或其它分子，通常與MHC分子或其衍生物復(fù)合或有效偶聯(lián)。T淋巴細(xì)胞對抗原的識別是主要組織相容性復(fù)合物(MHC)限制性的。給定T淋巴細(xì)胞僅識別與特定MHC分子結(jié)合的抗原。一般地，T淋巴細(xì)胞僅在自身MHC分子存在時被激活，抗原以與自身MHC分子相結(jié)合的抗原片段的形式被識別。MHC限制性在所識別抗原方面以及與其抗原性片段結(jié)合的MHC分子方面限定了T淋巴細(xì)胞的特異性。在一些具體方面，一些抗原會與特定MHC分子或來源于其的多肽配對。本文所用的術(shù)語"有效連接"或"包被"指在與靶位點(diǎn)(例如免疫細(xì)胞)結(jié)合之前，^^個多肽組分(例如MHC)和抗原性組分(例如肽)27組分相結(jié)合形成活性復(fù)合物。這包括以下情況在施用給受試者之前，在體外合成或重組表達(dá)各個多肽復(fù)合物組分，然后分離并結(jié)合以形成復(fù)合物；嵌合或融合多肽(即所述復(fù)合物每個獨(dú)立的蛋白質(zhì)組分包含在單個多肽鏈中)合成或重組表達(dá)成完整復(fù)合物。通常，將多肽復(fù)合物添加到微米顆粒，以形成吸附有或連接有多肽復(fù)合物的微米顆粒，其分子數(shù):顆粒數(shù)比約為約、至少約或至多約0.1、0.5、1、10、100、500、1000或更多比l，更常見0.1:1至50:1?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)測定所述微米顆粒的多肽成分含量。A.MHC分子細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外抗原在識別和合適應(yīng)答方面都給免疫系統(tǒng)帶來完全不同的挑戰(zhàn)?？乖蔬f到T細(xì)胞是由兩類不同的分子介導(dǎo)的I類MHC(MHC-I)和II類MHC(MHC-II)，它們利用不同的抗原加工途徑。來自胞內(nèi)抗原的肽被在幾乎所有細(xì)胞上表達(dá)的I類MHC分子呈遞給CD8+T細(xì)胞，而來自胞外抗原的肽被II類MHC分子呈遞給CD4+T細(xì)胞。但是，此二分法有一些例外情況。一些研究顯示，從被胞吞的顆?；蚩扇艿鞍桩a(chǎn)生的肽在巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞中的MHC-I分子上呈遞。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，鑒定了來源于自身抗原的特定肽，其在合適的I類或II類MHC多肽背景下在肽/MHC/顆粒復(fù)合物中呈遞。在一些方面中，可評估受試者的遺傳組成，以確定將哪種MHC多肽用于特定患者和特定的肽集合。還考慮將非經(jīng)典MHC分子用于本發(fā)明的MHC復(fù)合物。非經(jīng)典MHC分子是在物種之間非多態(tài)性的、保守的，并具有窄且深的疏水配體結(jié)合口袋。這些結(jié)合口袋能夠?qū)⑻侵土字蔬f給自然殺傷T(NKT)細(xì)胞。NKT細(xì)胞代表一類獨(dú)特的淋巴細(xì)胞群體，其共表達(dá)NK細(xì)胞標(biāo)志物和半恒定T細(xì)胞受體(TCR)。它們參與與許多種疾病相關(guān)的免疫應(yīng)答的調(diào)控。B.抗原性組分本發(fā)明的一些方面包括涉及抗原性組合物的方法和組合物，所述抗原性組合物包括多肽、肽、核酸、碳水化合物、脂類和其它引起或誘導(dǎo)抗原應(yīng)答之分子的區(qū)段、片段或表位，一般稱其為抗原。特別的，可鑒28定通過自身免疫應(yīng)答導(dǎo)致細(xì)胞破壞的自身抗原或這些自身抗原的抗原性區(qū)段或片段，并將其用于產(chǎn)生本文所述的MHC/顆粒復(fù)合物。這些自身抗原可傳遞于胰島或支持胰島細(xì)胞的細(xì)胞上。本發(fā)明的一些實(shí)施方案包括調(diào)節(jié)針對發(fā)揮特定生理功能之特定細(xì)胞或細(xì)胞群的免疫應(yīng)答的組合物和方、法。1。肽組分和蛋白性組分可以通過多種氨基酸缺失、插入和/或替換來修飾本發(fā)明的多肽和肽。在一些特定實(shí)施方案中，經(jīng)修飾的多肽和/或肽能夠調(diào)節(jié)受試者中的免疫應(yīng)答。如本文所述，"蛋白質(zhì)"或"多肽"或"肽，，指包含至少5個氨基酸殘基的分子。在一些實(shí)施方案中，利用野生型形式的蛋白質(zhì)或肽，但是，在本發(fā)明的許多實(shí)施方案中，利用經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)或多肽來產(chǎn)生肽/MHC/顆粒復(fù)合物?？墒褂秒?MHC/顆粒復(fù)合物來產(chǎn)生免疫應(yīng)答和/或修飾免疫系統(tǒng)的T細(xì)胞群(即重新謙導(dǎo)(re-educate)免疫系統(tǒng))。上文所述術(shù)語在本文中可互換使用。"經(jīng)修飾蛋白質(zhì)"或"經(jīng)修飾多肽"或"經(jīng)修飾肽"指化學(xué)結(jié)構(gòu)特別是氨基酸序列相對于野生型蛋白質(zhì)或多肽發(fā)生改變的蛋白質(zhì)或多肽。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)修飾蛋白質(zhì)或多肽或肽至少具有一種經(jīng)修飾的活性或功能(在認(rèn)可蛋白質(zhì)或多肽或肽可具有多種活性或功能的情況下)。特別地，考慮在MHC/顆粒復(fù)合物的背景下，經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)或多肽或肽可以在一種活性或功能方面發(fā)生變化，但是保留其它方面的野生型活性或功能，例如免疫原性或與免疫系統(tǒng)的其它細(xì)胞相互作用的能力。本發(fā)明的肽包括任何自身反應(yīng)性肽。自身反應(yīng)性肽包括但不限于MnsB1018(HLVEALYLV(SEQIDNO:l))、hIGRP228-236(LNIDLLWSV(SEQIDNO:2))、hIGRP265273(VLFGLGFAI(SEQIDNO:3))、IGRP206214(VYLKTNVFL(SEQIDNO:4))、hIGRP206214(VYLKTNLFL(SEQIDNO:5))、NRP誦A7(KYNKANAFL(SEQIDNO:6))、NRP-I4(KYNIANVFL(SEQIDNO:7))、NRP-V7(KYNKANVFL(SEQIDNO:8))、YAI/Db(FQDENYLYL(SEQIDNO:9))和/或INSB15_23(LYLVCGERG(SEQIDNO:IO))以及美國專利公開20050202032中公開的肽和蛋白質(zhì)，其通過參考以整體并入本文。其它可在本發(fā)明中作為自身反應(yīng)性肽或作為對照肽的肽包括但不限于INS隱I9(LYLVCGERI(SEQIDNO:ll))、TUM(KYQAVTTTL(SEQIDNO:12))和G6Pase(KYCLITIFL(SEQIDNO:13))。在一些方面中，可使用1、2、3、4、5、6或更多種肽。可用于本發(fā)明的肽實(shí)例還包括表1中給出的那些。這些肽可以與特定的顆粒/MHC分子相結(jié)合，或者多個肽可以與共同的顆粒和一個或多個MHC分子相結(jié)合。這些肽組合的施用包括施用一組附著有多種肽的顆粒和/或施用各自附著有一種特定肽的多個顆粒的組，或者這些顆粒的組合，其包括l、2、3、4、5、6或更多種顆粒，其附著有l(wèi)、2、3、4、5、6或更多種肽。表1AT1D的I類HLA局限性表位<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>222-230A2228-236A2265-273A2A2YIXLRV1LNI(SEQID,NO:26)LNIDIXWSV(SEQIDNO:27)VLFGLGFAI(SEQIDNO:28)RLLCALTSL(SEQIDNO:29)在T1D患者中檢測到反應(yīng)性在經(jīng)免疫的HHD小鼠中檢測到對來自小鼠IGRP(在2個氨基酸處不同)的對應(yīng)表位的反應(yīng)性在經(jīng)免疫的HHD小鼠和近期發(fā)病的T1D患者中檢測到反應(yīng)性在T1D患者中檢測到反應(yīng)性Jarchumeta/,2008Takakiet"Z.2006Takakiet2幅，Ungeretfl/.2007，Jarchumeta/.2008Ouyangeta/.2006胰島素原L2-10L3-11L6-14B5-14A2A2A2A2B10-18A2B14-22B15-24A3，AllA24B17-25Al,A3B18-27B20-27B21-29B25-C1Al，A2，B8，B18A1，B8A3B8ALWMRLLPL(SEQIDNO:30)LWMRLLPLL(SEQH)NO:31)RLLPLLALL(SEQIDNO:32)HLCGSHLVEA(SEQIDNO:33)HLVEALYLV(SEQIDNO:34)ALYLVCGER(SEQIDNO:35)LYLVCGERGF(SEQIDNO:36)LVCGERGFF(SEQIDNO:37)VCGERGFFYT(SEQIDNO:38)GERGFFYT(SEQIDNO:39)ERGFFYTPK(SEQIDNO:40)FYTPKTRRE(SE(JIDNO:41)在HHD小鼠和T1D患者中檢測到反應(yīng)性在HHD小鼠中檢測到對來自小鼠胰島素原1(在5個氣基酸處不同)的對應(yīng)表位的反應(yīng)性在TID患者中檢測到反應(yīng)性在HHD小鼠中檢測到對來自小鼠胰島素原1(在1個M酸處不同)的對應(yīng)表位的反應(yīng)性在經(jīng)免疫的HHD小鼠和TID患者中檢測到反應(yīng)性在TID患者中檢測到反應(yīng)性在TID患者中檢測到反應(yīng)性在TID患者中檢測到反應(yīng)性在TID患者中檢測到反應(yīng)性在TID患者中檢測到反應(yīng)性在TID患者中檢測到反應(yīng)性在TID患者中檢測到反應(yīng)性Mallonea/.2007，Jarchum"a/.2007Jarchum/2007Malloneat2007Jarchuma/.2007Tomaa/.2005,Hassainyaa/.2005，Pinksea/.2005Tomaa/.2005Tomaa/.2005Tomaa/.2005Tomaeta/.2005，Hassainyaet.al.2005,Tomaa/.2005Tomaa/.2005Tomaa/.2005B27-CSC20-28C25-33C29-A5A1-10A2-10A12-20B8A2A2A2A2A2A2TPKTRREAEDL(SEQ1DNO:42)SL(JPLALEG(SEQIDNO:43)ALEGSLQKR(SE(JIDNO:44)SLQKRGIVEQ(SEQIDNO:45)GIVEQCCTSI(SEQIDNO:46)IVE(JCCTSI(SEQIDNO:47)SLYQLENYC(SEQIDNO:48)在T1D患者中檢測到反應(yīng)性在經(jīng)肽免疫的HHD小鼠中檢測到反應(yīng)性在經(jīng)肽免疫的HHD小鼠中檢測到反應(yīng)性在經(jīng)肽免疫的HHD小鼠中檢測到反應(yīng)性在經(jīng)肽免疫的HHD小鼠中檢測到反應(yīng)性在HHD小鼠中檢測到對來自小鼠胰島素原1(在1個氨基酸處有不同)的對應(yīng)表位的反應(yīng)性在經(jīng)肽免疫的HHD小鼠中檢測到的反應(yīng)性2005Hassainya2005Hassainyae￡2005Hassainya2005Hassainya2005a/.a/.Jarchuma/.2007Hassainyaa/.2005GAD65:65kDa谷氨酸脫羧酶，GFAP:膠質(zhì)原纖維酸性蛋白，IA-2:胰島瘤相關(guān)抗原2，ppIAPP:胰島淀粉樣多肽前體蛋白，IGRP:胰烏特異性葡萄糖-6-褲酸酶催化亞勤目關(guān)蛋白表IBMS的I類HLA限制性表位抗原表位肌A猛醋列注釋參考文獻(xiàn)MAGMAGMAGMBPMOGMOGMOGMOGMOGMOG287-295509-517556-564110-118166-175172-180179-188188-196181-189A2A2A2A2A2A2A2A2A2A2SIXLELEEV(SEQIDNO:49)LMWAKIGPV(SEQIDNO:50)VLFSSDFRI(SEQIDNO:51)SLSRFSWGA(SEQIDNO:52)KVEDPFYWV(SEQIDNO:53)RTFDPHFLRV(SEQIDNO:54)FLRVPCWKI(SEQIDNO:55)KITLFVIVPV(SEQIDNO:S6)VLGPLVALI(SEQIDNO:57)TLFVIVPVL(SEQIDNO:58)被產(chǎn)生自MS患者和健康個體的CD8+T細(xì)胞系所識別被產(chǎn)生自MS患者和健康個體的CD8+T細(xì)胞系所識別被產(chǎn)生自MS患者和健康個體的CD8+T細(xì)胞系所識別被產(chǎn)生自MS患者和健康個體的CD8+T細(xì)胞系所識別在經(jīng)肽免疫的HHD小鼠中檢測到反應(yīng)性在經(jīng)肽免疫的HHD小鼠中檢測到反應(yīng)性在經(jīng)肽免疫的HHD小鼠中檢測到反應(yīng)性在經(jīng)肽免疫的HHD小鼠中檢測到反應(yīng)性在經(jīng)肽免疫的HHD小鼠中檢測到反應(yīng)性在經(jīng)肽免疫的HHD小鼠中檢測到反應(yīng)性Tsuchida"a/.1994Tsuchida1994Tsuchida"A1994Tsuchida"A1994，Jurewicza/.1998Marsa/.2007Marsa/.2007Marsat2007Mars/.2007Marsa/.2007Marsa/.2007RLAGQFLEEL在經(jīng)肽免疫的HHD小鼠中Marsa/.MOG205-214A2^,…，-一，(SEQIDNO:59)檢測到^SJi性2007Tsuchidaeta/.FLYGALLLAPLP80-88A2被產(chǎn)生自MS患者和健康個1994，Dressel(SEQIDNO:60),…，___體的CD8+T細(xì)胞系所識別a/.1997MBP:髓磷脂堿性蛋白，MAG:號褲脂相關(guān)糖蛋白，MOG:號磷脂少突自細(xì)胞糖蛋白，PLP:蛋白脂質(zhì)蛋白在一些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)或多肽(野生型或經(jīng)修飾的)(包括目的蛋白質(zhì)或肽的任何復(fù)合物，特別是MHC/肽融合物)的大小可包含但不限于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1750、2000、2250、2500個氨基分子或更多(包括其中可推導(dǎo)出的任何范圍或值)，或其衍生物。在一些方面中，可4吏用自身抗原中5、6、7、8、9、10或更多個連續(xù)Jl&酸(包括其衍生物)和片段(例如本文公開和參考的那些)作為抗原。考慮可以通過截短對多肽進(jìn)行突變，4吏得其比相應(yīng)野生型更短，但是也可以通過融合或綴合具有特定功能(例如以蛋白復(fù)合物的形式呈遞，以增強(qiáng)免疫原性，等等)的異源蛋白質(zhì)序列而使其改變。本文所使用的"氨基分子"是指本領(lǐng)域中已知的任何氬基酸、氨基酸衍生物或JL^酸模擬物。在一些實(shí)施方案中，蛋白性分子的殘基是連貫的，沒有任何非氨基分子插入在氨基分子殘基的序列中。在另一些實(shí)施方案中，所述序列可包括一個或多個非氨基分子部分。在一些具體實(shí)施方案中，所述蛋白性分子的殘基序列中可插入一個或多個非M分子部分。因此，術(shù)語"蛋白性組分，，涵蓋了包含天然合成蛋白質(zhì)中20種常見氨基酸中至少之一或者包含至少一個經(jīng)修飾或非常見氨基酸的氨基分子序列?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)制備蛋白性組分，所述技術(shù)包括(i)通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)表達(dá)蛋白質(zhì)、多肽或肽,從天然來源分離蛋白性化合物，或(iii)化學(xué)合成蛋白性材料。多個基因的核苷酸以及蛋白質(zhì)、多肽和肽序列之前已經(jīng)公開，并且可以在公認(rèn)的計算機(jī)化數(shù)據(jù)庫中找到。一個這樣的數(shù)據(jù)庫是NationalCenterforBiotechnologyInformation的GenBank和GenPept數(shù)據(jù)庫(互聯(lián)網(wǎng)地址是ncbi.nlm.nih.gov/)。可以使用本文公開的技術(shù)或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)擴(kuò)增和/或表達(dá)這些基因的編碼區(qū)的全部或一部分。這些組合物中自身抗原性表位和其它多肽的M酸序列變體可以是替換、插入或缺失變體。相比于野生型，本發(fā)明多肽中的修飾可以影響肽或多肽的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、32CK321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、4卯、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500個或更多個非連續(xù)或連續(xù)氨基酸?？紤]將導(dǎo)致自身免疫應(yīng)答特別是致病性自身免疫應(yīng)答的肽或多肽用于本發(fā)明方法。缺失變體通常缺少天然或野生型氨基酸序列中的一個或多個殘基?？梢匀笔蝹€殘基或缺失數(shù)個連續(xù)氨基酸?？梢詫⒔K止密碼子(通過替換或插入)引入編碼核酸序列中，以產(chǎn)生截短蛋白質(zhì)。插入突變體通常包括在多肽的非終止位點(diǎn)加入材料。這可以包括插入一個或多個殘基。還可以產(chǎn)生被稱為融合蛋白的末端添加。替換變體通常包含在所述蛋白質(zhì)中的一個或多個位點(diǎn)用一個氨基酸替換另一個，并可設(shè)計成調(diào)節(jié)所述多肽的一個或多個特性，而同時喪失或不喪失其它功能或特性。替換可以是保守的，也就是說，一個氨基酸被形狀和電荷相似的另一個氨基酸所替換。保守替換是本領(lǐng)域公知冬酰胺替換成谷氨酰胺或組氨酸，天冬氨酸替換成谷氨酸，半胱氨酸替換成絲氨酸，谷氨酰胺替換成天冬酰胺，谷氨酸替換成天冬氨酸，甘氨酸替換成脯氨酸，組氨酸替換成天冬酰胺或谷氨酰胺，異亮氨酸替換成亮氨酸或纈氨酸，亮氨酸替換成纈氨酸或異亮氨酸，賴氨酸替換成精氨酸、曱硫氨酸替換成亮氨酸或異亮氨酸，苯丙氨酸替換成酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸，絲氨酸替換成蘇氨酸，蘇氨酸替換成絲氨酸，色氨酸替換成酪氨酸，酪氨酸替換成色氨酸或苯丙氨酸，以及纈氨酸替換成異亮氨酸或亮氨酸。或者，替換可以是非保守的，使得多肽或肽的功能或活性(例如對細(xì)胞受體的親合力或親和性)受到影響。非保守改變通常包括將殘基替換為化學(xué)上不相似的殘基，例如用極性或帶電氨基酸替換非極性或不帶電氨基酸，反之亦然。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以是重組的，或者體外合成的。或者，重組蛋白可以分離自細(xì)菌或其它宿主細(xì)胞。本文使用的術(shù)語"功能等價密碼子"指編碼相同氨基酸的密碼子，例如精氨酸或絲氨酸的6個密碼子，也意為編碼生物學(xué)等價氨基酸的密碼子(參見表2，下文)。表2密碼子表<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>還應(yīng)理解，氨基酸和核酸序列可包含額外殘基，例如分別包含額外的N端或C端氨基酸，或者5，或3，核酸序列，但仍然基本如本文所公開的序列之一，只要所述序列滿足上文給出的標(biāo)準(zhǔn)(包括保持蛋白質(zhì)生物活性(例如免疫原性))即可。末端序列的添加特別適用于核酸序列，例如包含位于編碼序列5，或3，部分任一側(cè)翼的多種非編碼序列。考慮在本發(fā)明組合物中，每毫升中有約0.001mg至約10mg總蛋白。因此，組合物中蛋白濃度可以約為、至少約為或至多約為0.001、0.010、0.050、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、50、100pg/ml或mg/ml或更多(或其中衍生的任何范圍)。其中約、至少約或至多約l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、卯、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%可以是肽/MHC/顆粒復(fù)合物。本發(fā)明考慮施用肽/MHC/顆粒復(fù)合物，以實(shí)現(xiàn)對自身免疫應(yīng)答相關(guān)疾病或病癥的診斷、治療或預(yù)防性療法。另夕卜，美國專利4,554,101(H叩p)教導(dǎo)了以親水性為M從一級絲酸序列中鑒定和制備表位，其通過參考并入本文。通過Hopp中公開的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠從M酸序列中鑒定可能的表位，并確定它們的免疫原性。但是，許多科學(xué)出版物也致力于從Jl^酸序列分析中預(yù)測二級結(jié)構(gòu)，并鑒定表位(Chou&Fasman，1974a，b;1978a,b;1979)。如果需要，可以使用這些技術(shù)中的任意技術(shù)來補(bǔ)充Hopp在美國專利4,554,101中的教導(dǎo)。2.其它抗原性組分可以使用除肽以外的分子作為與MHC分子復(fù)合的抗原或抗原性片段，此類分子包括但不限于碳水化合物、脂類、小分子等。碳水化合物是多種細(xì)胞外表面的主要組分。某些碳水化合物是不同分化階段的特征，并且這些碳水化合物經(jīng)常被特異性抗體所識別。不同碳水化合物的表達(dá)可局限在特定的細(xì)胞類型中。針對子宮內(nèi)膜和血清抗原的自身抗體應(yīng)答已顯示為子宮內(nèi)膜易位的常見特征。已描述了子宮內(nèi)膜易位中針對數(shù)種之前所鑒定抗原(包括2-HS糖蛋白(2-HeremansSchmidtglycoprotein)和碳酸酐酶)的血清自身抗體應(yīng)答，它們對碳水化合物表位具侖特異性(Yeaman等，2002)。C.基質(zhì)/顆粒在一些方面中，抗原/MHC復(fù)合物與基質(zhì)有效連接?；|(zhì)可以是顆粒形式的。顆?？删哂卸喾N尺寸的結(jié)構(gòu)，已知有例如微米球、微米顆粒、納米顆粒、納米球或脂質(zhì)體。這些含有抗原/MHC復(fù)合物的顆?；苿┛梢酝ㄟ^所述復(fù)合物與所述顆粒的共價或非共價偶聯(lián)而形成。本文中"顆粒"、"微米顆粒"、"珠子"、"微米球"和語法上的等同說法意為可施用給受試者的小的離散顆粒。在一些實(shí)施方案中，所述顆粒基本為球形。本文所用的術(shù)語"基本為球形"意為顆粒外形與球形的偏差不超過約10%?？梢詫⒍喾N本發(fā)明的已知抗原或肽復(fù)合物施加給所述顆粒。所述顆粒通常由基本為球形的芯核和任選的一個或多個層組成。所述芯核可為多種尺寸和組成。除了芯核之外，所述顆?？梢跃哂幸粋€或多個層，以提供適于目的應(yīng)用的功能部分。層(如果存在)的厚度可以根據(jù)特定應(yīng)用的需要有所不同。例如，層可以賦予有用的光學(xué)特性。層還可以賦予化學(xué)或生物功能，本文稱為化學(xué)活性或生物學(xué)活性層，就這些功能而言，所述層的厚度通?？梢允羌s0.001微米(1納米)至約10微米或更大(取決于所需粒徑)，這些層通常施加在所述顆粒的外表面。所述芯核和層的組成可以有所不同。用于顆?；蛐竞说暮线m材料包括但不限于聚合物、陶瓷、玻璃、礦物等等。實(shí)例包括但不限于標(biāo)準(zhǔn)玻璃和特種玻璃、二氧化硅、聚苯乙烯、聚酯、聚碳酸酯、丙烯酸聚合物、聚丙烯酰胺、聚丙烯腈、聚酰胺、含氟聚合物、硅酮、纖維素、硅、金屬(例如鐵、金、銀)、礦物(例如紅寶石)、納米顆粒(例如金納米顆粒、膠體顆粒、金屬氧化物、金屬硫化物、金屬硒化物和磁性材料，例如鐵氧化物)，及其復(fù)合材料。所述芯核可以為均質(zhì)組成，或者根據(jù)所需性質(zhì)為兩種或更多種材料的復(fù)合材料。在某些方面中，會使用金屬納米顆粒。這些金屬顆?；蚣{米顆?？梢杂葾u、Pt、Pd、Cu、Ag、Co、Fe、Ni、Mn、Sm、Nd、Pr、Gd、Ti、Zr、Si、和In、前體、其二元合金、其三元合金及其金屬間化合物形成。參見美國專利6，712，997，其通過參考以整體并入本文。如上所述，所述顆粒中除了芯核之外還可包括一個或多個層。在所述微米顆粒中包含層的目的可以是多種多樣的。或者，所述顆粒的表面可以被直接官能化。層可以提供合適的表面，以用于附著化學(xué)官能部分，用作化學(xué)結(jié)合或偶聯(lián)位點(diǎn)。層可以在微米顆粒上以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方式產(chǎn)生。實(shí)例包括溶液-凝膠化學(xué)技術(shù)，例如Iler(1979);Brinker和Scherer(1990)所描述的。其它在顆粒上產(chǎn)生層的方法包括表面化學(xué)和包封技術(shù)，例如Partch和Brown(1998);Pekarek等(1994);Hanprasopwattana(1996);Davies(1998)及其中的未考文獻(xiàn)所描述的。還可以使用氣相沉積技術(shù)，未見例如Golman和Shinohara(2000);和美國專利6，387，498。其它一些方法包括層-層自組裝技術(shù)，例如Sukhorukov等(1998);Caruso等(1998);Caruso等(1999);美國專利6,103,379及其中的參考文獻(xiàn)所描述的?？赏ㄟ^下述步驟產(chǎn)生顆粒將含有抗原/MHC復(fù)合物及聚合物的水相與非水相相接觸，然后蒸發(fā)非7jc相，以使7K相中的顆粒發(fā)生聚并，如美國專利4,589,330或4,818，542中所教導(dǎo)的。用于此制備方法的優(yōu)選聚合物有選自以下的天然或合成的共聚物或聚合物明膠瓊脂、淀粉、阿拉伯半乳聚糖、白蛋白、膠原、聚乙醇酸、聚乳酸、乙交酯-L(-)-丙交酯聚(s-己內(nèi)酯、聚(s-己內(nèi)酯-CO-乳酸)共聚物、聚(s-己內(nèi)酯-CO-乙醇酸)共聚物、聚(p-羥基丁酸)、聚環(huán)氧乙烷、聚乙烯、聚(烷基-2-氰基丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸羥乙酯)、聚酰胺、聚氨基酸、聚(2-羥乙基DL-天冬酰胺)、聚酯脲、聚(L-苯丙氨^/乙二醇/l，6-己二異氰酸酯)和聚(甲基丙烯酸甲酯)。特別優(yōu)選的聚合物是聚酯，例如聚乙醇酸、聚乳酸、乙交酯-L(-)-丙交酯聚(s-己內(nèi)酯、聚(￡-己內(nèi)酯-CO-乳酸)共聚物和聚(e-己內(nèi)酯-CO-乙醇酸)共聚物。可用于溶解所述聚合物的溶劑包括水、六氟異丙醇、亞甲基氯、四氫呋喃、己烷、苯或者六氟丙酮倍半水合物。本文使用的術(shù)語"微米顆粒"指直徑約10nm至約150nm、更優(yōu)選39直徑約200nm至約30pjn、最優(yōu)選直徑約500urn至約.10fim的顆粒。優(yōu)選地，所述微米顆粒的直徑允許胃腸外或粘膜施用而不會堵塞針頭和毛細(xì)血管。通過本領(lǐng)域公知的技^M艮容易測定微米顆粒尺寸，例如光子相關(guān)光語法、激光衍射法和/或掃描電子顯微鏡。術(shù)語"顆粒"還可用于指代本文定義的微米顆粒。對于蛋白遞送系統(tǒng)的更廣泛的綜述，請參見Banga，TherapeuticPeptidesandProteins:Formulation,Processing,andDeliverySystems,TechnomicPublishingCompany,Inc.,Lancaster,Pa.,1995。顆粒化系統(tǒng)包括微米球、微米顆粒、微米膠嚢、納米膠嚢、納米球和納米顆粒。小于約1的顆粒、微球和,嚢一般分別被稱為納米顆粒，納米球和納米膠嚢。微米顆粒通常直徑約100nm，通過皮下或肌內(nèi)施用(參見Kreuter,1994;Tice&Tabibi，1992)。D.將抗原-MHC復(fù)合物與微米顆?；蚣{米顆粒偶聯(lián)為了將所述基質(zhì)或顆粒與抗原-MHC復(fù)合物偶聯(lián)，采用了下列技術(shù)?？赏ㄟ^對基質(zhì)或顆粒進(jìn)行化學(xué)修飾來形成連接，通常包括在表面上產(chǎn)生"官能團(tuán)"，所述官能,團(tuán)能夠與抗原-MHC復(fù)合物結(jié)合，和/或?qū)?連接分子"相連，然后將所述抗原-MHC復(fù)合物與所獲得顆粒反應(yīng)。術(shù)語"連接分子"意為能夠與所述基質(zhì)或顆粒連接并且還能夠與抗原-MHC復(fù)合物相連的物質(zhì)。本文此前所用的術(shù)語"官能團(tuán)"不僅限于形成共價鍵的反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)，還包括導(dǎo)致與所述抗原-MHC復(fù)合物形成離子相互作用或氫鍵的化學(xué)基團(tuán)。另外，應(yīng)注意，嚴(yán)格區(qū)分表面上產(chǎn)生的"官能團(tuán)，，與帶有"官能團(tuán)"的連接分子是不可能的，因?yàn)閷Ρ砻娴男揎椨袝r需要較小的連接分子(例如乙二醇)與所述顆粒表面的反應(yīng)。官能團(tuán)或帶有它們的連接分子可選自氨基、羧酸基、巰基、硫醚、二硫化物、胍基、羥基、胺基、鄰二醇、醛、a-卣代乙酰基、汞有機(jī)物、酯基、酰g、硫酯、酸酐、異氰酸酯、異硫代氰酸酯、磺酰卣、亞胺酯、重氮乙酸酯、重氮鹽、1，2-二酮、磷酸、磷酸酯、磺酸、氮雜內(nèi)酯(azolide)、咪唑、吲哚、N-馬來酰亞胺、a-j5-不飽和羰基化合物、芳基40卣化物或其衍生物。其它更高分子量的連接分子的非限制性實(shí)例有核酸分子、聚合物、共聚物、可聚合偶聯(lián)劑、二氧化硅、蛋白質(zhì)，以及表面具有與所述基質(zhì)或顆粒相反極性的鏈狀分子。核酸可提供與自身含有核酸分子的親和分子的連接，通過所述連接分子的互補(bǔ)序列來實(shí)現(xiàn)。可舉出的可聚合偶聯(lián)劑的實(shí)例有聯(lián)乙炔、苯乙烯丁二烯、乙酸乙烯酯、丙烯酸酯、丙烯酰胺、乙烯基化合物、苯乙烯、硅氧化物、硼氧化物、磷氧化物、硼酸酯、吡咯、聚吡咯和磷酸酯，所述基質(zhì)或顆粒的表面可進(jìn)行化學(xué)修飾，例如通過結(jié)合帶有功能性反應(yīng)基團(tuán)的磷酸衍生物來修飾。這些磷酸或磷酸酯衍生物的一個實(shí)例是亞氨基-雙(甲叉磷酸基)碳酸；其可以通過"Mannich-Moedritzer，，反應(yīng)合成。這一結(jié)合反應(yīng)可以用從制備過程直接獲得的或者預(yù)處理(例如用三甲基硅烷基溴化物)之后的基質(zhì)或顆粒來進(jìn)行。在第一種情況下，磷酸(酯)衍生物例如可以替換反應(yīng)介質(zhì)中仍與所述表面相連的組分。在較高溫度下可增強(qiáng)此替換。另一方面，認(rèn)為三甲硅烷基溴化物使得含有烷基的基于磷酸的絡(luò)合劑脫烷基化，由此產(chǎn)生新的磷酸(酯)衍生物的結(jié)合位點(diǎn)。所述磷酸(酯)衍生物或者與其相連的連接分子可以顯示與如上所述相同的官能團(tuán)。對基質(zhì)或顆粒進(jìn)行表面處理的另一個實(shí)例包括在二醇(例如乙二醇)中加熱。應(yīng)注意，如果已在二醇中進(jìn)行合成，那么這一處理可能是多余的。在這些情況下，直接獲得的合成產(chǎn)物很可能顯示必要的官能團(tuán)。但是，此處理適用于在含N或P的絡(luò)合劑中產(chǎn)生的基質(zhì)或顆粒。如果對這些基質(zhì)或顆粒進(jìn)行乙二醇的后續(xù)處理，那么反應(yīng)介質(zhì)中仍與所述表面相連接的成分(例如絡(luò)合劑)可以被二醇所替換和/或被脫烷基化。還可以用帶有第二官能團(tuán)的伯胺衍生物替換仍與所述顆粒表面連接的含N絡(luò)合劑。所述基質(zhì)或顆粒的表面還可由二氧化硅包被。二氧化硅允許進(jìn)行相對簡單的有機(jī)分子化學(xué)綴合，因?yàn)槎趸枰子谂c有機(jī)接頭(例如三乙氧基珪烷或氯硅烷)發(fā)生反應(yīng)。所述顆粒表面還可以由同聚物或共聚物包被?？删酆吓悸?lián)劑的實(shí)例有N-(3-氨基丙基)-3-巰基苯曱酰胺、3-(三曱SJ^甲硅烷基)丙基酰肼和3-三甲lt^甲硅烷基)丙基馬來酰亞胺。另一些可聚合偶聯(lián)劑的非限制實(shí)例在本文中給出。這些偶聯(lián)劑可用于含有過渡金屬氧化物的基質(zhì)或顆粒的另一種表面修飾技術(shù)是通過氯氣或有機(jī)氯化劑將過渡金屬氧化物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的氯氧化物。這些氯氧化物能夠與生物分子中常見的親核試劑(例如羥基或氨基)反應(yīng)。這一技術(shù)允許產(chǎn)生與蛋白質(zhì)(例如通過賴氨酸側(cè)鏈的氨基)的直接綴合。在用氯氧化物表面修飾后，與該蛋白質(zhì)的綴合還可以用雙功能接頭(例如馬來酰亞胺丙酸酰肼)來實(shí)現(xiàn)。對于非共價連接技術(shù)，具有與所述基質(zhì)或顆粒表面相反之極性或電荷的鏈狀分子是特別合適的?？梢苑枪矁r連接到芯核/殼納米顆粒的連接分子的實(shí)例包括陰離子、陽離子或兩性離子型表面活性劑；酸性或堿性蛋白質(zhì)；聚胺、聚酰胺、聚砜或者聚羧酸?；|(zhì)或顆粒與帶有功能性反應(yīng)基團(tuán)的兩親性試劑之間的疏水相互作用可產(chǎn)生所需連接。具體地，可以使用可彼此交聯(lián)的有兩親特性的鏈狀分子(例如磷脂或衍生多糖)?？赏ㄟ^共孵育將這些分子吸附在所述表面。親和分子與基質(zhì)或顆粒之間的結(jié)合還可以基于非共價自組織鍵。其中一個實(shí)例包括帶有生物素作為連接分子的簡單檢測探針，以及親和素或鏈霉親和素偶聯(lián)分子。用于官能團(tuán)與生物分子偶聯(lián)的方案可以在文獻(xiàn)中找到，例如在"BioconjugateTechniques"(GregT,Hermanson，AcademicPress1996)中。所述生物分子(例如MHC分子或其衍生物)可以按照有機(jī)化學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)步驟(例如氧化、卣化、烷基化、?；?、加成、取代或酰胺化)與所述連接分子共價或非共價偶聯(lián)。可以在將連接分子與基質(zhì)或顆粒偶聯(lián)之前或之后應(yīng)用這些用于偶聯(lián)共價或非共價結(jié)合的連接分子的方法。另外，可以通過孵育的方式將分子與相應(yīng)預(yù)處理(例如通過三甲硅烷基溴化物)的基質(zhì)或顆粒直接結(jié)合，其由于此預(yù)處理而顯示出經(jīng)修飾的表面(例如具有更高電荷或極性的表面)。E.蛋白質(zhì)產(chǎn)生本發(fā)明描述了用于本發(fā)明多個實(shí)施方案的多肽、肽和蛋白質(zhì)。例如，測定了特定肽及其復(fù)合物引發(fā)或調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的能力。在一些具體實(shí)施方案中，還可以根據(jù)常規(guī)技術(shù)在溶液中或固相支持物上合成本發(fā)明肽或蛋白質(zhì)的全部或一部分。有多種市售自動化合成儀，其可以根據(jù)已知方案使用。參見，例如Stewart和Young(1984);Tam等(1983);Merrifield(1986);以及Barany和Merrifield(1979),其均通過參考并入本文?；蛘?，可使用重組DNA技術(shù)，其中將編碼本發(fā)明肽的核苷酸序列插入到表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染進(jìn)合適的宿主細(xì)胞，并且在適于表達(dá)的條件下培養(yǎng)。本發(fā)明的一個實(shí)施方案包括將基因轉(zhuǎn)移入細(xì)胞(包括微生物)用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)。可以將目的蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)移進(jìn)合適的宿主細(xì)胞，然后在合適條件下進(jìn)行培養(yǎng)。可以使用編碼幾乎任何多肽的核酸。重組表達(dá)載體的產(chǎn)生及其中所包含的元件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且在本文中有簡要的討論。哺乳動物宿主細(xì)胞系的實(shí)例包括但不限于Vero和HeLa細(xì)胞，其它B細(xì)胞和T細(xì)胞系，例如CEM、721.221、H9，Jurkat、Raji以及中國倉鼠卵巢細(xì)胞系、W138,BHK，COS-7，293,HepG2，3T3,RIN和MDCK細(xì)胞。另外，可選擇這樣的宿主細(xì)Jf^，其調(diào)節(jié)插入序列的表達(dá)，或者以所需的方式修飾和加工基因產(chǎn)物。蛋白質(zhì)產(chǎn)物的這些修飾(例如糖基化)和加工(例如切割)對于所述蛋白質(zhì)的功能來說可能是重要的。不同的宿主細(xì)胞具有特征性且特定的蛋白質(zhì)翻譯后加工和修飾機(jī)制。可以選擇合適的細(xì)胞系或宿主系統(tǒng)，以確保所表達(dá)外源蛋白質(zhì)的正確修飾和加工。可以使用許多選擇系統(tǒng)，包括但不限于分別用于tk、hgprt或aprt細(xì)胞中的HSV胸苷激酶、次黃噤呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶以及腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因。另外，可以使用抗代謝物抗性作為選擇基礎(chǔ)dhfr,其賦予對甲氧千啶和甲氨蝶呤的抗性；gpt，其賦予對霉酚酸的抗性；neo,其賦予對氨基糖苷G418的抗性；以及hygro,其賦予對潮霉素的抗性。F.核酸本發(fā)明可包括編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)、多肽、肽的重組多核苷酸。包括編碼自身抗原及呈遞自身抗原的MHC分子的核酸序列，其可用于制備肽/MHC復(fù)合物。本申請中所使用的術(shù)語"多核苷酸，，指重組的或者分離的不含全部基因組核酸的核酸分子。術(shù)語"多核普酸，，中包括寡核苷酸(100個殘基或更短的核酸)、重組載體，其包括例如質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒等。在一些方面中，多核苷酸包括與其天然基因或蛋白質(zhì)編碼序列基本分離的調(diào)節(jié)序列。多核苷酸可以是RNA、DNA、其類似物或其組合。在這一方面中，使用術(shù)語"基因"、"多核苷酸"或"核酸"來表示編碼蛋白質(zhì)、多肽或肽的核酸(包括正確轉(zhuǎn)錄、翻譯后修飾或定位所需的任何序列)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，該術(shù)語涵蓋了基因組序列、表達(dá)盒、cDNA序列以及較小的經(jīng)改造核酸片段，其表達(dá)或者可適于表達(dá)蛋白質(zhì)、多肽、結(jié)構(gòu)域、肽、融合蛋白和突變體。編碼多肽全部或一部分的核酸可含有長度為10、20、30、40、50、60、70、80、卯、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、7卯、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、10卯、1095、1100、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、卯00、10000或更多個核苷酸、核苷或>5^對的編碼這些多肽之全部或一部分的連續(xù)核酸序列。還考慮來自給定物種的特定多肽可由含有天然變異的核酸編碼，其具有略微不同的核酸序列，但是仍編碼相同或基本相似的蛋白質(zhì)、多肽或肽。在一些特定實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有編碼自身抗原和/或MHC分子的核酸序列的分離的核酸片段和重組載體。術(shù)語"重組"可以與多肽或特定多肽的名稱一起使用，這通常指由已進(jìn)行過體外操作的核酸分子或這些分子的復(fù)制產(chǎn)物所產(chǎn)生的多肽。本發(fā)明中使用的核酸片段，不論其自身編碼序列的長度如何，都可與其它核酸序列(例如啟動子、多腺苷酸化信號、額外的限制性酶位點(diǎn)、多克隆位點(diǎn)、其它編碼片段等)相連，使得它們的總長可以有顯著的不同。因此，考慮可以使用幾乎任何長度的核酸片段，其總長優(yōu)選受到制備便利性和在預(yù)定重組核酸方案中用途的限制。在一些情況下，核酸序列可編碼具有額外異源編碼序列的多肽序列，例如用于多肽的純化、轉(zhuǎn)運(yùn)、分泌、翻譯后修飾，或者用于治療益處，例如耙向或效力?？梢詫?biāo)簽或其它異源多肽添加到經(jīng)修飾的多肽編碼序列上，其中"異源"指與所述經(jīng)修飾多肽不同的多肽。III.診斷和治療方法A.免疫應(yīng)答和測定如上所述，本發(fā)明涉及引發(fā)或調(diào)節(jié)受試者針對自身抗原的免疫應(yīng)答。在一個實(shí)施方案中，所致免疫應(yīng)答或病癥可為受試者提供針對自身免疫應(yīng)答相關(guān)疾病或癥狀的保護(hù)，或者對患有、懷疑患有與自身免疫應(yīng)答有關(guān)的疾病或癥狀或者具有發(fā)生其風(fēng)險的受試者進(jìn)行治療。1.免疫測定本發(fā)明包括實(shí)施血清學(xué)測定，以評價免疫應(yīng)答是否存在、是否被肽/MHC/顆粒復(fù)合物誘導(dǎo)、引發(fā)或者調(diào)節(jié)，以及評價其程度。可應(yīng)用許多種免疫測定。本發(fā)明涵蓋的免疫測定包括但不限于美國專利4,367,110(雙單克隆抗體夾心測定)和美國專利4,452,901(western印跡)中所述的。其它測定包括體內(nèi)和體外的標(biāo)記配體免疫沉淀和免疫細(xì)胞化學(xué)。一種用于對循環(huán)中抗原特異性CD8+T細(xì)胞數(shù)進(jìn)行定量的方法是四聚體測定。在此測定中，特異性表位與合成四聚體形式的熒光標(biāo)記I類MHC分子結(jié)合。因?yàn)?，CD8+T細(xì)胞識別與I類分子結(jié)合的短肽形式抗原，因此帶有合適T細(xì)胞受體的細(xì)胞會與所述帶標(biāo)記的四聚體結(jié)合，并且可通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行定量。盡管此方法比ELISPOT測定節(jié)省時間，但是四聚體測定僅測量結(jié)合，而不測量功能。并不是所有與特定抗原結(jié)合的細(xì)胞都一定被活化。但是，已經(jīng)證明了ELISPOT、四聚體和細(xì)胞毒性測定之間的相關(guān)性(Goulder等，2000)。免疫測定一般是結(jié)合測定。一些優(yōu)選的免疫測定是多種類型的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射性免疫測定(RIA)或者基于珠的測定，例如Luminex⑧技術(shù)，它們是本領(lǐng)域已知的。使用組織切片的免疫組化檢測也是特別有用的。在一個ELISA實(shí)例中，抗體或抗原被固定在選定的表面上，例如聚丙烯微滴定板的孔、試紙或者柱填料。然后，將懷疑含有預(yù)期抗原或抗體的測試組合物(例如臨床樣品)添加到所述孔中。在結(jié)合并洗滌以45除去非特異性結(jié)合免疫復(fù)合物之后，可檢測所結(jié)合的抗原或抗體。檢測一般通過加入對預(yù)期抗原或抗體有特異性的連接有可檢測標(biāo)記的另一種抗體來實(shí)現(xiàn)。此類ELISA稱為"夾心法ELISA"。檢測還可以通過加入對預(yù)期抗原具有特異性的第二種抗體，然后加入對所述第二種抗體有結(jié)合親和力的第三種抗體來實(shí)現(xiàn)，所述第三抗體與可檢測標(biāo)記相連。對ELISA技術(shù)的修改是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。竟?fàn)幮訣LISA也是可用的，其中測試樣品與已知量的帶標(biāo)記抗原或抗體竟?fàn)幗Y(jié)合。如下測定未知樣品中反應(yīng)物的量在與已包被的孔一起孵育之前或過程中，將所述樣品與已知的標(biāo)記物質(zhì)相混合。所述樣品中反應(yīng)物的存在減少了可用于與孔結(jié)合的標(biāo)記物質(zhì)的量，因此降低了最終的信號。不論釆用什么樣的形式，ELISA都具有一些共同特征，例如包被、孵育或結(jié)合，清洗以除去非特異性結(jié)合的物質(zhì)，和檢測所結(jié)合的免疫復(fù)合物?？乖蚩贵w還可以與固體支持物相連，例如以板、珠子、試紙、膜或者柱基質(zhì)的形式，然后將待分析樣品應(yīng)用于已固定的抗原或抗體。在用抗原或抗體包被板時，一般將所述板的孔與所述抗原或抗體的溶液一起孵育過夜或一段時間。然后洗滌該板的孔，以除去不完全吸附的物質(zhì)。然后用非特異性蛋白質(zhì)"包被，，孔剩余的可用表面，所述非特異性蛋白質(zhì)相對于測試抗血清是抗原中性的。它們包括牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白和奶粉溶液。所述包被使得該固定表面的非特異性吸附位點(diǎn)被封閉，因此減少了由抗血清非特異性結(jié)合到所述表面上造成的背景。在ELISA中，更習(xí)慣使用第二或第三種檢測方式，而不是直接檢測。因此，在所述抗原或抗體與孔結(jié)合之后，用非反應(yīng)性材料包被以減少背景，然后洗滌以除去未結(jié)合材料，在有效允許免疫復(fù)合物(抗原/抗體)形成的條件下，所述固定表面與待檢測的臨床或生物樣品接觸。然后，對所述免疫復(fù)合物的檢測需要帶標(biāo)記的第二種結(jié)合配體或抗體，或者與帶標(biāo)記的第三種抗體或第三種結(jié)合配體相連的第二種結(jié)合配體或抗體。B.評估自身免疫應(yīng)答或病癥除了使用蛋白質(zhì)、多肽和/或肽來治療或預(yù)防自身免疫病之外，本發(fā)明還考慮以多種方式使用這些多肽、蛋白質(zhì)和/或肽，其包括檢測自身抗原或自身免疫病癥的存在，以診斷某些自身反應(yīng)性細(xì)胞群體或病癥的存在。根據(jù)本發(fā)明，檢測自身反應(yīng)性存在的方法包括從個體(例如從其血液、唾液、組織、骨、肌肉、軟骨或皮膚)中獲得樣品的步驟。在分離樣品之后，可實(shí)施利用本發(fā)明多肽、蛋白質(zhì)和/或肽進(jìn)行的診斷測定，以檢測自身反應(yīng)性的存在，用于在樣品中測定這些物質(zhì)的此類測定技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，其包括例如四聚體測定、免疫測定、western印跡分析和/或ELISA測定的方法。本文使用的短語"免疫應(yīng)答，，或其等同形式"免疫學(xué)應(yīng)答，，指發(fā)生針對自身抗原或自身抗原相關(guān)表位的細(xì)胞免疫應(yīng)答(由抗原特異性T細(xì)胞或其分泌產(chǎn)物介導(dǎo))。細(xì)胞免疫應(yīng)答由與I類或II類MHC分子相關(guān)的多肽表位呈遞引發(fā)，其激活抗原特異性CD4+T輔助細(xì)胞和/或CD8+細(xì)胞毒T細(xì)胞。所述應(yīng)答還可涉及其它組分的激活。對于本說明書及所附權(quán)利要求而言，術(shù)語"表位"和"抗原決定簇"可互換使用，表示抗原上被B和/或T細(xì)胞應(yīng)答或識別的位點(diǎn)。B細(xì)胞表位可由連續(xù)氨基酸或者由于蛋白質(zhì)三級折疊而靠近的非連續(xù)氨基酸形成。由連續(xù)氨基酸形成的表位一般在暴露于變性溶劑后仍保持存在，而由三級折疊形成的表位通常在用變性溶劑處理后喪失。表位通常包括至少3個(更常見至少5個或8-10個)呈獨(dú)特空間構(gòu)象的氨基酸。確定表位空間構(gòu)象的方法包括如X射線晶體學(xué)和二維核磁共振。參見，例如EpitopeMappingProtocols(1996)。CD8T細(xì)胞識別約9個^J^酸的連續(xù)表位，而CD4T細(xì)胞識別約13-15個氨基酸。可通過如下方法鑒定識別所述表位的T細(xì)胞通過檢測抗原依賴性增殖(如通過應(yīng)答于表位而引發(fā)的T細(xì)胞的3H-胸苷摻入所確定的(Burke等，1994))的體外測定，通過抗原依賴性殺傷(細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞測定，Tigges等，1996)或者通過細(xì)胞因子分泌?？赏ㄟ^增殖測定(CD4+T細(xì)胞)或CTL(細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞)測定來確定細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的存在情況。如本文和權(quán)利要求中所使用的，術(shù)語"抗體"或"免疫球蛋白"可互換使用，來表示數(shù)類結(jié)構(gòu)上相關(guān)蛋白中的任意種類，其起到動物或受體的免疫應(yīng)答之一部分的功能，所述蛋白質(zhì)包括1gG、IgD、IgE、1gA、IgM和相關(guān)蛋白。任選地，自身抗原(或優(yōu)選的自身抗原表位)可以與其它蛋白(例如MHC和MHC相關(guān)蛋白)化學(xué)綴合或表達(dá)成為融合蛋白。本文使用的術(shù)語"免疫原性物質(zhì)"或"免疫原"或"抗原"可互換使用，以描述能夠在單獨(dú)或者與佐劑聯(lián)合或者在展示載體上施用給受體后誘導(dǎo)針對其自身的免疫應(yīng)答的分子。C.治療方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的方法包括治療由一種或多種自身抗原引起的疾病或病癥?？山o予本發(fā)明的免疫原性多肽，以在患有、懷疑患有自身免疫病癥或疾病或者具有發(fā)生自身免疫病癥或疾病風(fēng)險的人中誘導(dǎo)或調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。對于測試為自身免疫性陽性或者被認(rèn)為具有發(fā)生此類病癥或相關(guān)病癥風(fēng)險的個體，可應(yīng)用該方法。IV.診斷和治療耙標(biāo)本發(fā)明的實(shí)施方案可用于治療或減輕多種免疫介導(dǎo)的疾病或自身免疫病，例如糖尿病、移植排斥等。"自身免疫病，，包括由于針對個體自身的組織或器官而引起的疾病或病癥，或者其表現(xiàn)或由其引起的病癥。在一個實(shí)施方案中，它指由于產(chǎn)生對正常機(jī)體組織和抗原具有反應(yīng)性的T細(xì)胞而導(dǎo)致或者加重的狀況。自身免疫病或病癥的實(shí)例包括但不限于關(guān)節(jié)炎(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎例如急性關(guān)節(jié)炎、慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、急性免疫性關(guān)節(jié)炎、慢性炎癥性關(guān)節(jié)炎、退行性關(guān)節(jié)炎、II類膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎、感染性關(guān)節(jié)炎、萊姆關(guān)節(jié)炎、增殖性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、斯蒂爾病(Still'sdisease)、脊堆關(guān)節(jié)炎和青少年發(fā)病的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、進(jìn)行性慢性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)炎變形、原發(fā)性慢性多發(fā)性關(guān)節(jié)炎(polyarthritischronicaprimaria)、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎和僵硬性脊推炎)，炎癥性高增殖皮膚病，銀屑病如斑塊型銀屑病、gutatte銀屑病、膿皰型銀屑病和指甲銀屑病，遺傳性過敏癥(atopy)包括特應(yīng)性過敏疾病例如花粉熱和喬布祭合征，皮炎包括接觸性皮炎、慢性接觸性皮炎、剝脫性皮炎、變應(yīng)性皮炎、國民接觸性皮炎、皮炎皰滲、錢幣狀皮炎、脂溢性皮炎、非特異性皮炎、原發(fā)刺激性接觸性皮炎和特應(yīng)性皮炎,X連鎖高IgM綜合征，變應(yīng)性眼內(nèi)炎性疾病，風(fēng)滲例如慢性變應(yīng)性風(fēng)滲和慢性先天性風(fēng)滲、包括慢性自身免疫性風(fēng)滲，肌炎，多肌炎/皮肌炎，青少年皮肌炎，毒性表皮壞死松解，硬皮病(包括全身性硬皮病)，硬化癥例如全身性硬化、多發(fā)性硬化(MS)例如脊推-目艮部多發(fā)性硬化(spino-叩ticalMS)、原發(fā)進(jìn)展型MS(PPMS)和復(fù)發(fā)緩解型MS(RRMS)、選艮型全身性硬化、動脈硬化、動脈硬化、播散型硬化、共濟(jì)失調(diào)型硬化、視神經(jīng)脊髓炎(NMO)、炎性腸病(IBD)(例如克羅恩病、自身免疫介導(dǎo)胃腸病、結(jié)腸炎例如潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)腸炎潰瘍、微小性結(jié)腸炎、膠原性結(jié)腸炎、結(jié)腸炎息肉、壞死性小腸結(jié)腸炎和透皮性結(jié)腸炎，以及自身免疫性炎性腸病)，腸炎癥，壞疽性膿皮病，結(jié)節(jié)性紅斑，原發(fā)性硬化性膽管炎，呼吸窘迫綜合征包括成年或急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、腦膜炎，葡萄膜全部或部分的炎癥，虹膜炎，脈絡(luò)膜炎，自身免疫性血液病，類風(fēng)濕性脊推炎，類風(fēng)濕性滑膜炎，遺傳性血管性水肺，如腦膜炎中的顱神經(jīng)損傷，，皰滲，陰嚢瘙癢病，自身免疫性卵巢早衰，由于自身免疫狀況導(dǎo)致的突發(fā)性聽覺喪失，IgE介導(dǎo)的疾病例如過^:反應(yīng)以及變應(yīng)性及特應(yīng)性鼻炎、腦炎例如拉斯馬森腦炎(Ras畫sen，sencephalitis)和邊緣系統(tǒng)和/或腦干腦炎，葡萄膜炎例如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽腫性葡萄膜炎、晶狀體抗原性葡萄膜炎、非肉芽腫性葡萄膜炎、晶狀體抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎，帶有和不帶有腎病變綜合征的腎小球腎炎(glomerulonephritis，GN)例如慢性或急性腎小球腎炎如原發(fā)性GN、免疫介導(dǎo)的GN、膜性GN(膜性腎病)、先天性膜性GN或先天性膜性腎病、膜性或膜性增生性GN(membranousproliferativeGN，MPGN)包括I類和II類、以及快速進(jìn)展型GN、增生性腎炎、自身免疫性多腺體內(nèi)分泌衰竭、龜頭炎包括漿細(xì)胞性局限性龜頭炎、包皮龜頭炎，離心性環(huán)形紅斑，持久性色素異常性紅斑，多形紅斑，光澤苔蘚，硬化萎縮性苔癬，慢性單純性莒蘚，小棘苔蘚，扁平苔蘚，板層狀魚鱗病，表皮松解性角化過度，癌前角化，壞疽性膿皮病，過敏性狀況和應(yīng)答，過敏反應(yīng)，濕滲包括過敏性或遺傳過敏性濕瘆、干性濕滲、出汗障礙性濕滲和嚢泡型掌跖濕滲，津喘例如哞喘性支氣管炎、支氣管哮喘和自身免疫性哮喘，涉及T細(xì)胞浸潤和慢性炎癥應(yīng)答的狀況，抗外源抗原的免疫應(yīng)答例如懷孕期間的胎兒A-B-O血型，慢性肺炎癥性疾病，自身免疫性心肌炎，白細(xì)胞粘附缺陷，狼瘙包括狼疾性腎炎、狼瘡性腦炎、小兒狼瘡、非腎源性狼掩、腎外狼瘡、盤狀狼疾和盤狀紅斑狼瘡、脫發(fā)性狼瘙、系統(tǒng)性紅斑l良掩(systemiclupuserythematosus,SLE)例如皮膚SLE或亞急性皮趺SLE、新生兒狼掩綜合征(neonatallupussyndrome,NLE)，和散播型紅斑狼瘙，青少年發(fā)病的(I型)糖尿病包括小兒胰島素依賴型糖尿病(insulin-dependentdiabetesmellitus,IDDM),以及成AJL病的糖尿病(II型糖尿病)。還考慮了與細(xì)胞因子和T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的急性和延遲性超敏反應(yīng)相關(guān)的免疫應(yīng)答，結(jié)節(jié)病，肉芽胂包括淋巴瘤樣肉芽腫、韋格納肉芽腫(Wegener'sgranulomatosis),粒細(xì)胞缺乏癥，血管炎包括血管炎、大血管血管炎(包括風(fēng)濕性多肌痛和巨細(xì)胞(Takayashu)動脈炎)、中血管血管炎(包括川崎病和結(jié)節(jié)性多動脈il/結(jié)節(jié)性外周動脈炎)、微小多動脈炎、免疫性血管炎、CNS血管炎、皮膚血管炎、超敏血管炎、壞死性血管炎例如全身壞死性血管炎和ANCA相關(guān)性血管炎例如變應(yīng)性肉芽腫血管炎或綜合征(Churg-Strausssyndrome,CSS)和ANCA相關(guān)性小血管血管炎、顳動脈炎，再生障礙性貧血，自身免疫性再生障礙性貧血，Coombs試驗(yàn)陽性貧血，先天性純紅細(xì)胞再生障礙性貧血，溶血性貧血或免疫性溶血性貧血包括自身免疫性溶血性貧血(autoimmunehemolyticanemia,AIHA)，艾迪生病，自身免疫性嗜中性白細(xì)胞減少癥，全血細(xì)胞減少癥，白細(xì)胞減少癥，與白細(xì)胞滲出有關(guān)的疾病，CNS炎性疾病，阿爾茨海默病，帕金森病，多器官損傷綜合征例如繼發(fā)于敗血癥、外傷或出血的那些，抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾病，批腎小球基質(zhì)膜病，抗磷脂抗體綜合征，變應(yīng)性神經(jīng)炎，白塞病/綜合征，Castleman綜合征，Goodpasture綜合征，Reynaud綜合征，Sjogren綜合征，史-約綜合征，類天皰瘡例如大皰性類天皰疳和皮膚類天皰掩，天皰療(包括尋常型天皰齊、落葉型天皰療、pemphigusmucus-membranepemphigoid和紅斑型天皰瘙)，自身免疫性多內(nèi)分泌疾病，賴特爾病或綜合征，熱損傷，子癇前期，免疫復(fù)合物疾病例如免疫復(fù)合物性腎炎、抗體介導(dǎo)性腎炎，多發(fā)性神經(jīng)病，慢性神經(jīng)病例如IgM多發(fā)性神經(jīng)病或IgM介導(dǎo)的神經(jīng)病，自身免疫性或免疫介導(dǎo)的血小板減少例如先天性血小板減少性紫癜(idiopathicthrombocytopenicpurpura,ITP)包括慢性或急性ITP,鞏膜炎例如先天性cerato-鞏膜炎、表層鞏膜炎，睪丸和卵巢的自身免疫病包括自身免疫性睪丸炎和卵巢炎，原發(fā)性甲狀腺功能減退癥，曱狀旁腺功能減退癥，自身免疫性內(nèi)分泌病包括甲狀腺炎例如自身免疫性甲狀腺炎、橋本病、慢性甲狀腺炎(橋本甲狀腺炎)或者亞急性甲狀腺炎，自身免疫性甲狀腺病，先天性甲狀腺機(jī)能減退，格氏眼病，多腺體綜合征例如自身免疫性多腺體綜合征(或多腺體內(nèi)分泌病綜合征)，副癌綜合征包括神經(jīng)副癌綜合征例如萊-伊二氏肌無力綜合征或類重癥肌無力綜合征，僵人綜合征，腦脊髓炎例如過敏性腦脊髓炎或腦脊髄炎過敏癥和實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(experimentalallergicencephalomyelitis，EAE)，重癥肌無力例如胸腺瘤相關(guān)重癥肌無力，小腦變性，神經(jīng)性肌強(qiáng)直，眼陣攣-肌陣攣綜合征(opsoclonusoropsoclonusmyoclonussyndrome,OMS)，和感覺神經(jīng)病，多病灶運(yùn)動神經(jīng)病，席漢氏癥，自身免疫性肝炎，慢性肝炎，巨細(xì)胞肝炎，慢性活躍性肝炎或自身免疫性慢性活躍性肝炎，淋巴細(xì)胞性間質(zhì)性肺炎(lymphoidinterstitialpneumonitis,LIP)，閉塞性細(xì)支氣管炎(非移植)vsNSIP，格林-巴利綜合征，伯格氏病(IgA腎病)，先天性IgA腎病，線性IgA皮膚病，急性發(fā)熱性嗜中性皮膚病，角層下膿皰病，暫時性棘層松解性皮膚病，肝硬化例如原發(fā)性膽汁性肝硬化和肝石更變，自身免疫性腸病綜合征，腹腔病，口炎性腹瀉(麩質(zhì)腸病)，頑固性口炎性腹瀉，先天性口炎性腹瀉，冷球蛋白血癥，肌萎縮惻索>5更化(amylotrophiclateralsclerosis,ALS)(洛蓋赫里格病)，冠狀動脈疾病，自身免疫性耳病例如自身免疫性內(nèi)耳病(autoimmuneinnereardisease,AIED),自身免疫性聽覺喪失，多軟骨炎例如頑固性或復(fù)發(fā)性多軟骨炎，肺泡蛋白沉積癥，科干綜合征/非梅毒性角膜間質(zhì)炎，面神經(jīng)麻痹，Sweet病/綜合征，自身免疫性酒糟鼻，帶狀皰疹相關(guān)疼痛，淀粉樣變性病，非癌癥淋巴細(xì)胞增多，原發(fā)性淋巴細(xì)胞增多，其包括單克隆B細(xì)胞增多(例如溫和性單克隆丙種球蛋白病和意義未明單克隆丙種球蛋白病(monoclonalgammopathyofundeterminedsignificance,MGUS))，夕卜周神經(jīng)病，副癌綜合征，離子通道病例如癲癇、偏頭痛、心律不齊、肌肉病、耳聾、盲、周期性麻痹和CNS的離子通道病，孤獨(dú)癥，炎癥性肌病，局灶性或節(jié)段性或局灶節(jié)段性腎小^f更4t癥(focalsegmentalglomerulosclerosis,FSGS)，內(nèi)分泌'性目艮病,葡萄膜視網(wǎng)膜炎，脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎，自身免疫性肝病，纖維肌痛，多內(nèi)分泌衰竭，施密特氏綜合征，腎上腺炎，胃萎縮，早老性癡呆，脫髓鞘疾病例如自身免疫性脫髓鞘疾病和慢性炎癥性脫髓鞘多神經(jīng)病，心肌梗塞后綜合征，嚴(yán)重脫發(fā)(alopeciagreata)，完全脫發(fā)(alopeciatotalis)，CREST(calcinosis,Raynaud'sphenomenon,esophagealdysmotility,sclerodactylyandtelangiectasia)綜合征(鈣質(zhì)沉著、雷諾現(xiàn)象、食道運(yùn)動功能障礙、指端硬化和毛細(xì)血管擴(kuò)張)，男性和女性自身免疫性不育例如由于抗精子抗體所導(dǎo)致的，混合型結(jié)締組織病，查格斯病，風(fēng)濕熱，習(xí)慣性流產(chǎn)，農(nóng)民肺，多形紅斑，心臟術(shù)后綜合征，Cushing綜合征，養(yǎng)鳥AJ^，變應(yīng)性肉芽肺性血管炎，良性淋巴脈管炎，奧爾波特綜合征，肺泡炎例如過敏性肺泡炎和纖維性肺泡炎，間質(zhì)性肺病，輸血反應(yīng)，麻風(fēng)病，瘧疾，寄生蟲病，例如利什曼病，kypanosomiasis，血吸蟲病，蛔蟲病，曲霉菌病，Sampter綜合征，Caplan綜合征，登革熱，心內(nèi)膜炎，心內(nèi)膜心肌纖維炎，彌漫性肺間質(zhì)纖維化，肺間質(zhì)纖維化，肺纖維化，特發(fā)性肺纖維化，嚢性纖維化，眼內(nèi)炎，持久性隆起性紅斑，胎兒有核紅細(xì)胞增多癥，嗜酸性筋膜炎，Shulman綜合征，F(xiàn)elty綜合征，絲蟲病，睫狀體炎例如變應(yīng)性睫狀體炎，異時性睫狀體炎，虹膜睫狀體炎(急性或慢性)，或Fuch睫狀體炎，過敏性紫癜，人類免疫缺陷病毒(HIV)感染，SCID,獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)，?？刹《靖腥?，敗血癥，內(nèi)毒素血癥，胰腺炎，甲狀腺毒癥，細(xì)小病毒感染，風(fēng)滲病毒感染，免疫接種后綜合征，先天性風(fēng)滲病毒感染，EB病毒感染，流行性腮腺炎，Evan綜合征，自身免疫性性腺失效，Sydenham舞蹈癥，鏈球菌感染后腎炎，血栓閉塞性脈管炎，甲亢，脊髓癆，脈絡(luò)膜炎，巨細(xì)胞多肌疼，慢性過敏性肺炎，干燥性角結(jié)膜炎，流行性角結(jié)膜炎，原發(fā)性腎病綜合征，微小病變腎病，良性家族病和缺血再灌注損傷，移植器官再灌注損傷，視網(wǎng)膜自身免疫性疾病，關(guān)節(jié)炎癥，支氣管炎，慢性阻塞性氣管/肺病，矽肺，口奄，口疾性口腔炎，動脈硬化，asperniogenese，自身免疫性溶血，Boeck病，冷球蛋白血癥，掌腱膜攣縮癥，endophthalmiaphacoanaphylactica，變應(yīng)性腸炎，麻風(fēng)結(jié)節(jié)性紅斑，特發(fā)性面^t經(jīng)麻痹，慢性疲勞綜合征，風(fēng)濕熱，Hamman-Rich病，感覺神經(jīng)性聽覺喪失，血紅蛋白尿paroxysmatica,性腺機(jī)能減退，局限性回腸炎，白細(xì)胞減少癥，感染性單核細(xì)胞增多，橫貫性脊髓炎，原發(fā)性特發(fā)性粘液水腫，腎病，ophthalmiasymphatica，肉芽肺性睪丸炎，胰腺炎，急性多發(fā)性神經(jīng)根炎，壞疽性膿皮病，亞急性甲狀腺炎，獲得性脾萎縮，良性胸腫瘤，白痰風(fēng)，毒性休克綜合征，食物中毒，與T細(xì)胞浸潤有關(guān)的病癥，白細(xì)胞黏附缺陷癥，與細(xì)胞因子和T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的急性和延遲超斜目關(guān)的免疫應(yīng)答，與白細(xì)胞浸潤相關(guān)的病癥，多器官損傷綜合征，抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾病，抗腎小球基質(zhì)膜病，變態(tài)反應(yīng)性神經(jīng)炎,自身免疫性多內(nèi)分泌腺疾病，卵巢炎，原發(fā)性粘液水腫，自身免疫性萎縮性胃炎，交感性眼炎，風(fēng)濕性疾病，混合性結(jié)締組織病，腎病綜合征，胰島炎，多內(nèi)分泌腺衰竭，I型自身免疫性多腺體綜合征，成年特發(fā)性甲狀旁腺功能減退癥(AOIH)，心肌病例如擴(kuò)張性心肌病，后天性大皰性表皮爭〉解(epidermolisisbullosaacquisita，EBA)，血色素沉著癥，病毒性心肌炎，腎病綜合征，原發(fā)性硬化性膽管炎，化膿或非化膿性鼻竇炎，急性或慢性鼻竇炎，篩竇炎，額竇、頜竇或蝶竇鼻竇炎，嗜酸性粒細(xì)胞相關(guān)疾病例如嗜酸性粒細(xì)胞增多，肺浸潤嗜酸性粒細(xì)胞增多，嗜酸性粒細(xì)胞增多肌疼綜合征，Loffler綜合征，慢性嗜酸性粒細(xì)胞肺炎，熱帶嗜酸粒細(xì)胞增多癥，支氣管肺炎曲霉病，曲霉腫，或含嗜酸性粒細(xì)胞的肉芽腫，過敏反應(yīng)，血清陰性脊柱關(guān)節(jié)病，多內(nèi)分泌腺自身免疫性疾病，硬化性膽管炎，鞏膜，鞏膜外層，慢性粘膜皮膚念珠菌病，Bruton綜合征，嬰兒暫時性丙種球蛋白血癥，Wiskott-Aldrich綜合征，共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張綜合征，血管擴(kuò)張，與膠原疾病相關(guān)的自身免疫病，風(fēng)濕病，神經(jīng)病，淋巴腺炎，血壓應(yīng)答降低，血管功能障礙，組織損傷，心血管缺血，痛覺過敏，腎缺血，腦缺血，和血管形成有關(guān)的疾病，過^i敏疾病，腎小球腎炎(glomerulon印hritides)，再灌注損傷，缺血性再灌注疾病，心肌或其它組織的再灌注損傷，淋巴瘤氣管支氣管炎，炎癥性皮膚病，具有急性炎癥性組分的皮膚病，多器官衰竭，大皰性疾病，腎皮質(zhì)壞死，急性化膿性腦膜炎或其它中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥疾病，眼或眼眶炎癥性疾病，粒細(xì)胞輸注相關(guān)綜合征，細(xì)胞因子誘導(dǎo)毒性，發(fā)作性睡病，急性重癥炎癥，慢性頑固性炎癥，腎盂腎炎，動脈內(nèi)增生，胃潰瘍，心臟瓣膜炎和子宮內(nèi)膜異位。V.實(shí)施例為說明本發(fā)明的多種實(shí)施方案，給出了下述實(shí)施例，其不意為以任何方式限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，本發(fā)明非常適于實(shí)現(xiàn)所述目的，獲得所述結(jié)果和優(yōu)點(diǎn)及其固有的目的、結(jié)果和優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)施例與其中所述的方法代表目前優(yōu)選的實(shí)施方案，其為示例性的，不意為對本發(fā)明范圍的限制。如權(quán)利要求書范圍限定的本發(fā)明構(gòu)思所涵蓋的其改變和其它用途對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是^f艮明顯的。實(shí)施例1通過用肽/MHC包被的納米顆粒進(jìn)行處理實(shí)現(xiàn)的T1D保護(hù)通過用NRP-V7/Kd單體包被的超順磁性納米顆粒進(jìn)行處理來實(shí)現(xiàn)的糖尿病保護(hù)。為了研究NRP-V7/Kd包被的納米顆粒是否在體內(nèi)致耐受，通過數(shù)次靜脈內(nèi)注射小體積顆粒(5帶有0.6嗎的NRP-V7，每3天1次)來處理8.3-TCR-轉(zhuǎn)基因NOD小鼠(下文也被稱為8.3-NOD或Val7。4十TCR-TG小鼠)。在3次給藥中顯著清除了這些小鼠的轉(zhuǎn)基因高親合力IGRP2。6^4反應(yīng)性脾CD8+T細(xì)胞辦脾CD8:CD4比例從4下降至~1X圖1A)。少數(shù)未清除的CD8+T細(xì)胞顯示如評估CD44表達(dá)所確定的前激活(prioractivation)特征(圖1B)，并且其在體外對抗原刺激表現(xiàn)低應(yīng)答，表明所述處理使得它們不應(yīng)答(圖1C)。為了研究"多重化，，的有效性，用6種不同的肽/MHC單體包被順磁珠(本文稱其為"珠子"、"納米顆粒"或"叩，，)。用這些珠子、以對照肽(TUM)/K41包被的珠子或以NRP-V7/Kd包被的珠子處理野生型NOD小鼠群體(預(yù)計與NRP-V7類似，NRP-V7/Kd包被的珠子會清除整個IGRP2。6-2M反應(yīng)性群體，但不提供糖尿病保護(hù)(Han等,2005))。令人驚奇的是，與用未包被的珠子、親合素-生物素包被的珠子(本文也稱為"生物素-np")、TUM/Kd-包被的珠子或僅以NRP-V7肽(Han等2005)處理的小鼠不同，用NRP-V7/Kd包被的珠子處理的NOD小鼠(每2-3周一次)得到對T1D的高度保護(hù)(圖2)。通過用NRP-V7/Kd單體包被的超順磁納米顆粒處理來全身性擴(kuò)增低親合力克隆型。使用放射性標(biāo)記的珠子進(jìn)行的研究顯示，像根據(jù)其小尺寸所預(yù)計的一樣，在所檢測的所有年齡下，在單次注射24小時內(nèi)其組織分布是全身性的(圖3)。對處理小鼠血清中一些細(xì)胞因子和趨化因子水平的檢測進(jìn)一步表明，np處理未誘導(dǎo)"細(xì)胞因子風(fēng)暴，，(即由于剌激多種免疫細(xì)胞類型(包括NRP-V7反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞)所導(dǎo)致的細(xì)胞因子血清水平提高)(圖4)。然而，最引人注意的是，在跟蹤觀察期(32周)結(jié)束時，與用對照納米顆粒處理的年齡匹配非糖尿病動物相比，用NRP-V7/Kd包被的珠子處理的小鼠中循環(huán)及胰島內(nèi)NRP-V7/Kd四聚體+CD8+細(xì)胞群顯著提高(圖5A)。值得注意的是，NRP-V7/Rd納米顆粒處理小鼠的胰島內(nèi)CD8+T細(xì)胞結(jié)合NRP-V7/Kd四聚體的親合力比對照小鼠胰島中所存在的那些低得多(更高的Kd)，表明所述納米顆粒處理刺激了非致病性低親合力克隆型的擴(kuò)增，而減少其致病性高親合力對應(yīng)物(圖5B)。這些作用是劑量依賴性的，因?yàn)橛幂^低劑量處理的小鼠對糖尿病的保護(hù)低得多(圖5C)，并且胰島和脾中四聚體+CD8+T細(xì)胞百分比更低(圖5D,和數(shù)據(jù)未顯示)。另夕卜，每次給藥的作用似乎是累加性的，因?yàn)榻邮?0次連續(xù)納米顆粒給藥(在10周齡時開始，兩次/周)的小鼠具有比僅接受4次給藥(也從10周齡開始)的小鼠高得多的循環(huán)四聚體+CD8+T細(xì)胞百分比(圖5E)。上述結(jié)果顯示，NRP-V7/K/Kd包被的np被NRP-V7反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞(通過其TCR)特應(yīng)性識別和才IUV。為了研究這一情況，本發(fā)明人評估了表達(dá)轉(zhuǎn)基因NRP-V7反應(yīng)性TCR的NOD小鼠及野生型非轉(zhuǎn)基因NOD小鼠中不同脾細(xì)胞亞群中綠色熒光的存在情況(與所述肽-MHCnp復(fù)合物中的親合素分子結(jié)合)。在NRP-V7/Kdnp注射的24-40小時內(nèi)，僅可在TCR轉(zhuǎn)基因小鼠的CD8+T細(xì)胞亞群中檢測到綠色焚光(圖6A)，并在非轉(zhuǎn)基因小鼠的CD8+T細(xì)胞亞群中檢測到程度低得多的綠色熒光(圖6B)。在任一類型小鼠的脾CD4+T、B、CDllb+或CDllc+細(xì)胞亞群中均未檢測到可檢出的綠色熒光積累(圖6A和6B)。由次要自身抗原性肽/MHC(DMK138.146/Db)復(fù)合物包被的超順磁納米顆粒的抗致糖尿病特性。本發(fā)明人研究了上述處理途徑的保護(hù)作用是NRP-V7反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞(NOD小鼠中占優(yōu)勢的自身反應(yīng)性T細(xì)胞亞群)的獨(dú)特性質(zhì)，還是也適用于其它次要自身抗原性特異類型的現(xiàn)象。為此，用來源于另一種自身抗原的肽包被的珠子處理小鼠，所述自身抗原通過Db呈遞，并被小得多的致糖尿病自身反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞群所乾向(強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良激酶(DystrophiaMyotonicsKinase,DMK)殘基138-146;本文稱其為"DMK138-146/Db，，XLieberman等，2004)。與用NRP-V7/Kd復(fù)合物包被的納米顆粒情況一樣，用DMK138.146/Db包被的納米顆粒處理NOD小鼠導(dǎo)致循環(huán)中、脾和胰島內(nèi)的DMKu8446/Db反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞顯著擴(kuò)增(圖7A)，并提供顯著的糖尿病保護(hù)(圖7B)。體內(nèi)的T細(xì)胞擴(kuò)增是抗原特異性的，因?yàn)镈MK138.146/Db包被的納米顆粒不擴(kuò)增NRP-V7反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞(圖7C)，并且NRP-V7/Kd包被的納米顆粒不擴(kuò)增DMK^"6/Db反應(yīng)性T細(xì)胞(圖7D)。圖7E顯示代表性FACS染色i普。在用NRP-V7/Kd或DMK138.146/Db包被的納米顆粒處理的小鼠中其它IGRP自身反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞特異性募集到胰島的情況削弱。接著，本發(fā)明人研究了納米顆粒所擴(kuò)增低親合力NRP-V7和/或DMK138_146/Db反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞的募集是否如APL處理的動物一樣(Han等2005)削弱了其它p細(xì)胞自身反應(yīng)性T細(xì)胞特異性募集到胰島。這通過比較用對照、NRP-V7或DMK138-146/Db包被的納米顆粒處理小鼠的胰島相關(guān)CD8+T細(xì)胞與一組76種不同1GRP表位以及DMK138_146的應(yīng)答來進(jìn)行。如預(yù)計地，由于它們含有頻率增加的NRP-V7或DMK^"/Db反應(yīng)性克隆型，因此用NRP-V7包被的和DMK138-146/Db包被的納米顆粒處理的小鼠胰島相關(guān)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答于NRP-V7和0]\^138-146分別比從對照小鼠中所分離細(xì)胞產(chǎn)生明顯更多的IFN-Y(圖8)。特別地，相比于用對照納米顆粒處理的小鼠，能夠?qū)τ肗RP-V7/Kd或DMK^46/Db包被納米顆粒處理的小鼠的胰島相關(guān)CD8十T細(xì)胞引發(fā)顯著IFN-Y應(yīng)答的表位數(shù)量顯著減少，表明募集和/或積累受損(表3)。表3、在用對照納米顆粒或者NRP-V7/Kd或DMKu8446/Db單體包被的納米顆粒處理的小鼠中胰島相關(guān)CD8+T細(xì)胞對一組IGRP表位的反應(yīng)性。小鼠每2-3周一次接受一劑靜脈內(nèi)注射納米顆粒，自4周齡開始。這些樣品來自處理結(jié)束時(32周齡)的小鼠。對胰島相關(guān)€08+T細(xì)胞測定應(yīng)答于肽脈沖刺激抗原呈遞細(xì)胞的IFN-y產(chǎn)生，以及計數(shù)得到的陽性(>50pg/ml)和陰性(<50pg/ml)應(yīng)^lt。NRP-V7/Kd和DMK138.146/Db包被的納米顆粒在新發(fā)病糖尿病NOD小鼠中誘導(dǎo)高比例的糖尿病好轉(zhuǎn)。處理在糖尿病前階段中的有效性使得我們開始研究納米顆粒處理在新診斷的糖尿病小鼠中恢復(fù)正常血糖水平的能力。每周兩次檢測小鼠群體的血糖水平，判定^10.5mM血糖為高血糖。使小鼠隨機(jī)接受TUM/Kd包被的納米顆粒或NRP-V7/Kd包被的納米顆粒(每周注射一次，共兩次)。每天一次對出現(xiàn)糖尿的小鼠皮下施用半個單位的胰島素，以減少p細(xì)胞應(yīng)激，并促進(jìn)p細(xì)胞再生。另外的小鼠群體接受DMK138-146/Db包被的納米顆粒。用單克隆抗CD3抗體(20ng/天，共5天)處理作為陽性對照，其已在不同研究中顯示出誘導(dǎo)不同比例動物的穩(wěn)定好轉(zhuǎn)。如圖9A和9B所示，用NRP-V7/Kd包被的顆粒處理的11只小鼠中有9只在處理5-12周之內(nèi)恢復(fù)正常i^t。未被治愈的兩只小鼠是僅有的兩只在血糖水平>18mM/1時接受第一劑處理的，表明其有效性可能需要存在必要量的殘余P細(xì)胞。類似地，用DMK^46/Db包被的納米顆粒處理的11只小鼠中有8只恢復(fù)正常血糖(圖9A和9C)，其余三只顯示波動iMt#陽性數(shù)#陰性數(shù)n1385469283525152894性陰o00959性曰oft/7理照7Y處對vJ水平，其在長時間中未達(dá)到20mM(圖9C)。相反，接受對照TUM/Kd-包被的納米顆粒的9只小鼠中只有1只沒有M成明顯的高iMt(圖9A和9D)。圖9E比較了在每次注射納米顆粒后每組小鼠中的平均血糖水平。圖9F顯示了用抗CD3mAb(之前已顯示出也能夠在急性糖尿病小鼠中恢復(fù)正常血糖的非抗原特異性免疫治療策略)處理的結(jié)果(陽性對照組)，6只小鼠中的4只恢復(fù)正常血糖。綜上，這些結(jié)果表明，抗原特異性納米顆粒治療方法的有效性與已在小鼠中以及最近在人糖尿病患者中證明成功的非抗原特異性方法相當(dāng)(Keymeulen等，2005;Herold等，2002)。為了研究在糖尿病小鼠中治療的作用是否是長效的，如在糖尿病前動物中所見的，在連續(xù)4周正常血糖后撤除處理，并對小鼠的糖尿病復(fù)發(fā)進(jìn)行跟蹤。在治療撤除時、4周后以及高血糖復(fù)發(fā)時，評估該處理對循環(huán)中四聚體陽性群體,的作用。如預(yù)計地，在處理停止4周后，循環(huán)中四聚體反應(yīng)性T細(xì)胞群M^減小(圖IOA)，推測因此~30-45%被治愈的糖尿病小鼠在4至14周后復(fù)發(fā)高血瞎(圖10B和10C)。il^明內(nèi)源性自身抗原(即在糖尿病前動物中)或者由納米顆粒加強(qiáng)注射(即在P細(xì)胞量嚴(yán)重減少的糖尿病動物中)對所擴(kuò)增低親合力自身反應(yīng)性T細(xì)胞群的再激活可能是長期保護(hù)所必需的。在用DMK138-146/Db-包被的納米顆粒處理的小鼠中獲得類似結(jié)果(圖10A、10B和10D)。在治愈小鼠以及糖尿病小鼠和非糖尿病的未處理小鼠中進(jìn)行的腹膜內(nèi)葡萄糖耐量測試(Intraperitonealglucosetolerancetests,IPGTT)確認(rèn)了前者具有與非糖尿病未處理動物中所示基本上相同的葡萄糖耐受曲線，并且顯著優(yōu)于糖尿病小鼠中的相應(yīng)曲線(圖IIA)。另外，治愈動物的餐后血清胰烏素水平與非糖尿病未處理小鼠中所見的水平是統(tǒng)計學(xué)相當(dāng)?shù)?，并顯著高于糖尿病未處理動物中的水平(圖IIB)。與這些數(shù)據(jù)一致，NRP-V7/Kd-np和DMK138146/Db-np處理小鼠的IPGTT血清胰島素水平類似于非糖尿病小鼠，顯著優(yōu)于糖尿病未處理動物(圖IIC)。相比于年齡匹配的非糖尿病未處理小鼠，所述治愈的動物在50周齡時(>高血糖逆轉(zhuǎn)后的25周)具有正常體重(圖11D)。肽/MHC包被的納米顆粒可有效"區(qū)分"高親合力和低親合力自身反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞。大多數(shù)IGRP2。6-;M4反應(yīng)性CD8+細(xì)胞利用CDR3恒定的Val7-Ja42鏈，而不是異源VDjp鏈。糖尿病發(fā)病過程中此T細(xì)胞亞群的"親合力成熟"與三種不同Val7元件使用的改變有關(guān)。這3種不同的Va元件提供了不同的配體結(jié)合親合力(Val7.5>Val7。4>Vod7,6)，其在單TCRj3鏈背景下表達(dá)3種不同CDR3恒定Val7-Ja42鏈的TCRaP-轉(zhuǎn)染體研究+得到確認(rèn)(Han等，2005)。為了研究肽/MHC包被的納米顆粒是否事實(shí)上可差異靶向以不同親合力識別配體的T細(xì)胞，評估NRP-V7/Kd包被納米顆粒誘導(dǎo)CD8分子在這些轉(zhuǎn)染體上"加帽"的能力。多于60%的￥0117.5+細(xì)胞，但少于20%的Val7.4+或Val7.6+細(xì)胞在與NRP-V7/Kd包被的珠子一起孵育5分鐘后形成帽。至30分鐘時，帶有帽的丫0117.4+細(xì)胞百分比接近￥0117.5+細(xì)胞，但是對Val7.6+細(xì)胞來說此數(shù)量仍低于20%(圖12)。這些結(jié)果證明，NRP-V7/Kd包被的珠子確實(shí)可以區(qū)分高親合力和低親合力T細(xì)胞，并為這些納米顆粒為何優(yōu)先清除幼稚的高親合力克隆型提供了解釋。然而，它們不能解釋這些顆粒為何擴(kuò)增低親合力克隆型，特別是如果假設(shè)在不存在共刺激的情況下(通過納米顆粒上的肽/MHC)TCR連接預(yù)計也會清除而不是擴(kuò)增低親合克隆型的話。表達(dá)低親合力Val7.6/8.3PTCR的CD8+細(xì)胞是抗致糖尿病的。為了研究低親合力自身反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞是否具有體內(nèi)抗致糖尿病性質(zhì)，將低親合力IGRP嵐-2w反應(yīng)性Val7.6/8.3pTCR在NOD小鼠中轉(zhuǎn)基因表達(dá)(本文中稱其為"Val7.6+",其親合力比8.3-TCR(Val7.4+)低~10倍，Teyton和Santamaria，未發(fā)表數(shù)據(jù))。已顯示，WTCR&iiCD8+細(xì)胞的正選擇，但是明顯少于8,3-TCR(Val7.4+)(Han等，2005)。結(jié)果，Val7.6+TCR-TG小鼠含有比Val7.4+TCR-TG小鼠少的NRP-V7四聚體反應(yīng)性CD8+胸腺細(xì)胞和脾細(xì)胞。另外，在體外肽刺激后，來自Val7.6+TCR-TG小鼠的所述四聚體+(高和低)CD8+細(xì)胞比來自Val7.4+TCR-TG小鼠的那些細(xì)胞分泌的IFN-y(和IL-2)少，并且其低效地殺傷NRP-V7脈沖刺激的RMA-SKd靶標(biāo)，這與它們對配體的低親合力相一致(Han等,2005，數(shù)據(jù)未顯示)。最重要的是，這些小鼠幾乎完全得到針對糖尿病(70只雌鼠中僅有2只發(fā)生T1D)和胰島炎的保護(hù)[在Val7.6+和Val7.4+TCR-TG小鼠中得分分別是<0.4和>3(最大值是4)(P<0.012)(圖13A和圖13B)。這與表達(dá)無關(guān)非自身反應(yīng)性TCR的NOD小鼠完全相反，所述TCR識別LCMV表位(LCMVTCR-TGNOD小鼠)。如之前Serreze等(2001)所報道的，并且由本文確認(rèn)，這些小鼠基本上如野生型NOD小鼠一樣發(fā)生T1D，將內(nèi)源性IGRP2。6-2w反應(yīng)性CD8+細(xì)胞募集到胰島(在Val7.6+TCR-TG小鼠胰島中完全不存在)(圖13C)。因此,與Val7.4+和LCMVTCR(分別為前致糖尿病性和神經(jīng)性)不同,Val7.6+TCR看來具有抗致糖尿病性質(zhì)。盡管這些Val7.6+TCR-TG小鼠的大多數(shù)TGT細(xì)胞微弱結(jié)合四聚體或者根本不結(jié)合，但是一部分離開胸腺的所述細(xì)胞以明顯高的親合力(即高mfi)結(jié)合四聚體(圖14A)。本發(fā)明人懷疑這些小鼠的四聚體-低Uo)和四聚體-陰性CD8+T細(xì)胞來源于表達(dá)TGTCR但發(fā)生了對內(nèi)源TCR(即TCRa鏈)的正選擇的CD4+CD8+胸腺細(xì)胞。另一方面，所述四聚體國高(hi)細(xì)胞來源于^f5l^達(dá)TGTCRaP鏈的CD4+CD8+胸腺細(xì)胞，因?yàn)樗鼈儗﹄?MHC的低親合力，如果它們i達(dá)比正常水平高的TGTCR，那么其僅可發(fā)生正選擇。該解釋得到了下述結(jié)果的支持在RAG-2一背景中表達(dá)Val7.6+TCR的小鼠中，成熟的唯一細(xì)胞是以高親合力與四聚體結(jié)合的細(xì)胞(圖14B)。重要的是，這兩種類型的RAG-2一TCR-TG小鼠以類似的發(fā)病率發(fā)生糖尿病(圖15)。因此，本發(fā)明人懷疑，在RAG-2+Val7.6TCR-TG小鼠中成熟的四聚體-低和四聚#^:08+T細(xì)胞顯示抑制其四聚體-高(其在RAG一TCR-TG小鼠中造成糖尿病)對應(yīng)物的致糖尿病潛力。這些結(jié)果在帶有內(nèi)源TCR-Ca缺陷的Val7.6TCR-TG小鼠群中重現(xiàn)，所述缺陷阻止了內(nèi)源(即非轉(zhuǎn)基因)TCRa鏈的表達(dá)(圖16A和16B)。Val7.6十(非Val7,4+)TCR-TG小鼠自發(fā)產(chǎn)生具有免疫抑制活性的記憶CD8+細(xì)胞群。對丫(!17.6+TCR-TG小鼠和TCR-Ca-缺陷型Val7,6TCR-TG小鼠的不同淋巴器官中所含四聚體陽性€08+T細(xì)胞的細(xì)胞熒光測量研究表明，在脾、淋巴結(jié)以及尤其在骨髓(已知記憶T細(xì)胞儲庫)中，CD44hi和CD44hiCD122十CD8+細(xì)胞群體相比于Val7.4+TCR-TG小鼠增大(圖17A和17B)。重要的，這主要發(fā)生在四聚體-低中，卻不發(fā)生在不含有CD122+細(xì)胞的四聚體-高亞群中(圖17C)。這些細(xì)胞表達(dá)中央記憶淋巴細(xì)胞和效應(yīng)子記憶淋巴細(xì)胞上的所述標(biāo)志物(圖17D)，其位于且主要發(fā)現(xiàn)于外周淋巴器官而不^腺中，表明其外周來源(圖17E)。另夕卜，BrdU摻入測定表明它們體內(nèi)增殖(圖17F)。這些記憶樣細(xì)胞在功能上明顯表現(xiàn)為"記憶，，T細(xì)胞，如純化的脾Val7.6+(非Val7.4+)TCR-TGCD8+細(xì)胞在APC和抗原不存在時應(yīng)答于IL-2或IL-15而劇烈增殖(圖17G)。另夕卜，在體外用抗原刺激后，它們快速產(chǎn)生IFN-y(圖17H和171)。但是，在體外抗原刺激后，它們既不增殖也不產(chǎn)生白介素-2(圖17J)。此功能i普非常類似于調(diào)節(jié)性(抑制性)CD4+CD25+T細(xì)胞亞群。綜上，這些數(shù)據(jù)表明，Val7.6十(非Val7.4+)TCR-TGCD8+細(xì)胞變成長壽命記憶T細(xì)胞(遇到一種或多種抗原后)的能力增加，推測能夠應(yīng)答于動態(tài)平衡信號而不定期存活，甚至是在抗原不存在時也是如此。這些結(jié)果使本發(fā)明人懷疑，這些記憶低親合力T細(xì)胞的優(yōu)秀的動態(tài)平衡"適應(yīng)性"(否則無法殺傷P細(xì)胞)為它們帶來抗致糖尿病活性(即通過提供相對于其較高親合力但大部分為幼稚(5細(xì)胞殺傷克隆型的竟?fàn)巸?yōu)勢，和/或通過抑制它們的活化)。為了評估后者，評估純化CD122+和CD122-Val7.6+TCR國TGCD8+T細(xì)胞抑制來自Val7.4十TCR誦TGNOD小鼠的CFSE標(biāo)記的脾CD8+T細(xì)胞增殖的能力。如圖18所示，CD122+(非CD122-)Val7.6+TCR-TGCD8+T細(xì)胞幾乎完全抑制其較高親合力幼稚T細(xì)胞對應(yīng)物的增殖。與Val7.6+TCR-TGNOD小鼠中自發(fā)擴(kuò)增的記憶(CD122+)低親合力自身反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞群為抗糖尿病的想法相一致，用NRP-V7脈沖刺激的DC、抗CD40的拮抗型mAb或者抗4-1BB的拮抗型mAb全身性(靜脈內(nèi))處理Val7.6+和Val7.4+TCR-TG小鼠(以增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞活化/存活)在Val7.4+TCR-TGNOD小鼠中誘導(dǎo)糖尿病快速發(fā)病，但是不能在Val7.6+TCR-TG小鼠中引發(fā)疾病(表4)。表4、在17.4a/8.3b-TGNOD小鼠中促進(jìn)記憶T細(xì)胞發(fā)育和擴(kuò)增的處理促使糖尿病急性發(fā)病,但在17.6a/8.3b-TGNOD小鼠中則不然。<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>以3-4天間隔J8JI內(nèi)注射3次抗CD40mAb或抗4-1BBmAb1002次注射100fig/mlNRP-V7脈沖刺激的106LPS-活化的骨髄來源DC在最后一次注射后觀察小鼠至少8周以監(jiān)測糖尿病CD122+Val7.6+TCR-TGCD8+T細(xì)胞抑制同源和非同源致糖尿病T細(xì)胞應(yīng)答的能力(即針對自身抗原性肽，而不是這些抑制性T細(xì)胞的靶標(biāo)自身抗原性肽一一IGRP2。6-214)使得本發(fā)明人懷疑它們可能是通過靶向抗原呈遞細(xì)胞(Apc)實(shí)現(xiàn)其抑制活性。細(xì)胞毒性n釋放)測定利用肽脈沖刺激的DC作為靶細(xì)胞，CD122或CD122-Val7.6+和CD122-Val7.4+TCR-TGCD8+T細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，顯示前者能夠體外特異性裂解NRP-V7脈沖刺激的DC(圖19A),而后者不能。本發(fā)明人確認(rèn)，在體內(nèi)也是這樣的。它們將相同量的NRP-V7脈沖刺激的和TUM!^沖刺激的B細(xì)胞(分別帶有高濃度或低濃度染料CFSE標(biāo)記)注入Val7.6+TCR-TG和￥(117.4+TCR-TG小鼠中，一天后處死宿主，以研究哪種細(xì)胞在轉(zhuǎn)移后存活。如圖19B所示，NRP-V7脈沖刺激的B細(xì)胞僅僅在Val7.4+TCR-TG小鼠中存活，而用陰性對照肽TUM脈沖刺激的B細(xì)胞在兩種TCR-TG小鼠中都存活。在使用DC而不是B細(xì)胞作為APC時，得到基本上相同的結(jié)果(圖19B)。這些數(shù)據(jù)表明，低親合力CD122+Val7.6+TCR-TGCD8+T細(xì)胞通過殺傷載有自身抗原的APC來抑制同源和非同源致糖尿病T細(xì)胞應(yīng)答。在野生型NOD小鼠中NRP-V7/Kd包被的納米顆粒誘導(dǎo)低親合力(四聚體-中等)記憶自身反應(yīng)性CD8+細(xì)胞的擴(kuò)增。在丫0117.6+TCR-TGNOD小鼠中的上述結(jié)果非常類似于在用JiiJMHC包被的納米顆粒處理的NOD小鼠中所見的高親合力克隆型消失，低親合力CD8+T細(xì)胞擴(kuò)增并募集，其它IGRP表位反應(yīng)性特異性向胰島的募集減少，保護(hù)免受糖尿病。為了評估野生型NOD小鼠中珠子擴(kuò)增的CD8+T細(xì)胞是否是長壽命低親合力記憶T細(xì)胞，本發(fā)明人分析了用NRP-V7/Kd包被的納米顆粒處理的小鼠脾和骨髓中NRP-V7/Kd四聚體陽性CD8十T細(xì)胞中記憶標(biāo)志物(CD44和CD122)的存在情況。這些小鼠的脾和骨髓中所含四聚體陽性細(xì)胞的擴(kuò)增群體含有百分比增加的CD44hi和CD44hiCD122+CD8+T細(xì)胞，特別是在骨髓中(圖20A)，證實(shí)NRP-V7/Kd納米顆粒處理增加了四聚體+CD44hi和四聚體+€04411^0122+T細(xì)胞群的大小。在功能上，通過用NRP-V7/Kd包被納米顆粒的體內(nèi)治療擴(kuò)增的記憶樣T細(xì)胞的表現(xiàn)類似于在Val7.6+TCR-TG小鼠中自發(fā)積累的記憶CD122+Val7.6+TCR-TGCD8+T細(xì)胞它們都不產(chǎn)生IL-2也不增殖，但是應(yīng)答于體外抗原刺激產(chǎn)生高水平的IFN-Y(圖20B)。最重要的，在用抗CD3mAb和IL-2激活后，這些記憶樣T細(xì)胞在體外有效抑制CFSE標(biāo)記的應(yīng)答Val7.4+TCR-TGCD8+T細(xì)胞的增殖(圖20C)。抑制作用并非簡單的由于肽的竟?fàn)?，因?yàn)?78￡標(biāo)記的應(yīng)答丫0117.4+TCR-TGCD8+T細(xì)胞在通過DMK138146/Db包被納米顆粒處理而擴(kuò)增的記憶樣T細(xì)胞存在下也無法增殖(圖20D)。肽/MHC包被的納米顆粒擴(kuò)增之前存在的低親合力記憶T細(xì)胞。一些研究結(jié)果表明，肽/MHC包被的納米顆粒不從頭產(chǎn)生記憶T細(xì)胞，而是擴(kuò)增之前存在的記憶T細(xì)胞群(i)用TUM/Kd包被的納米顆粒處理NOD小鼠不誘導(dǎo)TUM反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞(識別腫瘤特異性抗原，不在NOD小鼠中表達(dá))的全身性擴(kuò)增(圖21A);(ii)用NRP-V7/Kd包被的納米顆粒處理B10,H2g7小鼠(其不發(fā)生糖尿病也不發(fā)生胰島炎)在所檢查的所有淋巴器官中不誘導(dǎo)顯著擴(kuò)增NRP-V7/Kd四聚體+CD8+T細(xì)胞亞群(圖21B);(Hi)在納米顆粒處理的NOD小鼠中四聚體>^應(yīng)性CD8+T細(xì)胞的21C);(iv)不像幼稚€08+T。細(xì)胞(在共刺激不存在^時，'TCR連接后通常發(fā)生凋亡)，記憶CD8+T細(xì)胞共刺激與生長無關(guān)。為了正式研究上述假說，本發(fā)明人研究了IGRP206_214/Kd包被的納米顆粒是否能在表達(dá)突變體形式IGRP的基因靶向NOD小鼠中擴(kuò)增IGRP206-2M/Kd反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞,在所述突變體形式IGRP中IGRP2。6-214的兩個TCR接觸殘基被丙氨酸所替換(K209A和F213A)(圖22A)。使用快速同源法(speed-congenic)將靶向等位基因(本文稱之為FLEX1或NOD,IGRPK209A/m3A1^10)與NOD背景回交(來自129)，以確保NOD等位基因在所有基因座的純合性。因?yàn)樵谶@些基因靶向小鼠中成熟的CD8+T細(xì)胞從未在體內(nèi)接觸IGRP2G6_214，所以這些小鼠無法自發(fā)產(chǎn)生記憶IGRP2。6_214/Kd反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞。盡管這些小鼠發(fā)生糖尿病和胰島炎(未顯示)，它們的胰島相關(guān)CD8+T細(xì)胞識別IGRP中的表位，但是它們完全不含有IGRP2。6-214/Kd反應(yīng)性CD8+克隆型。最重要的，用最優(yōu)劑量IGRP2。6_214/Kd包被顆粒處理的FLEXl-純合NOD小鼠在其淋巴器官中不含有擴(kuò)增的IGRP2Q6-2"/Kd反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞群(圖22B)。這些數(shù)據(jù)提供正式證據(jù)證明肽/MHC包被的納米顆粒擴(kuò)增之前存在的具有抑制性能的記憶T細(xì)胞群，而不能從頭產(chǎn)生記憶T細(xì)胞。因?yàn)榈陀H合力克隆型(即在Val7.6+TCR-TG小鼠中)顯得相比于其高親合力對應(yīng)物(即在Val7.4+TCR-TG小鼠中)在糖尿病發(fā)病過程中更有效地產(chǎn)生記憶T細(xì)胞后代，所以推斷肽/MHC包被的顆粒通過誘導(dǎo)清除幼稚高親合力克隆型和擴(kuò)增之前存在的記憶低親合力克隆型小群體來發(fā)揮作用。實(shí)施例2測試用人I型糖尿病相關(guān)肽/HLA復(fù)合物包被的鐵氧化物納米顆?；謴?fù)正常血糖的能力可用于預(yù)定研究的表達(dá)HLA轉(zhuǎn)基因的"人源化"小鼠和肽/HLA復(fù)合物。如上所述，來源于胰島素和IGRP的肽是野生型NOD小鼠中CD8+T細(xì)胞的主要靶標(biāo)。在"人源化，，HLA-轉(zhuǎn)基因NOD小鼠中評估在糖尿病發(fā)生過程中人MHC分子(人白細(xì)胞抗原(HumanLeukocyteAntigen，HLA))對來源于這兩種自身抗原的肽的呈遞。研究開始集中于HLAA*0201，它是在某些種族內(nèi)幾乎50%的"達(dá)的MHC分子。此研究利用了稱為NOD.P2mnuH.HHD的小鼠，其缺少小鼠P2巨球蛋白基因且表達(dá)嵌合單鏈構(gòu)建體HHD(Pascolo等,1997)。此構(gòu)4體編碼人P2m，其與人HLA-AW201的al和ct2結(jié)構(gòu)域以及小鼠H-2Db的o3、跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域共價連接。盡管該品系^達(dá)HLA-A*0201而不表達(dá)內(nèi)源小鼠I類MHC分子，但是其為糖尿病易感性的，30周齡時有55%的雌鼠患病(Takaki等，2006)。與HLA-A*0201結(jié)合的人IGRP兩個表位(hlGRP228.236和MGRP265_273)被這些小鼠的胰島相關(guān)CD8+T所識別，從NOD.|32mnull.HHD小鼠的胰島分離的CD8+T細(xì)胞對人HLA-A*0201陽性胰島具有細(xì)胞毒性(Takaki等，2006)。使用這些肽之一制備肽/HLA-A*0201四聚體。為了促進(jìn)這些四聚體與小鼠CD8分子的結(jié)合，將HLA-A*0201復(fù)合物的o3(CD8結(jié)合)結(jié)構(gòu)域替換為小鼠H-2Kb分子的該結(jié)構(gòu)域。這些研究的結(jié)果已經(jīng)確認(rèn)了這些小鼠用于鑒定HLA-A1201限制性T細(xì)胞以及可能與人T1D相關(guān)的P細(xì)胞自身抗原(Takaki等2006)的用途。根據(jù)目前的公開內(nèi)容，可以從T1D患者中鑒定被HLA-A1201限制性T細(xì)胞靶向的人源肽。另外，本發(fā)明人制備了表達(dá)HLA-A*1101，HLA-B*0702或HLA-Cw*0304的NOD小鼠。通過將這些小鼠與NOD.p2mnull.hj32m品系雜交，也將它們的卩2m替換成人P2m(Hamilton-Williams等，2001)。所有三種HLA轉(zhuǎn)基因表達(dá)良好，所—三種HLA轉(zhuǎn)基因品系都是糖尿病易感性的。綜上，來自這些"人源化"動物的HLA代表四種不同HLA超型(分別為HLA-A2,HLA-A3,HLA-B7，和HLA-C1)(Sidney等，1996;Doytchinova等，2004)。根據(jù)所檢測的種族，HLA-A*1101、HLA-B*0702或HLA-Cw*0304等位基因的基因頻率可以分別高達(dá)23%,11%，或10%(Cao等，2001)。根據(jù)考慮的種族，當(dāng)乾向全部四種超型時，A^的覆蓋率可以超過90%(Sidney等，1996;Doytchi,a等，2004;Cao等，2001)。這一因素對于將這些研究應(yīng)用于人類來說是非常重要的。這些動物以及上文所述NO乖m肌".HHD品系可用于進(jìn)一步研究。在此實(shí)施例中，本發(fā)明人i殳計了怎樣將野生型NOD小鼠中的結(jié)果轉(zhuǎn)移到"人源化，，HLA-轉(zhuǎn)基因NOD小鼠上。目標(biāo)是研究使用多種不同肽/HLA復(fù)合物包被的納米顆粒處理是否可保護(hù)該小鼠免受糖尿病以及是否恢復(fù)新診斷患糖尿病對應(yīng)小鼠的正常血糖水平，所述復(fù)合物靶向與人T1D相關(guān)的自身>^應(yīng)性〔08+T細(xì)胞群。本發(fā)明人已顯示，使用小劑量包被有H-2Kd或H-2Db分子的納米顆粒對NOD小鼠的重復(fù)處理誘導(dǎo)記憶低親合力自身>^應(yīng)性CD8+T細(xì)胞肽特異性擴(kuò)增，所述H-2Kd或H-2Db分子分別呈遞優(yōu)勢和非優(yōu)勢自身反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞所特異性靶向的表位，所述記憶低親合力自身反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞能夠預(yù)防野生型NOD小鼠中發(fā)生T1D,并且能恢復(fù)新診斷出糖尿病的nod小鼠的正常jMI水平。本發(fā)明人提供了一種轉(zhuǎn)移方法，以鑒定用在人T1D中的T1D相關(guān)肽/HLA組合。具體地，本發(fā)明人考慮，由不同T1D相關(guān)自身抗原R/HLA-A*0201復(fù)合物包被的納米顆粒會在NOD.p2mnuu.HHD小鼠(表達(dá)HLA-A*0201)中提供糖尿病保護(hù)，并治愈T1D。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用^^開內(nèi)容，以用于與其它自身免疫病相關(guān)的其它表位，其中使用類似于在"人源化，，HLA-轉(zhuǎn)基因小鼠中由其它HLA分子呈遞給胰島相關(guān)CD8+T細(xì)胞的胰島素和/或IGRP表位所用的組合物和方法，以包括其它組合物和方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠鑒定最低治療條件和將提供最大治療益處的肽/HLA復(fù)合物類型，以及治療前存在記憶低親合力CD8+T細(xì)胞對治療成功的必要性，和鑒定覆蓋盡可能多的不同種族個體的其它肽/HLA組合。合成納米顆粒?；救缜八?Moore等，2004)在物理和化學(xué)水平上合成并表征納米顆粒，不同在于使用生物素化肽/HLA-A1201單體。所述復(fù)合物中的MHC分子由人|32微球蛋白和嵌合形式人HLA-A*0201構(gòu)成，其中ctl和a2結(jié)構(gòu)域與小鼠H-2Kb的a3結(jié)構(gòu)域融合(以促進(jìn)小鼠CD8分子的識別)。作為自身抗原肽，可使用多種胰島素和IGRP衍生物(例如hInsB1018，hIGRP228-236和MGRP265273)，其已顯示出在HLA-A*0201背景下^J4島相關(guān)CD8+T細(xì)胞識別。生物素化肽/HLA-A*0201單體以4摩爾生物素/1摩爾親合素的比例添加。在24小時中在4。C緩慢攪拌下(10rpm)分多次添加生物素化蛋白(約0.4摩爾生物素/親合素)。所得探針在磁分離柱上純化(MiltenyBiotec)。將由與HLA-A*0201分子復(fù)合的無關(guān)HLA-A*0201結(jié)合肽組成的單體用于合成陰性對照探針。測量納米顆粒尺寸、弛豫(每mM松弛速率的改變)、生物素結(jié)合位點(diǎn)數(shù)以及鐵和蛋白含量。施用納米顆粒。用各種上文所述不同肽/HLA復(fù)合物或陰性對照肽(流感)/HLA復(fù)合物包被的納米顆粒處理一群10-15只雌性NOD.|32mnull.HHD小鼠(0.01，0.05，0.1，0.5和1ng肽當(dāng)量，從4至30周齡每3周1劑，或者10周齡開始連續(xù)5周，2劑/周)。通過用抗CD8mAb和肽/MHC四聚體對血液單核細(xì)胞染色來記錄抗原特異性CD8+T細(xì)胞的外周擴(kuò)增(在治療開始前和治療撤除時)。在高血糖發(fā)生時或者在研究結(jié)束時處死小鼠。通過多色流式細(xì)胞^U9f究各個小鼠的不同淋巴器官(脾、淋巴結(jié))、骨髓(記憶T細(xì)胞的已知儲庫)、肝臟、肺和胰島中中央和/或效應(yīng)記憶(CD69,CD44hi,CD62Lhi或CD62L1。，CD122+，Ly6C+)四聚體+CD8+T細(xì)胞的存在情況。如(Han等，2005;Amrani等，2000)所述測定四聚體-結(jié)合親合力。本發(fā)明人考慮，該處理誘導(dǎo)低親合力中央和效應(yīng)記憶四聚體+CD8+細(xì)胞的全身性擴(kuò)增，并優(yōu)先(但是不是專門的)在骨髓、胰腺淋巴結(jié)(PLN)和胰島中積累這些T細(xì)胞。施用多劑肽/MHC復(fù)合物。在另一個研究中，用1、2、3或4次有效劑量注射來處理小鼠組，本發(fā)明人設(shè)想其類似于在其它研究中顯示療效的所有那些復(fù)合物(在4、7、10和13周時)。預(yù)計保護(hù)會需要一劑或多于一劑(以擴(kuò)增所述記憶低親合力T細(xì)胞群至高于保護(hù)閾值)，所擴(kuò)增的四聚體+CD8+記憶T細(xì)胞群逐漸從循環(huán)中消失并積累在骨髓、PLN和胰島中。在高血糖發(fā)病時施用肽/MHC復(fù)合物。在高血糖發(fā)病時(>10.5mM/1)用更激進(jìn)的納米顆粒處理方案(l-5將當(dāng)量，一周兩次，5周)處理小鼠。陰性對照和陽性對照分別接受由無關(guān)肽/HLA復(fù)合物或抗CD3mAb包被的納米顆粒(每天靜脈內(nèi)注射20ng，5天(Haller，2005))。在處理臨開始之前對小鼠^jk，以評估循環(huán)中四聚體陽性〔08+T細(xì)胞的基線百分比。在血糖值穩(wěn)定于<10mM/l至少4周時，i人為TlD好轉(zhuǎn)，此時撤除處理。再次對小鼠取血，以確認(rèn)存在循環(huán)中四聚體陽性€08+T細(xì)胞群的顯著擴(kuò)增。跟蹤觀察動物至少另外8-12周，以確定穩(wěn)定好轉(zhuǎn)。在觀察期結(jié)束時處死小鼠，以建立不同淋巴器官和非淋巴器官中擴(kuò)增的四聚體陽性CD8—T細(xì)胞群的長期存留。還收獲胰腺組織用于組織學(xué)分4斤。預(yù)計長期好轉(zhuǎn)與不具有單核細(xì)胞浸潤的許多小胰島的存在有關(guān)。也就^j兌，與前糖尿病小鼠中所述處理預(yù)計促進(jìn)保護(hù)性記憶T細(xì)胞進(jìn)占炎癥胰島的情況不同，糖尿病小鼠中的處理預(yù)計促進(jìn)保護(hù)性記憶T細(xì)胞在胰腺淋巴結(jié)(除了其它記憶T細(xì)胞儲庫之外)而不是胰島中的積累(猜測新生胰島缺乏炎性潛力)。肽/HLA包被的顆粒通過誘導(dǎo)幼稚高親合力克隆型的清除而發(fā)揮作用。本發(fā)明人設(shè)想，在T1DJC^過程中低親合力自身反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞傾向于以記憶細(xì)胞的形式積累(少量)，肽/HLA包被的顆粒通過誘導(dǎo)清除幼稚高親合力克隆型(由于沒有共刺激的TCR引發(fā))以及擴(kuò)增之前存在的記憶低親合力克隆型小群體(與共刺激無關(guān))而發(fā)揮作用。這部分地來自以下觀察用無關(guān)肽(來自腫瘤抗原TUM/H-2Kd)復(fù)合物處理小鼠不誘導(dǎo)TUM/Kd四聚體反應(yīng)性CD8+T外周擴(kuò)增至高于背景(參見上文)。然后，這些記憶低親合力自身反應(yīng)性CD8+細(xì)胞通過竟?fàn)幋碳ぴ?即DC上的抗原/MHC、細(xì)胞因子等)而抑制其幼稚高親合力(猜測較不適應(yīng))對應(yīng)細(xì)胞的活化。事實(shí)上，這在記憶細(xì)胞明顯可有效地與幼稚T細(xì)胞竟?fàn)巹討B(tài)平衡信息(即IL-15)的其他系統(tǒng)中很明顯(Tan等，2002)。通過穩(wěn)定接觸PLN中載有自身抗原的DC，這些優(yōu)勢記憶低親合力克隆型還會抑制其它自身反應(yīng)性T細(xì)胞類型特異性的活化。肽/HLA包被納米顆粒對T細(xì)胞擴(kuò)增(和抗致糖尿病活性)的實(shí)現(xiàn)需要內(nèi)源靶標(biāo)自身抗原在P細(xì)胞中表達(dá)。內(nèi)源靶標(biāo)自身抗原的表達(dá)被認(rèn)為是誘導(dǎo)記憶低親合力自身>^應(yīng)性CD8+T細(xì)胞群(其接著被納米顆粒處理所擴(kuò)增)形成的刺激來源。IGRP缺陷將被引入NOD.(32nT".HHD小鼠中。用hIGRP228-236(與mIGRP228236交叉反應(yīng))和hIGRP265273(同mIGRP265_273)/HLA-A*0201包被的納米顆粒處理這些小鼠(Takaki等，2006)。本發(fā)明人有兩個帶有條件型IGRP等位基因的ES克隆可用，在產(chǎn)生種系竟?fàn)幥逗象w之前，其目前正在進(jìn)行通過瞬時轉(zhuǎn)染Cre來去除新霉素表達(dá)盒。4吏用快速同源法(speed-congenicapproach)將所述靶向等位基因與NOD.|32mnull.HHD小鼠回交(來自129"系)，以確保NOD等位基因在所有Idd基因座的純合性。用最優(yōu)劑量的兩種IGRP/HLA復(fù)合物包被的納米顆粒處理所得NOD.P2mnuu.IGRpnu".HHD小鼠。本發(fā)明人考慮所述治療不會誘導(dǎo)相應(yīng)hIGRP肽/HLA-反應(yīng)性CD8+細(xì)胞的擴(kuò)增/募集。如果IGRP表達(dá)對于糖尿病^A來說不是必要的(已知缺少IGRP表達(dá)不致死，如大鼠就不表達(dá)它)并且小鼠自發(fā)發(fā)生糖尿病，那么還預(yù)計所述納米顆粒治療不會隊(duì)護(hù)小鼠免受T1D(將沒有記憶IGRP反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞)。相反，用由HLA-A*0201和胰島素表位的復(fù)合物包被的顆粒進(jìn)行處理會i秀導(dǎo)相應(yīng)記憶T細(xì)胞群的擴(kuò)增，并且會具有保護(hù)性，因?yàn)樗鲂∈髸掷m(xù)表達(dá)胰島素。待測試的納米顆?？赡懿粫谒行∈笾姓T導(dǎo)顯著的T細(xì)胞擴(kuò)增。這有可能取決于在治療開始前相應(yīng)T細(xì)胞群之前是否經(jīng)過體內(nèi)引發(fā)。研究用多種不同納米顆粒種類的組合處理的其它小鼠群可能是有用/必要的。顯然，與我們的預(yù)測相反，可以想象納米顆粒處理可能能夠i秀導(dǎo)從頭形成記憶低親合力T細(xì)胞群。但是，在這種情況下，本發(fā)明人設(shè)想這些細(xì)胞不會是保護(hù)性的，因?yàn)樗鼈儗⒉荒茉谒幚淼腘OD.p2mnull.IGRPnu".HHD小鼠中將內(nèi)源IGRP/HLA-A*0201復(fù)合物結(jié)合到DC上。表達(dá)hIGRP的小鼠。本發(fā)明人已經(jīng)建立了數(shù)個表達(dá)由大鼠胰島素啟動子驅(qū)動的人IGRP轉(zhuǎn)基因的小鼠品系，并且通過實(shí)時RT-PCR比較了每個品系中人轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平與內(nèi)源mIGRP編碼基因座的表達(dá)水平。盡管所述轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平在不同品系間差異4艮大，但是在同一品系的不同個體之間表達(dá)水平是一致的。在這些品系之一中(#1114),hIGRP表達(dá)水平與mIGRP相當(dāng)。本發(fā)明人將此RIP-hIGRP轉(zhuǎn)基因引入NOD.(32mnull.IGRPnull.HHD小鼠和hp2m/HLA-A*1101、HLA-B*0702或HLA-Cw*0304轉(zhuǎn)基因NOD.p2mnull.IGRPnu11小鼠，以鑒定在這四個不同HLA等位基因背景下hIGRP中作為CD8+T細(xì)胞應(yīng)答耙標(biāo)的其它表位。對這些小鼠的胰島相關(guān)CD8+T細(xì)胞篩選針對HLA-A*0201、HLA-A*1101、HLA-B*0702和HLA-Cw*0304結(jié)合hIGRP肽的反應(yīng)性。然后，在相應(yīng)hp2m/HLA-A*1101、HLA-B*0702或HLA-Cw*0304轉(zhuǎn)基因NOD.P2mnull.IGRPnu11小鼠中，測試相應(yīng)肽/HLA復(fù)合物包被的納米顆粒的抗致糖尿病效力。此工作的總目的是為了將可使用的肽/組合的功能擴(kuò)展到治療盡可能多的患者。參考文獻(xiàn)下列參考文獻(xiàn)通過參考特別并入本文，其程度等同于它們提供對本文進(jìn)行補(bǔ)充的示例性程序或其它細(xì)節(jié)。美國專利4，367，110美國專利4，452，901美國專利4,554,101美國專利4,589,330美國專利4,818,542美國專利6,103,379美國專利6,387,498美國專利6,651,655美國專利6,712,997美國專利^^開20050202032Aichele^"/"TV"".Z75^,91:444-448，1994.AmraniWfl/"http://附附w腳/o肌167:655-666,2001.Amrani"a/"7Va似^，406:739-742，2000.AndersonC飽/.CAS^，96:9311-9316，1999.AndertonandWraith,/畫簡o/,，28:1251-1261,1998.ArdenW"/"D/"6咖，48:531-539,1999.AtkinsonandMaclaren，TV.義Afcrf"331:1428-1436，1994.AtkinsonandMaclaren,j附.,7:62-67，1990.Banga,In:rAmi/^wft'ciV/rito"wrfiV她/肌i^環(huán)"toVm，Proc柳Z"g，fl/idDe//ve/jiSy他附s,TechnomicPub.Co.,Inc.,Lancaster,Pa.,1995.BaranyandMerrifield,In:TTreiV/;&Vfes,GrossandMeienhofer(Eds.)，AcademicPress,NY,1-284，1979.Bielekovafl/"艦6:1167-1175,2000.Bottazzo"fl/"TV.丄Aferf"313:353-360,1985.BrinkerandScherer,In:5W-ge/5Wewce，AcademicPress,1990.Burke&,丄D/s"170:1110-1119，1994.Cao&/"Hw附./附附w"o/"62:1009,2001.Camso"a/"Af齢o附o/翻/es，32(7):2317-2328,1999.Caruso,/J/ww.C7^附.121(25):6039-6046，1999.CastanoandEisenba池，A醒u。Rev.Immunol"8:647-679，1990.ChentoufiandPolychronakos，D/"&eto，51:1383，2002,ChouandFasman，顛，.五，附o/"47:45-148，1978a,ChouandFasman，Jwww.iev.5,Www"47:251-276,1978b.ChouandFasman,倫c7謂/考，13(2):211畫222，1974a.ChouandFasman，倫c/i簡/勿,13(2》222-245，1974b.ChouandFasman，說。/;/^s,/"26(3):385-399，1979.Davies,^v"歸譜她n"/s,10:1264-1270，1998..DiLorenzo,&"/"iVoc.TVa".Z75^，95:12538-12543，1998.DoytchinovaW義/附附wwo/"172:4314,2004，EpitopeMappingProtocols(1996Fennessy"fl/"i)/flZ^油g/"，37:937-945,1994.GolmanandShinohara,7>e/i^sCAe附.￡>ig/w.,6:1-6,2000.Goulder"fl/./Aferf.,192:1819-1832,2000.Group,D.P.T,T。D.S,Af^/.,346:1685-1691，2002.Haller"L/.Af^/.,353:2086-2087,2005.Hamilton-WilliamsCa/"TV"rf.98:11533，2001.HanCfl/.，C7/"./騰對"115:18792005.HanWTVfltM^/.，11:645-652，2005.Hanninen丄C7//I./匿W"90:1901-1910，1992.Hanprasopwattana，丄fl"g附w/r,12:3173-3179,1996Honeyman""/"編,M^"1(5):576國582,1995.IlerIn:C7rewtis^S///c"，JohnWiley&Sons,1979.ImagawaCfl/"D/"6eto，50:1269-1273,2001.ItohW"/.，/.C7//i./wve對"92:2313-2322,1993.KapposW/"艦AM"6:1176-1182，2000.KarinWfl/.，《/五jc;.M^/.，180:2227-2237,1994.KentWfl/.，^V"似m，435:224-228,2005.KeymeulenWTV.Ewg/./.Af^/.，352(25):2598-608，2005.Kreuter，In:CW/o,Vte/De//ve/jiSy她附s1，MarcelDekker，Inc.,NY.,219-342,1994.LiblauWa/"7m柳w/i/(v，17:1-6,2002.LiebermanandDiLorenzo,r/s幼dw^^is1,62:359-377，2003,Liebermane《《/"/./附附m"o/"173:6727，2004。Lieberman&fl/"7Va《/。Jcm/.SdKS^4，100:8384-8388,2003.LiuandWraith，/顏謝/"7:1255-1263，1995.Maree/附歸""/"18:1067-1077，2006.Martin"fl/"/層,276:25197-25207，2001.McKown,C版謂"42:1204-1208，1999.Merrifield，腸歸，232(4748):341-347，1986.MetzlerandWraith，/顯顯o/"5:1159-1165，1993.Miller"J5^/.M^f,，149:758-766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