專利名稱：：用于通過靶向腫瘤干細胞的ssDNA復(fù)制中間物而抑制腫瘤生長的方法和藥劑的制作方法用于通過耙向腫瘤干細胞的ssDNA復(fù)制中間物而抑制腫瘤生長的方法和藥劑相關(guān)串i青案的奪叉引用本申請案主張2007年6月13日申請的美國臨時申請案第60/934，420號的權(quán)利。以上申請案的全部教導(dǎo)都以引用的方式并入本文中。
背景技術(shù)：
：科學(xué)家已認(rèn)識到腫瘤細胞和病理組織結(jié)構(gòu)(諸如畸胎癌)與早期胚胎的細胞和組織的相似性。正常但未分化的胚胎干細胞能夠通過未確定的過程形成器官，所述過程在邏輯上必須包括細胞數(shù)目的快速增加和分化成器官原基(organanlage)以及隨后的器官發(fā)生。惡性腫瘤以類似于早期胎兒的速率生長且含有組織學(xué)上未分化或已組織化(組織學(xué)上出現(xiàn)正常組織)的小環(huán)境(niche)。腫瘤和胎兒組織似乎共用許多分子和過程。舉例來說，細胞表面的復(fù)雜抗原性糖胺聚糖，即"癌胚抗原"在胎兒組織與腫瘤中都進行表現(xiàn)，細胞粘附分子也是如此。類似個體發(fā)生，腫瘤發(fā)生似乎通過一組擴增的干細胞由直系后裔繼續(xù)進行。僅一小部分來自人類腫瘤的細胞單獨或與其它細胞一起具有形成作為免疫抑制嚙齒動物中的異種移植物的新腫瘤的能力。限制稀釋法異種移植實驗已顯示，假定腫瘤發(fā)生細胞內(nèi)的一種或一種以上細胞顯示類似干細胞的性質(zhì)，即其能夠產(chǎn)生含有其它干細胞的新腫瘤以及再生原始腫瘤中所存在的細胞的表型混合群體。腫瘤的單克隆性概念是在20世紀(jì)初建立的。近年來，已確定幾乎所有形式的晚發(fā)性癌癥都經(jīng)過長時期的瘤形成前期(preneoplasia)，且這些瘤形成前群落自身是單克隆的并由來自胚胎DNA的一種以上罕見的細胞遺傳突變產(chǎn)生。在21世紀(jì)初，直接嘗試使腫瘤細胞群體富集"干"細胞來進行移植/稀釋實驗，已證實不僅組織干細胞可能是瘤形成前期的來源，而且腫瘤自身也含有"干"細胞。已提出以下假說的現(xiàn)代重述腫瘤事實上是適度良好組織化的異質(zhì)胎兒結(jié)構(gòu)。將預(yù)期"癌胚"干細胞的數(shù)目會增加且產(chǎn)生使高度異質(zhì)小環(huán)境聚居于腫瘤塊中的分化細胞類型。整個干細胞領(lǐng)域中所用的各種抗原性標(biāo)記已用于表面上高度富集能夠再生組織或腫瘤的細胞。然而，在這些富集群體中沒有細胞顯示將其視為干細胞的任何微觀形態(tài)細胞性質(zhì)。如果確實腫瘤起源于單一干細胞，那么需要鑒別所述腫瘤且收集其作為足以分析分子和生物化學(xué)分析物的干細胞同源群體的方法。首要的是鑒別腫瘤細胞靶標(biāo)來開發(fā)針對選擇性抑制瘤形成和瘤形成前期的干細胞的生長或殺死所述干細胞的新穎療法。
發(fā)明內(nèi)容需要干細胞群體中的突變來產(chǎn)生癌癥干細胞。來源于19世紀(jì)病理學(xué)觀察結(jié)果的現(xiàn)代"腫瘤干細胞"假說假定腫瘤含有具有類似于正常干細胞與胎兒組織兩者的性質(zhì)的獨特細胞亞群。這些細胞通過數(shù)輪不對稱和非有絲分裂的細胞分裂而大量增殖。這種細胞群體可能自我更新且負責(zé)大多數(shù)腫瘤的生長和維持。因此，普遍相信對腫瘤干細胞分裂的抑制表示有希望相對于目前方法改良功效的新穎治療性干預(yù)。本發(fā)明是基于指出以下者的觀察結(jié)果人類胎兒/幼年生長期與干細胞譜系中的高突變率有關(guān)且這種譜系實行先前未檢測到的DNA分離和復(fù)制模式。先前在美國專利申請案第2006/0063144號和PCT/US06/047136(其教導(dǎo)以引用的方式并入本文中)中描述到腫瘤和胎兒干細胞的特征為稱為鐘形細胞核的獨特細胞核形態(tài)型。(鐘形細胞核也存在于合胞體中且也應(yīng)了解，本文所述的本發(fā)明方法包涵合胞體以及細胞中存在的鐘形細胞核)。含有鐘形細胞核的腫瘤和胎兒干細胞在本文中被稱為巨核細胞。本發(fā)明是基于以下本文所述的最重要觀察結(jié)果腫瘤和胎兒干細胞的鐘形細胞核經(jīng)歷獨特形式的復(fù)制。這種獨特形式的基因組復(fù)制涉及具有其中鐘形細胞核分離(如呈"杯與杯(cup-to-cup)"分離形式)的細胞核結(jié)構(gòu)構(gòu)型的復(fù)制中間物，且在分離期間，在基因組復(fù)制之前，所述基因組的一大部分首先分離成單鏈DNA(ssDNA)。這一觀察結(jié)果與人類細胞分裂的先前觀察結(jié)果(其中DNA合成通過反復(fù)拷貝DNA的短延伸段來進行，隨后在有絲分裂時染色單體以雙鏈DNA(doublestrandedDNA，dsDNA)形式聚集濃縮和分離)相反。此外，以下觀察結(jié)果同樣重要在這種獨特形式的基因組復(fù)制期間，除鐘形細胞核內(nèi)所含的ssDNA外，還可觀察到大量ssDNA，這種ssDNA與腫瘤干細胞復(fù)制所特有的復(fù)制中間物構(gòu)型相關(guān)且指示所述復(fù)制中間物構(gòu)型。重要的是，這些關(guān)鍵觀察結(jié)果，即在鐘形細胞核分裂期間，腫瘤和胎兒干細胞以及合胞體呈其中基因組在一段重要且可利用的時間內(nèi)在鐘形細胞核內(nèi)或外是實質(zhì)上單鏈DNA(ssDNA)的中間物構(gòu)型，可形成通過檢測含有呈復(fù)制中間物構(gòu)型的ssDNA的鐘形細胞核或通過檢測單獨ssDNA來檢定抗癌劑和療法的功效的方法的基礎(chǔ)。此外，腫瘤和胎兒干細胞以及合胞體所特有的這種基因組復(fù)制的動物(和植物)模型可形成通過靶向這種干細胞復(fù)制中間物構(gòu)型的抑制或破壞來合理地設(shè)計新穎癌癥療法的基礎(chǔ)。舉例來說，鐘形細胞核內(nèi)的大量ssDNA以這種獨特腫瘤干細胞復(fù)制中間物構(gòu)型存在，可靶向所述ssDNA來進行破壞或降解，從而抑制腫瘤干細胞的生長或致其死亡。或者，也可靶向腫瘤干細胞而非鐘形細胞核內(nèi)所含的ssDNA來進行破壞或降解，從而抑制腫瘤細胞的生長或致其死亡。(如本文中所使用，術(shù)語"腫瘤干細胞"和"巨核細胞(metakaryote)"可互換使用且打算包括腫瘤干細胞與胎兒干細胞)。如本文中所使用，無論何時術(shù)語"復(fù)制中間物"或"復(fù)制中間物構(gòu)型"與ssDNA結(jié)合使用，都打算不僅包括鐘形細胞核內(nèi)所含的ssDNA，而且包括鐘形細胞核內(nèi)不含而腫瘤干細胞內(nèi)所含的ssDNA。因此，舉例來說，當(dāng)本文描述可靶向ssDNA的藥劑時，意思是所靶向的ssDNA可含于鐘形細胞核內(nèi)或單獨在鐘形細胞核的范圍外。有理由相信其它大分子也以這種復(fù)制中間物構(gòu)型存在(例如，這種復(fù)制過程所需的大分子在本文中被稱為"腫瘤干細胞特異性分子"且這一術(shù)語也包涵"胎兒干細胞特異性分子"和"合胞體特異性分子")，但不一定具體說明)。腫瘤干細胞特異性分子是存在于腫瘤干細胞中、優(yōu)選地存在于細胞核中且不存在于周圍細胞中的分子(例如，本文中也稱為巨核細胞所特有的細胞分子)。這些腫瘤干細胞特異性分子(例如結(jié)構(gòu)蛋白、核酸酶等)也可用作新穎抗癌療法的靶標(biāo)。因此，本發(fā)明是針對鑒別特異性抑制腫瘤干細胞的生長/增殖或完全破壞腫瘤干細胞而不使正常或維持型干細胞在其封閉環(huán)境中受損或受損極小的藥劑和療法的方法，且針對所述藥劑的治療性應(yīng)用。如本文所述，腫瘤干細胞含有具有獨特形態(tài)學(xué)鐘形特征的細胞核，其中在細胞核分裂期間，基因組在一段重要且可利用的時間內(nèi)實質(zhì)上是單鏈DNA(ssDNA)。所述獨特的腫瘤干細胞(本文中稱為巨核細胞)典型地于特定時間間隔含有包含單鏈DNA的鐘形細胞核。因為經(jīng)修飾的ssDNA將無法經(jīng)歷進一步復(fù)制變回雙鏈DNA(dsDNA)，所以通過使用靶向且改變巨核細胞的ssDNA的藥劑(例如化學(xué)或酶藥劑)(例如烷化劑、單鏈特異性核酸酶、有毒結(jié)合物)，靶向腫瘤干細胞的細胞核物質(zhì)來進行破壞。本發(fā)明還針對鑒別腫瘤干細胞分裂的復(fù)制中間物構(gòu)型所特有的腫瘤干細胞的靶標(biāo)或標(biāo)記的方法。所述靶標(biāo)可例如通過分離含有經(jīng)歷復(fù)制的鐘形細胞核的腫瘤干細胞，培養(yǎng)所述細胞且使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)收集培養(yǎng)的腫瘤干細胞，并鑒別復(fù)制中間物所特有的mRNA、轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)來進行鑒別，其也通過使用所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的技術(shù)。巨核細胞的分離可根據(jù)含有ssDNA的鐘形細胞核或細胞核外ssDNA的存在來進行。有理由相信，導(dǎo)致鑒別本文所述的復(fù)制中間物所特有的分子的巨核細胞的分離和研究將導(dǎo)致鑒別將適用于抗腫瘤發(fā)生療法的新穎靶標(biāo)。在一個實施例中，本發(fā)明描述鑒別與獨特鐘形細胞核復(fù)制中間物構(gòu)型相互作用的藥劑的活體外和活體內(nèi)方法。所述藥劑可例如通過結(jié)合、改變腫瘤干細胞內(nèi)呈復(fù)制中間物構(gòu)型的ssDNA或其它腫瘤干細胞特異性分子、使所述ssDNA或分子不穩(wěn)定、降解或另外修飾所述ssDNA或分子來抑制或改變腫瘤或腫瘤干細胞生長，由此抑制腫瘤干細胞復(fù)制和/或減緩腫瘤生長。具體來說，腫瘤樣品(例如來自實體瘤的組織活檢)將從受試者獲得，具體來說是從實體瘤獲得?？墒鼓[瘤樣品與候選藥劑在合適的生理條件(例如保持鐘形細胞核復(fù)制中間物構(gòu)型的條件)下接觸，且將比較在接觸/處理之前和之后腫瘤/腫瘤樣品(具體來說是腫瘤干細胞)中鐘形細胞核的存在。將通過比較在用候選藥劑處理后樣品中含有ssDNA的鐘形細胞核的數(shù)目或單獨ssDNA的量、在處理前樣品中含有ssDNA的鐘形細胞核的數(shù)目或單獨ssDNA的量、與模擬處理的對照樣品中含有ssDNA的鐘形細胞核的數(shù)目或單獨ssDNA的量，來確定抑制腫瘤生長的藥劑。鐘形細胞核內(nèi)或鐘形細胞核外ssDNA的量可通過例如吖啶橙染色來定性地確定，或可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)確定定量的量。所處理的腫瘤或腫瘤干細胞中含有ssDNA的鐘形細胞核的數(shù)目減少或含有ssDNA的鐘形細胞核不存在(或單獨ssDNA的量減少或不存在)表示所關(guān)注的藥劑有效靶向ssDNA且抑制腫瘤干細胞生長或殺死腫瘤干細胞。也可檢定鐘形細胞核復(fù)制中間物是否存在。在另一個實施例中，通過給動物注射癌癥異種移植物來形成異質(zhì)動物模型。適合用于活體內(nèi)檢定方法的動物為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所知，且可對待評估的特定腫瘤類型具有特異性。舉例來說，諸如小鼠和大鼠等嚙齒動物通常用于實體瘤分析。所述方法包含將異種移植物移植到動物中，使所述異種移植物長成實體瘤，用候選藥劑/療法處理測試動物(且使所述腫瘤與所述候選藥劑/療法接觸)，切除腫瘤和與對照動物(例如未用候選藥劑處理的動物)相比，分析腫瘤組織中是否存在含有ssDNA的鐘形細胞核復(fù)制中間物或單獨ssDNA。美國專利申請案第2006/0063144號中所揭示的程序可用于鑒別鐘形細胞核結(jié)構(gòu)。此外，根據(jù)PCT/US06/047136中所揭示的程序，可鑒別鐘形細胞核內(nèi)或外的ssDNA。舉例來說，可用已知結(jié)合、修飾、改變或降解ssDNA(優(yōu)先于細胞中存在的雙鏈DNA)的藥劑(諸如烷化劑、ssDNA核酸酶、其它酶或蛋白質(zhì))處理測試動物。不同于基于相對于對照組生長腫瘤的收縮或異種移植動物的存活模式來關(guān)注藥劑的活性的典型腫瘤模型，這一策略涉及評估生長的異種移植物中ssDNA染色的巨核細胞或ssDNA是否存在或其減少。舉例來說，所關(guān)注的藥劑(本文中也稱為候選藥劑)是相對于對照組顯著減少吖啶橙染色的巨核細胞數(shù)目的藥劑。(吖啶橙使單鏈DNA染色且發(fā)出紅色熒光，而在合適的條件下雙鏈DNA發(fā)出綠色熒光)。在另一個實施例中，防止DNA再退火的藥劑是單獨使用或與破壞或降解ssDNA的藥劑一起使用。本發(fā)明的檢定模型靶向巨核細胞過程且因此鑒別用于治療未用靶向快速分裂的有絲分裂腫瘤細胞的標(biāo)準(zhǔn)藥劑治療的殘余表面腫瘤而非腫瘤主體的藥劑。在其它實施例中，方法是針對治療選擇性抑制腫瘤干細胞，而不會實質(zhì)上防止或抑制周圍細胞(例如維持型干細胞)的生長。舉例來說，雖然所靶向的干細胞正經(jīng)歷細胞核分裂，但所述方法包含使所述細胞與能夠進入細胞核且通過修飾或改變ssDNA來修飾或改變鐘形細胞核復(fù)制中間物構(gòu)型的藥劑接觸，從而防止所靶向的細胞內(nèi)鐘形細胞核的進一步細胞核分裂且/或破壞細胞。也可在細胞內(nèi)靶向腫瘤干細胞特異性分子，由此靶向和破壞腫瘤干細胞特異性分子的功能或活性，從而防止或抑制腫瘤細胞生長。在特定實施例中，所述藥劑是化學(xué)藥劑、放射藥劑、酶、或放射治療，由此靶向鐘形細胞核復(fù)制中間物。基于本文中所提供的資料，有理由相信癌發(fā)生似乎是連續(xù)過程，其中某些胎兒/幼年干細胞突變，故其在整個成年壽命中繼續(xù)以幼年干細胞形式生長且獲得所述額外變化以形成快速生長(胎兒速率)和死亡的瘤性干細胞。以下教導(dǎo)是基于對人類胎兒、瘤形成前和瘤性病變的鐘形細胞核內(nèi)的獨特且主要復(fù)制中間物的認(rèn)識呈先前未識別的干細胞DNA復(fù)制和分離形式的ssDNA、或所述獨特復(fù)制過程也需要的干細胞特異性分子，構(gòu)成旨在殺死人類瘤形成和瘤形成前期的干細胞或減緩其生長的療法的新穎有價值靶標(biāo)。圖1是關(guān)鍵影像的概述。A)人類胎兒腸、正常結(jié)腸粘膜、腺瘤和腺癌中的間期和早前期(E.P.)細胞內(nèi)所觀察到的細胞核形態(tài)型的實例。B)胎兒腸的鐘形細胞核的高分辨率影像(1400倍)。聚集濃縮的DNA似乎形成維持空心鐘結(jié)構(gòu)的開口的圓環(huán)。比例尺是5ym。圖2A和2B是5-7周的胚胎腸的影像。圖2A:相差像(左畫面)和染色的細胞核影像(中)和合并的影像(右)展示約50微米直徑管狀合胞體中的細胞核的線性陣列。圖2B:細胞核的高分辨率影像展示空心鐘形結(jié)構(gòu)。在所觀察的所有胚管中都保持鐘形物的"頭腳"定向，但管來回蛇形延伸，使得平行管可具有局部反平行鐘形細胞核定向。比例尺在低放大率下是50iim且在高放大率下是5iim。圖3A-3D展示胎兒腸中的鐘形細胞核的細胞核分裂的影像。圖3A和3B:對稱細胞核分裂。鐘形細胞核從類似形狀的鐘形細胞核中顯現(xiàn)出來。圖3C和3D:不對稱細胞核分裂。球形細胞核和"雪茄"狀細胞核從鐘形細胞核中顯現(xiàn)出來。比例尺是5ym。圖4A-4C展示正常成人結(jié)腸隱窩的影像。圖4A:約2000個類球形、球形或盤狀細胞核的隱窩偶爾(<1/100)含有位于隱窩底部的可識別的鐘形細胞核(箭頭)。圖4B:展示另一個鐘形細胞核的隱窩底部。圖4C:充分分散的隱窩中的壁和內(nèi)腔表面的間期和有絲分裂細胞核的形態(tài)型。放大影像展示(i)球形和卵形間期細胞核，(ii、iii)球形和卵形細胞核的早前期，和(iv)后期(anatelophase)細胞核。比例尺對于低放大率影像是100ym且對于高放大率影像是5iim。圖5A-5E展示腺瘤的影像。圖5A:腺瘤的特征性大分枝隱窩。圖5B:存在于整個腺瘤中的不規(guī)則隱窩樣結(jié)構(gòu)。通常2個、但有時1個、4個或甚至8個鐘形細胞核(插圖)出現(xiàn)在這些大的(>4000個細胞)不規(guī)則隱窩樣結(jié)構(gòu)的底部。圖5C:—群含有1個鐘形細胞核的具有類似細胞核形態(tài)型的細胞。這些形式的群含有正好總共16個、32個、64個和128個細胞。左圖是福爾根-吉姆薩染色(Feulgen-Giemsastain)。右圖是相差自體熒光影像。圖5D:鐘形細胞核出現(xiàn)在腺瘤中的背景(i)具有31個卵形細胞核和1個鐘形細胞核的群，(ii)并肩排列的多個鐘形細胞核，(iii)以并排模式排列的鐘形細胞核(箭頭)(iii)。約250個細胞核(其中數(shù)個鐘形細胞核表示初生隱窩底部)的不規(guī)則混合物。圖5E:含有5種不同細胞核形態(tài)型的細胞的明顯克隆膜片的不規(guī)則隱窩樣結(jié)構(gòu)，其中l(wèi)個鐘形細胞核(箭頭)位于底部。比例尺是100ym(在"a、b"中)和5ym(在"e"中)。圖6A-6E展示腺癌的影像。圖6A:具有分枝和頻繁斷點的極大隱窩樣結(jié)構(gòu)(>8000個細胞)。箭頭表示主要存在于腫瘤表面附近的約250個細胞隱窩樣結(jié)構(gòu)的實例。圖6B:具有多個鐘形細胞核(所有細胞核形態(tài)型的約3%)。的內(nèi)部腫瘤塊圖6C:以頭腳合胞體和非合胞體并排構(gòu)型定向的圖6B中的鐘形細胞核。圖6D:腺癌中的對稱細胞核分裂。圖6E:腺癌中的鐘形物的不對稱細胞核分裂，從而形成雪茄狀細胞核。已在肝的結(jié)腸轉(zhuǎn)移瘤中觀察到類似結(jié)構(gòu)。比例尺是5iim。圖7A-7D說明人類組織和細胞的研究中的定量影像細胞計量術(shù)的階段。圖7A:準(zhǔn)備進行固定的新鮮結(jié)腸手術(shù)丟棄物。圖7B:展現(xiàn)通過息肉的lmm切片的分散結(jié)果的顯微鏡載玻片制備物(描繪息肉的"上下"定位的輪廓)。圖7C:整個隱窩都可觀察到的細胞核分散(呈洋紅色)。與以上所示的5y切片(BrdU染色和H&M染色)相比，保留所有隱窩細胞核。圖7D:電動Axioscop顯微鏡-AxioCam彩色CCD相機-KS400軟件影像分析工作站。圖8A和8B說明在應(yīng)用FISH以研究腫瘤中的不分裂和分裂鐘形細胞核中的"所關(guān)注的靶標(biāo)"。圖8A:染色質(zhì)(由于每平方微米的DNA含量較高，所以染色較深)形成類似于以2個平行圓圈排列的前期染色體的獨特結(jié)構(gòu)。置于附圖中的這些圓圈說明特定染色體可能存在于鐘形細胞核的這一特定位點的預(yù)測。圖8B:在鐘形細胞核的整個不對稱分裂中發(fā)生的呈假想轉(zhuǎn)變(這里是鐘形細胞核變成卵形細胞核)的染色質(zhì)分布和特定染色體定位變化。圖9A-9D是說明TK_6人類細胞的球形細胞核內(nèi)的染色體11的熒光原位雜交結(jié)果的影像。圖9A:處于前期染色體分散的兩對染色體。圖9B:球形細胞核DAPI細胞核染色。圖9C:與FITC熒光探針雜交的同一對染色體。圖9D:DAPI與FITC間期染色體染色的合并影像。比例尺是5微米。圖10展示排列在合胞體中的鐘形細胞核的對稱細胞核分裂的影像。圖11展示描繪DNA在正經(jīng)歷細胞核分裂的鐘形細胞核中的定位的影像。圖12展示在鐘形細胞核的細胞核分裂期間細胞核物質(zhì)的排列和組成(ssDNA或dsDNA)。圖13A-13D展示人類胎兒制備物的影像，其描繪一系列先前未識別的細胞核形式。這些形式產(chǎn)生原始鐘形細胞核。圖13A展示呈圍繞球形或略微卵形細胞核的長軸的"帶"形式的具有聚集濃縮約10X的總DNA含量的細胞核。圖13B展示其中2個聚集濃縮的細胞核"帶"似乎已分離、但仍然是單個細胞核的一部分的細胞核。圖13C展示似乎已通過圖13B的雙帶狀細胞核的分裂而產(chǎn)生的一對細胞核。圖13D展示每一個合胞體都含有一組鐘形物，其中如圖13C中，單一一對鐘形物在其直線中點處以開口相對。這些影像展示一系列對稱分裂形成從中心對推開的細胞核。圖14A和14B展示結(jié)腸腺瘤(圖14A)和腺癌(圖14B)中的細胞核形態(tài)型。癌發(fā)生的形態(tài)型展示類似的帶，一個或兩個帶圍繞卵形細胞核的長軸。圖15A-15C展示對人類著絲粒具有特異性的FISH染色。圖15展示來自人類12周胎兒結(jié)腸組織的球形(圖15A)、雪茄狀(圖15B)和鐘形(圖15C)細胞核內(nèi)的著絲粒(亮色)。圖16展示由人類胎兒心肌(妊娠約12周)中的鐘形細胞核產(chǎn)生的多核合胞體。特定方法涉及酶組織解離，隨后吖啶橙染色和熒光顯微術(shù)。圖17展示分裂的鐘形細胞核內(nèi)的DNA合成的進展。DNA含量的增加在影像上方指出且在下方用圖表繪圖。所述影像由高分辨率(每個像素lOOObp.)福爾根DNA影像細胞計量術(shù)捕捉。圖18A-18B展示利用ssDNA中間物的鐘形細胞核的復(fù)制中間物構(gòu)型。圖18A展示鐘形細胞核的對稱分裂且指出DNA含量的相應(yīng)增加。圖18B展示鐘形細胞核的吖啶橙染色。所述吖啶橙染色的紅色熒光指示存在ssDNA中間物。相鄰細胞內(nèi)的雙鏈DNA由吖啶橙染色的綠色熒光指示。圖19展示用于合理治療性設(shè)計的定位腫瘤干細胞、形成均質(zhì)樣品、且鑒別對所述干細胞具有特異性的靶標(biāo)大分子的方法的流程圖。圖20A-20F展示由吖啶橙和ssDNA抗體染色的鐘形細胞核內(nèi)ssDNA中間物圖案的并排比較。具體實施例方式本發(fā)明涉及以下發(fā)現(xiàn)腫瘤干細胞(例如分裂產(chǎn)生腫瘤的細胞)的特征為鐘形細胞核且經(jīng)歷獨特形式的復(fù)制。鐘形細胞核很少存在于成人組織中，或以大量降低的數(shù)目存在，但腫瘤組織經(jīng)歷基因組以單鏈DNA(ssDNA)呈現(xiàn)的時間段。在結(jié)腸和胰腺人類腫瘤中，鐘形細胞核通過非有絲分裂過程對稱和不對稱地分裂(格思杰伐(Gostjeva)等人，癌癥遺傳學(xué)和細胞遺傳學(xué)(CancerGeneticsandCytogenetics)，164:16-24(2006);格思杰伐(Gostjeva)等人，干細胞評論(StemCellReviews)，1:243-252(2005))。這些鐘形細胞核大量地出現(xiàn)在5-7周胚胎后腸(其中，其被包裹于管狀合胞體中且占例如所有細胞核的30%)和腫瘤組織(其中，其大量存在于"未分化的"小環(huán)境中)中。其具有數(shù)個類似干細胞的品質(zhì)，尤其是不對稱分裂的"口令"和與人類結(jié)腸瘤形成前和瘤性組織的生長速率一致的細胞核分裂頻率(赫蕾諾-希門尼斯(Herrero-Jimenez，P.)等人，突變研究(Mutat.Res.)，400:553-78(1998)，赫蕾諾-希門尼斯(Herrero-Jiminez，P.)等人，突變研究(Mut.Res.)447:73-116(2000);格思杰伐(Gostjeva)等人，癌癥遺傳學(xué)和細胞遺傳學(xué)(CancerGeneticsandCytogenetics)，164:16-24(2006);格思杰伐(Gostjeva)等人，干細胞評論(StemCellReviews)，1:243-252(2005))。這些先前未識別的細胞核形式都是腫瘤產(chǎn)生和分化的來源且因此為癌癥治療策略的靶標(biāo)。這些鐘形細胞核經(jīng)歷基因組實質(zhì)上以ssDNA呈現(xiàn)的階段的觀察結(jié)果允許靶向和破壞所述細胞核。!猶月中齢頓誦誠本文所述的出乎意料的觀察結(jié)果是，腫瘤干細胞復(fù)制涉及復(fù)制中間物構(gòu)型，其中鐘形細胞核開始分離成兩個細胞核，且在細胞核分離期間，腫瘤干細胞基因組中的大部分首先分離成ssDNA。在這種復(fù)制中間物構(gòu)型期間，大量ssDNA存在于細胞核和細胞中，可使用常規(guī)方法進行檢測。這一觀察結(jié)果構(gòu)成篩選和鑒別本文所述的有效抗腫瘤發(fā)生藥劑的方法的基礎(chǔ)，所述方法評估所述藥劑抑制/防止鐘形細胞核增殖的適用性。此外，在這種復(fù)制中間物構(gòu)型期間，腫瘤干細胞特異性分子也可存在于細胞中且也可用作檢定方法的基礎(chǔ)。使用本文和美國專利申請案2006/0063144和PCT/US06/047136(各案的教導(dǎo)都以全文引用的方式并入本文中)中所述的方法，可在接觸候選抗腫瘤發(fā)生藥劑或用所述藥劑處理之前和之后，使實體瘤塊中含有ssDNA的鐘形細胞核或單獨ssDNA顯像，且比較在用候選/測試藥劑處理之前和之后具有鐘形細胞核(巨核細胞)的細胞的相對密度，或與并未接觸所述藥劑/用所述藥劑處理的其它腫瘤組織作比較。相對密度(例如，相對于細胞數(shù)目或相對于腫瘤塊重量，含有ssDNA的鐘形細胞核或單獨ssDNA的數(shù)目)降低將表示藥劑有效減少或防止腫瘤干細胞增殖。舉例來說，在已確定整個或一部分腫瘤樣品(例如從患者獲得，或從作為宿主生物體中的異種移植物形成的實體瘤獲得)中含有ssDNA的鐘形細胞核的相對密度后，基于鐘形細胞核不對稱分裂時存在的ssDNA中間物構(gòu)型，使腫瘤樣品接觸抗腫瘤發(fā)生藥劑，例如靶向ssDNA且降解ssDNA、防止ssDNA退火或防止ssDNA模板復(fù)制等的藥劑。接觸藥劑后，可再次確定鐘形細胞核的相對密度。如果含有ssDNA的密度降低或完全不存在，那么將有理由相信候選藥劑將是有效抗腫瘤發(fā)生藥劑。更具體來說，本文描述一種鑒別抑制腫瘤生長的藥劑的方法，其包含使受試者或宿主動物的腫瘤樣品與候選藥劑接觸，其中所述腫瘤樣品包含含有含ssDNA的鐘形細胞核或單獨ssDNA的腫瘤干細胞，且其中所述鐘形細胞核的一些或全部呈復(fù)制中間物構(gòu)型；保持所述樣品與所述候選藥劑在適合所述藥劑與ssDNA相互作用的條件下接觸；確定在接觸后腫瘤樣品中含有ssDNA的鐘形細胞核或單獨ssDNA的存在、不存在或數(shù)目；和比較在與候選藥劑接觸后樣品中含有ssDNA的鐘形細胞核或單獨ssDNA的存在、不存在或數(shù)目與對照樣品中含有ssDNA的鐘形細胞核或單獨ssDNA的存在、不存在或數(shù)目。確定在與候選藥劑接觸后樣品中含有ssDNA的鐘形細胞核的數(shù)目減少或不存在或ssDNA減少或不存在表示所述藥劑抑制腫瘤生長。或者，鐘形細胞核的存在、不存在或數(shù)目可通過檢測呈復(fù)制中間物構(gòu)型或極接近復(fù)制中間物構(gòu)型的一種或一種以上腫瘤干細胞特異性分子的存在來確定。此外，可使用本發(fā)明方法來檢測對鐘形細胞核的復(fù)制中間物構(gòu)型具有特異性的所述大分子。因為腫瘤干細胞的鐘形細胞核表示不存在于其它人類細胞中的事件，所以鑒別這些分子有助于鑒別用于治療性藥物設(shè)計的靶標(biāo)。此外，因為腫瘤干細胞中的大部分DNA在復(fù)制期間是單鏈，所以在對稱分裂過程中的干細胞可由所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員分離用于鑒別大分子。可能與復(fù)制中間物構(gòu)型有關(guān)的潛在大分子的實例包括ssDNA結(jié)合蛋白，諸如異質(zhì)細胞核核糖核蛋白；與ssDNA的物理移動和分離有關(guān)的染色體結(jié)構(gòu)維持(structuralmaintenanceofchromosome,SMC)蛋白；新穎著絲粒蛋白；與DNA修復(fù)有關(guān)的酶；新穎聚合酶；和一系列尚未鑒別的蛋白。在一個特定實施例中，可通過給動物注射癌癥異種移植物來形成合適的異質(zhì)動物模型。所述異種移植物隨后將長成實體瘤，隨后可切除。具有鐘形細胞核的細胞、巨核細胞或具有鐘形細胞核的合胞體的存在可如本文和PCT/US06/047136中所述來確認(rèn)。隨后可使動物和/或腫瘤接觸已知防止ssDNA的再退火、結(jié)合、修飾或降解ssDNA的靶向ssDNA的藥劑，例如烷化劑、ssDNA核酸酶或其它酶或蛋白質(zhì)，包括例如抗體、寡核苷酸、核糖核酸酶、核糖蛋白或融合蛋白等藥劑。一些非限制性實例包括卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(1omustine)、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)。不同于基于相對于對照組生長腫瘤的收縮或異種移植動物的存活模式來關(guān)注藥劑活性的其它腫瘤模型，這一策略涉及評估生長的異種移植物中ssDNA染色的巨核細胞的出現(xiàn)率。所關(guān)注的藥劑是相對于對照組(例如，和未經(jīng)處理的腫瘤樣品或在接觸所述藥劑前相同腫瘤樣品的一部分或全部)顯著減少例如吖啶橙染色的巨核細胞的數(shù)目的藥劑。有理由相信，預(yù)期干擾分裂腫瘤細胞的ssDNA復(fù)制中間物的藥劑/化合物靶向巨核細胞過程，且因此是有效治療未用靶向快速分裂的有絲分裂腫瘤細胞的標(biāo)準(zhǔn)藥劑處理的殘余表面腫瘤而非腫瘤主體的藥劑。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將僅需要關(guān)注鐘形細胞核的ssDNA、巨核細胞內(nèi)的ssDNA的數(shù)量或品質(zhì)所發(fā)生的變化，以及鐘形細胞和腫瘤自身所發(fā)生的任何形態(tài)變化，以確定候選藥劑(或所關(guān)注的藥劑)是否將是用于進一步評估的可行候選物。具體來說，腫瘤干細胞形態(tài)的變化、巨核細胞內(nèi)ssDNA的量的變化或腫瘤自身的形態(tài)可表示候選藥劑有效抑制腫瘤生長。所述變化將通過腫瘤干細胞的減少或不存在來表現(xiàn)。癌癥治療學(xué)中的"干細胞靶標(biāo)"由于本文所提供的資料，方法現(xiàn)可用于傳遞藥劑以耙向和破壞腫瘤干細胞而不使細胞在其封閉環(huán)境中受損或受損極小。在本發(fā)明的一個實施例中，方法可用于通過給藥ssDNA特異性藥劑或靶向腫瘤干細胞特異性分子的藥劑來治療受試者的瘤形成前期、瘤形成(癌瘤)或其它病理。如本文中所使用，術(shù)語"治療"可指改善與癌瘤或病理相關(guān)的癥狀；減少、防止或延緩癌瘤的轉(zhuǎn)移；減少一種或一種以上腫瘤的數(shù)目、減小其體積和/或尺寸；和/或降低癌瘤或病理的癥狀的嚴(yán)重程度、縮短其持續(xù)時間或降低其出現(xiàn)率。如本文中所使用，"ssDNA特異性治療劑"是指靶向腫瘤干細胞的ssDNA以通過防止ssDNA形成、干擾ssDNA復(fù)制或干擾ssDNA拷貝來進行破壞的藥劑(例如化學(xué)治療劑)，或另外治療受試者的癌瘤或減少或消除腫瘤或病理的作用的藥劑。如本文所述，ssDNA在腫瘤干細胞維持中很重要，因此破壞ssDNA會防止ssDNA形成、干擾ssDNA復(fù)制或干擾ssDNA拷貝，從而將抑制腫瘤干細胞復(fù)制且由此治療癌瘤或病理。在一些實施例中，所述的治療方法是與手術(shù)、激素切除療法、放射療法或化學(xué)療法中的一者或一者以上結(jié)合使用?；瘜W(xué)治療劑、激素藥劑和/或放射治療劑和本發(fā)明化合物可同時、分開或依次給藥。在一個實施例中，因為經(jīng)修飾的ssDNA將不會經(jīng)歷進一步復(fù)制變回雙鏈DNA(dsDNA)，所以可利用耙向且改變ssDNA的化學(xué)藥劑或酶藥劑(例如烷化劑、單鏈特異性核酸酶、耙向復(fù)制機構(gòu)的藥劑等)來靶向腫瘤干細胞的細胞核物質(zhì)進行破壞。因為ssDNA在分裂腫瘤干細胞的異型細胞核形態(tài)型中比在相鄰細胞中顯著更豐富，所以通過使用特異性靶向ssDNA的藥劑來實現(xiàn)特異性腫瘤細胞抑制。舉例來說，任何防止ssDNA復(fù)制的藥劑(例如與DNA雜交的分子)都不能延長，例如經(jīng)修飾的寡核苷酸或核酸衍生物，例如缺乏延長所必需的Y-磷酸酯的核酸或肽核酸。本發(fā)明是針對一種通過特異性靶向癌性腫瘤中的腫瘤干細胞的ssDNA來治療性治療具有所述腫瘤的患者的方法，其中所述方法包含向所述患者給藥治療有效量的特異性結(jié)合單鏈DNA且破壞腫瘤干細胞的烷化劑、DNA核酸酶、DNA結(jié)合多肽、寡核苷酸或小有機分子，由此有效治療性治療腫瘤。多肽、寡核苷酸或寡肽可視情況結(jié)合生長抑制劑或細胞毒性劑、放射性同位素、溶核酶等。此項技術(shù)中已知將藥劑傳遞到患者的細胞或腫瘤組織的方法，其中所述藥劑將破壞或防止ssDNA基因組復(fù)制，且由此防止腫瘤干細胞增殖。在本發(fā)明方法中，利用特異性結(jié)合ssDNA的藥劑或部分以腫瘤干細胞特異性方式傳遞藥劑。本文中所使用的術(shù)語"特異性結(jié)合"ssDNA的藥劑是優(yōu)先或選擇性結(jié)合ssDNA而非dsDNA的藥劑。雖然在特異性結(jié)合ssDNA與雙鏈DNA的藥劑之間會發(fā)生某種程度的非特異性相互作用，但如通過完整或部分地特異性識別ssDNA所介導(dǎo)，可區(qū)分特異性結(jié)合。特異性結(jié)合通常將通過腫瘤干細胞中ssDNA的相對豐度來證實。本發(fā)明的另一個實施例特異性耙向腫瘤干細胞的ssDNA。ssDNA可能不存在于細胞核中，或可能結(jié)合到核蛋白復(fù)合物中。ssDNA以所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠用于進行特異性靶向的獨特結(jié)構(gòu)構(gòu)型存在。舉例來說，熱力學(xué)證實形成十字形結(jié)構(gòu)和發(fā)夾環(huán)。在本發(fā)明的一個特定實施例中，可利用抗體特異性靶向這些結(jié)構(gòu)。"抗體"是通過活體外或活體內(nèi)產(chǎn)生體液反應(yīng)所獲得的免疫球蛋白分子，且包括多克隆和單克隆抗體。所述術(shù)語也包括遺傳工程改造形式，諸如嵌合抗體(例如人源化鼠源抗體)、異源偶聯(lián)抗體(例如雙特異性抗體)和重組單鏈Fv片段(scFv)。術(shù)語"抗體"也包括抗體的抗原結(jié)合片段，諸如Fab'、F(ab')2、Fab、Fv、rlgG和反向IgG，以及重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。與ssDNA產(chǎn)生的抗體免疫反應(yīng)性可在活體內(nèi)產(chǎn)生，或通過諸如在噬菌體或類似載體中選擇重組抗體庫等重組方法產(chǎn)生。參見例如，豪思(Huse)等人(1989)科學(xué)(Science)246:1275-1281;和沃德(Ward)等人(1989)自然(Nature)341:544-546;和沃恩(Vaughan)等人(1996)NatureBiotechnology,14:309-314。"抗原結(jié)合片段"包括結(jié)合ssDNA的抗體的任何部分?？乖Y(jié)合片段可例如為包括CDR區(qū)域的多肽或免疫球蛋白分子中保留對ssDNA的親和力和特異性的其它片段。許多ssDNA抗體是市售的。在一個特定實例中，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可鑒別ssDNA結(jié)合抗體的單鏈Fv片段，其是仍保留全長親本抗體的特異性和單價結(jié)合親和力的最小抗體形式。單鏈Fv片段是表達為單個基因且可與細胞核定位信號融合以將抗體片段導(dǎo)向細胞核。有理由相信，可通過顯微注射或病毒介導(dǎo)的基因療法在腫瘤細胞群中引入單鏈Fv片段并使其表達。一旦結(jié)合ssDNA的豐富二級結(jié)構(gòu)，抗體片段就會阻斷腫瘤干細胞的復(fù)制和分裂。在另一個實施例中，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可在活體外利用熟知方法表達并純化具有已知特異性ssDNA結(jié)合域的多肽。舉例來說，polyADP核糖聚合酶(polyADPRibosePolymerase,PARP)或異質(zhì)細胞核核糖核蛋白家族的ssDNA特異性域可通過桿狀病毒或其它真核蛋白表達系統(tǒng)進行表達。這些藥劑可以進一步與陽離子細胞穿透肽序列框內(nèi)融合，從而促進生物活性肽的快速細胞攝取?；蛘?，可利用顯微注射將多肽引入細胞中。在又一個實施例中，將陽離子氨基磷酸酯寡核苷酸引入腫瘤干細胞中以高效地靶向單鏈DNA。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可以如下方式制造這些藥劑所述藥劑將充分且隨機地靶向ssDNA的多個區(qū)域。這些藥劑以高親和力結(jié)合ssDNA且易于進入靶標(biāo)細胞中而無需載體處理(vectorization)或化學(xué)轉(zhuǎn)染。在另一個實施例中，可通過化學(xué)藥劑特異性靶向ssDNA。這些藥劑優(yōu)先以序列或二級結(jié)構(gòu)依賴性方式與ssDNA核苷酸堿基反應(yīng)。實例包括下表1中所列的放線菌素D(ActinomycinD)、高錳酸鉀、溴乙醛、氯乙醛、焦碳酸二乙酯和四氧化鋨。盡管這些物質(zhì)中的一些在高含量下有毒，但有理由相信可以局部和劑量選擇性方式將所述藥劑引入腫瘤中，由此使毒性最小。同樣，盡管一些化學(xué)藥劑結(jié)合ssDNA與雙鏈DNA，但腫瘤干細胞中豐富含量的ssDNA有助于極低和更有效的治療劑量?；瘜W(xué)藥劑機制放線菌素D充分研究的抗腫瘤藥劑。結(jié)合ssDNA中豐富的發(fā)夾DNA結(jié)構(gòu)。溴乙醛在腺嘌呤和胞嘧徒的堿基配對位置處發(fā)生反應(yīng)。優(yōu)先與單鏈環(huán)和十字形中的堿基反應(yīng)。氯乙醛易于與ssDNA相互作用以主要形成乙烯橋損壞的氯乙烯代謝物。焦碳酸二乙酯使嘌呤在N-7位置處羧乙基化，從而打開咪唑環(huán)。實質(zhì)上反應(yīng)性朝向DNA的單鏈區(qū)域。四氧化鋨在吡徒存在下添加到嘧徒的C-5、C-6雙鍵處以形成鋨酸酯。實質(zhì)上與ssDNA的反應(yīng)性大于與雙鏈DNA的反應(yīng)性。高錳酸鉀具有嘧啶特異性和單鏈特異性。通過氧化修飾堿基。表1:結(jié)合ssDNA的化學(xué)藥劑。在另一個實施例中，ssDNA治療劑包含活性劑組分/部分和靶向劑組分/部分。所述靶向劑組分是如上文所述特異性結(jié)合ssDNA的藥劑，或包含所述藥劑。靶向劑組分連接于所述活性劑組分上。舉例來說，其可直接彼此共價結(jié)合。當(dāng)兩者通過共價鍵彼此直接結(jié)合時，所述鍵可通過由每一部分上的活性基團形成合適的共價連接而形成。舉例來說，另一方面，一種化合物上的酸基可與胺、酸或醇縮合以分別形成相應(yīng)酰胺、酸酐或酯。除羧酸基團、氨基和羥基外，其它適合在靶向劑組分與活性劑組分之間形成連接的活性基團包括磺酰基、氫硫基和羧酸的鹵酸(haloicacid)和酸酐衍生物。在另一個實施例中，治療劑可包含兩種或兩種以上部分或組分，通常是靶向劑部分和一種或一種以上活性劑部分?？墒褂眠B接基團來連接活性劑與靶向劑組分，其中靶向劑與ssDNA或腫瘤干細胞特異性分子特異性相互作用，由此將活性劑傳遞到復(fù)制中間物構(gòu)型，且抑制鐘形細胞核的進一步復(fù)制。連接于靶向劑組分上的活性劑組分可為任何實現(xiàn)所需治療結(jié)果的藥劑或包含所述藥劑，所述藥劑包括諸如以下藥劑放射性核素(例如1125、123、124、131或其它放射性藥劑)；化學(xué)治療劑(例如抗生素、抗病毒劑或抗真菌劑)；免疫剌激劑(例如細胞因子)；13抗腫瘤劑消炎劑；促細胞凋亡劑(例如肽)；毒素(例如蓖麻毒素、腸毒素、LPS);抗生素；激素；蛋白(例如表面活性劑蛋白、凝結(jié)蛋白)；溶解劑；小分子(例如無機小分子、有機小分子、小分子的衍生物、復(fù)合小分子)；納米粒子(例如基于脂質(zhì)或非脂質(zhì)的調(diào)配物)；脂質(zhì)；脂蛋白；脂肽；脂質(zhì)體；脂質(zhì)衍生物；天然配體；發(fā)生改變的蛋白(例如經(jīng)修飾以增加對ssDNA的親和力的基于白蛋白或其它血液載體蛋白的傳遞系統(tǒng)，或膜聯(lián)蛋白Al的衍生物，即血清類粘蛋白)；溶核酶；抑制腫瘤干細胞的生長、遷移的藥劑；基因或核酸(例如反義寡核苷酸)；病毒或非病毒基因傳遞載體或系統(tǒng)；或前藥或前分子(promolecule)。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將熟悉活性劑的設(shè)計和應(yīng)用。舉例來說，在一個實施例中，放射性核素或其它放射性藥劑可用作活性劑組分。靶向劑組分以腫瘤特異性方式傳遞放射性藥劑，允許局部放射損傷且在整個腫瘤中(包括在腫瘤的腫瘤細胞、基質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞中)引起放射誘發(fā)的細胞凋亡和壞死。在另一個特定實施例中，用于瘤性疾病的化學(xué)治療劑可用作活性劑組分。代表性藥劑包括烷化劑(氮芥、乙烯亞胺、烷基磺酸鹽、亞硝基脲和三氮烯)和其它類似藥劑。舉例來說，在某些實施例中，化學(xué)治療劑可為細胞毒性或細胞抑制藥物?；瘜W(xué)治療劑也可包括對細胞具有其它作用(諸如將干細胞狀態(tài)逆轉(zhuǎn)為分化狀態(tài))或抑制細胞復(fù)制的化學(xué)治療劑。適用于本發(fā)明的已知細胞毒性劑的實例例如列于古德曼(Goodman)等人，"治療學(xué)的藥理學(xué)基石出(ThePharmacologicalBasisofTherapeutics)，，，第6片反，吉爾曼(A.G.Gilman)等人編/紐約麥克米蘭出版公司(MacmillanPublishingCo.NewYork)，1980中。下表2中展示一些實例。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表2:化學(xué)治療劑。其它細胞毒性劑包括長春花生物堿，諸如長春堿(vinblastine)和長春新堿(vincristine);酶，諸如L-天冬酰胺酶；鉑配位絡(luò)合物，諸如順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)和奧沙利鉑(oxaliplatin);經(jīng)取代的脲，諸如羥基脲；和甲基肼衍生物，諸如丙卡巴肼。因為ssDNA相較雙鏈DNA提供更多的潛在烷基化靶標(biāo)，所以本文所述的方法表示改良公知化學(xué)治療性DNA烷化劑的功效的方法。公知化學(xué)治療方案的顯著缺點包括非特異性和不良副作用。在選擇性靶向有限的易受損腫瘤細胞群體中的ssDNA的情況下，有理由相信為改良功效，可重新計算給藥方案。目前用于治療癌癥的大部分化學(xué)治療劑具有能夠直接與靶向劑組分的胺或羧基化學(xué)交聯(lián)的官能團。舉例來說，可利用順鉑上的游離氨基，同時可利用美法侖和苯丁酸氮芥上的游離羧酸基團。這些官能團(即游離氨基和羧酸)為各種同雙官能和雜雙官能化學(xué)交聯(lián)劑的靶標(biāo)，其可使這些藥物直接與游離氨基交聯(lián)。具體來說，本發(fā)明涵蓋靶向劑組分和/或活性劑組分包含用于螯合金屬的螯合物部分(例如用于放射金屬或順磁離子的螯合劑)的實施例。在優(yōu)選實施例中，所述螯合劑是用于放射性核素的螯合劑。適用于本發(fā)明的放射性核素包括Y發(fā)射體、正電子發(fā)射體、奧格電子(Augerelectron)發(fā)射體、X射線發(fā)射體和熒光發(fā)射體，其中P或a發(fā)射體優(yōu)選用于治療用途。在放射療法中適用作毒素的放射性核素的實例包括32P、33P、43K、47SC、52Fe、57CO、64CU、67Ga、67CU、68Ga、71Ge、75Br、76Br、77Br、77AS、77Br、81Rb/81MKr、87MSr、90Y、97RU、99Tc、咖pd，Rh、皿pb、服Rh、咖pd、mAg、m工n、n3工n、u9sb、msC5工，Cs、徴Ba,Cs、m工、131CS、143Pr、153Sm、161Tb、166HO、169EU、177LU、186Re、188Re、189Re、1910S、193Pt、194Ir、197Hg、199AU、203Pb、2"At,2pb，Bi和2"Bi。優(yōu)選治療性放射性核素包括，Re86Re、加3pb，Pb，Bi、冊Pd、64Cu、67Cu、9。Y25l，I、77Br、2"At、97Ru、服Rh、朋Au和鵬Ag、艦Ho或"7Lu。螯合劑將與金屬配位的條件例如由甘瑟(Gan謂)等人的美國專利第4，831，175號、第4，454，106號和第4，472，509號描述。"mTc是對這一應(yīng)用尤其具有吸引力的放射性同位素，因為其易于用于所有細胞核醫(yī)學(xué)部門，便宜，給與極少患者放射劑量，且可容易通過肼基煙酰胺部分拴住DNA寡核苷酸。(參見例如，那拓維馳(Hnatowich)等人，細胞核醫(yī)學(xué)雜志(J.ofNuclearMed.)，36:2306-2314(1995))。選擇無規(guī)DNA寡聚物可經(jīng)锝標(biāo)記且將結(jié)合腫瘤干細胞的ssDNA中的可接近且豐富的相應(yīng)序列。"mTc具有6小時的半衰期，這個意思是需要快速靶向標(biāo)記锝的寡聚物。因此，在某些實施例中，治療劑包括用于锝的螯合劑。治療劑也可包含放射致敏劑，例如增加細胞對放射的敏感性的部分。放射致敏劑的實例包括硝基咪唑、甲硝魅唑(metronidazole)和米索硝唑(misonidazole)(參見例如，迪芬達(DeVita，V.T.Jr.)，哈里森內(nèi)科學(xué)原理(Harrison'sPrinciplesofInternalMedicine)，第68頁，紐約麥克勞希爾圖書公司(McGraw-HillBookCo.，N.Y.)，1983，其以引用的方式并入本文中)。給藥包含放射致敏劑作為活性部分的ssDNA治療劑且使其定位于發(fā)生轉(zhuǎn)移的細胞處。使個體暴露于放射后，放射致敏劑被"激發(fā)"且導(dǎo)致細胞死亡。存在各種可用作螯合配體且可作為ssDNA治療劑的一部分衍生的部分。舉例來說，所述螯合配體可為1，4，7，10-四氮環(huán)十二烷四乙酸(D0TA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亞乙三胺五乙酸(DTPA)和l-對異硫氰基-苯甲基-甲基-二亞乙三胺五乙酸(ITC-MX)的衍生物。這些螯合劑通常在側(cè)鏈上具有基團，螯合劑可通過所述基團用于連接靶向劑組分。所述基團包括例如苯甲基異硫氰酸酯，DOTA、DTPA或EDTA可通過苯甲基異硫氰酸酯與例如抑制劑的氨基偶合。在另一個特定實施例中，本發(fā)明包括ssDNA特異性溶核酶用于破壞腫瘤細胞的ssDNA的用途。舉例來說，脫氧核糖核酸酶VI、S1核酸酶、RAD2或?qū)sDNA具有特異性的任何其它人類核酸內(nèi)切酶可通過病毒介導(dǎo)的基因表達或顯微注射而在腫瘤塊中異位表達。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將熟悉這些熟知方法。因為腫瘤干細胞具有與相鄰細胞相比實質(zhì)上提高含量的ssDNA，所以核酸酶將對腫瘤干細胞具有增強的細胞毒性作用。在一個類似實施例中，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可工程改造催化性RNA分子(核糖酶)以使ssDNA的不受阻礙和未受保護的核苷酸主鏈經(jīng)受親核性攻擊。舉例來說，單鏈DNA分子在生理條件下的特定裂解可通過具有脫氧核糖核酸酶活性的催化性RNA分子來實現(xiàn)。一個特定實例是具有核糖具有親核性2'羥基的5'端核苷酸的核糖核苷酸聚合物。在又一個實施例中，可靶向腫瘤干細胞的編碼ssDNA特異性胞苷脫氨酶的AP0BEC3G基因以使ssDNA高突變，由此限制復(fù)制。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將熟悉建構(gòu)AP0BEC3G表達載體且將其傳遞到靶標(biāo)細胞的方法。藥劑的傳遞在本發(fā)明方法中，藥劑可單獨給藥，或以包含藥劑和生理學(xué)上相容的載劑或賦形劑的組合物(例如醫(yī)藥或生理組合物)形式給藥。在本發(fā)明的一個實施例中，其可在活體內(nèi)(例如向個體)或活體外(例如向組織樣品)給藥。本發(fā)明方法不僅可用于人類個體，而且還可用于獸醫(yī)用途(例如用于其它哺乳動物，包括馴養(yǎng)動物(例如馬、牛、綿羊、山羊、豬、狗、貓、鳥)和非馴養(yǎng)動物。所述載劑和組合物可為無菌的。調(diào)配物應(yīng)適合給藥方式。合適的醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑包括(但不限于)水、鹽溶液(例如NaCl)、生理鹽水、緩沖生理鹽水、醇、甘油、乙醇、阿拉伯膠(gumarabic)、植物油、苯甲醇、聚乙二醇、明膠、碳水化合物(諸如乳糖、直鏈淀粉或淀粉)、右旋糖、硬脂酸鎂、滑石粉、硅酸、粘性石蠟、芳香油、脂肪酸酯、羥基甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等，以及其組合。必要時，可將醫(yī)藥制劑與助劑混合，所述助劑例如潤滑齊U、防腐齊U、穩(wěn)定齊U、濕潤齊IJ、乳化齊IJ、影響滲透壓的鹽、緩沖液、著色劑、調(diào)味劑和/或芳香族物質(zhì)和不與活性劑進行有害反應(yīng)的類似物。引入這些組合物的方法包括(但不限于)皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、眼內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、局部、口服和鼻內(nèi)。其它合適的引入方法也可包括可充電或生物可降解的裝置、粒子加速裝置("基因槍")和緩釋聚合裝置。醫(yī)藥組合物也可作為與其它藥劑形成的組合療法的一部分來給藥。所述組合物可根據(jù)常規(guī)程序調(diào)配為適合于向人類或動物給藥的醫(yī)藥組合物。舉例來說，用于靜脈內(nèi)給藥的組合物通常是無菌等滲水性緩沖液中的溶液。必要時，組合物也可包括增溶劑和局部麻醉劑以減輕注射部位的疼痛。各成分一般分開供應(yīng)或混合于單位劑型中一起供應(yīng)，例如在密閉容器(諸如指示活性劑數(shù)量的安瓿或袋)中的干燥凍干粉末或無水濃縮物。當(dāng)通過注射給藥組合物時，可提供1安瓿的無菌注射用水或生理鹽水以致可在給藥之前混合各成分。因此，由于本發(fā)明，檢定方法現(xiàn)可用于鑒別適合用于抑制腫瘤和胎兒干細胞的鐘形細胞核復(fù)制的新穎治療劑。此外，新穎治療方法也可用于治療與具有鐘形細胞核的腫瘤干細胞相關(guān)的瘤形成前期和瘤形成。提供以下實施例來說明本發(fā)明且不希望以任何方式限制本發(fā)明。實施例以下是本發(fā)明的實施例的描述。所有專利、公開申請案和本文中所引用的參考文獻的教導(dǎo)都以全文引用的方式并入本文中。實施例1.建立組織和腫瘤的來源。從麻省綜合醫(yī)院的病理部門(MassachusettsGeneralHospital,D印artmentofPathology)的合作者處獲得作為手術(shù)丟棄物由所述合作者丟棄的成人組織和腫瘤試樣(格思杰伐(Gostjeva，E.)等人，癌癥遺傳學(xué)與細胞遺傳學(xué)(CancerGenet.Cytogenet.)，164:16-24,2006)。使用匿名丟棄的腫瘤和組織切片已通過蒂利教授(Prof.W.G.Thilly)的實驗室由麻省理工學(xué)院以人為實驗對象委員會(MITCommitteeonUseofHumansasExperimentalsubjects)批準(zhǔn)。開發(fā)用于組織切除、固定、分散和DNA染色的方法。以下方案允許使具有所需透明度的組織和腫瘤試樣的細胞核顯像，以對染色體和細胞核進行結(jié)構(gòu)和數(shù)量觀察。關(guān)鍵要素是使用在30分鐘手術(shù)內(nèi)固定的新鮮腫瘤樣品且避免切薄片的標(biāo)準(zhǔn)程序。鐘形細胞核顯然是組織和腫瘤樣品中自溶作用的早期受害者且在切除術(shù)后約45分鐘不再能辨別。標(biāo)準(zhǔn)5微米切片完全切開數(shù)種所發(fā)現(xiàn)的細胞核形式，幾乎所有形式都具有大于5微米的最小直徑。所設(shè)計的特定技術(shù)是顯著進步的證明在切除術(shù)后30分鐘內(nèi)，將諸如結(jié)腸粘膜條或約lmm厚的腺瘤、腺癌或轉(zhuǎn)移瘤切片等薄片(約lcm2)置放于至少3體積的新鮮制備的4t:卡諾依氏固定液(Carnoy'sfixative)(3:1，甲醇冰乙酸)中。更換三次新鮮固定液(每隔45分鐘)且隨后用4°C70X甲醇更換以將樣品貯藏于-2(TC下。用蒸餾水沖洗固定的切片且在6(TC下置放于2mL1NHC1中8分鐘以使大分子部分水解和使DNA脫嘌呤。通過用冷蒸餾水沖洗來終止水解。將沖洗過的樣品浸于45%乙酸中(室溫)15到30分鐘以進行"組織浸漬"，對顯微鏡蓋玻片輕輕施壓，從而使植物和動物組織切片分散并進行觀察。將每一片浸漬過的切片等分成約0.5Xlmm的兩片且用L乙酸轉(zhuǎn)移到蓋玻片下方的載玻片中。為進行組織分散，將5層濾紙置放于所述蓋玻片上。在一個方向上沿濾紙以微小且均勻的壓力穩(wěn)定地移動鑷子柄。在充分分散的結(jié)腸組織中，無受損細胞核，而隱窩被壓成基本上單層。在干冰上冷凍后去除蓋玻片且干燥載玻片1小時。在室溫下將載玻片置放于充滿希夫試劑(Schiff'sreagent)的科普林缸(Coplinjar)中1小時以將部分脫嘌呤的DNA染色(福爾根染色)，在同一科普林缸中用2XSSC(8.8g/L檸檬酸三鈉、17.5g/L氯化鈉)沖洗兩次(一次歷時30秒且一次快速沖洗)。隨后用蒸餾水沖洗載玻片，且所述載玻片適合對細胞核進行影像分析(格思杰伐(Gostjeva，E.)，細胞遺傳學(xué)(CytolGenet.)，32:13-16，1998)。為達到優(yōu)良分辨率，進一步用吉姆薩試劑(Giemsareagent)將載玻片染色。用2XSSC沖洗，隨后立即將載玻片置放于1%吉姆薩溶液(吉姆薩，Art.9204，默克公司(Merck))中5分鐘，隨后，首先用索倫森緩沖液(Sorenssenbuffer)(11.87g/L二水合磷酸氫二鈉、9.07g/L磷酸二氫鉀)快速沖洗，隨后用蒸餾水快速沖洗。在室溫下干燥載玻片1小時且置放于充滿二甲苯的科普林缸中至少3小時以去除脂肪。用DePex封片劑將蓋玻片與載玻片膠合且干燥3小時，隨后進行高分辨率掃描?；蛘?，可通過接觸蛋白水解酶(例如膠原酶II)來實現(xiàn)浸漬，從而使活細胞與規(guī)定的細胞核形態(tài)型分離。顯微鏡和影像處理系統(tǒng)。本文中所使用的用于定量影像分析的軟件利用由早期衛(wèi)星監(jiān)視系統(tǒng)修改而來的背景抑制方法。這一技術(shù)由德國(Germany)控創(chuàng)公司(Kontroncorporation)獲得，所述公司自身先前已由蔡斯公司(Zeiss,Inc)獲得。所有影像都已使用定制的3.0版KS-400影像分析系統(tǒng)TM(德國蔡斯公司(Zeiss,Germany))獲得，所述系統(tǒng)由連接于個人計算機上的電動光學(xué)顯微鏡AxioscopeTM、彩色CCD相機AxioCam(德國蔡斯公司(Zeiss,Germany))組成。當(dāng)僅使用富爾根染色時，使用可見光和560nm(綠光)濾光器，在平面復(fù)消色差物鏡的1.4/100放大率下從顯微鏡透射影像。當(dāng)使用福爾根_吉姆薩染色時，不使用濾光器。在每一段掃描時間之前調(diào)節(jié)幀接收器和最佳曝光。以0.0223X0.0223微米的像素尺寸記錄細胞核影像。胚胎腸。在整個胎兒腸樣品中發(fā)現(xiàn)七種獨特細胞核形態(tài)型(大類球形、聚集濃縮類球形、卵形、豆形、雪茄狀、香腸狀和鐘形)(圖1A)。鐘形細胞核似乎由類似聚集濃縮染色體的聚集濃縮染色質(zhì)保持打開。鐘形細胞核在約20-50微米管中以線性'頭腳'定向組織化，或為合胞體(圖2)。在所觀察的所有胚管中都保持鐘形細胞核的'頭腳'模式，但管來回蛇形延伸，使得平行管具有局部反平行鐘形細胞核定向。觀察到鐘形細胞核經(jīng)歷對稱和不對稱無絲分裂，但僅在合胞體中出現(xiàn)(圖3)。鐘形細胞核的對稱無絲分裂類似兩個堆疊紙杯的簡單分離。在最高分辨率下，類似配對染色體的聚集濃縮染色質(zhì)似乎形成圓環(huán)，所述圓環(huán)使鐘形物的"開口"保持打開狀態(tài)。數(shù)種"閉合"的細胞核形態(tài)型中的每一者都經(jīng)常在管狀合胞體有絲分裂外觀察到，且小群落顯然由相同細胞核形態(tài)型的細胞組成。如圖1中所示，在早前期保持特定的"閉合"細胞核形態(tài)。iH常結(jié)腸上皮。從隱窩底部到內(nèi)腔表面可觀察到隱窩中的幾乎所有細胞核(圖4A)。許多隱窩以使得可辨別個別細胞核形狀的方式分散。具有卵形或類球形細胞核的細胞順著隱窩從恰好底部上方到延伸到內(nèi)腔中的上皮排列(圖4C)。在隱窩底部的前面約25個細胞中，潛在獨特的第九種細胞核形態(tài)型占優(yōu)勢，其可表征為約2-3微米厚且直徑為約10微米的盤狀(圖4B)。在細胞充分分離的所有隱窩底部的不足1%中，在明顯盤狀細胞核中辨別出單個鐘形細胞核(圖4A和4B)。已在成人肝的制備物中觀察到鐘形細胞核的類似的低出現(xiàn)率。在沒有瘤形成或瘤形成前期的任何病理病癥的成人結(jié)腸中，在對超過一千個充分分散的隱窩的逐個細胞掃描中未觀察到其它細胞核形態(tài)學(xué)變異體。腺瘤。腺瘤含有許多隱窩，無法與各具有約2000個細胞的正常結(jié)腸隱窩區(qū)分。如圖5A中所示，發(fā)現(xiàn)這些隱窩經(jīng)常呈分枝形式。隱窩壁中存在與正常結(jié)腸隱窩相同、但比正常結(jié)腸中更頻繁出現(xiàn)的類球形和卵形細胞核，在隱窩底部存在一個或兩個鐘形細胞核。也觀察到不規(guī)則小葉結(jié)構(gòu)含有多達約8000個細胞，所述細胞更容易通過組織浸漬來分散。在幾乎所有的不規(guī)則結(jié)構(gòu)中都存在兩個或兩個以上鐘形細胞核，所述鐘形細胞核由鐘形物開口在結(jié)構(gòu)主體方向上定向(圖5B)。另外，許多不同細胞和細胞群散置在隱窩和不規(guī)則結(jié)構(gòu)中(圖5C)。一些規(guī)則結(jié)構(gòu)似乎向著含有約250、約500或約1000個細胞的全尺寸正常隱窩生長?？吹皆S多細胞群為具有正好8、16、32、64和128個細胞的"環(huán)"形式，所述環(huán)各具有一個鐘形細胞核(圖5D)。較高放大率檢查結(jié)果顯示，隱窩樣結(jié)構(gòu)的壁的大部分細胞具有如正常成人結(jié)腸隱窩中一樣的球形或卵形細胞核。具有卵形、雪茄狀或子彈狀細胞核的細胞群落出現(xiàn)在不規(guī)則小葉結(jié)構(gòu)中，表明這是數(shù)個不同群落的融合體。已在胚胎后腸中觀察到具有卵形和雪茄狀細胞核的群落，但僅在腺瘤和腺癌中看到子彈狀細胞核形態(tài)型(圖5E)。子彈狀細胞核形態(tài)型也通過首先形成不規(guī)則末端的不對稱無絲分裂而由鐘形細胞核產(chǎn)生?？吹骄哂凶訌棤罴毎说男〖毎郝淝疫@些群落含有經(jīng)歷普通有絲分裂的細胞，但存在以下所關(guān)注的事實從前期到后期在某種程度上保留特殊細胞核形態(tài)。雖然在正常成人結(jié)腸中罕見，但鐘形細胞核經(jīng)常出現(xiàn)于多種腺瘤境況內(nèi)。一些細胞核是以1到10個或更多個"鐘形物"形式存在于隱窩樣結(jié)構(gòu)間的間隙中(圖5D)。其它細胞核是以單一"鐘形物"形式存在于多細胞環(huán)結(jié)構(gòu)中，其中始終看到一個鐘形細胞核位于具有(2n_l)個類球形或其它形態(tài)型的細胞的環(huán)中(圖5C和5D)。鐘形細胞核以單一鐘形物形式，更通常以一對鐘形物或偶爾4或8個鐘形物形式出現(xiàn)在隱窩樣結(jié)構(gòu)底部的杯狀物中。在大得多的不規(guī)則小葉結(jié)構(gòu)中，從解剖學(xué)上看，鐘形細胞核整合到與其它細胞核形態(tài)的細胞混合的異常結(jié)構(gòu)的壁中。看來這些較大的不規(guī)則隱窩樣結(jié)構(gòu)是多種不同群的嵌合體，所述群各自具有自己的細胞核形態(tài)型。據(jù)估計，大腺瘤(約lcm)含有約1000個鐘形細胞核。已在多種腺瘤中各觀察到數(shù)百個鐘形細胞核，但未觀察到任何腺瘤中的單個鐘形細胞核以在胚胎切片中經(jīng)常可見的對稱形式進行細胞核分裂；然而，已在腺瘤中觀察到不對稱細胞核分裂的數(shù)個實例。腺癌。腺癌與腺瘤類似，含有隱窩、較大不規(guī)則結(jié)構(gòu)和具有16、32、64和128個細胞的隱窩間群的混合形式。鐘形細胞核仍以單態(tài)、成對或較大數(shù)目存在于隱窩的底部杯狀物中且包埋于較大不規(guī)則小葉結(jié)構(gòu)的壁中的復(fù)雜螺層中(圖6)。腺癌中的細胞核形態(tài)型組似乎與腺瘤中所見的組(包括子彈狀形態(tài)型)一致。腺瘤與腺癌之間可辨別的差異在于，隱窩樣結(jié)構(gòu)相對于腫瘤表面隨機定向。在腫瘤內(nèi)部也并未頻繁發(fā)現(xiàn)隱窩和不規(guī)則結(jié)構(gòu)，這可較好地表征為較小的局部組織化結(jié)構(gòu)的選擇集合而非無秩序集合。腺癌不同于腺瘤的最顯著差異在于經(jīng)常出現(xiàn)超過數(shù)百個鐘形細胞核的明顯組織化組，這些鐘形細胞核中的一些經(jīng)常(約1%)與對稱細胞核分裂有關(guān)。這些對稱分裂稍后被鑒別為包含聚集濃縮的細胞核物質(zhì)。鐘形細胞核所具有的DNA的量等于正常單倍體細胞的DNA的量。當(dāng)鐘形細胞核開始經(jīng)歷"杯與杯(cup-from-cup)"對稱分裂時，DNA含量增加到單倍體基因組中DNA含量的1.05倍(如果復(fù)制著絲粒，那么預(yù)期大概增加l倍)。DNA含量保持這一水平直到"杯與杯"過程的較晚些時候，這時兩個細胞核含有2倍的DNA物質(zhì)的量。這是在或許僅復(fù)制著絲粒的階段期間，且基因組的各鏈分離，基因組主要組織化成ssDNA。直到在所述過程的較晚些時候進行復(fù)制時，基因組才再次變成dsDNA。在低放大率下，這些結(jié)構(gòu)出現(xiàn)在隱窩樣結(jié)構(gòu)間的間隙中且看上去像蜘蛛網(wǎng)或葉脈骨架。在較高放大率下，發(fā)現(xiàn)細脈絡(luò)部分地按具有鐘形細胞核的細胞鏈排列，所述細胞鏈具有其開口在與脈絡(luò)軸成90。的相同方向上定向的奇怪特征(圖6C)。也在局部界定的合胞體中發(fā)現(xiàn)鐘形細胞核呈在胚胎腸而非腺瘤中觀察到的'頭腳'定向(圖6C)。據(jù)估計，數(shù)百萬個鐘形細胞核在腺癌腫塊中以常見的對稱和不對稱形式進行無絲分裂(圖6D和6E)。結(jié)腸直腸腫瘤轉(zhuǎn)移到肝可重新形成看似無法與關(guān)于腺癌所觀察相區(qū)分的細胞核形態(tài)型、隱窩和不規(guī)則結(jié)構(gòu)模式。艦3D形z，制勺斜麵鍾,成應(yīng)禾爾,扁勺娜麵脆蹄IH、M為對以3D形式保存的單個鐘形細胞核和成對對稱分裂的鐘形細胞核執(zhí)行共焦顯微術(shù)，使用懷特海研究所影像中心(ImagingCenter,WhiteheadInstitute)的DeltaVisionRT復(fù)原成像系統(tǒng)。所述系統(tǒng)提供實時2D去巻積和3DZ投影來復(fù)原細胞核影像。應(yīng)用細胞核細胞質(zhì)(FITC-毒傘素(phalloidin))和細胞核(DAPI)的復(fù)染色來研究鐘形細胞核的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。按照與福爾根染色相同的程序，將細胞分散到載玻片上'水解'浸漬。不同之處在于應(yīng)用兩種不同固定液進行固定以比較結(jié)果在lOOmLPBS(室溫)中的2%BSA(2g)、0.2%脫脂乳(0.2g)、0.4%tritonX-100(400yL)中使用卡諾依氏固定液(4°C)和3.7%甲醛15分鐘和使用阻斷溶液2小時，推薦后者用于固定活組織細胞。將上面有組織分散物的顯微鏡載玻片用PBS洗滌兩次，接著轉(zhuǎn)移到潮濕箱中，滴100mL用阻斷溶液適當(dāng)稀釋的初級抗體液滴以覆蓋整個分散物區(qū)域且用橡膠膠水將蓋玻片密封在上面，置放于以箔包裹的容器中并置放于冷卻室中的潮濕箱中過夜。隨后用PBS洗滌未密封的載玻片三次。取出所述載玻片且再次放置100iiL用阻斷溶液適當(dāng)稀釋的二級抗體液滴和/或細胞染色劑(例如FITC-毒傘素、DAPI)以覆蓋含有細胞分散物的區(qū)域，并轉(zhuǎn)移到潮濕箱中，置放于容器中。所述容器/潮濕箱是密封的，以箔包裹且置放于室溫下2小時。用PBS洗滌載玻片五次且以各具有2-5iiL封片劑液滴(抗熒光衰減封片劑(anti-fade)SlowFade、VectaSheild或Prolong)的方式制備。安放蓋玻片，確保去除過量PBS(在紙巾上輕擦蓋玻片的角)。將蓋玻片的邊緣引入封片劑中，隨后使安放期間形成的氣泡數(shù)目完全降低，從而限制所述氣泡數(shù)目。使用指甲油將蓋玻片密封在載玻片上且在4t:下避光貯藏載玻片(或在-2(TC下較長時間)。使用DeltaVisionRT復(fù)原成像系統(tǒng)使載玻片顯像。使用已證實可精確進行DNA的細胞化學(xué)定位和化學(xué)計量的福爾根_希夫程序(Feulgen-Schiffprocedure)的方案來測量細胞核DNA含量。通過測量福爾根-DNA(染料-配體)復(fù)合物的分子吸光度來測量單一細胞核中的DNA含量(謝爾斯特蘭德(Kjellstrand，P.)，顯微術(shù)雜志(J.Microscopy)，119:391-396,1980;安德森(Andersson，G.)和謝爾斯特蘭德(Kjellstrand，P.)，組織化學(xué)(Histochemie)，27:165-200，1971)。使用由KS400影像分析系統(tǒng)(德國蔡斯公司(ZeissInc.Germany))修改而來的軟件來測量各個細胞核的整個區(qū)域上的積分光學(xué)密度(IOD)，從而測量不分裂(間期)和分裂的鐘形細胞核。這一特定影像分析工作站(參見圖9D)由連接于計算機上的顯微鏡Axioscop2M0T(蔡斯公司(Zeiss))聯(lián)合AxioCam彩色CCD相機(蔡斯公司(Zeiss))組成，其由卡爾蔡斯公司(CarlZeissInc.)工程師組裝，能夠?qū)毎撕图毎Y(jié)構(gòu)進行高分辨率影像顯微術(shù)，在早前期染色體測量中是每個像素約1000bpDNA。因此，有可能精確測量間期細胞核中約lMb對的聚集濃縮染色質(zhì)域。在細胞核的恒定放大率、曝光和閾值處理(邊緣增強)參數(shù)下，使用560nm綠色濾光器掃描影像。選擇這種DNA含量測量方式，因為有希望得到最精確的結(jié)果(貝斯德(Biesterfeld.S.)等人，分析和定量細胞學(xué)與組織學(xué)(Anal.QuantCytol.HistoL)，23:123-128,2001;哈迪(Hardie，D.)等人，組織化學(xué)與細胞化學(xué)雜志(J.Histochem.Cytochem.)，50:735-749,2002;格雷戈里(Gregory)和赫伯特(Hebert)，2002;格雷戈里(Gregory)，2005)。進行熒光原位雜交以界定處于間期和細胞核分裂期間的鐘形細胞核中所有24條人類染色體的空間分布。使用FISH確定在鐘形細胞核頂部以'環(huán)'形式表現(xiàn)的聚集濃縮所涉及的全部染色體?；旧?，預(yù)見對'環(huán)'中的染色體加標(biāo)記以及開發(fā)通過除細胞核形態(tài)外的其它方法識別這些細胞核的熒光標(biāo)記作為當(dāng)鐘形細胞核產(chǎn)生不同形態(tài)的細胞核(如圖10B中所示)時分析其轉(zhuǎn)化的方法。將每個載玻片不超過l-5Xl(f個細胞的腫瘤細胞分散到載玻片上。以兩種不同的細胞分散方式固定載玻片一種方式用于福爾根DNA影像細胞計量術(shù)的方案中且另一種方式由吉普森(Gibson)提出用于從結(jié)腸鏡檢查的活檢試樣中分離上皮細胞(吉普森(Gibson,P.)等人，胃腸病學(xué)(Gastroenterology)，96:283-291，1989)。后一種方式基本上使用30分鐘手術(shù)內(nèi)的腫瘤組織且立即將其置放于50mL冷漢氏平衡鹽溶液(Hank'sbalancedsaltsolution)中，隨后洗滌。隨后用解剖刀片切碎試樣且在4mL膠原酶-分散酶培養(yǎng)基(含有1.2U/ml分散酶I(印第安納州印第安納波利斯的柏林格爾曼海姆生物化學(xué)公司(BoehringerMannheimBiochemicals，Indianapolis,Ind.))禾口50U/mlIV型膠原酶(紐約州費里霍爾德的沃辛頓生物化學(xué)公司(Worthington，BiochemicalCorp.，F(xiàn)reehold,N.J.))的培養(yǎng)基)中消化1.5小時。對蓋玻片輕輕施加滑壓，從而將小球分散到顯微鏡載玻片的表面上。通過'水解'浸漬進行分散充當(dāng)陽性對照組以檢測在應(yīng)用膠原酶-分散酶處理以使細胞分散后是否發(fā)生鐘形細胞核形態(tài)的任何變形。使所準(zhǔn)備的載玻片干透且置于37t:下過夜。隨后依次用冰冷70%、80%、室溫100%乙醇使載玻片脫水，每次歷時2分鐘，且完全干燥的載玻片在72t:下在70%甲酰胺/2XSSC中經(jīng)歷變性歷時2分鐘，立即用相同順序再次脫水并完全干燥。制備含有7iiL雜交緩沖液、2iiL無菌水和1yL探針的雜交混合物。使混合物在72t:下變性8到12分鐘且立即添加到載玻片中，隨后蓋上蓋玻片，用橡膠膠水密封，且置于37°C的避光加濕箱中過夜。隨后用冷70%乙醇、冷80%乙醇和室溫100%乙醇使載玻片脫水，每次歷時2分鐘；在72t:下用70%甲酰胺、2XSSC變性50-60秒，這取決于乙酸變性的程度。再次用冷70%乙醇、冷80%乙醇和室溫100%乙醇使載玻片脫水，每次歷時2分鐘。雜交混合物包括7iiL雜交緩沖液、1.5iiL無菌H20和1.5iiL。應(yīng)用全染色體上色探針(威賽斯公司(Vysis))和光譜橙色或光譜綠色熒光染料。在72t:下使雜交混合物變性5-10分鐘且隨后完全干燥載玻片。將雜交混合物涂覆于載玻片上，蓋上蓋玻片且用橡膠膠水密封。隨后在37t:的加濕箱中培育載玻片過夜。第二天，在42t:下用50X甲酰胺、2XSSC洗滌載玻片，每次8分鐘。隨后在37t:下用2XSSC洗滌載玻片8分鐘且隨后在室溫下用IXPBD(O.05%吐溫(Tween)、4XSSC)洗滌三次，每次1分鐘。隨后添加10yLDAPIII抗熒光衰減封片劑(125ng/mL，威賽斯公司(Vysis))和蓋玻片。吸除過量的DAPIII抗熒光衰減封片劑，且用橡膠膠水密封載玻片。在-2(rc下使載玻片保持避光，隨后進行影像掃描程序。賴中翻朐雄麵扁，，tfr、翻禾口，，ffl歸D迪朐週絲追蹤DNA合成。本文所述的技術(shù)允許檢測人類細胞培養(yǎng)物中在有絲分裂期間任何兩種細胞核或后期成對細胞核之間低達2%的差異。使用這些技術(shù)來確定何時通過含有鐘形細胞核的細胞或合胞體合成DNA。這涉及掃描似乎處于細胞核分裂過程中的細胞核。應(yīng)注意，一般來說，與同一染色載玻片上的人類淋巴細胞DNA含量相比，胎兒鐘形細胞核含有預(yù)期量的二倍體人類細胞的DNA。另外，應(yīng)注意，人類瘤形成前病變和腫瘤的鐘形細胞核中DNA的量顯示圍繞平均大于二倍體DNA量的平均值的廣泛變化。測量已揭露另一個完全出乎意料的發(fā)現(xiàn)對于涉及鐘形細胞核的對稱和不對稱細胞核分裂，DNA合成與細胞核分裂過程一致，而非在細胞核分裂過程之前。細胞核似乎完全按照'杯與杯'分離過程，隨后明顯地檢測到總DNA含量從單個細胞核的量開始增加。DNA總量從接近明顯開始分裂的細胞核中的單一腫瘤細胞核平均值的低值開始增加且達到似乎即將完成分裂的細胞核中的平均細胞核含量的約兩倍。實施例2.胎兒器官發(fā)生中的合胞體鐘形細胞核。在產(chǎn)生鐘形細胞核的人類胎兒制備物中鑒別出一系列先前未識別的細胞核形式。在第五周檢測到這些形式，也檢測到含有鐘形細胞核的第一管狀合胞體。這些細胞的實例展示于圖13A-13D中。這是重大發(fā)現(xiàn)，指出從早期胚胎發(fā)生的有絲分裂球形細胞核到稍后表示凈生長和分化的生殖"干"細胞譜系的無絲分裂鐘形細胞核的形態(tài)學(xué)轉(zhuǎn)變。這些發(fā)現(xiàn)在組織類型間是一致的，因為已在一系列組織制備物中觀察到這些發(fā)現(xiàn)，包括例如肌肉、發(fā)育中的肢體、神經(jīng)組織和包括胃、胰腺、膀胱、肺和肝的臟器。合胞體以有規(guī)律間隔的約16-24個合胞體的群形式存在于發(fā)育中的器官團塊中，其中每個群具有約16個鐘形細胞核。合胞體在發(fā)育最少的可利用人類物質(zhì)(約5周)中很明顯且在第十三周時消失。第十二周后，鐘形細胞核以每種器官所特有的方式有規(guī)律地分布于三維空間中。圖13A展示呈圍繞球形或略微卵形細胞核的長軸的"帶"形式的具有聚集濃縮約10X的總DNA含量的細胞核。圖13B展示2個聚集濃縮的細胞核"帶"似乎已分離、但仍然是單個細胞核的一部分的細胞核。圖13C展示似乎通過圖13B的雙帶狀細胞核的分裂所產(chǎn)生的一對細胞核。圖13D展示每一個合胞體都含有一組鐘形物，其中如圖13C中，單一一對鐘形物在其直線中點處以開口相對。這些影像向我們表明，一系列對稱分裂形成從中心對推開的細胞核。在少到4個鐘形細胞核的組中檢測到合胞體結(jié)構(gòu)。在癌發(fā)生的細胞核形態(tài)型的研究中，在結(jié)腸腺瘤(圖14A)和腺癌(圖14B)中，細胞核顯示少量類似的帶，即一個或兩個圍繞卵形細胞核的長軸的帶。這一發(fā)現(xiàn)證實并擴充了對以下一般假說的支持腫瘤發(fā)生共用個體發(fā)生的許多關(guān)鍵的表型過渡步驟，然而以相反的出現(xiàn)順序呈現(xiàn)。對人類著絲粒具有特異件的FISH染色。合胞體外鐘形細胞核實際上含有人類DNA。在胎兒樣品中，大部分著絲粒與鐘形細胞核的開口處的聚集濃縮DNA區(qū)域相關(guān)。有趣的是，標(biāo)準(zhǔn)FISH方案不使合胞體內(nèi)鐘形或其它形狀細胞核染色，這表明合胞體的含有收縮元素的外鞘可阻斷FISH試劑的進入。圖15展示來自人類12周胎兒結(jié)腸組織的球形(圖15A)、"雪茄"狀(圖15B)和鐘形(圖15C)細胞核內(nèi)的著絲粒(綠色)。也觀察到，在鐘形細胞核的胎兒無絲分裂中成對細胞核的DNA含量相等，但在來自多個組織來源的人類腫瘤中的鐘形細胞核的無絲分裂中其顯示顯著程度的不等DNA分離。盡管尚未發(fā)現(xiàn)結(jié)腸瘤形成前息肉的鐘形細胞核中無絲分裂的實例，但應(yīng)注意，每個息肉所發(fā)現(xiàn)的許多鐘形細胞核中DNA含量的顯著分散表明，不等DNA分配是在瘤形成前期以及瘤形成中，而不是在鐘形細胞核的胎兒分裂中起作用的現(xiàn)象。這些觀察結(jié)果擴充了菲爾紹(Virchow)和康海姆(Cohnheim)的觀察結(jié)果腫瘤組織和胚胎組織具有類似的組織學(xué)特征，同時也擴充了勃法瑞(Boveri)的觀察結(jié)果處于有絲分裂中的腫瘤細胞顯示腫瘤的所有細胞所共有的大部分畸變?nèi)旧w，表明不穩(wěn)定染色體形成或分離的早期共同來源。小鼠的細胞核形態(tài)。在胎兒小鼠的組織中發(fā)現(xiàn)形態(tài)與圖13A-13D幾乎相同的所有各種形式的細胞核(具體來說，包括鐘形細胞核、前合胞體和合胞體形式)，其中首先在密切平行于胎兒小鼠的器官界定時段的12.5日胎兒、隨后在14.5-16.5日胎兒中檢測到前合胞體形式。雖然假設(shè)是人類觀察結(jié)果，小鼠中的這些發(fā)現(xiàn)并不令人驚訝，但其顯示在非人類物種中進行在人類中不道德或不可能的的器官發(fā)生研究的各種可能性。在介于妊娠第五周到第十六周范圍內(nèi)的品質(zhì)固定的胎兒丟棄物的樣品中，合胞體不再明顯，但鐘形細胞核以規(guī)則模式分布于生長器官中。實施例3.干細胞標(biāo)記使用原腸的豐富的合胞體和鐘形細胞核來應(yīng)用一系列組織化學(xué)程序(包括FISH)，從而界定染色體和染色體元素、各種收縮分子(例如肌動蛋白)和其它可鑒別標(biāo)記(包括常稱為"干細胞標(biāo)記"的標(biāo)記)的位置。將本文所述的技術(shù)應(yīng)用于使用ZEISS-P.A.L.M.顯微解剖儀器收集合胞體和個別細胞核的工作。成功標(biāo)準(zhǔn)是收集一系列就合胞體形式或細胞核形態(tài)型來說均質(zhì)的樣品，其數(shù)目等于或大于io，ooo個細胞核同等物，數(shù)目足以掃描細胞mRNA、最常見蛋白質(zhì)和葡糖胺聚糖。實施例4.吖啶橙染色其它鑒別復(fù)制中間物構(gòu)型的資料展示于圖16-19中。圖18B尤為重要。其最后證實ssDNA基因組存在于鐘形細胞核中。利用吖啶橙染色，其特定地且僅在結(jié)合ssDNA后發(fā)紅色熒光。在染色之前，在37t:的水浴中使載玻片接觸濃度為2mg/mL的RNA酶歷時2小時。用EDTA洗滌載玻片1分鐘，用分子級水沖洗且立即根據(jù)貝塔朗菲(Bertalanffy)(紐約科學(xué)年鑒(AnnNewYorkSci)，84:第227-238頁(1960);紐約科學(xué)年鑒(AnnNewYorkSci)93:16:第717-747頁(1962))中所述的方案，用吖啶橙溶液進行染色。簡單來說，吖啶橙染色劑是用500.0ml蒸餾水稀釋的0.05gm且添加5.0ml乙酸。每次在避光、室溫下將載玻片置放于科普林缸中之前，檢查室溫溶液的pH值，使其在3.1-3.4范圍內(nèi)。將載玻片染色30分鐘，用0.5%乙酸的100X乙醇溶液、100X乙醇、PBS沖洗且在仍然濕潤時蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下顯像。實施例5.ssDNA抗體染色使用單克隆抗體MabF7-26來檢測ssDNA中間物(奧地利維也納的本德米思特斯有限公司(BenderMedSystemsGmbH，Vienna,Austria))。在使用之前將抗體的儲備溶液稀釋10倍(用PBS和5%胎牛血清)。在施加ssDNA抗體之前，使用10mMHCl、50mMMgCl2中的O.005%胃蛋白酶和50mMMgCl2中的1%甲醛(詳細描述于佛米娜(Fomina)等人，2000中)執(zhí)行一系列洗滌步驟。每一洗滌步驟后，用PBS洗滌載玻片3次(每次5分鐘)。最后，用0.05%吐溫洗滌載玻片，隨后用阻斷蛋白質(zhì)3%BSA的吐溫溶液和再次用0.05%吐溫洗滌。之后，在室溫下用MabF7-26的5%FBS溶液處理載玻片60分鐘，隨后施加抗小鼠Ig-G-FITC(Alexa488)30分鐘。用DAPI將載玻片染色，用一系列70%、90%和100%乙醇脫水，風(fēng)干且安放于'Citiflour'培養(yǎng)基中?？磥礴娦渭毎说?開口"處的雙dsDNA環(huán)首先分離成2個ssDNA環(huán)且這些環(huán)進行拷貝，形成4個dsDNA環(huán)，先前使用福爾根染色和定量細胞計量術(shù)作為鐘形物分離和DNA增加的開始進行觀察。值得注意的是，在任何組織樣品的胎兒巨核細胞合胞體階段，僅約5_15%的合胞體顯示ssDNA，但在那些顯示ssDNA的具有至少一個細胞核的合胞體中，通常觀察到許多其它情況，這擴充了我們的早期觀察結(jié)果合胞體中的鐘形細胞核同步分離且合成DNA?；谔旱纳L速率和顯示任何ssDNA的細胞核的分率，我們已作出約8小時的初步估計，這是DNA分離/合成時段的4倍，其中分離ssDNA團塊的時間略少于這一時段的一半。參見圖18A-18F。雖然本發(fā)明已特定地參考其優(yōu)選實施例來展示和描述，但所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，可在不脫離由隨附權(quán)利要求書所涵蓋的本發(fā)明范圍的情況下對形式和細節(jié)作出各種變化。權(quán)利要求一種鑒別抑制腫瘤生長的藥劑的方法，其包含A)使受試者或宿主動物的腫瘤與候選藥劑接觸，其中所述腫瘤包含含鐘形細胞核的腫瘤干細胞，且其中一些或所有所述鐘形細胞核呈與ssDNA相關(guān)的復(fù)制中間物構(gòu)型；B)在適合所述候選藥劑與所述腫瘤相互作用的條件下保持所述腫瘤與所述藥劑接觸；C)切下所述腫瘤的樣品，且確定在步驟B)中的所述接觸后所述腫瘤樣品中含有ssDNA的鐘形細胞核的存在、不存在或數(shù)目、或單獨ssDNA的存在、不存在或量；和D)比較在與所述候選藥劑接觸后所述腫瘤樣品中含有ssDNA的鐘形細胞核的存在、不存在或數(shù)目、或單獨ssDNA的存在、不存在或量與對照樣品中含有ssDNA的鐘形細胞核的存在、不存在或數(shù)目、或單獨ssDNA的存在、不存在或量，由此，在與所述候選藥劑接觸后所述樣品中含有ssDNA的鐘形細胞核的數(shù)目減少或不存在、或單獨ssDNA的量減少或不存在表示所述藥劑抑制腫瘤生長。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述腫瘤樣品是從宿主生物體中的異種移植物所產(chǎn)生的實體瘤獲得。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中ssDNA是通過用吖啶橙將所述樣品染色且使所述ssDNA顯像來檢測。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述候選藥劑靶向單鏈DNA。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述候選藥劑破壞DNA的退火，降解單鏈DNA，或破壞從單鏈DNA模板復(fù)制DNA。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中含有ssDNA的鐘形細胞核的存在、不存在或數(shù)目是通過檢測呈所述復(fù)制中間物構(gòu)型或極接近所述復(fù)制中間物構(gòu)型的一種或一種以上腫瘤干細胞特異性分子來確定。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中可選地，步驟C)包含檢測在與所述候選藥劑接觸后所述腫瘤干細胞或所述腫瘤自身的形態(tài)變化，且其中步驟D)包含比較在與所述候選藥劑接觸后所述腫瘤干細胞或腫瘤的形態(tài)與對照樣品中的腫瘤干細胞或腫瘤的形態(tài)；且由此，腫瘤干細胞或腫瘤形態(tài)的變化表示所述藥劑抑制腫瘤生長。8.—種治療受試者腫瘤的方法，其包含使所述受試者的腫瘤干細胞與結(jié)合、修飾或降解ssDNA的藥劑接觸，其中所述腫瘤干細胞的特征為含有ssDNA且呈復(fù)制中間物構(gòu)型的鐘形細胞核，且所述藥劑結(jié)合、修飾或降解ssDNA，由此抑制或防止所述鐘形細胞核分裂，從而抑制或防止腫瘤干細胞增殖或所述腫瘤生長。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述藥劑是化學(xué)藥劑。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述化學(xué)藥劑是烷化劑。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述烷化劑是選自由以下組成的組雙_(氯乙基)-胺、雙-(2-氯乙基)-硫醚、2，2'-雙_(2〃-氯乙基硫基)_二乙醚、1，2-雙-(2'-氯乙基硫基)-乙烷、三-(2-氯乙基)-胺、雙-(2-氯乙基)-乙胺、雙-(2-氯乙基)-甲胺、氮丙啶(ethyleneimine)、溴氮丙啶、環(huán)磷酰胺、丙卡巴肼(procarbazine)、氮烯唑胺(dacarbazine)、六甲蜜胺(altretamine)、順二胺二氯鉑(11)、環(huán)磷脒、異環(huán)磷酰胺(fosfamide)、二氯甲二乙胺(mechlorethamine)、美法侖(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、雙氯乙基亞硝脲(BCNU)、羅氮芥(CCNU)、甲基-羅氮芥(CCNU)、N-亞硝基-N-甲脲、N-乙基-N-亞硝基脲和其它亞硝基脲。12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述藥劑是酶。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述酶是選自由以下組成的組單鏈DNA核酸內(nèi)切酶、脫氧核糖核酸酶VI、SI核酸酶、核酸內(nèi)切酶V、AP0BEC3G和催化性RNA分子。14.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述藥劑包含ssDNA結(jié)合部分。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述ssDNA結(jié)合部分具有序列特異性。16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述ssDNA結(jié)合部分是對ssDNA具有特異性的單克隆抗體。17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述ssDNA結(jié)合部分是來自ssDNA結(jié)合蛋白的ssDNA結(jié)合域。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述ssDNA結(jié)合域是來自選自由以下組成的組的ssDNA結(jié)合蛋白聚(ADP-核糖)聚合酶、hnRNP蛋白、單鏈DNA結(jié)合蛋白和RecA。19.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述ssDNA結(jié)合部分是反義寡核苷酸或單鏈寡核苷酸。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述寡核苷酸是ssDNA、RNA、PNA或能夠與ssDNA雜交的人工核酸。21.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述藥劑另外包含第二部分。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述第二部分降解或以化學(xué)方式修飾ssDNA，或?qū)λ瞿[瘤干細胞具有毒性。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述第二部分具有放射性。全文摘要本申請案是基于以下觀察結(jié)果腫瘤干細胞(TSC)復(fù)制涉及復(fù)制中間物構(gòu)型，其中當(dāng)鐘形細胞核開始分離成2個細胞核時，TSC基因組的很大一部分是以單鏈DNA(ssDNA)形式存在。在這種復(fù)制中間物構(gòu)型期間，大量ssDNA因此存在于細胞核中，而申請者提出其為抗腫瘤療法的靶標(biāo)。本發(fā)明主張一種篩選靶向ssDNA的抗腫瘤發(fā)生藥劑的方法和所述藥劑在治療中的用途。文檔編號A61K48/00GK101720436SQ200880020171公開日2010年6月2日申請日期2008年6月12日優(yōu)先權(quán)日2007年6月13日發(fā)明者威廉·G.·希利,艾連納·V.·寇斯特·杰華申請人:麻省理工學(xué)院