專利名稱：載脂蛋白d類型的蛋白質的美容用途的制作方法
載脂蛋白D類型的蛋白質的美容用途 本發(fā)明的主題是載脂蛋白D、源自該蛋白質的多肽或其類似物、編碼此類多肽的核 酸序列、或者調節(jié)此類多肽的活性或表達的試劑的用途，特別是美容和/或治療用途，特別 是用于剌激終末上皮分化。 本發(fā)明還涉及載脂蛋白D、源自該蛋白質的多肽或其類似物、或者編碼此類多肽的 核酸序列作為用于評價表皮狀態(tài)的標志物的用途。 上皮是其細胞彼此拼接和整體聯(lián)結并位于基底膜之上的組織。它們形成外部覆蓋 層，例如在皮膚的表面上，也就是說表皮；或者內部覆蓋層，在粘膜的表面上。它們還可以形 成腺體。 更精確地，這些上皮是這樣的結構，所述結構的內環(huán)境穩(wěn)定起因于受精細調控的 細胞內和細胞外信號集合的利用，所述細胞內和細胞外信號在下列的所有階段中起作用 細胞增殖、遷移或分化，以及細胞外基質的各種組分的合成。這些信號可以特別地起因于由 角質形成細胞所產生的因子的作用。 維持上皮的良好生理學功能特別地牽涉終末上皮分化和/或蛋白聚糖的合成。
更特別地關于表皮，它是一種上皮，其常規(guī)地分為下列部分包含特別是皮膚干細 胞并構成表皮發(fā)生層的角質形成細胞基底層；由數(shù)層排列在基底層上的多角細胞組成的所 謂棘細胞層；包含一至三層含有明顯細胞質內含物(角質透明蛋白顆粒)的所謂扁平細胞 的所謂顆粒層；和最后，稱為角化層(或角質層)的全體頂層，所述角化層由在其分化的終 末階段被稱為角質細胞(corneocyte)的角質形成細胞構成。 角質層(其是提供在身體和環(huán)境之間的屏障功能的皮膚的最外面部分)和毛干 (其是構成毛發(fā)的毛囊的顯現(xiàn)部分)二者均呈現(xiàn)了角質形成細胞的分化過程的結果。表皮 的分化跟隨在成熟過程之后，在所述成熟過程中基底層的角質形成細胞進行分化并遷移， 從而導致形成完全角質化的死細胞即角質細胞。所述分化是極好地受協(xié)調的現(xiàn)象的結果， 其導致維持恒定的厚度并因此引起表皮的內環(huán)境穩(wěn)定。 許多皮膚病癥或病理學狀況可以起因于表皮的內環(huán)境穩(wěn)定的功能障礙，特別是角 質形成細胞的終末上皮分化和/或蛋白聚糖的合成的功能障礙。 因此，涉及表皮的主要改變是角質形成細胞的分化的減少，其引起角化細胞 (horny cell)的蛋白質基質的缺乏；金屬蛋白酶(其為降解細胞外基質并參與皮膚衰老的 蛋白酶)的增加；和各種糖胺聚糖的合成的減少。 例如，在衰老的皮膚的情況下，所述功能障礙通常表現(xiàn)為出現(xiàn)皺紋(微起伏和深 皺紋)、喪失彈性、粗糙感和干燥。從組織學角度來看，觀察到真皮-表皮連接變平以及真皮 和表皮的厚度減少。膠原和糖胺聚糖的含量降低。皮膚的屏障功能受損。所有這些現(xiàn)象通 過長期日光暴露而加劇。 同樣地，在絕經期間，皮膚經歷在其所有區(qū)室(即表皮和真皮區(qū)室)中的變化。涉 及真皮的主要變化是膠原的量和真皮的厚度的減少。這在更年期婦女中引起皮膚和/或粘 膜厚度的減少。然后，這些婦女感到"干燥的皮膚"或繃緊的皮膚的感覺，并且觀察到表面 細小皺紋和細線的加重。皮膚展現(xiàn)出對于觸摸而言粗糙的外觀。最后，皮膚展現(xiàn)出減少的柔軟度。 已經知曉，在角質形成細胞的分化的各個階段期間，數(shù)個蛋白質家族開始起作用， 其中每個具有特定的功能。在這些之中，蛋白酶在脫屑中(也就是說在消除在表皮表面上 的角質細胞中)具有至關重要的作用，和轉谷氨酰胺酶參與將形成皮膚的角質包層的蛋白 質的交聯(lián)。 本發(fā)明特別地由于本發(fā)明人表征了載脂蛋白D(也稱為ApoD)在人表皮的角質層 中的表達而產生。 ApoD是29KDa的糖蛋白，其在人中與HDL相聯(lián)合地存在于血清中，并且它的功能還
不清楚。它的三維結構和它的脂籠蛋白家族的成員資格暗示，ApoD將會是小的疏水性分子
的轉運蛋白，并且它將會特別地結合膽紅素、膽固醇、孕酮、孕烯醇酮和花生四烯酸。 在人的數(shù)種疾病中觀察到該蛋白質的大幅度增加。因此，ApoD在患有"巨囊液病
(Gross Cystic Fluid Disease)"(—種形式的良性乳腺癌癥)這種疾病的婦女的乳腺的
囊液中高度積累。 此外，ApoD在神經再生過程中過表達。實際上，在外周神經損傷之后，觀察到信使 RNA和蛋白質的大幅度增加，這暗示ApoD可能在外周神經系統(tǒng)的維持中起重要作用。
最后，以及更新近地，發(fā)現(xiàn)ApoD在患有阿爾茨海默病的受試者的腦脊液和海馬中 積累。更詳盡的分析證明，在數(shù)種其他人類神經變性疾病例如腦膜腦炎、心血管意外、運動 神經元疾病和癡呆中出現(xiàn)大幅度增加。這暗示，ApoD可能也在中樞神經系統(tǒng)的維持中起重 要作用。 另一個方面，就本發(fā)明人的知識而言，載脂蛋白D到目前為止尚未被鑒定為人角 質層的蛋白質。 實際上，與所有預期相反，載脂蛋白D也被證實是皮膚的生理學狀態(tài)的潛在標志 物，特別是在衰老方面。因此，如從下面所呈現(xiàn)的測試中明顯可見的，本發(fā)明人已出乎意料 地觀察到，在一方面，這種糖蛋白在角質層中表達，和在另一方面，在表皮衰老過程中其表 達顯著減少。 因此，根據一個方面，本發(fā)明的主題是有效量的至少一種源自載脂蛋白D的多肽、 至少一種編碼此類多肽的核酸序列或者至少一種調節(jié)此類多肽的活性或表達的試劑作為 對于剌激終末上皮分化(特別是表皮類型)來說有用的試劑的美容或非治療用途，所述多 肽所具有的氨基酸序列特別地由完全或部分地由SEQ ID NO l所示序列、其類似物或其片 段所呈現(xiàn)的核酸序列編碼。 根據另一個方面，本發(fā)明的主題還是有效量的至少一種源自載脂蛋白D的多肽、 至少一種編碼此類多肽的核酸序列或者至少一種調節(jié)此類多肽的活性或表達的試劑在制 備用于剌激上皮分化(特別是終末表皮分化)的組合物(特別是治療組合物)中的用途， 所述多肽所具有的氨基酸序列特別地由完全或部分地由SEQ ID NO l所示序列、其類似物 或其片段所呈現(xiàn)的核酸序列編碼。 特別地，根據本發(fā)明所考慮的組合物可用于剌激角質形成細胞的終末分化。
為了本發(fā)明的目的，"有效量"這一表述意指對于觀察到所期望的效果，即美容效 果或治療效果而言所必需的最小量，應當理解對于獲得美容效果或治療效果而言所必需的 有效量在合適時可以是相同的或不同的。
為了本發(fā)明的目的，"美容用途"這一表述意指主要用于獲得美學效果和/或舒適 的用途。 為了本發(fā)明的目的，"治療組合物"這一表述意指用于獲得對于上皮(特別是表 皮)病癥的預防性或治療性效果的組合物，所述病癥被認為是病理學狀態(tài)的表現(xiàn)。
為了本發(fā)明的目的，"預防的"或"預防性的"這一表述意指減少現(xiàn)象例如病理學狀 況突然出現(xiàn)的風險。 特別地，根據本發(fā)明的組合物可以用于預防和/或治療上皮(特別是表皮)厚度
的減少，和/或上皮(特別是表皮)的緊實度(firmness)、彈性、密度和/或張度(tone)的
喪失，和/或皮膚衰老的征候(sign)例如鈹紋和細線(fine line)的形成。"皮膚衰老征候"這一表述意指由于衰老(其為時序性的(chronobiological)和
/或光誘導的)所導致的皮膚外觀的所有改變，例如皺紋和細線，干癟的皮膚，皮膚彈性和/
或張度的缺乏，真皮厚度減少，和/或膠原纖維降解，其引起松弛和有皺紋的皮膚外表。該
術語還意指皮膚的并不系統(tǒng)地導致經改變的外觀的所有內部改變，例如皮膚的所有內部降
解，特別是由于暴露于紫外線輻射而引起的彈性蛋白纖維或彈性纖維的降解。 根據另一個實施方案，根據本發(fā)明的組合物可以特別地用于預防和/或治療皮膚
干燥征候，特別是用于預防和/或治療上皮(特別是表皮)脫水。 根據本發(fā)明的組合物可以特別地用于預防和/或治療上皮(特別是表皮)或嘴唇 或頭皮的時序性衰老的效應。 根據另一個方面，本發(fā)明還涉及至少一種根據本發(fā)明的多肽作為用于篩選生物學 或化學化合物的工具的用途，所述化合物能夠調節(jié)(特別是激活)所述多肽的表達和/或 生物學活性。 特別地，本發(fā)明涉及用于篩選抗衰老活性劑的方法，其至少包括下列步驟
a)在適宜于表現(xiàn)出根據本發(fā)明的多肽的表達的條件下，使至少一種能夠表達根據 本發(fā)明的多肽即載脂蛋白D或其衍生物的細胞類型與至少一種待測試的化學或生物學化 合物相接觸， b)測定所述多肽的含量。 根據本發(fā)明的另外一個方面，本發(fā)明還涉及至少一種根據本發(fā)明的多肽或者至少 一種編碼所述多肽的核酸序列作為用于表征上皮(特別是表皮)狀態(tài)的工具的用途。
更精確地，根據本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明涉及用于表征上皮(特別是表皮)的 表面狀態(tài)的非侵入性的方法，特別是美容方法，所述方法至少包括定性或定量地表征根據 本發(fā)明的多肽即載脂蛋白D、其衍生物或片段的表達和/或生物學活性。
根據一個實施方案的變化形式，可以與參照數(shù)據項或值相比較地來評估所獲得的 數(shù)據或值，所述參照數(shù)據項或值例如至少獲自不同于所述表征受試物并且其狀態(tài)已知的上 皮，特別是表皮。 根據本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明的目的還是用于表征美容或治療處理的功效的 非侵入性的方法，特別是美容方法，所述美容或治療處理旨在改善上皮(特別是表皮)的生 理學狀態(tài)，和/或用于治療上皮(特別是表皮)厚度的減少，和/或上皮(特別是表皮)的 緊實度、彈性、密度和/或張度的喪失，和/或皮膚衰老的征候例如皺紋或細線，所述方法至 少包括定性或定量地表征根據本發(fā)明的多肽即載脂蛋白D、其衍生物或片段的表達和/或
6生物學活性。 根據一個實施方案的變化形式，在表征結束時獲得的數(shù)據也可以與參照值或數(shù)據
相比較地進行檢查。該參照值或數(shù)據可以為在施行所述處理之前或者在相比于處理開始日
期而言較短的時序時間內從待經歷處理的上皮(特別是表皮)獲得的數(shù)據。 如從下面的描述中明顯可見的，根據本發(fā)明的方法是特別有利的，因為它們的使
用不要求侵入性操作。 本發(fā)明的方法可以在體外、離體或在體內進行。 實際上，本發(fā)明人在角質層中定位了所述新型衰老生物標志物載脂蛋白D，這使得 僅通過局部樣品收集就能夠定量或定性地表征該糖蛋白的表達。樣品收集方法可以是例如 剝離(stripping)型技術，其在于對于所考慮的上皮例如表皮施加一部分膠粘帶。在去除 該膠粘帶時，上皮的級分(例如表皮級分)被去除。然后，在提取后，這通過常規(guī)方法例如 免疫酶測定法或更特別地Western印跡分析來進行分析。
縫,2 根據一個實施方案，適合于本發(fā)明的多肽可以具有完全或部分地由SEQ ID NO 2 所示序列或其類似物或其片段所呈現(xiàn)的氨基酸序列。 為了本發(fā)明的目的，除非另外說明，"ApoD"這一表述通常意指在天冬酰胺殘基第 45和178號上具有或不具有糖基化的蛋白質的序列(SEQ ID NO 2)，這導致分子量為19至 32kDa和pl為5. 6至7. 8的變體。"多肽的類似物"這一表述意指具有序列同源性(特別是相關于所述多肽的特征序
列)以及相同性質的生物學活性的任何多肽。 該化合物可以是肽模擬試劑(p印tidomimetic agent)。 同源性可以為至少85%，例如至少90%，和例如至少95%。同源性可以通過目視 比較或者借助于任何本領域中通常使用的計算機工具(例如在皿ncbi. nlm. nih. gov上
可獲得的并且以默認配置參數(shù)來使用的BLAST程序)來確定。 序列的同源性可以由于在根據本發(fā)明的肽序列中源自突變或變異的修飾而產生， 所述突變或變異源自在根據本發(fā)明的多肽的特征序列中一個或多個氨基酸的缺失，或一個 或多個氨基酸的插入，或一個或多個氨基酸的置換。 為了本發(fā)明的目的，"多肽片段"這一表述意指根據本發(fā)明的多肽的任何部分，其 包含所述多肽的至少4個，至少6個，特別是至少8個和更特別地至少12個連續(xù)氨基酸，以 及實質上相似的生物學活性。"多肽的特征序列"這一表述，特別是就載脂蛋白D而言，意指由SEQ ID NO 2所呈 現(xiàn)的序列。 通常，多肽類似物可以包含相對于天然多肽的氨基酸序列而言保守的置換。
可以將幾種這些修飾相組合。 作為在本發(fā)明中可以考慮的突變的例子，以非窮盡的方式，可以提及用具有相似 親水值的氨基酸殘基替代一個或多個氨基酸殘基而不因此明顯地影響該多肽的生物學特 性，特別是其生物學活性，例如其剌激角質形成細胞的增殖和/或遷移和/或終末分化的活 性，或剌激上皮(特別是表皮)中蛋白聚糖合成的活性。 親水值是根據其疏水性和其電荷而賦予氨基酸的值(Kyte等人，(1982) ， J. Mol.Biol. ，157 :105)。 本發(fā)明所涉及的多肽或類似物可以是經歷一種或多種翻譯后修飾的多肽。
"翻譯后修飾"這一表述意在包括肽或蛋白質在細胞中合成之后可能經歷的所有 修飾，例如一次或多次磷酸化、一次或多次糖基化、一次或多次脂質化(例如法呢基化或棕 櫚酰化)、結構重排例如二硫鍵的形成和/或例如肽序列內部的切割。
此外，所述類似物具有與天然多肽基本上相同的生物學活性。 根據一個實施方案，適合于實施本發(fā)明的多肽還可以是天然或合成的多肽，在需 要時所述多肽能夠在酶促或化學裂解載脂蛋白D后獲得，或通過化學或生物合成而獲得， 或通過從生物組織例如皮膚中提取而獲得，所述生物組織天然地或在轉染后表達該多肽以 及該多肽的各種翻譯后形式；或者其序列全部或部分地(完全或部分地)包含前述氨基酸 序列的任何天然或合成的多肽，例如變體和類似物。 借助于基于重組DNA的方法，例如在手冊《Molecular Cloning-A LaboratoryMa醒l》(第2版)，Sambrook等人，1989， Vol. 1-111， Coldspring HarborLaboratory，Coldspring Harbor Press,NY， (Sambrook)中所描述的那些方法，本令頁 域技術人員可以獲得根據本發(fā)明的多肽。 根據另一個實施方案，適合于實施本發(fā)明的多肽還可以是如前面所定義的多肽，
其中至少一個殘基已被具有相似親水值的氨基酸殘基所替代，如前面所定義的。 根據另一個實施方案，適合于實施本發(fā)明的多肽還可以是如前面所定義的多肽，
其與另一個多肽，親水或疏水性靶向試劑，生物轉化的前體，發(fā)光、放射性或比色標記試劑
相融合。 以非限制性的方式，作為能夠與根據本發(fā)明的多肽相偶聯(lián)的化合物的例子，可提
及熒光蛋白例如"綠色熒光蛋白"，熒光化學化合物例如羅丹明、熒光素、德克薩斯紅@，磷光
化合物，放射性元素例如3H、14C、35S、121I或1251，或者比色標記試劑例如對于半乳糖苷酶、過
氧化物酶、氯霉素乙酰轉移酶、螢光素酶或堿性磷酸酶的作用敏感的生色底物。 依照能夠與根據本發(fā)明的多肽相偶聯(lián)的化合物的性質，偶聯(lián)可以通過化學方法，
特別是借助于反應性化學官能團，或者通過本領域技術人員已知的分子生物學方法來進行。 核酸序列的定義 根據一個實施方案，本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的核酸序列以及其在根據本發(fā) 明的各種用途和方法中的應用。 因此，本發(fā)明還涉及核酸(特別是脫氧核糖核酸或核糖核酸)序列在制備根據本 發(fā)明的組合物中的用途，所述核酸序列編碼根據本發(fā)明的多肽，特別是相應于至少一種SEQ ID N0:1所示核酸序列、其類似物或其片段的序列。 為了本發(fā)明的目的，"核酸序列的片段"這一表述意指編碼根據本發(fā)明的多肽或其 類似物的全部或部分的核酸序列，特別是SEQ ID N0:1所示核酸序列或其類似物。
"核酸序列的類似物"這一表述意指任何這樣的核酸序列，其任選地由于核酸密碼 的簡并性而產生，并且編碼與由所述核酸序列所編碼的多肽序列相同或類似的多肽序列。
所述核酸序列可以源自任何可能的來源，即動物來源(特別是哺乳動物，和更特 別是人)、植物來源、微生物來源(病毒、噬菌體、細菌等)或者真菌來源，但并不預先判斷它們是否天然地存在或不存在于所述源生物體中。 在這種情況下，本發(fā)明還涉及編碼根據本發(fā)明所考慮的多肽的經分離和純化的核 酸片段的用途。 根據本發(fā)明的核酸序列可以包括有義、反義或干擾序列，其相應于編碼根據本發(fā) 明的多肽的序列。 因此，本發(fā)明還涉及編碼根據本發(fā)明的多肽的核酸(特別是脫氧核糖核酸或核糖 核酸)序列的用途。 根據本發(fā)明的核酸序列可以特別地用于制備相應的有義或反義核糖核酸序列。
本發(fā)明的主題還是任何多核苷酸的用途，所述多核苷酸具有包含有義或反義序列 的核糖核酸或脫氧核糖核酸序列(特別是"小干擾RNA")，所述序列至少相應于核酸序列 SEQ ID NO :1或其類似物。
調節(jié)試劑 根據另一個實施方案，本發(fā)明涉及調節(jié)根據本發(fā)明的多肽的表達、活性和/或釋 放的試劑的用途。 特別地，本發(fā)明涉及激活本發(fā)明多肽的活性的調節(jié)試劑的用途。 為了本發(fā)明的目的，"調節(jié)"這一表述，就所給出的效應而言，意指剌激或抑制該效
應的作用。 為了本發(fā)明的目的，表述"調節(jié)試劑或者能夠調節(jié)生物學活性和/或表達的化學 或生物學化合物"意指能夠對于至少一種根據本發(fā)明的多肽或編碼該多肽的核酸序列、或 者對于細胞內或細胞外信號傳導途徑或代謝途徑(牽涉所述多肽)的組分、或者對于在調 控編碼所述多肽的核酸序列的轉錄和/或翻譯中所牽涉的組分直接或間接地起作用的任 何化合物。"生物學活性"這一表述，就載脂蛋白D而言，特別意指具有SEQ ID NO 2所示序 列的蛋白質的生物學活性、所述蛋白質的成熟形式的生物學活性以及在天冬酰胺殘基第45 和178號上具有或不具有糖基化(這導致分子量從19至32kDa和pl從5. 6至7. 8的變 化)的蛋白質的生物學活性。 該調節(jié)試劑可以為激活本發(fā)明多肽的基因表達或蛋白質表達的試劑，或者抑制本 發(fā)明多肽的基因表達或蛋白質表達的試劑。 作為激活基因表達的試劑的舉例說明而非限制，可以特別提及雄激素類(雙氫睪 酮(DHT))、地塞米松(DEX)、反式-視黃酸、1， 25- 二羥維生素D3、氯氮平、a -白細胞介素1 和糖皮質激素。 作為抑制基因表達的試劑的舉例說明而非限制，可以特別提及黃芩苷元、雌激素 類(雌二醇)和他莫昔芬。 更特別地，調節(jié)試劑可以是根據本發(fā)明的多肽的基因表達的激活劑。 本發(fā)明另外還涉及用于篩選能夠調節(jié)根據本發(fā)明的多肽的生物學活性的生物學
或化學化合物或者物理化學因素的方法，所述方法至少包括下列步驟 a)在適宜于表現(xiàn)出根據本發(fā)明的多肽的所述生物學活性的條件下，使至少一種根 據本發(fā)明的多肽與至少一種待測試的化學或生物學化合物相接觸，和/或對所述多肽施以 所述物理化學因素，禾口
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b)測定所述多肽的所述生物學活性。 在這樣的方法中，所述多肽的生物學活性，特別是其上皮分化活性，尤其是表皮終 末分化活性(尤其是關于角質形成細胞而言)，可以例如通過本領域技術人員已知的任何 方法來測定。
例如并且非限制性地，可提及這樣的方法進行細胞培養(yǎng)；隨后對分化標志物例
如角蛋白10、聚絲蛋白，或增殖標志物例如KI67和PCNA進行表征。 根據一個實施方案，可以將所述多肽的生物學活性與參照值進行比較。 可以通過在不存在任何待測試的生物學或化學化合物或者物理化學因素的情況
下測量所述多肽的生物學活性來獲得參照值。 假定參照值的該測量在使用待測試的生物學或化學化合物或者物理化學因素之
前進行，那么根據本發(fā)明的方法此外還可以，在需要時，允許評價所述化合物的潛在功效。 該生物學活性可以不受所述化合物的存在的影響，或者相反地被抑制或剌激。 假定觀察到了剌激效應，那么該受試化合物能夠用作例如抗衰老活性劑。 根據本發(fā)明的方法可以在分離的細胞樣品上進行，所述細胞樣品從皮膚活組織檢
查或者從培養(yǎng)的細胞獲得。 有利地，作為適合于本發(fā)明的細胞樣品，可提及角質形成細胞樣品。
有利地，在根據本發(fā)明的方法中使用的多肽可以是載脂蛋白D。 本發(fā)明還涉及用于篩選能夠調節(jié)根據本發(fā)明的多肽的表達的生物學或化學化合 物的方法，所述方法至少包括下列步驟 a)在適宜于表現(xiàn)出編碼根據本發(fā)明的所述多肽的核酸序列的表達的條件下，使至
少一種能夠表達編碼根據本發(fā)明的所述多肽的核酸序列的細胞類型與至少一種待測試的
化學或生物學化合物相接觸，禾口 b)測定所述核酸序列的表達。 核酸序列的表達可以，例如借助于寡核苷酸探針，或者通過本領域技術人員已知 的任何實驗方案來測定。 作為核酸序列的檢測方法的例子，可提及聚合酶鏈式反應(PCR)、反轉錄酶-聚合
酶鏈式反應(RT-PCR或Q-PCR) 、Northern印跡法、核糖核酸酶保護測定法、使用DNA芯片的
方法、使用轉錄物組學芯片的方法、使用寡核苷酸芯片的方法、原位雜交法。 作為適合于檢測核酸序列，特別是mRNA序列的試劑的例子，可提及可以與所述序
列雜交的經標記的核酸探針。 這樣的核酸探針可以通過本領域技術人員已知的任何方法容易地獲得。 因此，根據本發(fā)明的核酸序列可以用于制備有義和/或反義寡核苷酸引物，所述
引物可以在高嚴緊條件下與序列SEQ ID N0:1或其類似物雜交。 可以將根據本發(fā)明的核酸序列的表達與參照值進行比較，所述參照值例如通過在 不存在受試化合物的情況下實施根據本發(fā)明的方法而獲得。 核酸序列的表達還可以間接地通過測定由所述序列編碼的多肽的表達來測定，其 中借助于本領域已知的任何技術，例如Western印跡法、ELISA、Bradford或Lowry法，或者 如下文所示的。 本發(fā)明還涉及用于篩選能夠調節(jié)根據本發(fā)明的多肽的表達的生物學或化學化合物(甚至抗衰老活性劑)的方法，所述方法至少包括下列步驟 a)在適宜于表現(xiàn)出根據本發(fā)明的多肽的表達的條件下，使至少一種能夠表達根據
本發(fā)明的多肽的細胞類型與至少一種待測試的化學或生物學化合物相接觸， b)測定所述多肽的含量，禾口 c)將在步驟b)中測得的所述含量與在不存在待測試的化學或生物學化合物的情 況下測得的所述多肽的含量進行比較。 在步驟c)中進行的比較可以使得能夠推斷出關于所述受試化合物調節(jié)本發(fā)明多 肽表達的特性的信息。 本發(fā)明的方法可以在分離的細胞樣品上進行。 根據本發(fā)明的多肽的含量的測定可以借助于本領域技術人員已知的任何方法來 進行。 作為多肽的檢測方法，可以提及Western印跡法，狹線印跡法，斑點印跡法，單重 或多重類型的ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定法)方法，蛋白質組學或糖組學方法，用基于銀的 染色劑、考馬斯藍或SYPRO在聚丙烯酰胺凝膠中對多肽進行染色的方法，免疫熒光方法，UV 吸收方法，使用常規(guī)顯微術、電子顯微術或共聚焦顯微術的免疫組織化學方法，F(xiàn)RET(熒光 共振能量轉移)方法，TR-FRET(時間分辨FRET)方法，F(xiàn)LIM(熒光壽命成像顯微術)方法， FSPIM(熒光光譜成像顯微術)方法，F(xiàn)RAP(熒光漂白恢復)方法，通過報告基因的方法， AFM(原子力顯微術)方法，表面等離子共振方法，微量量熱法，流式細胞術方法，生物傳感 器方法，放射免疫測定法(RIA)，等電點聚焦方法，酶測試，使用肽芯片、糖芯片、抗體芯片的 方法，質譜法，SELDI-TOF型光譜方法(Ciphergen)。 根據本發(fā)明的方法可以在樣品(例如分離自上皮，特別是表皮)上進行，所述樣品 從皮膚活組織檢查獲得，或者從上皮(例如表皮)細胞模型獲得，或者更有利地從角質層的 (特別是使用膠粘帶("剝離帶")的)非侵入性表面取樣獲得，或者通過簡單洗滌獲得。
表皮樣品可以通過本領域技術人員已知的任何方法來收集。
這些方法可通過所謂的剝離技術來進行。
這些剝離是施加到表皮表面上的粘性表面，例如3M的Blenderm 、
D' squam(CuDERM的商業(yè)膠粘劑)、氰基丙烯酸酯粘合膠或者涂料剝離(varnish stripping)法。通過使用這些剝離，可以收集得到粘附性角質細胞和其細胞間隙的內容物， 并隨后使其經歷提取，這使得能夠評估蛋白質的含量。 適合于所述方法的樣品的收集還可以更直接地通過"洗滌"皮膚表面來進行，其中 借助于例如葉輪(vane turbine)類型的附件、螺旋室(spiral cell)類型的附件(如專利 FR 2 667 778中所描述的)(其與流體回路(fluid circuit)相組合)，或者簡單地通過在 皮膚表面上添加/移去緩沖液滴。 作為對適合于實施本發(fā)明的其他樣品收集方法的引導，可提及基于借助雙刀片 (twin blade)系統(tǒng)刮削角質層頂部的方法。該技術使得能夠收集鱗屑，所述鱗屑然后可以 通過各種技術直接進行分析，以測定礦物質、氨基酸或脂質水平。 應當理解，根據本發(fā)明所考慮的所有美容或治療組合物采用生理學上可接受的介 質。 為了本發(fā)明的目的，"生理學上可接受的介質"這一表述意指這樣的介質，其適合于將組合物應用在上皮或角蛋白材料(例如，皮膚，頭皮，嘴唇，粘膜，以及角蛋白纖維例如 頭發(fā)、指(趾)甲和體毛)上，或在需要時通過口服或腸胃外途徑。 為了本發(fā)明的目的，"治療的"這一表述意指可以在上皮(特別是表皮)狀態(tài)的預 防性和/或治療性處理的范圍內，或者在上皮(特別是表皮)狀態(tài)的評價方法的范圍內使 用的組合物。 根據另一個實施方案，根據本發(fā)明的美容或治療組合物另外還可以包含至少一種 美容和/或治療活性劑。 作為在本發(fā)明范圍內可使用的活性劑的例子，可提及美容用油，例如硅油或甘油 三酯類型的植物油，烴油例如parleam油以及脂肪酸和脂肪醇的酯。 還可以使用其他使得能夠改善皮膚狀況的活性劑，例如水化活性劑或潤濕活性 劑，或使得能夠改善天然脂質屏障的活性劑，例如神經酰胺、硫酸膽固醇和/或脂肪酸以及 它們的混合物。 還可以使用對皮膚具有活性的酶，例如蛋白酶、脂肪酶、葡糖苷酶、酰胺酶、腦苷酶 和/或melanases以及它們的混合物。 作為適用于實施本發(fā)明的活性劑的其他例子，可以提及止痛活性劑、抗酵母活性 劑、抗細菌活性劑、抗寄生蟲活性劑、抗真菌活性劑、抗病毒活性劑、類固醇抗炎活性劑、麻 醉活性劑、止癢活性劑、角質層分離活性劑、抗自由基活性劑、抗皮脂溢活性劑、去頭屑活性 劑、抗痤瘡活性劑、旨在防止皮膚衰老和/或改善其狀況的活性劑、抗皮炎活性劑、抗剌激 物活性劑、免疫調節(jié)活性劑、用于治療干燥的皮膚的活性劑、抗出汗活性劑、抗銀屑病活性 劑、針對UV的保護性活性劑、抗組胺活性劑、瘢痕形成活性劑、自曬黑活性劑、抗氧化劑例 如綠茶或其活性級分、甘油、l即onite、咖啡因、芳香精油、著色劑、去色素活性劑、脂調節(jié) 劑、柔軟化活性劑、提神活性劑、祛臭活性劑、脫敏活性劑、漂白活性劑、和營養(yǎng)活性劑、減少 皮膚的分化和/或增殖和/或色素沉著的活性劑以及它們的混合物。 —般地，可以將本發(fā)明的任何組合物應用于皮膚(身體的任何皮膚區(qū)域)上或者 粘膜(頰的、顴的、牙齦的、生殖器的、結膜的粘膜等等)上。 正如已經知道的，美容組合物還可以含有美容學領域中通常使用的輔助劑，例如 親水或親脂的凝膠劑、親水或親脂的添加劑、防腐劑、抗氧化劑、溶劑、香料、填料、防曬劑、 氣味吸收劑和著色物質。 根據本發(fā)明的組合物的各種組分的量為在所考慮的領域中常規(guī)使用的量。
在根據本發(fā)明的組合物中所包含的化學或生物學化合物或者根據本發(fā)明的多肽、 核酸序列或調節(jié)試劑的量(也稱為"有效量")，當然取決于所述化合物的性質和所尋求的 效應，并因此可以在大的范圍內變動。 為了給出大概的數(shù)量級，組合物所包含的根據本發(fā)明的調節(jié)試劑或多肽的量可以 為所述組合物總重量的0. 00001 %至50 % ，特別地0. 001 %至10 % ，和更特別地0. 1 %至1%。 更特別地，根據本發(fā)明的組合物旨在用于減少和/或治療可能使上皮(特別是表 皮)狀態(tài)變壞的疾患。 本發(fā)明所涉及的上皮狀態(tài)可以是與下列相關的狀態(tài)終末上皮(特別是表皮的， 尤其是角質形成細胞的)分化的功能障礙。
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這樣的狀態(tài)可以是時序起因的(即與時間流逝相關的，例如皮膚衰老)，和/或為 與例如光衰老相關的皮膚病癥的指示。 因此，根據本發(fā)明的組合物(特別是美容組合物)可以特別是用于預防和/或治 療表皮厚度的減少，和/或表皮的緊實度、彈性、密度和/或張度的喪失，和/或皺紋和細線 的形成。 根據另一個實施方案，根據本發(fā)明的組合物(特別是美容組合物)可以特別是用 于預防和/或治療皮膚干燥征候，特別是預防和/或治療表皮脫水。 本發(fā)明的組合物還可以用于預防和/或治療上皮(特別是表皮)屏障功能的紊 亂。 根據另一個實施方案，根據本發(fā)明的組合物(特別是美容組合物)可以用于預防 和/或治療表皮衰老的征候。 更特別地，根據本發(fā)明的組合物(特別是治療組合物)可以用于治療皮膚病癥，例 如皮膚水化紊亂，例如干燥病，角化不全，角化過度，魚鱗病，銀屑病，特應性皮炎，濕疹，酒 渣鼻，苔癬(lichen)，瘙癢癥，具有炎性組分或者由于免疫應答的改變而引起的皮膚病理學 狀態(tài)，脫屑，黑素生成或皮脂生成(sebogenesis)的失常，脫發(fā)，多毛癥，瘢痕形成紊亂，或 者牽涉分泌現(xiàn)象和細胞侵入過程的皮膚病癥，特別是在惡性或良性瘤形成的范圍內。
根據另一個方面，本發(fā)明還涉及至少一種根據本發(fā)明的多肽或至少一種編碼所述 多肽的核酸序列作為用于表征上皮(特別是表皮)狀態(tài)的工具的用途。
作為例子，根據本發(fā)明可以表征上皮狀態(tài)，所述上皮狀態(tài)選自脫屑、魚鱗病、角化 過度、表皮干燥、衰老或光衰老。 因此，如上所說明的，根據本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明涉及用于表征非病理性表 皮的表面狀態(tài)或者美容或治療處理的功效的非侵入性方法，其旨在定性或定量地表征載脂 蛋白D、其衍生物或片段的表達。 這些方法是特別有利的，因為它們的應用并不必定要求訴諸外科手術技術來實施 此類表征。因此，表皮提取物可以通過簡單的剝離而獲得，并且直接通過常規(guī)的分析技術來 進行分析，特別是如上面所描述的。 根據一個實施方案，用于表征上皮(例如表皮)狀態(tài)的方法至少包括下列步驟
a)測定在所述上皮的樣品中根據本發(fā)明的多肽或編碼所述多肽的核酸序列的含 量，禾口 b)將在步驟a)中測得的所述含量與參照值進行比較。
有利地，本發(fā)明的方法是非侵入性的。
有利地，本發(fā)明的方法在分離的樣品上進行。 根據一個實施方案，根據本發(fā)明的方法可以在收集自個體的上皮(特別是表皮) 樣品上進行。 根據本發(fā)明的方法還可以在上皮(特別是表皮)樣品上進行，所述樣品收集自上 皮(特別是表皮)細胞模型或者重構的分離的皮膚，以便對其狀態(tài)進行定性。
上皮樣品的收集可以通過本領域技術人員已知的任何方法來進行。
根據本發(fā)明的方法可以在體內、在體外或離體進行。 參照值可以是例如在表皮樣品上所測得的多肽或核酸序列的含量，所述表皮樣品收集自上皮，特別是正常皮膚，即在生理學方面符合例如年輕皮膚的形象。 參照值的測量可以與測定多肽或核酸序列的所述含量平行地或順次地進行。 所測得的含量與參照值的比較可以使得能夠評價相對于該值的偏差。 分析該偏差的程度和/或性質(負的或正的)可以提供關于表皮狀態(tài)的信息。 表皮狀態(tài)的表征可以為可能的皮膚病癥的指示，所述皮膚病癥可以通過使用能夠
調節(jié)根據本發(fā)明的多肽的表達的化合物來修正。 根據一個實施方案，根據本發(fā)明的方法可以在個體中在推測的上皮(特別是表 皮)病癥的體內、體外或離體診斷方法中施行。 例如，待評價的上皮狀態(tài)可以選自脫屑、魚鱗病、角化過度、表皮干燥、衰老或光衰老。 有利地，適合于施行根據本發(fā)明的方法的多肽可以是載脂蛋白D。 可以通過本領域技術人員已知的任何實驗方案來測定表皮樣品中根據本發(fā)明的
多肽或根據本發(fā)明的核酸的含量。 作為多肽檢測的方法，可提及前面已列舉的那些。 因此，可以設想，借助于抗體，在需要時以經標記的形式，來檢測根據本發(fā)明的多 肽的存在。 能夠用作用于評價表皮狀態(tài)的工具的抗體可以通過本領域技術人員已知的任何 方法來獲得，例如在"Antibodies :A Laboratory Manual ，，， Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1990)中所描述的方法。有利地，所使用的抗體可以是 重組抗體，例如由Antibodies-by-design公司所開發(fā)出的那些抗體。 有利地，適合于施行根據本發(fā)明的方法的核酸序列可以是編碼ApoD的核酸序列， 例如mRNA類型的核酸序列。 作為根據本發(fā)明的核酸的檢測方法的例子，可以提及前面已列舉的方法。 本發(fā)明還涉及非治療方法，其用于證明在個體中能夠引起上皮病癥(特別是皮膚
或頭皮病癥)消退的處理的效果，所述方法至少包括下列步驟 a)在所述處理之前，在收集自所述個體的第一上皮樣品中進行至少一次根據本發(fā) 明的多肽的生物學活性和/或表達或者編碼所述多肽的核酸序列的表達的第一測定，
b)在所述處理之后，在收集自所述個體的第二上皮樣品中進行至少一次在步驟 a)中所測定的所述多肽的所述生物學活性和/或所述表達或者所述核酸序列的所述表達 的第二測定，禾口 c)將所述第一和第二測定進行比較，特別是以便從中推斷出至少關于所述處理的 效果的信息。 此類處理可以特別地為美容處理。 特別地，其效果待評價的處理可以是用于緩解或減少與角質形成細胞的增殖和/
或分化的功能障礙相關的皮膚或頭皮病癥的處理。 可以如上所示來測定多肽的生物學活性和表達。 根據另一個方面，本發(fā)明涉及用于皮膚病癥的美容處理的方法，其至少包括下列 步驟將至少一種根據本發(fā)明的美容組合物應用在皮膚、粘膜和/或角蛋白纖維的至少一 部分上。 根據另一個方面，本發(fā)明涉及有效量的至少一種根據本發(fā)明的多肽或者至少一種調節(jié)所述多肽的表達的試劑用于制備和/或改善多層細胞模型(特別是表皮或粘膜類型 的)，特別是重構的皮膚模型的用途。 為了本發(fā)明的目的，"重構的皮膚模型"這一表述意指這樣的模型，在所述模型中 組合了各種細胞類型，例如特別是皮膚的天然組成成分，例如角質形成細胞、成纖維細胞、 朗格漢斯細胞和黑素細胞。 成纖維細胞類型的細胞可以是經照射的或相反。
這樣的模型及其制備是本領域技術人員已知的。 為了本發(fā)明的目的，"a"應當理解為指"至少一 (種、個)"的意思。
下面給出的實施例是為了舉例說明而非限制本發(fā)明的目的而呈現(xiàn)的。
實施例1 通過在個體的不同皮膚區(qū)域上進行涂料剝離而收集的樣品的分析 通過使用在腿上進行的涂料剝離來施行所述分析。 將適合于該研究的受試者分成4個組。 AS組相應于組1 :干燥的更年期個體，n = 15。 AN組相應于組2 :正常的更年期個體，n = 13。 JS組相應于組3 :干燥的年輕個體，n = 16。 JN組相應于組4 :正常的年輕個體，n = 14。
1 :丙酮制粉的制備 將兩個10cm2的涂料剝離物(B. Mehul等人，J Biol Chem 2000，Apr 28 ;275(17): 12841-7)置于20ml丙酮中。角質細胞發(fā)生脫附。將該混合物在40 y m尼龍膜上進行過濾。 用相同體積的丙酮進行3次連續(xù)的漂洗。最后，在真空泵上使該懸浮液進行過濾。以干燥
形式獲得角質層的丙酮制粉。
2 :樣品的提取 在變性條件下進行提取。為此，每mg丙酮制粉，添加100 iU體積的PBS緩沖液 (磷酸鹽緩沖鹽水)+0. 1% Triton XIOO，以進行預洗滌。在Potter中研磨該混合物，并進行 離心?；厥战琴|細胞粒狀沉淀。用相同體積(100iil/mg)的包含O. 0625mM Tris pH 6.8， 200mM DTT，2% SDS， 10%甘油的Laemmli緩沖液進行提取。將該混合物在沸騰溫度下加熱 10分鐘，隨后進行研磨并以10000g離心10分鐘。回收上清液。使用Bradford試劑，按照 Bradford技術來進行蛋白質測定法(Bio-Rad蛋白質測定法)。將樣品調整至lmg/ml。
3 :通過Western印跡法來分析所述蛋白質 通過SDS-PAGE電泳來分離開所述蛋白質。在根據標準實驗方案半干燥地轉移 到PVDF膜(Immobilon-P Milipore)上之后，將所述蛋白質與抗_載脂蛋白D抗體Medcla 457 (36c6) (Accurate Chemical) —起在4。C下溫育過夜。接下來，用針對一抗的二抗(在 該情況下，為小鼠抗體(山羊抗小鼠IgG HRP綴合物)(Bio-Rad))來進行第二次溫育，所述 溫育在室溫下進行1小時30分鐘。在免疫檢測后，用酰胺黑對在轉移后在膜上存在的總蛋 白質進行染色。將ECL Plus試劑盒(Amersham)用于可視化。用FluorSmax(Biorad)來獲 取圖像，并且借助于Quantity-one軟件(Biorad)對條帶進行定量。
4 :結果 將結果表示為目標蛋白的A cnt*mm2/總蛋白質的A cnt*mm2。
15
方法 皮膚的年齡和類型的雙因素方差分析(考慮了這兩個因素的相互作用)+單因素 方差分析(組)和Turkey' s多重比較檢驗。由于正態(tài)性和同方差性條件未經驗證，因此 在對數(shù)變換后進行所述分析。 用軟件包SAS版本8. 2和SPSS版本12進行統(tǒng)計學分析。 以5%雙側閾值來進行所有的檢驗。
下表顯示了平均值結果以及其平均值的標準誤差(sem)。

組載脂蛋白Dsem apoD
AS19262
AN20676
738245
了N728201注意到在皮膚衰老過程中載脂蛋白D的表達顯著減少(p=0. 005)。序列表SEQID NO 11gctgattctgcatctgg^actgccttcat皿gctccaggtcccttctcc61agccacccagccccaagatggtgatgctgctgctgctgctttccgcactggctggcctct121tcggtgcggcgcatttcatcttggg皿gtgccccaatcctccggtgcagg181ag朋ttttgacgtg皿teagtetctcggaagatggtecga241cctttgagaatggacgctgcatccaggccaactectcactgg^agatca301朋gtgtte朋cc郷agttg卿gctgatgg皿ctgtg皿ggtg皿gcca361ccccagtteacctcacagagcctgccaagctgg皿gtteagttttcctggtttetgccat421cggcaccgtectggatcctggccaccgactatgag皿ctetgccctcgtgtettcctgte481cctgcatcatccaactttttcacgtggattttgcttggatcttggc皿gaaacccteatc541tccctccaga皿C3gtgg3Catetcctgacttcteateacattgatgtca601ggtC3C3g3Ccaggtg皿ctgccccaagctctcgteaccaggttctecag661ggaggctgcacccactccatgttecttctgcttcgctttccccteccccacccccccccc721ate朋gac朋C3Cg3C皿3gg皿gttgacctg皿catgteaccatgccct781accctgtteccttgctegctcttgttgctgacctgc皿皿841a a a a a a a a a ￡SEQID NO 21匪LLLLLSALAGLFGMEGQAFHLGKCPNPPVQENFDVNKYLGRWYEIEKIPTTFENGR61CIQANYSLME NGKIKVLNQELRADGT濯EGEATPVNLTEPAKLEVKFSWFMPSAPYWI121LATDYENYAL VYSCTCIIQLF誦FAWILARNPNLPPETVDSL認ILTSNNIDVKKMTVT181DQVNCPKLS
1權利要求
有效量的至少一種多肽、至少一種編碼此類多肽的核酸序列或者至少一種調節(jié)此類多肽的活性或表達的試劑作為對于刺激終末上皮分化來說有用的試劑的美容用途，所述多肽所具有的氨基酸序列由完全或部分地由SEQ ID NO 1所示序列、其類似物或其片段所呈現(xiàn)的核酸序列編碼。
2. 有效量的至少一種多肽、至少一種編碼此類多肽的核酸序列或者至少一種調節(jié)此類 多肽的活性或表達的試劑在制備用于剌激終末上皮分化的治療組合物中的用途，所述多肽 所具有的氨基酸序列由完全或部分地由SEQ ID NO l所示序列、其類似物或其片段所呈現(xiàn) 的核酸序列編碼。
3. 根據權利要求1或2的用途，其中所述多肽具有完全或部分地由SEQ ID N02所示序 列、其類似物或其片段所呈現(xiàn)的氨基酸序列。
4. 根據前述權利要求中任一項的用途，其中所述調節(jié)試劑是所述多肽的基因表達的激 活劑。
5. 根據前一項權利要求的用途，其中所述激活劑選自雙氫睪酮(DHT)、地塞米松 (DEX)、反式-視黃酸、1，25- 二羥維生素D、氯氮平和糖皮質激素。
6. 根據前述權利要求中任一項的用途，其中所述組合物用于預防和/或治療表皮厚度 的減少，和/或表皮的緊實度、彈性、密度和/或張度的喪失，和/或皺紋和細線的形成。
7. 根據權利要求2、3、4或5的用途，其中所述組合物用于預防和/或治療皮膚干燥征 候，特別是預防和/或治療表皮脫水。
8. 根據權利要求2、3、4或5的用途，其中所述組合物用于預防和/或治療表皮屏障功 能的素亂。
9. 至少一種依照權利要求1或3所定義的多肽作為用于篩選生物學或化學化合物的工 具的用途，所述化合物能夠調節(jié)所述多肽的表達和/或生物學活性。
10. 至少一種依照權利要求1至3所定義的多肽或者至少一種編碼所述多肽的核酸序 列作為用于表征上皮狀態(tài)的工具的用途。
11. 根據前一項權利要求的用途，其中所述上皮狀態(tài)選自脫屑、魚鱗病、角化過度、表皮 干燥、衰老或光衰老。
12. 用于表征上皮狀態(tài)的方法，其至少包括下列步驟a) 測定在所述上皮的樣品中依照權利要求1至3所定義的多肽或編碼所述多肽的核酸 序列的含量，禾口b) 將在步驟a)中測得的所述含量與參照值進行比較。
13. 根據前一項權利要求的方法，其特征在于，它是非侵入性的。
14. 用于篩選抗衰老活性劑的方法，其至少包括下列步驟a) 在適宜于表現(xiàn)出權利要求1至3中所定義的多肽的表達的條件下，使至少一種能夠 表達權利要求1至3中所定義的多肽的細胞類型與至少一種待測試的化學或生物學化合物 相接觸，b) 測定所述多肽的含量。
15. 用于表征美容或治療處理的功效的美容方法，所述美容或治療處理旨在改善上皮 的生理學狀態(tài)，和/或用于治療上皮厚度的減少，和/或上皮的緊實度、彈性、密度和/或張 度的喪失，和/或皮膚衰老的征候例如皺紋和細線，所述方法至少包括定性或定量地表征權利要求1至3中所定義的多肽的表達和/或生物學活性。
16.有效量的至少一種依照權利要求1至3中任一項所定義的多肽或者至少一種調 節(jié)所述多肽的表達的試劑用于制備和/或改善多層細胞模型，特別是重構的皮膚模型的用 途。
全文摘要
本發(fā)明的主題是載脂蛋白D、源自該蛋白質的多肽或其類似物、編碼此類多肽的核酸序列、或者調節(jié)此類多肽的活性或表達的試劑的用途，特別是美容和/或治療用途，特別是用于刺激終末上皮分化。本發(fā)明還涉及載脂蛋白D、源自該蛋白質的多肽或其類似物、或者編碼此類多肽的核酸序列作為用于評價表皮狀態(tài)的標志物的用途。
文檔編號A61P17/00GK101796417SQ200880021314
公開日2010年8月4日 申請日期2008年6月20日 優(yōu)先權日2007年6月22日
發(fā)明者D·貝爾納, I·卡斯蒂埃爾, L·西莫內蒂 申請人:歐萊雅公司