專利名稱：生物表面活性劑作為抗炎劑和組織防腐液的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物活性劑作為抗炎劑和組織防腐液的應(yīng)用。更
具體地說，本發(fā)明涉及一種含有生物表面活性劑的抗炎劑和組織防腐 液，其中，該生物表面活性劑通過使促炎因子乳化而阻斷促炎因子與受
體反應(yīng)。
背景技術(shù)：
天然免疫機制是抵御病原體感染的第一道防線，在受損組織 的識別和愈合過程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，它由某些細胞如巨噬細胞和樹突 狀細胞、體液因子如補體系統(tǒng)和血凝系統(tǒng)介導(dǎo)。具體地說，天然免疫系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)是一種因細菌內(nèi)毒素和 組織損傷引起的體內(nèi)防御機制，伴有炎性細胞(巨噬細胞、樹突狀細胞 等)和促炎細胞因子(白細胞介素-12、 TNF-a等)增加、發(fā)熱、組織 液局部擴散、纖維增生等。促炎細胞因子產(chǎn)生，與炎性細胞基因轉(zhuǎn)錄調(diào) 控有關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子表達，以及與炎性細胞活化有關(guān)的共刺激分子 (CD40、 CD80、 CD86)和主要組織相容性復(fù)合體(MHCs)表達，通 過這些能確認(rèn)這些促炎細胞被活化。而且，在天然免疫機制內(nèi)，包括抗原提呈細胞的炎性細胞直 接或間接誘導(dǎo)活化由T-細胞和B-細胞誘導(dǎo)的獲得性免疫機制。由全身 炎性反應(yīng)活化的獲得性免疫反應(yīng)又進一步加劇了炎性反應(yīng)。毒素(內(nèi)毒素或外毒素)材料就是一類能誘導(dǎo)天然免疫系統(tǒng) 變態(tài)活化和炎性反應(yīng)的例子。內(nèi)毒素，如大腸桿菌五.Co/Z的組成物質(zhì)性菌細胞壁的主要物質(zhì)。尤其是，我們知道內(nèi)毒素的脂區(qū)具有強疏水性，在誘導(dǎo)細胞 毒性方面發(fā)揮重要作用。所以，內(nèi)毒素會引發(fā)各種不同的病癥。尤其是， 在急診室或手術(shù)當(dāng)中，敗血癥能引起諸多嚴(yán)重的問題。當(dāng)細菌毒素在血管中循環(huán)時，敗血癥在血液中引起嚴(yán)重的炎 性反應(yīng)。敗血癥還導(dǎo)致各種癥狀出現(xiàn)，如發(fā)熱、嘔吐、腹灣、血壓降低、 呼吸急促、心動過速、尿頻、昏迷等。敗血癥是發(fā)達國家第三大死因。美國每年有超過750,00人 感染敗血癥，美國總死亡人數(shù)中9%死于敗血癥。革蘭氏陽性或陰性細菌分泌的外毒素也能引起炎癥。外毒素 由蛋白質(zhì)組成，是白喉桿菌(O 0^eZ aten'wm A》/^/^Wae)、破傷風(fēng)梭菌 (C7o^nW謂)、 肉毒梭菌(C7asW(i,wm 6o勵'w謂)等細菌產(chǎn)生并 分泌出來的毒素。痢疾桿菌、鏈球菌等能產(chǎn)生類似的外毒素。通過變態(tài)天然免疫活化產(chǎn)生的炎性反應(yīng)在器官移植時會產(chǎn)
生比較嚴(yán)重的問題，其中一個問題是，在將豬細胞移植人體時，會發(fā)生 免疫排斥反應(yīng)。這種免疫排斥反應(yīng)由手術(shù)過程中損傷的組織以及血液中 的天然抗體活化，從而因嚴(yán)重的炎性反應(yīng)而導(dǎo)致組織壞死。尤其是，從供體摘除器官時因缺血性缺氧引起的器官損傷、
器官移植前器官防腐過程中的損傷，以及再灌注之后活性氧形成和免疫 反應(yīng)增加都導(dǎo)致了嚴(yán)重的問題。所以，需要一種能最大程度地減少要移植和免疫排斥器官損 傷的器官防腐液。目前，從市面上可以買到各種器官防腐液，如美國威 斯康星大學(xué)研發(fā)的威斯康星大學(xué)防腐液和德國研發(fā)的HTK (Histidine-Tryptophan畫Ketoglutarate，組氨酸-色氨酸-酮戊二酸)液。從 供體摘除器官前，把器官防腐液作為灌注液注入器官，或?qū)⑵鞴僖浦不?br> 4者前，使用防腐液對器官進行防腐處理。但是，傳統(tǒng)的器官防腐液對抑 制因移植所致器官損傷引起的炎性反應(yīng)有一定局限性。同樣，控制炎性反應(yīng)對各種炎癥以及器官移植是很重要的。傳統(tǒng)的有炎性抑制作用的抗炎劑和免疫抑制劑的缺點在于 這些制劑只有局部作用，而且需要連續(xù)使用。另外，這些制劑在使用時 還有副作用。 Vi0X^是一種非甾類抗炎藥(NSAID)，它被用于治療關(guān)節(jié) 炎，但是據(jù)報道，臨床試驗中Viox^會使心臟病的發(fā)病率加倍。所以， 研究人員們正在對其它類似Viox^的有炎性抑制機理的藥物的安全性
進行研究。甾類抗炎藥也有副作用。如果濫用這些甾類抗炎藥，體內(nèi)疾 病抵抗力會降低，導(dǎo)致人體易患糖尿病、骨質(zhì)疏松癥等疾病。 Xigri^是第一例上市的治療敗血癥的制劑，它在血液凝固過
程中進行干涉，所以會引起大出血或內(nèi)出血。美國專利5,283,236和5,658,878公開了甘膽酸鈉及其衍生 物。但是，上述專利只公開了甘膽酸鈉作為藥物釋放促進劑的應(yīng)用，l付 沒有披露作為抗炎劑方面的應(yīng)用。另外，M.Katsrma等人報道，他們在研究促進結(jié)腸內(nèi)藥物釋 放能力的過程中發(fā)現(xiàn)，將聚環(huán)氧乙垸與胰島素一并使用時，胰島素在結(jié) 腸內(nèi)的吸收得到提高(International Journal of Pharmaceutics, 2006， pp.l56-162)。但是，M.Katsrma等人并沒有公開甘膽酸鈉及其衍生物的 抗炎效果。所以， 一直以來業(yè)界都迫切需要研制出一種新的能彌補傳統(tǒng) 抗炎劑的不足并促進抗炎劑對炎癥的治療效果。
發(fā)明內(nèi)容
[技術(shù)問題所以，本發(fā)明的首要目的是要提供一種含有生物表面活性劑 的抗炎劑，這種生物表面活性劑通過使促炎因子乳化而阻斷促炎因子與 受體反應(yīng)。本發(fā)明的另一目的是要提供一種含有至少一種選自膽酸、鵝 脫氧膽酸、脫氧膽酸、石膽酸、脫氫膽酸和前述物質(zhì)與甘氨酸或牛磺酸 的結(jié)合物及其藥用鹽的生物表面活性劑的組織或細胞防腐液添加劑。本發(fā)明的再一目的是要提供一種敗血癥治療劑，其含有至少 一種選自膽酸、鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸、石膽酸、脫氫膽酸和前述物質(zhì) 與甘氨酸或?；撬岬慕Y(jié)合物及其藥用鹽的生物表面活性劑。通過提供一種含有能使促炎因子乳化而阻斷促炎因子與受 體反應(yīng)的生物表面活性劑的抗炎劑，可實現(xiàn)本發(fā)明的上述首要目的。生物表面活性劑是至少一種選自膽酸、鵝脫氧膽酸、脫氧膽 酸、石膽酸、脫氫膽酸和前述物質(zhì)與甘氨酸或?；撬岬慕Y(jié)合物及其藥用 鹽的表面活性劑。膽酸、鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸、石膽酸、脫氫膽酸的結(jié)構(gòu)式 如下所示
膽酸
<formula>formula see original document page 6</formula>鵝脫氧膽酸
<formula>formula see original document page 7</formula>
本文中"結(jié)合物" 一詞是指膽酸、鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸、 石膽酸或脫氫膽酸與甘氨酸或?；撬峤Y(jié)合而成的一種化合物，例如甘膽 酸、牛磺膽酸、甘鵝脫氧膽酸、?；蛆Z脫氧膽酸、甘脫氧膽酸、?；敲?氧膽酸等。本文中"藥用鹽"是指膽酸、鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸、石膽 酸、脫氫膽酸、或前述物質(zhì)與甘氨酸或?；撬岬慕Y(jié)合物的鈉鹽或鉀鹽。本發(fā)明的抗炎劑能阻斷毒素或受損組織與炎性細胞之間相 互作用，并抑制天然免疫系統(tǒng)的活化，從而治療和預(yù)防由毒素和受損組 織引起的炎性反應(yīng)。另外，本發(fā)明的抗炎劑可用于治療和預(yù)防全身炎癥。本發(fā)明的抗炎劑可用于阻斷宿主細胞與細菌毒素或內(nèi)源促 炎性因子的反應(yīng)。本發(fā)明的抗炎劑可用于治療或預(yù)防阿爾茨海默氏病、動脈硬 化、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、增殖性關(guān)節(jié)炎等疾病或蛋白錯誤折疊病，這些疾病 的發(fā)生或發(fā)展均是由疏水區(qū)過分暴露在外的促炎物質(zhì)引起的。優(yōu)選地，確保本發(fā)明的抗炎劑在體內(nèi)具有抗炎效果且不產(chǎn)生 毒性的使用劑量為0.1 mg/kg -1 mg/kg。當(dāng)使用本發(fā)明的抗炎劑進行治療，阻斷毒素引起的細胞活化 時，會抑制因毒素刺激導(dǎo)致的促炎細胞因子產(chǎn)生并抑制炎性細胞活性。 本發(fā)明的抗炎劑在不超過1 mg/ml的劑量下不顯示細胞毒性。在小鼠試 驗中，按250 ml/kg小鼠劑量給小鼠投用甘膽酸鈉后，無副作用產(chǎn)生， 而且按12.5 ml/kg小鼠劑量投用甘膽酸鈉后，小鼠的死亡率大幅度降低。本發(fā)明的抗炎劑的給藥途徑可選自口服、非經(jīng)胃腸道給藥、 注射、局部或舌下給藥。另外，本發(fā)明的抗炎劑的劑型可選自液體劑、 軟膏劑、乳膏劑、凝膠劑、洗劑、混懸劑、片劑、膠囊劑或栓劑。通過提供一種含有至少一種選自膽酸、鵝脫氧膽酸、脫氧膽 酸、石膽酸、脫氫膽酸和前述物質(zhì)與甘氨酸或牛磺酸的結(jié)合物及其藥用鹽的生物表面活性劑的組織或細胞防腐液添加劑，可以實現(xiàn)本發(fā)明的另 一目的。把本發(fā)明的組織或細胞防腐液添加劑加到傳統(tǒng)的器官防腐 液中，不僅能抑制因腎缺血-再灌注損傷引起的免疫反應(yīng)，而且有助于 腎功能恢復(fù)。所以，器官或細胞防腐液的功效得以增強。另外，往器官 或細胞防腐液中加入本發(fā)明的組織或細胞防腐液添加劑后，也可用于治 療目的。在對受到缺血-再灌注損傷的大鼠進行腎試驗時，加入本發(fā) 明的組織或細胞防腐液添加劑后，不僅大鼠的腎功能被增強，而且炎性 反應(yīng)的抑制效果也有提高。使用本發(fā)明的組織或細胞防腐液添加劑的優(yōu)
選劑量是0.01 mg/ml-10mg/ml。通過提供一種敗血癥治療劑，其含有至少一種選自膽酸、鵝 脫氧膽酸、脫氧膽酸、石膽酸、脫氫膽酸和前述物質(zhì)與甘氨酸或?；撬?的結(jié)合物及其藥用鹽的生物表面活性劑，可以實現(xiàn)本發(fā)明的再一目的。本發(fā)明的抗炎劑能有效抑制毒素或組織損傷引起的炎性反 應(yīng)。另外，把本發(fā)明的組織或細胞防腐液添加劑加到器官或細胞防腐液 中，能增強器官或細胞的功能。而且，本發(fā)明的添加劑可用做各種免疫 反應(yīng)的抑制劑。


圖1顯示了本發(fā)明例1中，甘膽酸鈉對用熒光素標(biāo)記的 co// LPS和CHO細胞之間相互作用的抑制功效。圖2A顯示了在核因子(NF-kB)啟動子調(diào)控下表達CD25 的CHO細胞系統(tǒng)，圖2B顯示了本發(fā)明的例1中，甘膽酸鈉對co// LPS 刺激的CHO細胞的抑制功效。。/。CD25+細胞是指一部分NF-kB活化細 胞。
圖3顯示了本發(fā)明例2中，甘膽酸鈉和脫氧膽酸鈉對五.co"
LPS刺激的CHO細胞的NF-kB活性的抑制功效。圖4顯示了本發(fā)明例2中，甘鵝脫氧膽酸鈉和牛磺鵝脫氧膽 酸鈉對五.co/z' LPS剌激的CHO細胞的NF-kB活性的抑制功效。圖5顯示了本發(fā)明例2中，?；悄懰徕c和?；敲撗跄懰徕c對 co/z' LPS刺激的CHO細胞的NF-kB活性的抑制功效。圖6顯示了本發(fā)明例2中，脫氫膽酸和石膽酸對E co// LPS 刺激的CHO細胞的NF-kB活性的抑制功效。圖7顯示了本發(fā)明例2中，鵝脫氧膽酸和石膽酸水合物對 E co// LPS刺激的CHO細胞的NF-kB活性的抑制功效。圖8顯示了膽酸對五.co" LPS刺激的CHO細胞的NF-kB活
性的抑制功效。圖9顯示了本發(fā)明例3中，甘膽酸鈉對五.co// LPS刺激的樹 突狀細胞的活性的抑制功效。圖10顯示了本發(fā)明例3中，?；蛆Z脫氧膽酸鈉對co// LPS 刺激的樹突狀細胞的活性的抑制功效。圖11顯示了本發(fā)明例3中，?；敲撗跄懰徕c對五.LPS 刺激的樹突狀細胞的活性的抑制功效。圖12顯示了本發(fā)明例4中，甘膽酸鈉對E co" LPS刺激的 小鼠腹部(A、 B)和樹突狀(C、 D)細胞產(chǎn)生促炎細胞因子的影響。圖13顯示了本發(fā)明例5中，甘膽酸鈉、?；蛆Z脫氧膽酸鈉 和?；敲撗跄懰徕c對五."http://LPS剌激的腹部細胞產(chǎn)生NO的影響。圖14顯示了本發(fā)明例5中，甘膽酸鈉、牛磺鵝脫氧膽酸鈉 和?；敲撗跄懰徕c對五.LPS刺激的巨噬細胞產(chǎn)生NO的影響。圖15顯示了本發(fā)明例6中，甘膽酸鈉對五.co" LPS剌激的 樹突狀細胞介導(dǎo)的T細胞活性的影響。
圖16是本發(fā)明例7中，確定給C57BL/6小鼠投用的LPS濃
度的相關(guān)圖。圖17顯示了本發(fā)明例7中，甘膽酸鈉對投用LPS的C57BL/6 小鼠的存活率的影響。圖18顯示了本發(fā)明例8中，給己給用LPS的C57BL/6小鼠 投用甘膽酸鈉時，促炎細胞因子IL-12p70的減少。圖19顯示了本發(fā)明例8中，給已給用LPS的C57BL/6小鼠 投用甘膽酸鈉時，促炎細胞因子IFN-g的減少。圖20顯示了本發(fā)明例8中，給已給用LPS的C57BL/6小鼠 投用甘膽酸鈉時，抗炎細胞因子IL-IO的增加。圖21顯示了本發(fā)明例8中，給已給用LPS的C57BL/6小鼠 投用甘膽酸鈉時，促炎細胞因子TNF-ct的減少。圖22顯示了本發(fā)明例8中，給已給用LPS的C57BL/6小鼠 投用甘膽酸鈉時，促炎細胞因子MCP-I的減少。圖23顯示了本發(fā)明例8中，給已給用LPS的C57BL/6小鼠 投用甘膽酸鈉時，促炎細胞因子IL-6的減少。圖24顯示了在腎出現(xiàn)缺血-再灌注損傷時甘膽酸鈉對炎性反 應(yīng)和腎功能的影響。圖25A顯示了本發(fā)明例10中，甘膽酸鈉對被處理的CHO 細胞沒有產(chǎn)生細胞毒性；圖25B顯示了本發(fā)明例10中，甘膽酸鈉對被 處理的樹突狀細胞沒有產(chǎn)生細胞毒性；圖25C顯示了本發(fā)明例10中， 甘膽酸鈉對被處理的樹突狀細胞介導(dǎo)的T細胞沒有產(chǎn)生細胞毒性；以及 圖25D顯示了本發(fā)明例10中，甘膽酸鈉對從小鼠中分離的被處理腹部 細胞沒有產(chǎn)生細胞毒性。圖26顯示了本發(fā)明例10中，甘膽酸鈉水合物和脫氧膽酸鈉 對CHO細胞的細胞毒性。
圖27顯示了本發(fā)明例10中，甘鵝脫氧膽酸鈉和?；蛆Z脫氧 膽酸鈉對CHO細胞的細胞毒性。圖28顯示了本發(fā)明例10中，?；悄懰徕c和牛磺脫氧膽酸鈉 對CHO細胞的細胞毒性。圖29顯示了本發(fā)明例10中，脫氫膽酸和石膽酸對CHO細 胞的細胞毒性。圖30顯示了本發(fā)明例10中，鵝脫氧膽酸和甘膽酸對CIIO 細胞的細胞毒性。圖31顯示了本發(fā)明例10中，甘膽酸對CHO細胞的細胞毒性。圖32顯示了本發(fā)明例10中，甘膽酸鈉對用甘膽酸鈉進行胃 內(nèi)注射的Balb/c小鼠的細胞毒性。圖33顯示了本發(fā)明例10中，通過給小鼠尾部靜脈注射甘膽 酸鈉時，甘膽酸鈉對Balb/c小鼠的細胞毒性。
具體實施例方式下面參照以下實施例，對本發(fā)明進行更詳細的描述。這些實 施例只是用于闡述本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
例1:對熒光標(biāo)記的五.co//脂多糖(LPS)和中國倉鼠卵巢(CHO) 細胞之間相互作用的抑制情況的測定本試驗中使用了氟硼熒(BODIPY)標(biāo)記的E. co/Z LPS和 CHO細胞。讓BODIPY標(biāo)記的LPS與甘膽酸鈉在玻璃管內(nèi)、37。C反應(yīng) 14小時。將用反應(yīng)液混勻的2X1()SCH0細胞加到96孔板各孔內(nèi)，然 后37"C溫育14小時。用7-氨基-放線菌素(7-AAD)將溫育液染色，然 后用流式細胞計分析。對每個處理組的分析至少重復(fù)兩次，所得數(shù)據(jù)按t-檢驗法進行統(tǒng)計學(xué)處理。與只用BODIPY-LPS處理的CHO細胞所在 的實驗組比較，結(jié)果P〈0.05。挑選7-AAD(-)細胞以分析活細胞。如圖1所示，根據(jù)結(jié)果 可確定，BODIPY的熒光量隨BODIPY-LPS濃度增加而增加。此外， BODIPY-LPS與細胞之間的相互作用受到的抑制與甘膽酸鈉濃度增加 對應(yīng)，這種抑制功效隨BODIPY-LPS濃度增加而降低(圖1)。所以， 從試驗結(jié)果可知，在LPS刺激的炎性反應(yīng)中甘膽酸鈉的炎性抑制功效 是甘膽酸鈉抑制LPS和細胞間相互作用所產(chǎn)生的結(jié)果。
例2:對五.co// LPS刺激的NF-kB活化的抑制測定為評估對CHO細胞內(nèi)五.co// LPS刺激的NF-kB活化的抑制 功效，按以下方法評估CHO細胞內(nèi)CD25的表達百分比，然后用7-AAD 染色后進行FACS分析以評估細胞毒性。根據(jù)膽鹽在不同溶劑中的溶解 性，將膽鹽分成3組，具體如下組I.水溶性化學(xué)物質(zhì)甘膽酸鈉水合物、脫氧膽酸鈉、甘
鵝脫氧膽酸鈉、?；蛆Z脫氧膽酸鈉、?；悄懰徕c水合物、?；敲撗跄懰?鈉水合物
甘膽酸鈉水合物
<formula>formula see original document page 13</formula>14<formula>formula see original document page 14</formula><formula>formula see original document page 15</formula>?；悄懰徕c水合物
<formula>formula see original document page 15</formula>組II.溶于乙醇的化學(xué)物質(zhì)(以下稱"乙醇溶性化學(xué)物質(zhì)"): 脫氫膽酸、石膽酸、鵝脫氧膽酸、甘膽酸水合物組III.溶于甲醇的化學(xué)物質(zhì)(以下稱"甲醇溶性化學(xué)物質(zhì)"):
膽酸
■細胞的培養(yǎng)與刺激如圖2A所示，本實驗中使用在核因子(NF-kB)啟動子調(diào) 控下表達CD25的CHO細胞。另外還使用了被Toll樣受體2 (TLR2) 和CD14基因轉(zhuǎn)化的CHO細胞(以下稱作"3FP細胞")。用HamF-12基本培養(yǎng)基(含5。/。FBS、 0.584 g/1 L-谷酰胺、 青霉素-鏈霉素、400 pg/ml潮霉素、50 |ig/ml G418和50 |ig/ml慶大霉 素)選擇性培養(yǎng)3FP細胞后，用Trypsin-EDTA從培養(yǎng)液中分離3FP細胞，然后按每孔3乂105個細胞接種到96孔板內(nèi)，溫育18小時。第二 天，用膽酸衍生物和LPS處理培養(yǎng)細胞，37"C在C02培養(yǎng)箱內(nèi)溫育15 小時。
■流式細胞技術(shù)實驗上述溫育細胞經(jīng)剌激15小時后，將培養(yǎng)液離心(1200rpm、 5min、 4°C)，倒去培養(yǎng)上清。沉淀物用200^1 FACS緩沖液(含1%BSA 和lmM EDTA的1XPBS)洗滌兩次。往每個孔內(nèi)加20|il阻斷液(含 1:10正常小鼠血清和1:3抗人CD14/CD32 (BD、 2.4G2)的PBS)，冰 上反應(yīng)30分鐘。將抗人CD25-PE (1:16)和抗人CD14-FITC (1:32) 的混合液加到孔內(nèi)，然后冰上反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)液用200W FACS緩沖 液洗滌兩次，然后往反應(yīng)混合物中加入200[xl 7-AAD (1:20)。反應(yīng)混 合物在冰上反應(yīng)10分鐘后，使用流式細胞計對CD25表達情況和細胞 毒性進行分析。
■評估膽鹽對LPS刺激的CD25表達情況的影響
1) 組I.水溶性化學(xué)物質(zhì)根據(jù)7AAD(-)LPS刺激的3FP活細胞的CD25表達的研究結(jié) 果，膽酸衍生物中除甘膽酸鈉水合物之外，甘鵝脫氧膽酸鈉、?；蛆Z脫 氧膽酸鈉、?；悄懰徕c水合物、?；敲撗跄懰徕c水合物均顯示出對LPS 刺激的CD25表達(NF-kB活化)的抑制效果(圖2B和圖3-圖8)。為了分析活細胞，選擇7-AAD(-)細胞，根據(jù)CD25表達量增 加來確定核轉(zhuǎn)錄因子的活化。如圖2B所示，LPS刺激的3FP細胞的核 轉(zhuǎn)錄因子活化被抑制，抑制程度隨甘膽酸鈉的濃度變化而不同。在0.5 mg/ml甘膽酸鈉存在下，核轉(zhuǎn)錄因子被抑制率達到21.7+0.9% (p<0.05)， 在1 mg/ml甘膽酸鈉存在下，核轉(zhuǎn)錄因子被抑制率達到88.2+1.2% (p<0.05)。
2) 組II.乙醇溶性化學(xué)物質(zhì)
根據(jù)7AAD(-)LPS刺激的3FP活細胞的CD25表達的研究結(jié) 果，膽酸衍生物中脫氫膽酸、甘膽酸水合物、石膽酸和鵝脫氧膽酸均顯 示出對CD25表達(NF-kB活化)的抑制效果(圖6和圖7)。
3)組III.甲醇溶性化學(xué)物質(zhì)根據(jù)7AAD(-)LPS刺激的3FP活細胞的CD25表達的研究結(jié) 果，膽酸衍生物中的溶于甲醇的膽酸表現(xiàn)出抑制效果(圖8)。
例3.甘膽酸鈉對能使樹突狀細胞活化的LPS的抑制測定為了研究甘膽酸鈉對抗原提呈細胞的活化過程(Kco/ZLPS 誘導(dǎo))的影響，從重組活化基因2(Rag2)缺陷小鼠的骨髓中分離細胞。 將分離出的細胞按2乂105個細胞/孔加到96孔板內(nèi)，然后用1.5ng/ml粒 細胞-巨噬細胞克隆刺激因子(GM-CSF)和0.75 ng/ml白細胞介素-4處 理，溫育6天后，這些細胞分化成樹突狀細胞。將樹突狀細胞與甘膽酸鈉和LPS充分混合。在37。C刺激18 小時，用抗CD40-FITC、抗-CD50-FITC、抗隱I-Ab-PE、抗-CD86-PE、 7AAD和抗-CDllc-APC染色，然后用流式細胞計對細胞進行測定。每組 經(jīng)處理并測定至少兩次，結(jié)果用t-試驗法進行統(tǒng)計學(xué)分析。與只用LPS 處理的實驗組相比，結(jié)果是p0.05。如圖9-11所示，為了僅評估活的樹突狀細胞，選擇 CDllc(+)/7AAD(-)細胞，然后評估樹突狀細胞共刺激分子和I-Ab的表 達情況。100ng/ml五.co"LPS誘導(dǎo)的CD40、 CD80、 CD86禾P I-Ab表
達增加被抑制，抑制程度隨甘膽酸鈉的濃度變化而不同。另外抑制程度 也隨?；蛆Z脫氧膽酸鈉和?；敲撗跄懰徕c水合物的濃度變化而不同。所 以，結(jié)果顯示，樹突狀細胞被LPS顯著抑制。
例4.對￡. c^/LPS促使產(chǎn)生體外促炎細胞因子的評估為評估甘膽酸鈉對五.co// LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的促炎細胞因子的 影響，用例3中的相同方法制備樹突狀細胞，巨噬細胞從C57BL/6小鼠的腹部分離。隨后，讓甘膽酸鈉與LPS在體外37'C作用1小時，然
后與細胞混合。每個細胞在37。C刺激14小時后，分離上清液。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定分離上清液中TNF-(x和白細胞介素-12p40的濃度。 LPS刺激巨噬細胞和樹突狀細胞產(chǎn)生TNF- ct受到了抑制，在0.5 mg/ml甘膽酸鈉存在下，抑制率達到42.2+0.9% (pO.05)和70.2+2.3% (p<0.05)，在1 mg/ml甘膽酸鈉存在下，抑制率分別達到87.8+0.2% (pO.05)和101.0+0.2% (p<0.05)。結(jié)果還顯示，LPS束U激產(chǎn)生白細胞介素-12p40過程中，巨噬細胞和樹突狀細胞被抑制，在0.5 mg/ml甘膽酸鈉存在下，抑制率達到9.8+11.0% (pO.05)和4.7+3.1% (p<0.05)，在1 mg/ml甘膽酸鈉存在下，抑制率分別達到54.3±4.1% (p〈0.05)和106.6+1.3% (p<0.05)(圖12)。各組經(jīng)處理和測定至少兩次，用t-試驗法對結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。與只用LPS處理的實驗組比較，結(jié)果為p0.05。
例5.對五.co//LPS誘導(dǎo)樹突狀細胞和巨噬細胞產(chǎn)生一氧化氮(NO)的抑制測定為測定甘膽酸鈉對LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的細胞毒素因子NO的影響，按例4所述的相同方法制備樹突狀細胞。分別用甘膽酸鈉、牛硫鵝脫氧膽酸鈉和牛磺脫氧膽酸鈉水合物處理樹突狀細胞，37'C用LPS刺激18小時。然后將得到的樹突狀細胞混合物加到96孔板內(nèi)，每孔100ml。每孔內(nèi)加入Griss試劑，用箔覆蓋96孔板，室溫持續(xù)反應(yīng)15分鐘。用ELISA檢測儀測定540nm吸光度。從腹部分離的巨噬細胞也用甘膽酸鈉、?；蛆Z脫氧膽酸鈉和?；敲撗跄懰徕c分別處理，然后用LPS刺激18小時。之后，對巨噬細胞進行與樹突狀細胞相同的實驗。如圖13A和圖14A所示，LPS刺激巨噬細胞和樹突狀細胞產(chǎn)生NO受到甘膽酸鈉的抑制。LPS刺激巨噬細胞和樹突狀細胞產(chǎn)生NO也受到?；蛆Z脫氧膽酸鈉和牛磺脫氧膽酸鈉水合物的抑制，如圖13B、 13C、圖14B和圖14C所示。從這些結(jié)果中可知，以上3種膽酸衍生物均抑制NO產(chǎn)生，在炎性發(fā)展中扮演重要角色。
例6.五."http://LPS誘導(dǎo)的樹突狀細胞介導(dǎo)T細胞的活化的抑制測定 LPS活化的抗原提呈細胞使T細胞活化。試驗確定LPS活化樹突狀細胞時，被甘膽酸鈉阻斷的樹突狀細胞是否能活化T細胞。從Rag2缺陷雄性小鼠的骨髓中采集細胞。將采集的細胞按4Xl(f個細胞/孔加到96孔板中，用1.5 ng/ml粒細胞克隆刺激因子和0.75ng/ml白細胞介素_4處理，然后溫育6天至細胞分化成樹突狀細胞。讓LPS和甘膽酸鈉在37。C反應(yīng)1小時，然后與樹突狀細胞混合。這些樹突狀細胞在37'C被刺激14小時，然后將從具有H-Y抗原特異性T細胞受體(TCR)的雌性Marilyn小鼠中分離的CD3+和CD4+ T細胞與樹突狀細胞溫育72小時。往96孔板中按lpCi/孔加入[3H]-甲基胸苷，然后溫育18小時。從96孔板中收集細胞，然后用P計數(shù)器測定CPM (總數(shù)/分鐘)。結(jié)果顯示，樹突狀細胞介導(dǎo)的T細胞的增殖受到抑制，0.5mg/ml甘膽酸鈉存在下，抑制率達到104.9+3.2% (p<0.05)， lmg/ml甘膽酸鈉為105.1+3.2% (p<0.05)(圖15)。在只溫育樹突狀細胞或T細胞的實驗組中沒有觀察LPS或甘膽酸鈉刺激的T細胞增殖。所以，從結(jié)果中可知，LPS誘導(dǎo)的樹突狀細胞的活化被抑制，從而樹突狀細胞介導(dǎo)的T細胞的活化也被抑制(p<0.05)。
例7.對LPS小鼠敗血癥模型中甘膽酸鈉的保護作用的測定為測定甘膽酸鈉對LPS的中和能力，每組選用3只6星期前的C57BL/6小鼠。給小鼠腹部注入20 mg/kg和10 mg/kg LPS以測定LPS的LD50。結(jié)果顯示，20 mg/kg的LPS是進行保護作用測定試驗的最佳濃度(圖16)。對甘膽酸鈉對LPS的體外中和能力進行了測定。先往小鼠腹部注入20 mg/kg LPS,再往小鼠腹部分別注入12.5 mg/kg甘膽酸鈉、20 mg/kg LPS和50 mg/kg甘膽酸鈉各兩次，之后測定小鼠的存活率。在將LPS注入小鼠腹部后60小時內(nèi)陰性對照組的小鼠全部死亡，而分別注入12.5 mg/kg和50 mg/kg甘膽酸鈉的實驗組從注入LPS起分別經(jīng)過1小時和6小時，結(jié)果顯示小鼠的存活率分別為40%和60%(圖17)。
例8.對LPS體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗炎細胞因子的抑制測定如例7所述，先往小鼠腹部注入20 mg/kg LPS，再往小鼠腹部分別注入12.5 mg/kg甘膽酸鈉、20 mg/kg LPS和50 mg/kg甘膽酸鈉各兩次。預(yù)定時間后，從鼠尾采血，然后離心(2400Xg， IO分鐘)獲得血清。使用流式微球陣列(CBA)試劑盒測定血清中細胞因子表達量的變化。從注入甘膽酸鈉起4小時、8小時和12小時后IL-12p70和IFN-g減少(圖18和圖19)，注入甘膽酸鈉起12小時、24小時和48小時后TNF- cu MCP-I和IL-6顯著減少(圖21、圖22和圖23)。注入甘膽酸鈉的實驗組中，抗炎細胞因子IL-10大幅度減少(圖20)。
例9.甘膽酸鈉作為器官移植防腐液添加劑的抗炎效果測定本測定試驗中，評估甘膽酸鈉對缺血-再灌注腎損傷模型中炎性反應(yīng)和腎功能的作用。每組選用5只6星期前的Sprague-Dawlcy
(SD)雄性大鼠，實驗前1天所有鼠禁水禁食。給大鼠腹部注入lmg阿佛丁 (三溴乙醇/戊基水合物)AOOg大鼠將其麻醉，然后剖腹。用血管鉗夾住主動脈和腔靜脈，阻斷所有流到左腎的血流。注射器官防腐液之前，將左腎血管浸泡以盡可能的減少因防腐液壓力導(dǎo)致的腎的物理損傷。然后，按每只鼠4ml的量往血管中注射組氨酸-色氨酸-酮戊二酸
(HTK)或HTK和0.5 mg/ml甘膽酸鈉的混合液，使用10-0縫合線將血管損傷部位縫合。上述狀態(tài)維持30分鐘后，取下血管鉗，將剖腹部位縫合。24小時再灌注后，再次將手術(shù)后的大鼠麻醉，從心臟采血，制備血漿或血清。除了 HTK或含HTK溶液的甘膽酸鈉(HTKN)的處理程序不同外，按上述同樣方法對假手術(shù)組進行手術(shù)，所有的手術(shù)至少
重復(fù)3次。用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定血清中IL-6的濃度，并用自動分析儀測定血尿素氮(BUN)、肌酸酐(Cre)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的濃度。對于缺血-再灌注損傷，用HTK溶液處理的實驗組中IL-6的濃度是466±218 pg/ml，用HTKN溶液處理的實驗組中IL-6的濃度是260士144pg/ml (與用HTK溶液處理的實驗組相比p=0.08)。所以，可以確定炎性反應(yīng)被抑制(圖24)。另外，HTK處理組中，作為腎功能指示標(biāo)志的BUN、 Cre和AST濃度顯著低于HTKN處理組中BUN、 Crc和AST的濃度，這說明甘膽酸鈉能抑制缺血-再灌注腎損傷(表24)。
例10.毒性測定本例中測定甘膽酸鈉對上述實施例中使用的CHO細胞、樹突狀細胞、T細胞的細胞毒性。采用7AAD染色，然后進行FACS分析。首先，將甘膽酸鈉在體外37。C放置1小時，然后與細胞混合。37"C溫育CHO細胞或樹突狀細胞14小時，再將溫育14小時的樹突狀細胞與T細胞混合，溫育4天。最后用7AAD將各細胞染色，用流式細胞計進行細胞分析。為測定甘膽酸鈉對小鼠的毒性，每組選用5只7-9周大的C57BL/6雄性小鼠進行實驗。將甘膽酸鈉溶解在PBS中，體外37'C放置1小時，然后將甘膽酸鈉溶液注入小鼠腹部，隨后進行細胞分析。注入1小時后，分離腹部細胞，用7AAD染色，然后分析腹部細胞。將細胞反復(fù)凍融至少5次，在用7AAD染色的陽性對照組中使用。按t-試驗法對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析，與不用甘膽酸鈉處理的實驗組相比，p<0.05。與陰性對照組相比，在含有甘膽酸鈉情況下，CHO細胞(圖25A)、樹突狀細胞(圖25B)和樹突狀細胞介導(dǎo)的T細胞(圖25C)的7AAD(+)增加2-4%， 1 mg/ml的甘膽酸鈉沒有顯示出明顯的細胞毒性(圖25)。試驗結(jié)果還確定從每只注射了 5mg甘膽酸鈉(250 mg/kg鼠)的小鼠中分離的腹部細胞與只注射PBS的對照組的細胞沒有顯著的區(qū)別(圖25D)。圖26-圖31中所進行的操作程序與圖25A相同，對根據(jù)不同溶劑中溶解性差異分類的三組膽酸衍生物進行細胞毒性實驗。與各溶劑的陰性對照組相比，水溶性膽酸衍生物、乙醇溶性膽酸衍生物和甲醇溶性膽酸衍生物均沒有顯示出顯著的細胞毒性。每組選用5只6周大的Balb/c小鼠，以不同的甘膽酸鈉濃度進行腹部和尾部靜脈注射，測定嚴(yán)重毒性情況。在腹部給藥實驗中，結(jié)果顯示甘膽酸鈉的濃度大于500 mg/kg時有毒性。但是，甘膽酸鈉為250mg/kg或低于250mg/kg時，全部小鼠都100%存活(圖32)。另外，小鼠尾部靜脈注射不同濃度甘膽酸鈉的實驗中，甘膽酸鈉濃度不超過150mg/kg時，全部小鼠都100%存活(圖33)。
權(quán)利要求
1.一種抗炎劑，其含有能通過使促炎因子乳化而阻斷促炎因子與受體反應(yīng)的生物表面活性劑。
2. 如權(quán)利要求1所述的抗炎劑，其中，所述生物表面活性劑是至 少一種選自膽酸、鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸、石膽酸、脫氫膽酸和前述物 質(zhì)與甘氨酸或牛磺酸的結(jié)合物及其藥用鹽的生物表面活性劑。
3. 如權(quán)利要求1所述的抗炎劑，其中，所述生物表面活性劑是要 治療或預(yù)防毒素或組織損傷引起的炎癥。
4. 如權(quán)利要求1所述的抗炎劑，其中，所述生物表面活性劑是要 治療或預(yù)防全身炎癥。
5. 如權(quán)利要求1所述的抗炎劑，其中，所述生物表面活性劑是要 阻斷宿主細胞與細菌毒素或內(nèi)源促炎性因子的反應(yīng)。
6. 如權(quán)利要求1所述的抗炎劑，其中，所述抗炎劑是要治療或預(yù) 防選自阿爾茨海默氏病、動脈硬化、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、增殖性關(guān)節(jié)炎和蛋 白錯誤折疊病的疾病。
7. 如權(quán)利要求1所述的抗炎劑，其中，所述抗炎劑的給藥途徑選 自口服、非經(jīng)胃腸道給藥、注射、局部和舌下給藥途徑。
8. 如權(quán)利要求1所述的抗炎劑，其中，所述抗炎劑的劑型選自液 體劑、軟膏劑、乳膏劑、凝膠劑、洗劑、混懸劑、片劑、膠囊劑或栓劑。
9. 一種組織或細胞防腐液添加劑，其含有至少一種選自膽酸、鵝 脫氧膽酸、脫氧膽酸、石膽酸、脫氫膽酸和前述物質(zhì)與甘氨酸或牛磺酸 的結(jié)合物及其藥用鹽的生物表面活性劑。
10. —種敗血癥治療劑，其含有至少一種選自膽酸、鵝脫氧膽酸、 脫氧膽酸、石膽酸、脫氫膽酸和前述物質(zhì)與甘氨酸或?；撬岬慕Y(jié)合物及 其藥用鹽的生物表面活性劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物表面活性劑作為抗炎劑和組織防腐液的應(yīng)用。更具體地說，本發(fā)明涉及一種含有生物表面活性劑的抗炎劑和組織防腐液，其中，該生物表面活性劑通過使促炎因子乳化而阻斷促炎因子與受體反應(yīng)。
文檔編號A61K33/14GK101678045SQ200880015680
公開日2010年3月24日 申請日期2008年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月14日
發(fā)明者姜昌求, 成承鏞, 金延禧 申請人:首爾大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力財團