專利名稱：與化療藥劑聯(lián)用的用于治療癌癥的免疫細(xì)胞因子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用化療藥劑與免疫球蛋白的聯(lián)用來治療癌癥。
背景技術(shù)：
細(xì)胞粘合素-C (tenascin-C )是一種細(xì)胞外基質(zhì)的大分子六聚體 #唐蛋白，其用于調(diào)節(jié)細(xì)月包粘附。它涉及例力o細(xì)月包增殖和細(xì)月包遷移的 過程，并且與如在形態(tài)發(fā)生和胚胎發(fā)生的過程中以及在腫瘤發(fā)生或 血管形成的情況下出現(xiàn)的組織結(jié)構(gòu)變化相關(guān)。
已經(jīng)才艮道了細(xì)月包粘合素-C同種型對(duì)許多腫瘤的4交強(qiáng)過表達(dá) [Borsi 1992 supra]，并且在臨床中已經(jīng)廣泛地表4正了分別特異于結(jié) 構(gòu)域Al和D的單克隆抗體[Riva P等，Int J Cancer 1992; 51:7-13, RivaP等，Cancer Res 1995; 55 : 5952s-5956s， Paganelli G等，Bur J Nucl Med 1994; 21:314-321, Reardon DA等，J Clin Oncol 2002; 20:1389-1397， Bigner DD等，J Clin Oncol 1998; 16:2202-2212]。
WO2006/050834中描述了特異于細(xì)胞粘合素-C的人單克隆抗 體片,殳，并且相對(duì)于正常組織而言其表現(xiàn)出優(yōu)先結(jié)合于腫瘤組織。 這些抗體是有用的，例如，用于特異于腫瘤細(xì)胞遞送毒素，例如細(xì) 胞因子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在癌癥的治療中，輩巴向于細(xì)胞粘合
素-c的抗體-細(xì)胞因子結(jié)合物具有意料不到的與諸如多柔比星和紫
杉醇之類的抗癌化合物的協(xié)同作用。
本發(fā)明的一個(gè)方面一是供了 一種治療癌癥的方法，包括對(duì)需要治
療的個(gè)體給予抗癌化合物和抗體-白細(xì)胞介素2 (IL2)結(jié)合物，其 中該抗體-IL2結(jié)合物包含與特異性結(jié)合于細(xì)力包粘合素-C的抗體相 結(jié)合的IL2。
本發(fā)明的其他方面提供了 一種在治療癌癥的方法中使用的抗 癌化合物，該方法包括對(duì)需要治療的個(gè)體與抗體-IL2結(jié)合物聯(lián)合給 予抗癌化合物，該抗體-IL2結(jié)合物包含與特異性結(jié)合于細(xì)胞粘合素 -C的抗體相結(jié)合的白細(xì)胞介素2 (IL2 )，并且提供了抗癌化合物在 制造用于治療癌癥的方法的藥物中的應(yīng)用，其中該方法包4舌3于需要 治療的個(gè)體與抗體-IL2結(jié)合物聯(lián)合給予抗癌化合物，所述抗體-IL2 結(jié)合物包含與特異性結(jié)合于細(xì)胞粘合素-C的抗體相結(jié)合的白細(xì)胞 介素2 (IL2 )。
本發(fā)明的其他方面提供了 一種在癌癥治療方法中使用的抗體 -IL2結(jié)合物，包含與特異性結(jié)合于細(xì)胞粘合素-C的抗體相結(jié)合的白 細(xì)胞介素2 (IL2),其中該方法包括對(duì)需要治療的個(gè)體與抗體-IL2 結(jié)合物聯(lián)合給予抗癌化合物，并且還提供了抗體-IL2結(jié)合物在制造 用于治療癌癥的方法中4吏用的藥物的應(yīng)用，其中該抗體-IL2結(jié)合物 包含與特異性結(jié)合于細(xì)胞粘合素-C的抗體相結(jié)合的白細(xì)胞介素2 (IL2 ),該方法包括對(duì)需要治療的個(gè)體與抗癌化合物聯(lián)合纟會(huì)予抗體 -IL2結(jié)合物。本發(fā)明的其他方面^是供了 一種抗癌化合物與抗體-IL2結(jié)合物 的組合物，該抗體-IL2結(jié)合物包含在治療癌癥的方法中4吏用的與特 異性結(jié)合于細(xì)胞粘合素-C的抗體相結(jié)合的白細(xì)胞介素2 (IL2 )，該 方法包括對(duì)需要治療的個(gè)體給予抗體-IL2結(jié)合物和抗癌化合物，并 且還4是供了該抗癌化合物與抗體-IL2結(jié)合物的組合物在制造用于治 療癌癥的方法中〗吏用的藥物的應(yīng)用，其中該抗體-IL2結(jié)合物包含與 特異性結(jié)合于細(xì)胞粘合素-C的抗體相結(jié)合的白細(xì)胞介素2 (IL2 )， 該方法包括對(duì)需要治療的個(gè)體給予抗體-IL2結(jié)合物和抗癌化合物。
本文中所述的適合于治療的癌癥包括任何類型的實(shí)體腫瘤和 非實(shí)體腫瘤或惡性淋巴瘤，并且尤其是白血病、肉瘤、皮膚癌、膀
胱癌、乳癌、子宮癌、卵巢癌、前列A泉癌、"申癌，結(jié)腸癌，頸癌、 肝癌，頭頸癌、食管癌、減A泉癌、腎癌、胃癌以及腦癌。癌癥可以 是遺傳性的也可以是偶發(fā)性的。
在一些〗尤選實(shí)施方式中，癌癥是乳癌。
抗癌化合物是抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和/或增殖的細(xì)胞毒素化 合物。在一些情況下，抗癌4b合物可以對(duì)患者體內(nèi)的正常非癌變細(xì) 胞起作用。例如，抗癌化合物可以抑制細(xì)胞周期或激活細(xì)胞凋亡。 抑制細(xì)胞周期的適合的抗癌化合物包括DNA損傷劑(DNA damaging agent)和抗有絲分裂藥劑，包括有絲分裂紡錘體組裝的抑 制劑。
DNA損傷劑是一種化療藥劑，其i秀導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)DNA發(fā)生DNA DSB 乂人而抑制或停止DNA復(fù)制。許多用于治療癌癥的適合的化合 物是本領(lǐng)域已知的，包括例如，博來霉素羥基脲、絲裂霉素和放線 菌素以及拓樸異構(gòu)酶I和II活性的抑制劑，包括蒽環(huán)類，例如柔紅 霉素、多柔比星、表柔比星、伊達(dá)比星、米托蒽醌和戊柔比星、依 托泊苷和替尼泊苷，以及帝肯(tecan)家族成員，例如伊立替康、托泊替康、盧比替康。本文中所描述的DNA損傷劑可以是任何方 便的形式或制劑。例如，可以采用任意適合的異構(gòu)體、鹽、溶劑化 物、化學(xué)保護(hù)的形式、或特定DNA損傷劑的前藥。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，該DNA損傷劑是多柔比星((8S, 1 OS)-10-(4-氨基-5-羥基畫6畫曱基-四氫國2H-p比喃-2-基氧)-6,8,11 -三羥基 -8-(2-羥基乙?；?-1-曱氧基-7,8,9,10-四氫并四苯-5,12-二酮)。多柔 比星是一種蒽環(huán)類抗生素嵌入劑，其以商品名例如AdriamycinTM和 RubexTM廣泛應(yīng)用于癌癥的治療。
抑制有絲分裂紡4垂體組裝的抗癌化合物例如可以結(jié)合纟效管并 改變微管聚合或穩(wěn)定性，這會(huì)導(dǎo)致抑制細(xì)胞周期進(jìn)行并最終凋亡。 有絲分裂紡錘體組裝抑制劑的實(shí)例包括紫杉烷類，例如紫杉醇 (taxolTM : P-(苯酰氨基)-a-羥基-6,12b-雙(乙酰氧)-12-(苯酰 氧)-2^3,4，4^5，6,9,10，11，12,12^121>十二氫陽4,11-二羥基-4^8，13，13-四曱基-5-氧代-7,ll-亞曱基-lH-環(huán)十(3,4)苯(l，2-b)氧雜環(huán)丁 ( oxet) -9- 基 酯 ，
(2aR-(2a-a，4-p,4a-P,6-p，9國a(a-R承，p-S承),ll-a,12國a，12a-a,2b-a))國苯丙酮
酸)以及它們的類似物或f;于生物。
紫杉烷類是由連接于4個(gè)成員的環(huán)氧丙烷(oxetan，氧雜環(huán)丁 烷)環(huán)的15個(gè)成員的紫杉烷環(huán)體系構(gòu)成的復(fù)合酯類。優(yōu)選的紫杉 烷類是那些具有本領(lǐng)域已知構(gòu)成的要求增強(qiáng)微管形成的紫杉烷類， 例如紫杉醇和多西4也賽。紫杉醇和多西4也賽的結(jié)構(gòu)在C-10紫杉》克 環(huán)位置處和連接于C-13的酯側(cè)鏈處取代不同。多西他賽具有叔畫丁 氧基羰基，在C-13位置處代替了(2R,3S)-苯基異絲氨酸部分的氨基 上的苯曱?；?，以及羥基在C-10處代替了乙酰氧基。紫杉醇和多西 他賽的結(jié)構(gòu)是本領(lǐng)域中/>知的。分子的部分改變的紫杉醇;f汙生物，該紫杉醇分子包含-友6-12，在 C-7、 C-9和C-10處具有氧官能團(tuán)。許多這樣的衍生物都是本領(lǐng)域 已知的，并且已知這樣的衍生物表現(xiàn)出可比得上紫杉醇的生物活性 的生物學(xué)活性。例如，C-7羥基的?；饔茫蛴脷渲面鶌J它都不會(huì) 明顯減少紫杉醇的活性。此外，用氫置換10-乙酰氧基僅會(huì)造成較 少的活性下降。
已知C-9羰基被還原成a-OH會(huì)引起微管蛋白組裝活性稍微增 加。此外，已知在7位和8位與環(huán)丙烷環(huán)橋連所得的重排產(chǎn)物幾乎 具有與紫杉醇一樣的細(xì)胞毒性。還報(bào)道了 m-取代的苯曱?；苌?比其p-取代的類似物具有更強(qiáng)的活性，并且通常具有比紫杉醇本身 更強(qiáng)的活性。
本文中使用的另 一種適合的紫杉醇類似物是A-去曱-紫杉醇 (A-nor-paclitaxel )。這種類似物具有的微管蛋白組裝活性僅為紫杉 醇的三分之一。A-去甲-紫杉醇和紫杉醇具有非常類似的分子形狀， 這可以解釋它們具有類似的微管蛋白組裝活性。
其他適合的紫杉烷類是taxasm、 7-表紫杉醇、t-乙?；仙即肌?10-去乙?；?紫杉醇、10-去乙?；?7-表紫杉醇(或7-表-10-去乙酰 基紫杉醇)、7-木糖紫杉醇(7-xylosylpaclitaxel)、 10-去乙?；?7-戊 二?；仙即?、7-N,N-二曱基氨乙酰紫杉醇、7-L-丙氨?；仙即肌?以及它們的混合物。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，該抗癌化合物是紫杉醇。
本文所述使用的抗體-IL2結(jié)合物可以包含與特異性結(jié)合于細(xì) 月包粘合素-C的抗體相結(jié)合的白細(xì)月包介素2 (IL2 )。白細(xì)胞介素2 (IL2)是一種分泌的細(xì)胞因子，其與免疫調(diào)節(jié)以及T和B淋巴細(xì)胞的增殖有關(guān)。IL-2已經(jīng)表現(xiàn)出對(duì)腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性效應(yīng)，且FDA已經(jīng)批準(zhǔn)使用重組體人IL2 (阿地白介素ProleukinR)來治療遷移性腎癌和遷移性黑素瘤。SEQIDNO:ll中列出了人IL2的序列并且7>眾可/人基因凝:才居庫(sequence database )中以參考號(hào)NP—000577.2 GI: 28178861獲得。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗體-IL-2結(jié)合物的IL-2部分包含與在SEQ ID NO: 11中列出的成熟人IL2序列具有至少90%的序列同一'I"生，至少95%的序列同一性，或具有至少98%的序列同一性的序列。
序列同一'I"生通常是參照算法GAP來定義的(Wisconsin GCGpackage, Accelerys Inc, 圣;也亞哥，美國)。GAP禾'J用Needleman禾口Wunsch算法來比對(duì)兩個(gè)匹配數(shù)最多且空位數(shù)最少的完整序列。一般而言，使用默認(rèn)參數(shù)，空位產(chǎn)生罰分=12且空位延伸罰分=4。利用GAP是優(yōu)選的，^旦也可以z使用其他算法，例如BLAST (其利用Altschul等.(1990) / Mo/. Sz'o/. 215: 405- 410的方';去)、FASTA (其利用Pearson和Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448的方法)，
195-197 ),或Altschul等(1990 ) supra的TBLASTN程序，其通常采用默認(rèn)參數(shù)。尤其是，可以利用psi-Blast算法(Nucl. Acids Res.(1997) 25 3389-3402)。
在一些尤其優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗體-IL2結(jié)合物的IL2部分包含在SEQ ID NO: 11中列出的成熟人IL2的序列。
IL2部分可以在抗體或其多肽成分的上游(N-末端)或下游(C-末端)發(fā)生融合。IL2部分可以通過任何適合的共價(jià)方式或非共價(jià)方式而連接或附著于抗體-IL2結(jié)合物的抗體部分。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該抗體-IL2結(jié)合物可以是一種包含IL2和抗細(xì)月包粘合素C抗體或其多肽成分(例如抗體的重鏈或輕鏈或多鏈抗體片段，例如Fab)的融合蛋白。因此，例如，IL2部分可以融合于抗體的VH結(jié)構(gòu)i或或VL結(jié)構(gòu)域。通常，抗體或其成分，以及IL2部分經(jīng)由肽4妄頭而連接，該肽接頭例如是約5-25個(gè)殘基、例如10-20個(gè)殘基，優(yōu)選約15個(gè)殘基的肽。肽接頭的適合的實(shí)例是本領(lǐng)域中7>知的。在一些實(shí)施方式中，4妄頭可以具有如SEQIDNO: 12中所列出的氨基酸序列。通常，該才妾頭具有包含一個(gè)或多個(gè)前后重復(fù)的基因座(motif)的氨基酸序列。該基因座通常是五個(gè)殘基的序列，并優(yōu)選至少4個(gè)殘基是Gly或Ser。其中五個(gè)殘基中的四個(gè)是Gly或Ser，其他的殘基可以是Ala。更優(yōu)選五個(gè)殘基中的每一個(gè)都是Gly或Ser。優(yōu)選的基因座是GGGGS、 SSSSG、 GSGSA禾口 GGSGG。 4尤選:t也，i亥基因座在序列中是相鄰的，在重復(fù)之間沒有插入核苷酸。接頭序列可以包含l至5個(gè)，優(yōu)選3個(gè)或4個(gè)基因座的重復(fù)，或由1至5個(gè)，優(yōu)選3個(gè)或4個(gè)基因座的重復(fù)組成。例如，具有三個(gè)前后重復(fù)的4妻頭可以為以下氨基酸序列之一
GGGGSGGGGSGGGGS-SEQ ID NO: 13
SSSSGSSSSGSSSSG-SEQ ID NO: 14
GSGSAGSGSAGSGSA-SEQ ID NO: 15
GGSGGGGSGGGGSGG畫SEQ ID NO: 16。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗體-IL2結(jié)合物的抗體部分特異性結(jié)合于細(xì)胞粘合素-C大分子同種型。例如，相對(duì)于細(xì)胞粘合素-C小分子同種型而言，該抗體可以優(yōu)先結(jié)合于細(xì)月包粘合素-C大分子同種型。最優(yōu)選地，該抗體結(jié)合于細(xì)胞粘合素-C大分子同種型的Al結(jié)構(gòu)域。4尤選的抗體是腫瘤特異性的或相對(duì)于正常組織而言伊C先與腫瘤組織結(jié)合。例如，抗體可以優(yōu)先于正常組織而結(jié)合于腫瘤組織的基質(zhì)和/或新生血管和周圍血管結(jié)構(gòu)。
WO2006/050834中4皮露了抗體-IL2結(jié)合物中所使用的適合的4元體的實(shí)例。
在一些實(shí)施方式中，本文中所描述的抗體-IL2結(jié)合物的抗體部分與包含SEQ ID NO. 2的4A1-F16 VH結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO. 4的4A1-F16 VL結(jié)構(gòu)域的抗體竟?fàn)幮越Y(jié)合于細(xì)胞粘合素-C。
抗體之間的竟?fàn)幙梢砸子谠隗w外測(cè)定，例如，利用ELISA和/或通過對(duì)一種抗體標(biāo)記特異性的^艮告分子，該種抗體能夠在其^f也未經(jīng)標(biāo)記的( 一種或多種)抗體的存在下凈皮;險(xiǎn)測(cè)出，從而使得能夠鑒定結(jié)合于同一表位或重疊表位的抗體。
本文所述的抗體-IL2結(jié)合物中所利用的適合的抗體可以包含抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)，該抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)包含VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域，該VH結(jié)構(gòu)域包含SEQIDNO. 5的VH CDR1、 SEQ ID NO.6的VH CDR2以及SEQ ID NO. 7的VH CDR3;而VL結(jié)4勾i或包含SEQ ID NO. 8的VL CDRl 、 SEQ ID NO. 9的VL CDR2以及SEQ IDNO. 10的VLCDR3。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗體可以包含抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)，該抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)包含SEQ ID NO. 2的4A1-F16 VH結(jié)構(gòu)域以及SEQ ID NO. 4的4A1-F16 VL結(jié)構(gòu)域。
這些VH和VL結(jié)構(gòu)i或以及CDR的變體也可以在用于如本文所述的抗體-IL2結(jié)合物的抗體中采用。適合的變體可通過序列改變或突變或篩選方法的方式而^f尋到。用于本文所述的特定變體可以包4舌一種或多種氨基酉菱序列？文
變(氨基酸殘基的加入、缺失、置換和/或插入)，可以少于約20個(gè)的 文變，少于約15個(gè)的 文變，少于約10個(gè)的 文變或少于約5、 4、3、 2或1個(gè)改變。改變可以在一個(gè)或多個(gè)骨架區(qū)和/或一個(gè)或多個(gè)CDR中進(jìn)行。尤其是，改變可以在VH CDR1、 VH CDR2和/或VHCDR3,尤其是VH CDR3中進(jìn)4亍。
抗癌化合物、抗體-IL2結(jié)合物以及包含這些分子中的一者或二者的組合物優(yōu)選以足以對(duì)患者表現(xiàn)出益處的"治療有效量，，給藥。這樣的益處可以是至少改善至少一種癥狀。實(shí)際給予的量、給藥速率以及時(shí)程則根據(jù)所治療的性質(zhì)和嚴(yán)重程度來確定。治療的處方(例如確定的劑量等)在普通醫(yī)生和其他藥劑師的能力范圍內(nèi)。
準(zhǔn)確的劑量取決于幾個(gè)因素，待治療區(qū)域的尺寸和位置、抗體-IL2結(jié)合物的準(zhǔn)確性質(zhì)(例如完整抗體、片,殳或雙特異抗體)。對(duì)于系統(tǒng)應(yīng)用而言， 一種典型的抗體-IL2結(jié)合物劑量在0.5mg至100g的范圍內(nèi)，而乂于于局部應(yīng)用而言則為lOpg至lmg。通常，結(jié)合物的抗體部分是完整抗體，優(yōu)選IgGl或lgG4同種型。這是對(duì)于成年患者單獨(dú)治療的劑量，其對(duì)于兒童或幼兒可以成比例地調(diào)整，并且也可以才艮據(jù)分子量4安比例調(diào)整以用于其^f也的抗體形式(antibodyformats )?？拱┗衔锏倪m當(dāng)劑量和用藥方法是本領(lǐng)域中/>知的。
治療可以每天重復(fù)兩次，每周兩次，每周一次或每月一次，這是由醫(yī)生來判定的。
才艮據(jù)4壬4可適合的用藥方法，抗體-IL2結(jié)合物和抗癌4匕合物可以連續(xù)給藥或同時(shí)給藥。
抗體-IL2結(jié)合物和抗癌4匕合物通常會(huì)以藥物組合物的形式纟會(huì)予個(gè)體，該藥物纟且合物除了活〗生〗匕合物之外還包含至少 一種纟且分。適合的組分包括藥用賦形劑、載體、緩沖劑、穩(wěn)定劑或本領(lǐng)域 普通技術(shù)人員公知的其他物質(zhì)。這樣的物質(zhì)應(yīng)該是無毒的并且應(yīng)該 不干擾活性成分的效力。載體和其他物質(zhì)的準(zhǔn)確性質(zhì)取決于給藥途 ^圣，可以是口月良、或注射，例》口4爭(zhēng)月永注射。
抗體-IL2結(jié)合物和抗癌化合物可以單獨(dú)配制成藥物組合物，或 者在適當(dāng)?shù)那闆r下配制成同 一種藥物組合物。
本發(fā)明的其他方面提供了 一種用于治療癌癥的藥物組合物，該 藥物組合物包含抗癌化合物和抗體-IL2結(jié)合物，該抗體-IL2結(jié)合物 包含與特異性結(jié)合于細(xì)胞粘合素-C的抗體相結(jié)合的白細(xì)胞介素2 (IL2 )。
本發(fā)明的另 一 方面提供了 一種制造用于治療癌癥的藥物組合 物的方法，該方法包含配制抗癌化合物與纟元體-IL2結(jié)合物，該纟元體 -IL2結(jié)合物包含與特異性結(jié)合于細(xì)胞粘合素-C的抗體相結(jié)合的白 細(xì)月包介素2 (IL2 )。
用于口服給藥的藥物組合物可以是片劑、膠嚢劑、粉劑或液體 形式。片劑可以包含諸如明膠的固體載體或佐劑。液體藥物組合物 通常包含i者^口 K、石油(petroleum )、動(dòng)凈勿或才直凈勿、油、石廣沖勿油或合 成油之類的液體載體?？梢园ㄉ睇}水溶液、葡萄糖或其他糖類 溶液或二醇類，例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
對(duì)于靜脈注射，或在病痛位置處的注射，該活性成分為腸胃外 用的水溶液形式，其為無熱原的并且具有適合的pH、等滲性和穩(wěn) 定性。相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠例如利用等滲載體來制備適合的溶 液，該等滲載體例如是氯化鈉注射液、林才各氏注射液、乳酸林才各氏 注射液?？梢圆鹏迵?jù)需要包括防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、抗氧化劑和 /或其4也^力口劑。
15本發(fā)明的另 一 方面纟是供了 一種用于治療癌癥的治療用試劑盒，
其包含抗癌化合物和抗體-IL2結(jié)合物，該抗體-IL2結(jié)合物包含與特 異性結(jié)合于細(xì)胞粘合素-C的抗體相結(jié)合的白細(xì)胞介素2 (IL2 )。
試劑盒中的組分(即，抗癌化合物和抗體-IL2結(jié)合物)是無菌 的并且一皮密封在藥并瓦或其^f也容器中。試劑盒可以進(jìn)一步包含關(guān)于該 組分在本文所述的方法中應(yīng)用的i兌明。該試劑盒的組分可以^皮包含 或包裝在容器中，例如袋、盒、瓶、罐或罩板包裝(blisterpack )。
術(shù)語
在沐
其描述了天然的或部分或全部合成產(chǎn)生的免疫球蛋白。該術(shù)語
的任何多肽或蛋白?？贵w的實(shí)例是免疫球蛋白同種型和它們的同種 型亞類；包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的片^史，例如Fab、 scFv、 Fv、 dAb、 Fd;以及乂又特異4元體。
可以采用單克隆纟元體和其伸4元體并利用重纟且DNA纟支術(shù)來生產(chǎn)
以涉及將抗體的編碼免疫J求蛋白可變區(qū)、或互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的 DNA引入不同免疫球蛋白的恒定區(qū)，或恒定區(qū)加上骨架區(qū)。參見 例如，EP-A-184187、 GB 2188638A或EP-A-239400?？蒦f吏產(chǎn)生4元 體的雜交瘤或其4也細(xì)"包經(jīng)歷基因突變或其4也變4b，這會(huì)改變或不改 變所產(chǎn)生的抗體的結(jié)合特異性。
由于可以i午多種方式對(duì)抗體進(jìn)^^奮飾，因此術(shù)語"抗體"應(yīng)該 被理解為包含具有所需特異性的具有結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何特異性結(jié) 合成員或物質(zhì)。因此，該術(shù)語包含抗體片段、衍生物、功能等價(jià)物以及抗體的同源物，包括包含免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽， 不論其是天然存在的或全部或部分合成的。因此包括了包含免疫球 蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域或等價(jià)物的融合于其他多肽的嵌合體分子。
EP-A-0120694和EP-A-0125023中描述了嵌合抗體的克隆和表達(dá)。
完整抗體的片段已經(jīng)表現(xiàn)出能夠?qū)崿F(xiàn)結(jié)合抗原的功能。結(jié)合片 革史的實(shí)例是(i)由VL、 VH、 CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fab片段；(ii) 由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片,更；(iii)由單獨(dú)一種抗體的VL 和VH結(jié)構(gòu)i或組成的Fv片革殳；(iv)由VH結(jié)構(gòu)i或組成的dAb片,殳
(Ward, E.S.等，Nature 341， 544-546 (1989) ); (v)分離的CDR區(qū)；(vi) F(ab')2片段，其是一種包含兩個(gè)連接的Fab片段的二價(jià)體片段；(vii) 單鏈Fv分子(scFv )，其中VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域通過肽接頭連 接，其使得兩個(gè)結(jié)構(gòu)域相聯(lián)合以形成抗原結(jié)合位點(diǎn)(Bird等，Science, 242, 423-426, 1988; Huston等，PNAS USA， 85， 5879-5883， 1988 ); (viii)雙特異單鏈Fv 二聚體(PCT/US92/09965 );以及(ix)"雙特異 抗體"，由基因融合構(gòu)造的多4介或多特異片段(WO94/13804; P. Holliger等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993 )?？梢酝?過連4妄VH和VL結(jié)構(gòu)域的二石危橋的相連而使Fv、 scFv或雙特異抗 體分子穩(wěn)、定4匕(Y. Reiter等，Nature Biotech 14 1239-1245 1996)。 也可以制造包含連4妻于CH3結(jié)構(gòu)i或的scFv的農(nóng)t小抗體(minibody )
(S. Hu et al， Cancer Res. 56 3055-3061 1996 )。
雙特異抗體是多肽的多聚體，每一個(gè)多肽都包含第一結(jié)構(gòu)域和 第二結(jié)構(gòu)域，其中第一結(jié)構(gòu)域包含免疫球蛋白輕鏈的結(jié)合區(qū)，第二
結(jié)構(gòu)i或包含免疫5求蛋白重《連的結(jié)合區(qū)，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)i或是相連的(例
如，通過肽接頭)，但不能彼此聯(lián)合以形成抗原結(jié)合位點(diǎn)抗原結(jié) 合位點(diǎn)是通過多聚體中的一種多肽的第 一結(jié)構(gòu)域與該多聚體中的 另 一種多肽的第二結(jié)構(gòu)域的聯(lián)合而形成的(WO94/13804 )?？筤潛合潛溝試
其描述了包含特異性結(jié)合于部分或全部抗原或與部分或全部 抗原互補(bǔ)的區(qū)域的抗體部分。其中，抗原是大分子的，抗體可以Y又 結(jié)合于該抗原的特定部4立，該部4立稱為表4立?？乖Y(jié)合結(jié)構(gòu)域可以
由一個(gè)或多個(gè)抗體可變結(jié)構(gòu)域來才是供(例如，由VH結(jié)構(gòu);或組成的 所謂Fd抗體片段)。優(yōu)選地，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含抗體輕鏈可變區(qū) (VL)和4元體重4連可變區(qū)(VH)。
使用該術(shù)語是指特異性結(jié)合對(duì)中的一個(gè)成員不會(huì)表現(xiàn)出任何 明顯的結(jié)合于除了(一個(gè)或多個(gè))其特異性結(jié)合伴侶之外的分子的 情形。例如，特異于細(xì)胞粘合素-C的抗體不結(jié)合于或幾乎不結(jié)合于 細(xì)胞外基質(zhì)的其他組分，例如纖連蛋白。類似地，特異于細(xì)胞粘合 素-C大分子同種型的抗體不結(jié)合于或幾乎不結(jié)合于細(xì)胞粘合素-C ,J、分子同種型。該術(shù)語也適用于例如抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異于多個(gè)抗 原所具有的特定表位的情況，在這種情況下，該具有抗原結(jié)合結(jié)構(gòu) 域的特異性結(jié)合成員將能夠結(jié)合于具有該表位的各種抗原。
逸舍
該術(shù)語通常以包括的含義使用，即，允許存在一個(gè)或多個(gè)特征 或一種或多種組分。
"基本上如所列出"的意思是本發(fā)明的相關(guān)CDR或VH或VL 結(jié)構(gòu)域與本文所列出的序列的特定區(qū)域完全相同或高度相似。"高 度相似，，是指可以在CDR和/或VH或VL結(jié)構(gòu)域中具有1至5,優(yōu) 選1至4，例》口 1至3或1或2，或3或4個(gè)置4奐。具有本發(fā)明的CDR的結(jié)構(gòu)通常是4元體重《連或輕4連序列或它們 的實(shí)質(zhì)部分，其中該CDR位于與重排免疫球蛋白基因編碼的天然 存在VH和VL抗體可變區(qū)的CDR相應(yīng)的位置。免疫球蛋白可變區(qū) 和CDR的結(jié)構(gòu)和位置可以通過參考來確定(Kabat, E.A.等， Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Edition, US Departmentof Health and Human Services, 1987，及其更*斤，i見在可 乂人互聯(lián)網(wǎng)獲4尋(http:〃immuno.bme.nwu.edu ))。
通過閱讀本發(fā)明4皮露的內(nèi)容，本發(fā)明的各種其他的方面和實(shí)施 方式對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。本說明書中提及的全 部文件和凄t才居庫實(shí)體都以其全部?jī)?nèi)容結(jié)合于本文作為參考。
本文中所使用的"和/或"是指具體披露兩個(gè)具體特征或組成部 分中的任意一個(gè)和另一個(gè)或未具體4皮露另一個(gè)。例如，^又僅當(dāng)其中 的每一種情況都在本文中單獨(dú)一坡露時(shí)，"A和/或B"是指具體披露了 (i) A、 ( ii) B以及(iii) A和B這三種情況中的每一種。
除非文中另有指示，否則上述特4正的i兌明和定義均不限于本發(fā) 明的特定方面和實(shí)施方式，并且采用與所述的所有方面和實(shí)施方式 相同的含義。
附圖i兌明
現(xiàn)在將以舉例的方式并參考以上的附圖和以下的表4各來i兌明 本發(fā)明的某些方面和實(shí)施方式。


圖1至圖4示出了在預(yù)注射多柔比星后主合藥的標(biāo)記的F16-IL2 的生物分布。
圖5示出了多柔比星、F16-IL2和重組IL2對(duì)植入^果鼠體內(nèi)的 MDA-MB231人吝'L癌月中瘤的4乍用。圖6示出了紫杉醇(taxolTM)和F16-IL2對(duì)植入棵鼠體內(nèi)的 MDA-MB231人乳癌腫瘤的作用。
圖7示出了小分子(A)和大分子(B)細(xì)胞粘合素-C的示意 圖。4吏幾種III型纖連蛋白樣結(jié)構(gòu)域經(jīng)受可變剪切，以佳J尋其分子 中包括(B)或省去(A)。氨基酸序列和細(xì)胞粘合素-C的編碼核苷 酸序列是公眾可得到的，它們的數(shù)據(jù)庫參考號(hào)分別為NP_002151.1 GI:4504549和NM一002160.1 GI:4504548。
具體實(shí)施例方式
實(shí)驗(yàn)
^:參為、布
通過生物分布分析來評(píng)價(jià)體內(nèi)靶向性能。通過在10至12周齡 的Balb/c雌性4果鼠體內(nèi)皮下注射107個(gè)MDA-MB-231人乳癌細(xì)月包來 獲《尋荷瘤小鼠(Charles River Labor atories )。當(dāng)可明顯觸及腫瘤時(shí) 將小鼠分組(n^ 5 )并在生物分布8天、24h或2h之前，在側(cè)向 尾靜脈通過靜脈注射10 mg/kg的多柔比星。對(duì)照組不給予多柔比 星。將經(jīng)純化的F16-IL2進(jìn)行放射性碘化并注射到所有小鼠的側(cè)向 尾靜脈中。在注射后24小時(shí)處死小鼠(12.5(ag, 3.3pCi/小鼠)。對(duì) 器官進(jìn)行稱重并用Packard Cobra伽瑪計(jì)數(shù)器讀出其放射性。代表 性器官的》丈射性含量被表示為每克組織注射劑量的百分比 (%ID/g )。
這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，多柔比星劑量的預(yù)注入不會(huì)削弱免疫細(xì) 月包因子的腫瘤革巴向作用(圖1至圖4)。治^f
通過在10至12周齡的Balb/c雌性凈果鼠體內(nèi)皮下注射2><107個(gè) MDA-MB-231人乳癌細(xì)胞來獲得荷瘤小鼠(Charles River Labor atories)。在腫瘤細(xì)胞植入9天后，當(dāng)可明顯觸及腫瘤時(shí)將小鼠分組
(n = 5)并在側(cè)向尾4爭(zhēng)脈通過靜脈注射鹽水，20 jiigF16-IL2 (相應(yīng) 于6.6 pg IL2 )、 6.6 |ug重纟且IL2 ( Proleukin )、以及最大體禾口、為250 iul的4 mg/kg或1 mg/kg多柔比星。每天監(jiān)測(cè)小鼠并且每周用測(cè)徑 器測(cè)量三次腫瘤生長(zhǎng)，利用以下/>式計(jì)算體積體積二長(zhǎng)度x寬度 2x0.5。當(dāng)腫瘤達(dá)到體積> 2000 mm3或當(dāng)腫瘤壞死時(shí)，才艮才居瑞士法4聿
(Swiss regulations) 并依據(jù)由 Veterinaramt des Kantons Ziirich (198/2005)頒發(fā)的項(xiàng)目許可證將動(dòng)物處死。腫瘤的尺寸由平均值士 SE表示。
在才直入到凈果鼠體內(nèi)的MDA-MB231人乳癌才莫型中7見察到 F16-IL2與多柔比星的協(xié)同作用(圖5)。還觀察到較高劑量的多柔 比星比低劑量更加有效。
向以同樣方式產(chǎn)生的荷瘤小鼠的側(cè)向尾靜脈通過靜脈注射鹽 7K, 20 pg F16-IL2 (牙目應(yīng)于6.6 pg IL2 )、以及最大體積、為250 pl的 1 mg/kg或5 mg/kg taxolTM。如上文所述監(jiān)控小鼠并測(cè)量胂瘤的生 長(zhǎng)。
在才直入凈果鼠中的MDA-MB231人乳癌才莫型中^見察到了 F16-IL2 與taxolTM之間的協(xié)同作用(圖6)。序列
SEQ ID NO: 1. 4A1 -F16 VH結(jié)構(gòu)域核苦酸序歹'J
GAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT AGC CGG TAT GGT GCG AGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTC TCA GCT ATT AGT GGT AGT GGT GGT AGC ACA TAC TAC GCA GAC TCC GTG AAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCC GTA TAT TAC TGT GCG AAA GCG CAT AAT GCT TTT GAC TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTG TCG AGA
SEQ ID NO: 2 4A1 -F16 VH結(jié)構(gòu)域氨基酸序列
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYGASWVRQA PGKGLEWVSA ISGSGGSTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKAH NAFDYWGQGT
LVTVSREVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS
RYGASWVRQA PGKGLEWVSA ISGSGGSTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKAH NAFDYWGQGT LVTVSR
SEQ ID NO: 3 4A1 -F16 VL結(jié)構(gòu)i或核苦酸序歹。
TCG TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAG ACA GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA AGC TAT TAT GCA AGC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC ATC TAT GGT AAA AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT GGC TCC AGC TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG GCG GAA GAT GAG GCT GAC TAT TACTGT AAC TCC TCT GTT TAT ACT ATG CCG CCC GTG GTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGC
SEQ ID NO: 4 4A1 -F16 VL結(jié)構(gòu)域氨基酸序列
SSELTQDPAV SVALGQTVRI TCQGDSLRSY YASWYQQKPG QAPVLVIYGK NNRPSGIPDR FSGSSSGNTA SLTITGAQAE DEADYYCNSS VYTMPPVVFG GGTKLTVLG
SEQ ID NO: 5 4A1-F16 VH CDRl氨基酸序列 RYGAS
SEQ ID NO: 6 4A1畫F 16 VH CDR2氨基酸序列 AISGSGGSTYYADSVKG
SEQ ID NO: 7 4A1 -F16 VH CDR3氨基酸序列 AHNAFDY
SEQ ID NO: 8 4A1-F16 VL CDRl氨基酸序列 QGDSLRSYYAS
SEQ ID NO: 9 4A1國F 16 VL CDR2氨基酸序歹'j GKNNRPS
SEQ ID NO: 10 4A1隱F 16 VL CDR3氨基酸序歹'j NSSVYTMPPVV
SEQ ID NO: 11 hlL2前體序歹'J (成熟hlL2:殘基7-150 )
MY腹QLLSCI ALSLALVTNS APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGI麗 YKNPKLT腹L TFKFYMPKKA TELKHLQCLEEELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT
SEQIDNO: 12肽才妄頭氨基酸序歹1！ GGGGSGGGGSGGGG
SEQ ID NO: 13 肽4妄頭氨基酸序列 GGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO: 14 肽4妄頭氨基酸序歹'J SSSSGSSSSGSSSSG
SEQ ID NO: 15 肽4妻頭氨基酸序列 GSGSAGSGSAGSGSA
SEQ ID NO: 16 肽4妻頭氨基酸序歹'J GGSGGGGSGGGGSGG 。
2權(quán)利要求
1.一種治療癌癥的方法，包含對(duì)有需要的個(gè)體給予抗癌化合物和抗體-白細(xì)胞介素2(IL2)結(jié)合物，其中所述抗體-IL2結(jié)合物包含與特異性結(jié)合于細(xì)胞粘合素-C的抗體相結(jié)合的IL2。
2. 才艮據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述抗體特異性結(jié)合于所 述細(xì)胞粘合素-C大分子同種型。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述抗體特異性結(jié)合于所 述細(xì)月包粘合素-C大分子同種型的Al結(jié)構(gòu)i或。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述抗體與包含SEQ ID NO. 2的4A1-F16 VH結(jié)構(gòu)i或和SEQ ID NO. 4的4A1-F16 VL結(jié)構(gòu)域的抗體竟?fàn)幗Y(jié)合于細(xì)胞粘合素-C大分子同種型。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述抗體包含具有VH結(jié) 構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)i或的4元體纟元原結(jié)合4立點(diǎn)，所述VH結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO. 5的VH CDR1 、 SEQ ID NO. 6的VH CDR2和SEQ ID NO. 7的VH CDR3;以及所述VL結(jié)構(gòu)i或包含SEQ ID NO. 8的VL CDR1 、 SEQ ID NO. 9的VL CDR2和SEQ ID NO. 10的VL CDR3。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述抗體包含抗體抗原結(jié) 合^f立點(diǎn)，所述抗體抗原結(jié)合^f立點(diǎn)包含SEQ ID NO. 2的4A1-F16 VH結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO. 4的4A1-F16 VL結(jié)構(gòu)域。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述抗癌化 合物是DNA損傷劑。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述抗癌化合物是多柔比 星。
9. 才艮據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述抗癌化 合物是有絲分裂紡錘體組裝抑制劑。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述抗癌化合物是紫杉醇。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述癌癥 是乳癌。
12. 抗癌化合物在制造用于治療癌癥的方法中4吏用的藥物中的應(yīng) 用，所述方法包含與抗體-IL2結(jié)合物聯(lián)合纟會(huì)予所述抗癌化合 物，所述抗體-IL2結(jié)合物包含與特異性結(jié)合于細(xì)胞粘合素-C 的4元體相結(jié)合的白細(xì)胞介素2 (IL2 )。
13. 包含與特異性結(jié)合于細(xì)胞粘合素-C的抗體相結(jié)合的白細(xì)胞介 素2 (IL2)的抗體-IL2結(jié)合物在制造用于治療癌癥的方法中 使用的藥物的應(yīng)用，所述方法包含與所述抗癌化合物聯(lián)合給予 所述寺元體-IL2結(jié)合物。
14. 才艮據(jù)4又利要求12或4又利要求13所述的應(yīng)用，其中，所述抗體 特異性結(jié)合于所述細(xì)胞粘合素-C大分子同種型。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的應(yīng)用，其中，所述抗體特異性結(jié)合于 所述細(xì)胞粘合素-C大分子同種型的Al結(jié)構(gòu)域。
16. 才艮據(jù)氺又利要求15所述的應(yīng)用，其中，所述抗體與包含SEQ ID NO. 2的4A1-F16 VH結(jié)構(gòu)i或和SEQ ID NO. 4的4A1-F16 VL結(jié)構(gòu)域的抗體竟?fàn)幗Y(jié)合于細(xì)胞粘合素-C大分子同種型。
17. 才艮據(jù)沐又利要求16所述的應(yīng)用，其中，所述抗體包含具有VH 結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)3或的抗體#元原結(jié)合<立點(diǎn)，所述VH結(jié)構(gòu)J或包含SEQ ID NO. 5的VH CDR1 、 SEQ ID NO. 6的VH CDR2和SEQ ID NO. 7的VH CDR3;以及所述VL結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO. 8的VL CDR1 、 SEQ ID NO. 9的VL CDR2和SEQ ID NO. 10的VL CDR3。
18. 才艮據(jù)4又利要求17所述的應(yīng)用，其中，所述抗體包含抗體抗原 結(jié)合位點(diǎn)，所述抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)包含SEQ ID NO. 2的 4A1-F16 VH結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO. 4的4A1-F16 VL結(jié)構(gòu)i或。
19. 根據(jù)權(quán)利要求12至18中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述抗癌 化合物是DNA損傷劑。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的應(yīng)用，其中，所述抗癌化合物是多柔 比星。
21. 根據(jù)權(quán)利要求12至18中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述抗癌 化合物是有絲分裂紡錘體組裝抑制劑。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的應(yīng)用，其中，所述抗癌化合物是紫杉醇。
23. 根據(jù)權(quán)利要求12至22中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述癌癥 是乳癌。
24. —種用于治療癌癥的試劑盒，包含抗癌化合物和抗體-IL2結(jié)合 物，所述抗體-IL2結(jié)合物包含與特異性結(jié)合于細(xì)胞粘合素-C 的抗體相結(jié)合的白細(xì)胞介素2 (IL2 )。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用抗癌劑與靶向于細(xì)胞粘合素-C的抗體-免疫球蛋白2(IL-2)結(jié)合物聯(lián)合用來治療癌癥，該抗癌劑例如是多柔比星或紫杉醇。
文檔編號(hào)A61K47/48GK101687049SQ200880021930
公開日2010年3月31日 申請(qǐng)日期2008年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月28日
發(fā)明者伊夫林·特拉赫塞爾, 曼努埃拉·卡斯帕, 杰茜卡·馬林德, 達(dá)里奧·內(nèi)里 申請(qǐng)人:菲洛根股份公司