專利名稱：：介導(dǎo)癌細(xì)胞細(xì)胞毒性的嵌合和人源化抗cd44抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及診斷和治療癌性疾病，具體地，涉及介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞細(xì)胞毒性；和更具體地，涉及減輕癌性疾病的抗體(CDMAB)，任選與一種或多種CDMAB/化療劑組合作為用于起始細(xì)胞毒性響應(yīng)的工具的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及利用本發(fā)明CDMAB的結(jié)合測定。
背景技術(shù)：
：癌癥中的CD44:針對人白細(xì)胞生成單克隆抗體導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)CD44抗原；一種在廣泛多樣的正常組織上和全部類型的造血細(xì)胞上表達(dá)的單鏈透明質(zhì)酸(HA)結(jié)合糖蛋白。其最初與淋巴細(xì)胞活化和歸巢有關(guān)。當(dāng)前，其推定的生理學(xué)作用還包括活化炎性基因、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)分化和發(fā)育、誘導(dǎo)細(xì)胞骨架重構(gòu)和細(xì)胞遷移和細(xì)胞針對凋亡的存活/抗性。在人類中，CD44的單基因拷貝位于染色體11的短臂，11pl3上。該基因含有19個外顯子；最開始的5個是恒定的，之后的9個是變化的，再之后的3個是恒定的且最后2個是變化的。分化剪接可以導(dǎo)致超過1000種不同的同種型。然而，目前僅確定了數(shù)打天然存在的變體。CD44標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白由N-末端胞外(包括20個a.a.引導(dǎo)序列，和膜近側(cè)區(qū)(85a.a.))結(jié)構(gòu)i或(270a,a.)，跨膜區(qū)(21a.a.)和細(xì)胞質(zhì)尾部(72a.a.)組成。胞外區(qū)還包含位于N-末端的連接構(gòu)件。該區(qū)長度為92a.a.，并顯示出與其他HA結(jié)合連接蛋白的同源性。在CD44的小鼠和人形式之間存在高度的同源性。該蛋白的變體形式插入到外顯子5的羧基末端并在表達(dá)時位于細(xì)胞外。CD44的血清可溶性形式也天然存在并可以由終止密碼子(可變區(qū)內(nèi))或由蛋白水解活性產(chǎn)生。來自多種剌激包括TNF-a的細(xì)胞活化導(dǎo)致CD44受體的釋放。對于腫瘤細(xì)胞也觀察到該受體的釋放，并且其可以導(dǎo)致人血清CD44濃度增高高達(dá)10倍。高CD44血清濃度提示惡性腫瘤(卵巢癌是例外)。CD44的標(biāo)準(zhǔn)形式以約37kD的分子量存在。翻譯后修飾使分子量增加到80-90kD。這些修飾包括位于天冬酰胺殘基處的氨基末端胞外結(jié)構(gòu)域N-連接的糖基化，位于胞外結(jié)構(gòu)域的羧基末端的絲氨酸/蘇氨酸處的O-連接的糖基化和粘多糖添加。剪接變體可以在80-250kD的尺寸范圍內(nèi)變化。HA，位于哺乳動物中的胞外基質(zhì)(ECM)上的多糖，被認(rèn)為是主要的CD44配體。然而，還發(fā)現(xiàn)CD44結(jié)合這樣的蛋白，如膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白等。HA結(jié)合和糖基化之間似乎存在相關(guān)性。失活的CD44(不結(jié)合HA)具有最高水平的糖基化，活性CD44(結(jié)合HA)具有最低的，而可誘導(dǎo)的CD44(不或很弱地結(jié)合HA，除非受到細(xì)胞因子、單克隆抗體、生長因子等的活化)具有活性和失活形式之間某處的糖基化水平。CD44可以通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)它的一些功能，這取決于細(xì)胞、刺激和環(huán)境的相互作用。這些途徑中的一些包括NFKB信號傳導(dǎo)級聯(lián)(參與炎性反應(yīng))、Ras-MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(涉及活性細(xì)胞周期和增殖)、蛋白質(zhì)Rho家族(涉及細(xì)胞骨架重構(gòu)和細(xì)胞遷移)和PI3-K-相關(guān)信號傳導(dǎo)途徑(涉及細(xì)胞存活)。全部上述功能與腫瘤疾病的開始和進(jìn)展密切相關(guān)。CD44還涉及在癌癥中通過多種另外的機制起作用。這些包括通過CD44細(xì)胞表面上存在的細(xì)胞表面蛋白聚糖對參與惡性腫瘤的受體呈遞生長因子、趨化因子和細(xì)胞因子。而且，在CD44-HA復(fù)合物內(nèi)在化后由溶酶體透明質(zhì)酸酶引起的HA胞內(nèi)降解可以通過ECM潛在地增加腫瘤侵入和誘導(dǎo)血管發(fā)生的可能性。另外，顯示出存活或凋亡信號的傳輸通過標(biāo)準(zhǔn)或可變CD44受體發(fā)生。還提示CD44參與細(xì)胞分化和遷移。這些機制中的許多，如果不是全部，是環(huán)境和細(xì)胞依賴性的，且若干引起可變的結(jié)果。因此，在可以得出任何結(jié)論之前需要更多的研究。為了驗證CD44在癌癥中的潛在功能作用，采取CD44的表達(dá)研究以確定該受體的分化表達(dá)是否與疾病進(jìn)展相關(guān)。然而，在大部分腫瘤類型中觀察到不一致的結(jié)果，且這可能歸因于研究者之間的試劑、技術(shù)、病理學(xué)評分和細(xì)胞類型差異的組合。腎細(xì)胞癌和非霍奇金淋巴瘤似乎是另外，其中具有高CD44表達(dá)腫瘤的患者一致地具有比他們的低或非CD44表達(dá)的負(fù)體更短的存活時間。由于其與癌癥的聯(lián)系，CD44己經(jīng)是抗癌治療發(fā)展的耙標(biāo)。仍然存在一些爭論，如關(guān)于腫瘤進(jìn)展需要CD44的標(biāo)準(zhǔn)形式還是變體形式。存在支持這兩種觀點的體內(nèi)動物數(shù)據(jù)，并且同樣地其可以是腫瘤類型和甚至細(xì)胞類型依賴性的。不同的治療方法已經(jīng)包括注射可溶性CD44蛋白，乙酰透明質(zhì)酸合成酶cDNA,透明質(zhì)酸酶，使用CD44反義和CD44特異性抗體。每種方法引起了一定程度的成功，從而為抗CD44癌癥治療提供支持。已經(jīng)實驗室生成了變體和標(biāo)準(zhǔn)CD44特異性單克隆抗體，但是在很大程度上，這些抗體不具有固有的生物活性，相反地，它們特異性結(jié)合它們識別的CD44類型。然而，這些是在體外或體內(nèi)但通常不在兩處具有活性的一些。若干抗CD44抗體顯示出介導(dǎo)細(xì)胞事件。例如，鼠抗體A3D8，針對人紅細(xì)胞盧氏抗原CD44標(biāo)準(zhǔn)形式，顯示出增強CD2(9-1)抗體和CD3(OKT3抗體)介導(dǎo)的T細(xì)胞活化；另一種抗CD44抗體具有類似的作用。A3D8還誘導(dǎo)IL-1從單核細(xì)胞中釋放和IL-2由T淋巴細(xì)胞中釋放。有趣地，與藥物諸如柔紅霉素，米托蒽醌和依托泊苷聯(lián)合使用A3D8通過消除第二信使神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生抑制HL60和NB4AML細(xì)胞中的凋亡誘導(dǎo)。J173抗體，其不具有固有活性且針對CD44的類似表位，不抑制藥物誘導(dǎo)的凋亡。而且，A3D8和另一種抗CD44單克隆抗體H90，以及乙酰透明質(zhì)酸，誘導(dǎo)來自急性骨髓型白血病(AML)患者的白血病胚細(xì)胞的分化。然而，在相同的研究中，也結(jié)合CD44標(biāo)準(zhǔn)形式的J173抗體不誘導(dǎo)相同細(xì)胞的分化。有趣地，H90不結(jié)合來自其AML細(xì)胞與J173結(jié)合的患者子集的AML細(xì)胞，這說明這些抗體識別不同的表位。在一項獨立的研究中，A3D8和H90均誘導(dǎo)若干AML-來源的細(xì)胞系的末期分化。NIH44-1抗體，其針對CD44的85-110kD和200kD形式，通過作者推測為交聯(lián)或聚集CD44的途徑，增加T細(xì)胞增殖?？傊?，不存在這樣的證據(jù)，即抗體諸如這些適合于用作癌癥治療法，因為它們不針對癌癥(例如，活性淋巴細(xì)胞)，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，或當(dāng)與細(xì)胞毒性試劑一起使用時抑制藥物誘導(dǎo)的癌細(xì)胞死亡。己經(jīng)描述了若干抗CD44抗體，這證明了體內(nèi)抗腫瘤作用?？贵wH90是通過用人紅細(xì)胞(RBCs)免疫小鼠產(chǎn)生的鼠單克隆抗體，且其據(jù)報告結(jié)合13CD44的所有同種型。對用輻射處理的已接種人AML細(xì)胞的NOD-SCID小鼠施用該抗體，三次/周，4周，通過這些細(xì)胞阻斷種群恢復(fù)。另外，在由經(jīng)歷了使用H90抗體處理的動物中獲得細(xì)胞時，來自這些動物的AML細(xì)胞的連續(xù)傳代未能在接受者小鼠中種群恢復(fù)。該抗體的作用似乎是通過干擾白血病干細(xì)胞的分化和AML細(xì)胞與適當(dāng)生態(tài)位之間的相互作用來介導(dǎo)的。另外，受輻射的具有人臍帶血干細(xì)胞的NOD-SCID小鼠的種群恢復(fù)不受該處理的損傷，這說明了該抗體的選擇性作用和還有AML和正常人造血干細(xì)胞之間的重要表現(xiàn)型差異?？贵w1.1ASML，即針對CD44的v6變體的小鼠IgGl，顯示出減少大鼠胰腺腺癌BSp73ASML的淋巴結(jié)和肺轉(zhuǎn)移。受處理的動物的存活隨之增多?？贵w只有在淋巴結(jié)建群之前施用時才有效，且假定其干擾淋巴結(jié)中的細(xì)胞增殖。體外不存在該抗體對腫瘤細(xì)胞直接細(xì)胞毒性，且該抗體不增強補體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，或免疫效應(yīng)子細(xì)胞功能。沒有描述該抗體對人細(xì)胞的效用。Breyer等描述了可商購的抗CD44抗體中斷同位移植大鼠成膠質(zhì)細(xì)胞瘤進(jìn)展的應(yīng)用。大鼠成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系C6植入到額葉中，并在1周后，通過大腦內(nèi)注射給予大鼠3次該抗體的處理。受處理的大鼠證明了減少腫瘤生長，和比緩沖液或同種型對照處理的大鼠更高的體重。該抗體能夠抑制細(xì)胞在體外與用胞外基質(zhì)成分覆蓋的蓋玻片粘連，但是不具有針對細(xì)胞的任何直接細(xì)胞毒性作用。該抗體沒有針對人細(xì)胞進(jìn)行測試。進(jìn)行了這樣的研究，其比較了抗CD44抗體(IM-7.8.1)和抗CD44vl0抗體(K926)的功效。將高度轉(zhuǎn)移的鼠黑素瘤品系B16F10，其表達(dá)這兩種CD44同種型，靜脈內(nèi)植入小鼠。2天后，在研究的期間內(nèi)給藥抗體，每3天一次。這兩種抗體均導(dǎo)致肺轉(zhuǎn)移數(shù)量大于50%的顯著減少；這兩種抗體之間不存在功效的顯著差別。該抗體不影響體外增殖，且作者即Zawadzki等推測腫瘤生長的抑制歸因于抗體阻斷CD44與其配體的相互作用。在另一項使用IM-7.8.1的研究中，Zahalka等證明了該抗體及其F(ab，)2片段能通過鼠T細(xì)胞淋巴瘤LB阻斷浸潤淋巴結(jié)。這賦予小鼠顯著的存活益處。Wallach-Dayan等顯示用CD44v4-v10轉(zhuǎn)染不自發(fā)形成腫瘤的LB-TR鼠淋巴瘤賦予形成腫瘤的能力。與同種型對照抗體相比，IM-7.8.1的施用減少植入的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的腫瘤尺寸。這些研究中沒有一個證明了關(guān)于該抗體的人類效用。GKW.A3，即小鼠IgG2a，特異于人CD44并阻止人黑素瘤異種移植物在SCID小鼠中的形成和轉(zhuǎn)移。將該抗體與轉(zhuǎn)移人細(xì)胞系SMMU-2混合，并然后進(jìn)行皮下注射。處理持續(xù)隨后3周。4周后，與未處理的動物的100%相比，僅1/10小鼠在注射位點發(fā)育腫瘤。該抗體的F(ab，)2片段證明了相同的腫瘤形成抑制，這提示該作用機制不依賴于補體或抗體依賴性細(xì)胞毒性。如果腫瘤細(xì)胞在第一次抗體注射前一周注射，則80%的動物在原發(fā)位點發(fā)育腫瘤。然而，注意到，存活時間仍然顯著延長。盡管延遲的抗體施用對原發(fā)腫瘤形成沒有作用，但是其完全阻止在未處理動物中存在的向肺、腎、腎上腺、肝和腹膜的轉(zhuǎn)移。該抗體既不具有在體外針對該細(xì)胞系的任何直接細(xì)胞毒性，也不干擾SMMU-2細(xì)胞的增殖，且似乎具有通過影響轉(zhuǎn)移或生長具有其影響腫瘤形成的主要作用。該抗體的一個值得注意的特性是其識別CD44的所有同種型，這提示用于治療應(yīng)用的有限可能性。Strobd等描述小鼠異種移植模型中抗CD44抗體(克隆515)抑制人卵巢癌細(xì)胞腹膜植入的應(yīng)用。將人卵巢細(xì)胞系36M2在存在抗CD44抗體或?qū)φ湛贵w的條件下腹膜內(nèi)植入小鼠中，并且然后在隨后的20天內(nèi)施用處理。5周后，在該抗體處理的組中在腹膜腔中存在顯著更少的結(jié)節(jié)。來自這兩種抗CD44和對照處理的組的結(jié)節(jié)尺寸相同，這提示細(xì)胞一旦植入，則抗體對腫瘤生長沒有作用。當(dāng)皮下植入細(xì)胞時，也不存在對腫瘤生長的作用，這說明抗體本身不具有抗增殖或細(xì)胞毒性作用。另外，該抗體對體外細(xì)胞生長沒有作用。VFF-18，也稱為BIWA1，是針對CD44的v6變體的高親和性抗體，其特異于該多肽的360-370區(qū)。該抗體在12名患者的第一階段臨床實驗中已經(jīng)被用作"m锝標(biāo)記的綴合物。測試了該抗體在患有頭和頸的鱗狀細(xì)胞癌的患者中的安全性和靶向潛力。注射后40小時，14%的注射劑量被腫瘤吸收，在其他器官包括腎、脾和骨髓中具有最少的累積。高度選擇性腫瘤結(jié)合提示該抗體在放射免疫療法中的功能，盡管該抗體的異常高親和性阻止?jié)B透進(jìn)入腫瘤的較深層。應(yīng)用BIWA1的其他局限是鼠抗體的免疫原性(12名患者中的11名形成人抗小鼠抗體(HAMA))，遍及腫瘤的異源累積和抗體-可溶性CD44復(fù)合物的形式。WO02/094879公開了設(shè)計用于克服HAMA反應(yīng)的VFF-18的人源化形式，稱為BIWA4。發(fā)現(xiàn)BIWA4具有比母體VFF18抗體顯著更低的抗原結(jié)合親和性。令人驚訝地，較低親和性BIWA4抗體具有比較高親和性BIWA8人源化VFF-18抗體更好的腫瘤吸收特征。"m锝標(biāo)記的和186錸標(biāo)記的BIWA4抗體均在33名患者的第一階段臨床實驗中評估，以確定186Re標(biāo)記的BIWA4的情形中的安全性、耐受能力、腫瘤累積和最大耐受劑量。似乎存在99mTc標(biāo)記的BIWA4腫瘤相關(guān)吸收。關(guān)于所有劑量186Re標(biāo)記的BIWA4沒有觀察到腫瘤反應(yīng)，盡管一些具有穩(wěn)定的疾??；劑量限制性毒性出現(xiàn)在60mCi/m2。存在50-65%的有害事件率；認(rèn)為33名患者中的12名貝有嚴(yán)重的有害事件(血小板減少癥、白血球減少癥和發(fā)燒)且其中6名均受到186Re標(biāo)記的BIWA4處理的患者在處理過程中或后續(xù)由于疾病進(jìn)展而死亡。2名患者形成人抗人抗體(HAHA)。在20名患者中進(jìn)行186Re標(biāo)記的BIWA4的第一階段劑量逐步增加實驗。觀察到口腔粘膜炎和劑量限制性血小板減少癥和白血球減少癥；一名患者形成HAHA反應(yīng)。在以最高劑量60mCi/n^處理的5名患者中觀察到穩(wěn)定的疾病。盡管認(rèn)為對于獲得的功效而言安全性和耐性能力是可接受的，但是這些研究與臨床研究中的其他非放射性同位素綴合生物療法相比，具有更高的有害事件率。美國專利申請US2003/0103985公開了與美登木素生物堿綴合的人源化VFF-18形式，稱為BIWIl，用于腫瘤治療中。發(fā)現(xiàn)人源化VFF18抗體，即BIWA4，在與毒素，即BIWI1綴合時，在人外陰表皮狀癌、咽鱗狀細(xì)胞癌或乳腺癌的小鼠模型中具有顯著的抗腫瘤作用。未綴合形式，即BIWA4，不具有抗腫瘤作用。在BIWI1的第一階段實驗中，該實驗針對受不可治愈的頭頸癌影響的患者，由于實驗的過早中斷，不可以確定最大耐受劑量，實驗的過早中斷歸因于患者之一由大規(guī)模皮膚毒性引起的死亡。在平行的第二項BIWI1實驗中，該實驗也針對患有頭頸癌的患者，確定MTD且它是皮膚毒性的結(jié)果。在第三項關(guān)于BIWIl的實驗中，該實驗針對預(yù)先經(jīng)歷了化學(xué)療法的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者，大多數(shù)常見毒性是輕微的和瞬間皮膚病癥。通過該方法，即使不存在功效的客觀測量，50%的受處理的患者顯示出不依賴劑量的穩(wěn)定疾病。關(guān)于所有實驗的總負(fù)面風(fēng)險對比功效評估，由于缺乏致命事件的可預(yù)言性，導(dǎo)致停止進(jìn)一步開發(fā)該藥物。MabU36是通過UM-SCC-22B人下咽骨癌細(xì)胞免疫和關(guān)于癌癥和組織特異性的選擇產(chǎn)生的鼠單克隆IgGl抗體。通過cDNA克隆和序列分析獲得的抗原特征確定角化細(xì)胞-特異性CD44剪接變體epican的v6結(jié)構(gòu)域為MabU36的靶標(biāo)。免疫組化研究顯示表位局限于細(xì)胞膜。此外，MabU36強烈標(biāo)記94M的頭頸鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC)，并且在這些腫瘤中存在均勻的細(xì)胞染色。10名患者99mTc標(biāo)記的MabU36研究顯示抗體對HNSCC癌的選擇性累積(在2天時，20.4+/-12.4%注射的劑量/1^);沒有報告副作用，但2名患者形成HAMA。在放射性碘標(biāo)記的的鼠MabU36的研究中，存在18名患者中的3個HAMA案例和HNSCC中的選擇性同源吸收。為了減小MabU36的抗原性和減少HAMA率，構(gòu)建嵌合抗體。嵌合或原始鼠MabU36均不具有ADCC活性。不存在關(guān)于MabU36的天然功能活性的證據(jù)。使用^Re標(biāo)記的嵌合MabU36確定MabU36作為治療劑的效用。在該第一階段逐步增加劑量實驗中，13名患者接受跟蹤劑量的99mTc標(biāo)記的嵌合MabU36，隨后是186Re標(biāo)記的嵌合MabU36。沒有報告急性有害事件，但是處理后，在3名患者中的2名中觀察到劑量限制性骨髓毒性(myelotoxcity)(1.5GBq/m2)，且在1名受最大耐受劑量(l.OGBq/m2)處理的患者中觀察到血小板減少癥。盡管對腫瘤尺寸存在一些影響，但是這些影響達(dá)不到對處理的客觀反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。關(guān)于186Re標(biāo)記的嵌合MabU36的進(jìn)一步研究使用利用粒細(xì)胞集落刺激因子刺激的全血再灌輸?shù)牟呗?，從而將最大耐受活性加倍?.8Gy。在該關(guān)于9名患有不同頭頸腫瘤的患者的研究中，3名由于與藥物有關(guān)的貧血而需要輸血。其他毒性包括3級骨髓毒性和2級粘膜炎。沒有報告客觀腫瘤反應(yīng)，盡管在5名患者中獲得穩(wěn)定疾病3-5個月。因此，可以看到，盡管MabU36是高度特異性的抗體，但是需要放射性免疫綴合物還實現(xiàn)抗癌作用的缺點限制其有效性，因為獲得與涉及臨床作用的治療有關(guān)的毒性。總而言之，CD44v6(I.IASML)和CD44vl0(K926)單克隆抗體分別在注射了轉(zhuǎn)移型胰腺腺癌的大鼠或注射了惡性黑素瘤的小鼠中顯示出了降低的轉(zhuǎn)移活性。另一種抗CD44v6抗體(VFF-18及其衍生物)，只有在與美登木素生物堿或放射性同位素綴合時，顯示出具有抗腫瘤作用?？箻?biāo)準(zhǔn)CD44單克隆抗體也表現(xiàn)出抑制大鼠成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的大腦內(nèi)進(jìn)展(抗CD44)，小鼠T細(xì)胞淋巴瘤的淋巴結(jié)侵入(IM-7.8.1)以及抑制人卵巢癌細(xì)胞系植入裸鼠(克隆515)，小鼠黑素瘤細(xì)胞系的肺轉(zhuǎn)移(IM-7.8.1)和人黑素瘤細(xì)胞系在SCID小鼠中的轉(zhuǎn)移(GKW.A3)。放射性同位素綴合的MabU36抗CD44v6抗體及其衍生物在臨床實驗中具有抗腫瘤活性，其伴隨顯著的毒性。這些結(jié)果，盡管鼓勵和支持抗CD44單克隆抗體作為潛在的癌癥治療法的開發(fā)，但是證明了有限的效力、安全性、或?qū)θ祟惏┌Y的適用性。因此，如果分離一種介導(dǎo)癌細(xì)胞細(xì)胞毒性的抗體組合物，其CD44在所述細(xì)胞上的細(xì)胞表面表達(dá)的功能作為其吸引力，則將實現(xiàn)有價值的診斷和治療方法。作為癌癥治療的單克隆抗體患有癌癥的每個個體都是獨特的，并且患有與其它癌癥不同的癌癥，正如個人的身份一樣。除此之外，目前的治療法以相同的方法治療患有同種類型的癌癥、處于相同的階段的所有患者。這些患者中至少有30%將在一線治療中失敗，由此導(dǎo)致以后幾輪的治療和治療失敗、轉(zhuǎn)移、以及最終死亡的增加的可能性。較好的治療方法應(yīng)該是對于特定的個體量身定制的治療法。目前本身適于量身定制的唯一的治療法是手術(shù)?；熀头派渲委煵荒軐颊哌M(jìn)行量身定做，并且手術(shù)本身在大部分情形中不足以產(chǎn)生治愈。隨著單克隆抗體的出現(xiàn)，由于每種抗體可以針對單個表位，則開發(fā)量身定制的治療法的方法的可能性變得更加現(xiàn)實。此外，產(chǎn)生針對獨特限定特定個體的腫瘤的表位群的抗體組合也是可能的。已經(jīng)認(rèn)識到在癌癥細(xì)胞和正常細(xì)胞之間的顯著不同是在于癌癥細(xì)胞包含對轉(zhuǎn)化的細(xì)胞特異的抗原，科學(xué)團體長期認(rèn)為單克隆抗體可以設(shè)計成通過特異性與這些癌癥抗原結(jié)合而特異性靶向轉(zhuǎn)化的細(xì)胞；因此產(chǎn)生這樣的信心單克隆抗體可以作為"魔力子彈(MagicBullets)"來消除癌細(xì)胞。然而，現(xiàn)在廣泛認(rèn)識到，沒有任何一種單個的單克隆抗體可以在所有癌癥情形中起作用，并且單克隆抗體可以被開發(fā)為一類作為靶向癌癥治療。己經(jīng)表明按照本文公開的發(fā)明的教導(dǎo)分離的單克隆抗體以有益于患者的方式減輕癌性疾病過程，例如通過減少腫瘤負(fù)荷的方式，并且在本文中應(yīng)該不同地稱為減輕癌性疾病的抗體(CDMAB)或"抗癌"抗體。18目前，癌癥患者通常具有很少的治療選擇。對癌癥治療法的管理方法己經(jīng)在全球存活和發(fā)病率中產(chǎn)生了改善。然而，對于特定的個體，這些改善的統(tǒng)計學(xué)沒有與他們個人情況的改善必然相關(guān)。因此，如果采用能夠使執(zhí)業(yè)者獨立于處于同一團體中的其他患者而治療每種腫瘤的方法，這將允許產(chǎn)生僅使治療適合該名個體的獨特方法。這樣的治療療程將理想地增加治愈率，并且產(chǎn)生更好的結(jié)果，由此滿足長期渴望的需要。歷史上，多克隆抗體已經(jīng)進(jìn)行了應(yīng)用，在治療人類癌癥中具有有限的成功。己經(jīng)使用人血漿治療淋巴瘤和白血病，但是存在很少延長的好轉(zhuǎn)或反應(yīng)。此外，與化療相比，缺少再現(xiàn)性，并且沒有其它的益處。實體瘤諸如乳腺癌、黑素瘤和腎細(xì)胞癌也已經(jīng)使用人血液、黑猩猩血清、人血漿和馬血清進(jìn)行治療，具有相對不可預(yù)知的和無效的結(jié)果。對于實體瘤，已經(jīng)存在單克隆抗體的許多臨床試驗。在20世紀(jì)80年代，對于人乳腺癌存在至少4種臨床試驗，其使用針對特異抗原的抗體或基于組織選擇性，在至少47名患者中僅產(chǎn)生一名響應(yīng)者。直到1998年才出現(xiàn)使用人源化的抗Her2/neu抗體(Herceptii^)與順鉑組合的成功的臨床試驗。在該試驗中，評估37名患者的響應(yīng)，其中約四分之一具有部分響應(yīng)率，另外四分之一具有較小或穩(wěn)定的疾病發(fā)展。在所述響應(yīng)者中對發(fā)展的中值時間是8.4個月，中值響應(yīng)持續(xù)5.3個月。Herceptin⑧在1998年首次核準(zhǔn)與Taxof組合用于一線應(yīng)用。臨床研究結(jié)果顯示，與僅接受Taxof的組(3.0個月)相比，對于接受抗體治療加Taxo胸的那些的疾病發(fā)展的中值時間(6.9個月)增加。在中值存活中也存在稍微的增加；對于Hercepti,加Taxo^治療組相對于單獨的Taxo產(chǎn)治療組為22個月相對于18個月。另外，與單獨的Taxol⑧相比較，在抗體加Taxof組合組中，在完全(8%相對于2%)和部分響應(yīng)者(34%相對于15%)的數(shù)量中存在增加。然而，與單獨的Taxol⑧治療相比較，用Hercepti^和Taxo^治療導(dǎo)致更高的心臟中毒的發(fā)生(分別為13%相對于1%)。此外，Herceptii^治療法只對過量表達(dá)(通過免疫組化(IHC)分析確定)人表皮生長因子受體2(Her2/neu)的患者，患有轉(zhuǎn)移乳腺癌的患者的大約25%中有效；所述人表皮生長因子受體2是一種受體，其目前具有未知的功能或生19物學(xué)重要的配體。因此，對于患有乳腺癌的患者仍然存在大量未滿足的需求。即使可以受益于Herceptin⑧治療的那些仍然需要化療，并且因此仍然必須處理，至少在某種程度上，處理這種治療的副作用。研究結(jié)腸直腸癌的臨床試驗包括針對糖蛋白和糖脂耙點的抗體?？贵w如17-lA，其對于腺癌具有某種特異性，已經(jīng)在六十多名患者中進(jìn)行了2期臨床試驗，僅有l(wèi)名患者具有部分響應(yīng)。在其它試驗中，在使用額外的環(huán)磷酰胺的方案中，使用17-1A在52名患者中僅產(chǎn)生1例完全響應(yīng)和2例較小的響應(yīng)。迄今為止，17-lA的III期臨床試驗尚未表現(xiàn)出作為III期結(jié)腸癌的輔助治療的提高的功效。最初核準(zhǔn)用于成像的人源化鼠單克隆抗體的應(yīng)用也沒有產(chǎn)生腫瘤衰減。僅在最近，使用單克隆抗體的結(jié)腸直腸癌臨床研究產(chǎn)生了一些積極的結(jié)果。在2004年，6朋111^@核準(zhǔn)用于患有表達(dá)EGFR的轉(zhuǎn)移結(jié)腸直腸癌的患者的二線治療，所述患者對基于伊立替康的化療不起反應(yīng)(refractory)。來自兩組(two-arm)II期臨床研究和單組研究的結(jié)果表明，ERBITIIX^與伊立替康組合分別具有23%和15%的響應(yīng)率，疾病發(fā)展的中值時間分別為4.1個月和6.5個月。來自同一兩組II期臨床研究和另一單組研究的結(jié)果表明，僅用￡朋11!;乂@治療分別導(dǎo)致11%和9%的響應(yīng)率，疾病發(fā)展的中值時間分別為1.5個月和4.2個月。因此，在瑞士和美國，ERBrniX^與伊立替康組合治療，并且在美國，單獨的￡1^111^@治療，已經(jīng)被核準(zhǔn)作為在一線伊立替康治療中失敗的結(jié)腸癌患者的二線治療。因此，如同Herceptin⑧，在瑞士只核準(zhǔn)治療作為單克隆抗體和化療的組合。另外，在瑞士和美國只核準(zhǔn)治療作為二線治療用于患者。此外，在2004年，AVASTD^被核準(zhǔn)與靜脈內(nèi)基于5-氟尿嘧啶的化療組合用作轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌的一線治療。III期臨床研究結(jié)果表現(xiàn)出與僅用5-氟尿嘧啶治療的患者相比，用AVASTINM5-氟尿嘧啶治療的患者的中值存活延長(分別為20個月相對于16個月)。然而，同樣如同Herceptir^和ERBITUX,治療僅被核準(zhǔn)作為單克隆抗體和化療的組合。對于肺癌、腦癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌還繼續(xù)存在極差的結(jié)果。對于非小細(xì)胞肺癌的最有希望的最近的結(jié)果來自II期臨床試驗，其中治療包括與殺細(xì)胞藥多柔比星綴合的單克隆抗體(SGN-15;dox-BR96，抗-唾液酸(sialyl)-LeX)，其與化療藥TAXOTERE⑧組合。TAXOTERE⑧是唯一一種FDA核準(zhǔn)的化療藥，用于肺癌的二線治療。原始數(shù)據(jù)顯示與單獨的TAXOTERE⑧相比提高的整體存活時間。在本研究征募的62名患者中，三分之二接受SGN-15與TAXOTERE⑧組合，而其余三分之一接受單獨的TAXOTERE。對于接受SGN-15與TAXOTERE⑧組合的患者，中值整體存活時間是7.3個月，而與之比較的接受單獨的TAXOTERE㊣的患者是5.9個月。對于接受SNG-15加TAXOTERE㊣的患者的整體存活時間為1年和18個月的分別為29%和18%，而與之比較的對于接受單獨的TAXOTERE的患者分別為24%和8%。計劃了進(jìn)一步的臨床試驗。臨床前，對于黑素瘤使用單克隆抗體已經(jīng)存在一些有限的成功。這些抗體中很少已經(jīng)達(dá)到臨床試驗階段，并且迄今為止沒有一種已經(jīng)被核準(zhǔn)或在III期臨床試驗中表現(xiàn)出有利的結(jié)果。治療疾病的新藥的發(fā)現(xiàn)受到在30,000種己知的基因產(chǎn)物中缺少相關(guān)耙點的鑒定的阻礙，所述30,000種己知的基因可能有助于疾病的發(fā)病機理。在腫瘤學(xué)研究中，潛在的藥物耙點通常由于它們在腫瘤細(xì)胞中過量表達(dá)的事實來簡單地選擇。然后篩選這樣鑒定的靶點與多種化合物的相互作用。在潛在的抗體治療的情形中，這些候選化合物通常衍生于根據(jù)Kohler和Milstein所述的基本原理(1975,自然(Nature),256,495-497,Kohler和Milstein)的單克隆抗體產(chǎn)生的常規(guī)方法。從用抗原(例如，全細(xì)胞，細(xì)胞級分，純化的抗原)免疫的小鼠收集脾細(xì)胞，并且與無限增殖的雜交瘤配偶體融合。篩選所得到的雜交瘤，并且針對最親和性地與所述耙點結(jié)合的抗體的分泌進(jìn)行選擇。針對癌細(xì)胞的許多治療和診斷抗體，包括Herceptin和RITUXIMAB，已經(jīng)使用這些方法產(chǎn)生，并且基于它們的親和性進(jìn)行選擇。這種方法中的缺點是兩方面的。首先，對治療或診斷抗體結(jié)合選擇適當(dāng)?shù)陌悬c受到關(guān)于組織特異性致癌過程的極少的知識以及用于鑒定這些靶點的所得到的過于單純化的方法的限制，所述過于單純化的方法如通過過量表達(dá)進(jìn)行選擇。第二，與受體以最大的親和力結(jié)合的藥物分子通常具有起始或抑制信號的最大可能性的假設(shè)可能不總是這種情形。除了對于乳腺癌和結(jié)腸癌的治療的一些進(jìn)展之外，作為單一藥劑或共同治療的有效抗體治療的鑒定和開發(fā)對于所有類型的癌癥尚是不充足的?，F(xiàn)有專利美國專利號5,750,102公開這樣一種方法，其中來自患者腫瘤的細(xì)胞用MHC基因轉(zhuǎn)染，所述MHC基因可克隆自來自該患者的細(xì)胞或組織。然后，使用這些轉(zhuǎn)染的細(xì)胞免疫該患者。美國專利號4,861,581公開這樣一種方法，所述方法包括下列步驟獲得單克隆抗體，所述單克隆抗體對哺乳動物的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的內(nèi)部細(xì)胞成分是特異性的，但是對外部成分不是特異性的；標(biāo)記所述單克隆抗體，使所標(biāo)記的抗體與己經(jīng)接受治療的哺乳動物組織接觸以殺死腫瘤細(xì)胞；并且通過測量所標(biāo)記的抗體與退化的腫瘤細(xì)胞的內(nèi)部細(xì)胞成分的結(jié)合而確定治療的功效。在制備針對人細(xì)胞內(nèi)抗原的抗體時，專利權(quán)所有人認(rèn)為惡性細(xì)胞代表這樣的抗原的便利的來源。美國專利號5,171,665提供一種新型抗體以及其生產(chǎn)方法。具體地，該專利教導(dǎo)形成這樣的單克隆抗體，所述單克隆抗體具有與人腫瘤例如結(jié)腸腫瘤和肺腫瘤相關(guān)的蛋白質(zhì)抗原的那些強結(jié)合而與正常細(xì)胞以弱得多的程度結(jié)合的性質(zhì)。美國專利號5,484,596提供一種癌癥治療方法，所述方法包括從人癌癥患者手術(shù)取出腫瘤組織，處理所述腫瘤組織以獲得腫瘤細(xì)胞，輻射所述腫瘤細(xì)胞以成為存活的但非腫瘤發(fā)生性的，并且使用這些細(xì)胞制備用于患者的疫苗，所述疫苗能夠抑制原發(fā)瘤的復(fù)發(fā)而且同時抑制轉(zhuǎn)移。該專利教導(dǎo)開發(fā)與腫瘤細(xì)胞的表面抗原反應(yīng)的單克隆抗體。如在第4欄45行等描述的，專利權(quán)所有人在開發(fā)用于人腫瘤形成的表達(dá)單克隆抗體的活性特異性免疫治療中使用自生的腫瘤細(xì)胞。美國專利號5,693,763教導(dǎo)一種糖蛋白抗原，其是人癌癥特有的，并且不依賴于起源的上皮組織。美國專利號5,783,186涉及在表達(dá)Her2的細(xì)胞中誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的抗-Her2抗體，產(chǎn)生所述抗體的雜交瘤細(xì)胞系，使用所述抗體治療癌癥的方法和包括所述抗體的藥物組合物。美國專利號5,849,876描述了用于產(chǎn)生針對黏蛋白抗原的單克隆抗體的新雜交瘤細(xì)胞系，所述黏蛋白抗原由腫瘤和非腫瘤組織來源純化。22美國專利號5,869,268涉及產(chǎn)生人淋巴細(xì)胞的方法，所述人淋巴細(xì)胞產(chǎn)生對目的抗原特異性的抗體，產(chǎn)生單克隆抗體的方法，以及由所述方法產(chǎn)生的單克隆抗體。該專利特別涉及有效用于癌癥診斷和治療的抗-HD人單克隆抗體的生產(chǎn)。美國專利號5,869,045涉及與人癌癥細(xì)胞反應(yīng)的抗體、抗體片段、抗體綴合物和單鏈免疫毒素。這些抗體作用的機制是兩面性的，原因在于分子與在人癌癥表面上存在的細(xì)胞膜抗原反應(yīng)，并且此外，原因在于所述抗體具有在癌癥細(xì)胞內(nèi)部內(nèi)在化的能力，隨后結(jié)合，使它們特別有效用于形成抗體-藥物和抗體-毒素綴合物。在它們的未修飾形式中，所述抗體還在特定的濃度表現(xiàn)出細(xì)胞毒性特征。美國專利號5,780,033公開自體抗體用于腫瘤治療和預(yù)防的應(yīng)用。然而，這種抗體是來自年老的哺乳動物的抗核自體抗體。在這種情形中，認(rèn)為該自體抗體是在免疫系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的一種自然抗體類型。因為該自體抗體來自"年老的哺乳動物"，不存在所述自體抗體實際來自被治療的患者的要求。另外，該專利公開了來自年老的哺乳動物的天然和單克隆抗核自體抗體，和產(chǎn)生單克隆抗核自體抗體的雜交瘤細(xì)胞系。美國專利號5,916,561公開抗Cd44基因的變體外顯子v6的特異性抗體，VFF-18，及其變體。該抗體是超越比較物抗體的改進(jìn)，因為其識別人CD44v6變體而非大鼠Cd44v6變體。另外，該抗體公開了用于CD44v6表達(dá)的診斷測定。關(guān)于該抗體沒有公開體外或體內(nèi)功能。美國專利號5，616,468公開針對含有由人CD44基因外顯子6A編碼的序列的合成肽產(chǎn)生的單克隆抗體，Var3.1。具體地，該抗體不結(jié)合人CD44的卯kD形式且與Hermes-3抗體不同。提供用于檢測CD44的v6變體的方法，以及用于基于該抗原來篩選和測定惡性轉(zhuǎn)化的方法。還提供了用于基于在血清中檢測該抗原來篩選炎癥的方法。美國專利號5,879,898公開結(jié)合人CD44變體6的129bp外顯子的特異性抗體，其生成43個氨基酸的肽。單克隆抗體通過許多雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生MAK<CD44>M-1.1.12,MAK<CD44>M-2.42.3,MAK<CD44>M-4.3.16。該抗體由融合蛋白產(chǎn)生，所述融合蛋白包含新CD44v6氨基酸序列的至少六肽。此外，存在關(guān)于檢測可以用作癌癥診斷的外顯子6變體的免疫測定200880022591.5說明書第14/67頁的內(nèi)容。顯著地，沒有公開該抗體的體外或體內(nèi)功能。美國專利號5,942,417公開編碼CD44樣多肽的多核苷酸，和利用該多核苷酸及其變體制備重組蛋白的方法。要求保護(hù)了針對這些多肽的抗體，然而，不存在具體的實施例且沒有保藏分泌所述抗體的克隆。Northern印跡證明該多核苷酸出現(xiàn)在若干組織類型中，但是沒有伴隨證據(jù)顯示存在該多核苷酸的翻譯和表達(dá)。因此，沒有這樣的證據(jù)，即存在針對該多核苷酸的基因產(chǎn)物制備的抗體，這些抗體應(yīng)該具有體外或體內(nèi)功能，和它們是否與人癌性疾病相關(guān)。美國專利號5,885,575公開與CD44的變體表位反應(yīng)的抗體和通過使用該抗體識別該變體的方法。編碼該變體的分離的多核苷酸從大鼠細(xì)胞分離，且針對該變體的抗體，mAbl.lASML，識別分子量為120kD,150kD，180kD，和200kD的蛋白。單克隆抗體1.1ASML的施用延遲大鼠BSp73ASML在同基因大鼠中的生長和轉(zhuǎn)移。顯著地，I.IASML不識別人腫瘤，如其缺乏與LCLC97人大細(xì)胞肺癌的反應(yīng)性所證明地。從LCLC97分離人類同源物，但是沒有生成識別該同源物的等價抗體。因此，盡管生成了特異于大鼠CD44的變體的抗體，并顯示出影響大鼠腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，但是不存在關(guān)于該抗體針對人腫瘤的作用的證據(jù)。更明確地，該發(fā)明人指出該抗體不識別人類癌癥。發(fā)明概述本申請利用在U.S.6,180,357專利中教導(dǎo)的生產(chǎn)患者特異的抗癌抗體的方法分離雜交瘤細(xì)胞系，所述雜交瘤細(xì)胞系編碼減輕癌性疾病的單克隆抗體。這些抗體可以針對一種腫瘤特異性制備，并且因此使得癌癥治療的量身定制成為可能。在本申請的情形中，具有殺傷細(xì)胞(細(xì)胞毒性)或抑制細(xì)胞生長(抑制細(xì)胞)特性的抗癌抗體在下文中稱為細(xì)胞毒性的。這些抗體可以用于輔助癌癥的分階段和診斷，并且可以用于治療腫瘤轉(zhuǎn)移。這些抗體還可以用于通過預(yù)防治療的方式用于預(yù)防癌癥。與根據(jù)傳統(tǒng)藥物發(fā)現(xiàn)樣本(paradigm)產(chǎn)生的抗體不同，以這種方式產(chǎn)生的抗體可以靶向這樣的分子和途徑，所述分子和途徑先前沒有顯示出對于惡性組織的生長和/或存活是必需的。此外，這些抗體的結(jié)合親和力適合起始可能不易受更強的親和性相互作用影響的細(xì)胞毒性事件的需要。此外，將標(biāo)準(zhǔn)化療形式如放射性核素與本發(fā)明的CDMAB綴合也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，由此集中在所述化療劑的應(yīng)用。所述CDMAB也可以與毒素、細(xì)胞毒性部分、酶例如生物素綴合的酶、細(xì)胞因子、干擾素、靶標(biāo)或報告部分或造血細(xì)胞綴合，由此形成抗體綴合物。所述CDMAB可以單獨或與一種或多種CDMAB/化療劑組合使用。個體化的抗癌治療的前景將在患者的管理方式中引起改變?？赡艿呐R床方案(scenario)是在出現(xiàn)時獲得腫瘤樣品，并且儲存。從該樣品，腫瘤可以用一組預(yù)先存在的減輕癌性疾病的抗體而確定類型。將患者進(jìn)行常規(guī)分階段，但是可用的抗體可以用于將患者進(jìn)一步分階段?；颊呖梢粤⒓从矛F(xiàn)有的抗體進(jìn)行治療，并且使用本發(fā)明描述的方法或通過利用噬菌體展示文庫與本發(fā)明公開的篩選方法聯(lián)合，可以產(chǎn)生一組對腫瘤特異性的抗體。由于其它腫瘤可能攜帶一些與被治療的腫瘤相同的表位，故將產(chǎn)生的所有抗體加入到抗癌抗體文庫中。按照該方法產(chǎn)生的抗體可以有效用于治療許多患有與這些抗體結(jié)合的癌癥的患者中的癌性疾病。除了抗癌抗體之外，患者可以選擇接受目前推薦的治療作為多形式治療方案的一部分。通過本方法分離的抗體對非癌癥細(xì)胞是相對無毒的事實允許以高劑量使用抗體組合，單獨的，或與常規(guī)治療組合。高治療指數(shù)還允許在短時間范圍內(nèi)再次治療，這應(yīng)該降低耐受治療的細(xì)胞出現(xiàn)的可能性。如果患者對初始的治療療程沒有反應(yīng)或發(fā)展了轉(zhuǎn)移，則可以重復(fù)產(chǎn)生針對腫瘤的特異性抗體的方法，進(jìn)行再次治療。此外，所述抗癌抗體可以與從該患者獲得的紅細(xì)胞綴合，并且重新輸注用于治療轉(zhuǎn)移。對于轉(zhuǎn)移癌存在很少有效的治療，并且轉(zhuǎn)移通常預(yù)示著導(dǎo)致死亡的最壞結(jié)果。然而，轉(zhuǎn)移癌通常充分地血管化，通過紅細(xì)胞遞送抗癌抗體可以具有將所述抗體集中在腫瘤部位的作用。甚至在轉(zhuǎn)移之前，大部分癌癥細(xì)胞依賴于宿主的血液供應(yīng)它們的生存，并且與紅細(xì)胞綴合的抗癌抗體還可以有效針對原位腫瘤。備選地，所述抗體可以與其它造血細(xì)胞綴合，如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞等。存在5類抗體，并且每類與由其重鏈賦予的功能相關(guān)。通常認(rèn)為由裸抗體殺傷癌癥細(xì)胞通過抗體依賴性細(xì)胞毒作用(ADCC)或補體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)進(jìn)行介導(dǎo)。例如，鼠lgM和IgG2a抗體可以通過結(jié)合補體系統(tǒng)的C-l成分而激活人補體，由此激活可以導(dǎo)致腫瘤消退的補體激活經(jīng)典途徑。對于人抗體，最有效的補體激活抗體通常是IgM和IgGl。IgG2a和lgG3同種型的鼠抗體有效募集具有Fc受體的細(xì)胞毒性細(xì)胞，其將導(dǎo)致由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和某些淋巴細(xì)胞進(jìn)行的細(xì)胞殺傷。IgGl和IgG3同種型的人抗體介導(dǎo)ADCC。通過Fc區(qū)域介導(dǎo)的細(xì)胞毒性需要存在效應(yīng)細(xì)胞、其相應(yīng)受體、或蛋白質(zhì)，例如NK細(xì)胞、T-細(xì)胞和補體。在缺乏這些效應(yīng)子機制的條件下，抗體的Fc部分是無活性的?？贵w的Fc部分可以賦予這樣的特性，即影響抗體體內(nèi)藥物代謝動力學(xué)，但在體外其是無效的?？贵w介導(dǎo)的癌癥殺傷的另一種可能的機制可以通過使用催化細(xì)胞膜中的不同化學(xué)鍵的水解的抗體以及其相關(guān)的糖蛋白或糖脂，即所謂的催化抗體進(jìn)行。存在3種抗體-介導(dǎo)的癌癥細(xì)胞殺傷的其它機制。第一種是使用抗體作為疫苗來誘導(dǎo)機體產(chǎn)生針對存在于癌癥細(xì)胞上的推定的抗原的免疫反應(yīng)。第二種是使用這樣的抗體，所述抗體靶向生長受體，并且干擾它們的功能，或下調(diào)所述受體，以致有效地喪失其功能。第三種是所述抗體對細(xì)胞表面部分的直接連接的作用，所述細(xì)胞表面部分的直接連接可能導(dǎo)致直接的細(xì)胞死亡，諸如死亡受體如TRAILRl或TRAILR2的連接，或整聯(lián)蛋白分子如aVP3的連接等。癌癥藥物的臨床應(yīng)用基于所述藥物在對患者的可接受的危險模式下的益處。在癌癥治療中，通常是在益處之后最追求生存，然而，除了延長生命之外，還存在許多其它公認(rèn)的益處。這些其它的益處，其中治療沒有不利地影響生存，包括癥狀減輕，針對不利事件的保護(hù)，復(fù)發(fā)時間的延長或沒有疾病的生存，并且延長發(fā)展的時間。這些標(biāo)準(zhǔn)通常被接受，并且管理團體如美國食品及藥品管理局(F.D.A.)核準(zhǔn)產(chǎn)生這些益處的藥物(Hirschfeld等.腫瘤學(xué)/血液學(xué)的重要綜述(CriticalReviewsinOncology/Hematolgy)42:137-1432002)。除了這些標(biāo)準(zhǔn)之外，公認(rèn)還存在其它的可以預(yù)示這些類型的益處的終點(endpoint)。部分地，由美國F.D.A.26授予的加速的核準(zhǔn)流程承認(rèn)存在可能預(yù)測患者益處的替代品。到2003年年末，在這種流程下已經(jīng)核準(zhǔn)了16種藥物，并且這些中有4種已經(jīng)繼續(xù)獲得了完全的核準(zhǔn)，即，隨后的研究已經(jīng)表明由替代品終點預(yù)測的直接的患者益處。確定藥物在實體瘤中的作用的一個重要的終點是通過測量針對治療的響應(yīng)而評估腫瘤負(fù)荷(Therasse等.國家癌癥研究所雜志(JournaloftheNationalCancerInstitute)92(3):205-2162000)。關(guān)于所述評估的臨床標(biāo)準(zhǔn)(RECIST標(biāo)準(zhǔn))已由癌癥國際專家組實體瘤工作組的響應(yīng)評估標(biāo)準(zhǔn)公布。與適當(dāng)?shù)膶φ战M相比較，對腫瘤負(fù)荷具有證明的作用的藥物，如由RECIST標(biāo)準(zhǔn)所述的目標(biāo)響應(yīng)所示，最終傾向于產(chǎn)生直接的患者益處。在臨床前設(shè)定中，腫瘤負(fù)荷通常更直接進(jìn)行評估和記錄。因為臨床前研究可以轉(zhuǎn)換成臨床設(shè)定，在臨床前模型中產(chǎn)生延長的生存的藥物具有最大的預(yù)測臨床用途。與產(chǎn)生針對臨床治療的積極響應(yīng)類似，在臨床前設(shè)定中減少腫瘤負(fù)荷的藥物還可能對疾病具有顯著的直接影響。盡管延長生存是在癌癥藥物治療的臨床結(jié)果后最追求的，但是存在其它的益處，其具有臨床應(yīng)用，并且清楚地，可能與疾病發(fā)展的延遲、延長的生存或二者相關(guān)的腫瘤負(fù)荷減少還可以導(dǎo)致直接的益處和具有臨床影響(Eckhardt等.發(fā)展的治療學(xué)目標(biāo)化合物的臨床試驗設(shè)計的成功與失敗(DevelopmentalTherapeutics:SuccessesandFailuresofClinicalTrialDesignsofTargetedCompounds);ASCO教育書，第39次年會，2003,第209-219頁)。充分利用U.S.6,180,357的方法，在用來自患者肺腫瘤活檢組織的細(xì)胞和NCI-H460肺癌細(xì)胞系免疫小鼠后，獲得小鼠單克隆抗體，H460-16-2。H460-16-2抗原在來自不同組織來源的廣泛范圍的人細(xì)胞系的細(xì)胞表面上表達(dá)。乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和皮膚癌細(xì)胞系A(chǔ)2058在體外易受H460-16-2的細(xì)胞毒性作用的影響。H460-16-2在培養(yǎng)物中針對MDA-MB-231細(xì)胞的細(xì)胞毒性的結(jié)果通過其在植入小鼠時針對這些癌細(xì)胞的抗腫瘤活性得到進(jìn)一步擴展(如S.N.10/603,000中公開地)。臨床前異種移植腫瘤模型被認(rèn)為是治療功效的有效預(yù)測因子。在人乳腺癌的預(yù)防性體內(nèi)模型中，H460-16-2處理比同種型對照抗體顯著(pO.0001)更有效地抑制處理過程中的腫瘤生長。在處理期結(jié)束時，27給藥H460-16-2的小鼠具有僅生長到對照組的1.3%的腫瘤。在處理后的后續(xù)時期內(nèi)，H460-16-2的處理作用持續(xù)并且處理組中的平均腫瘤體積繼續(xù)顯著小于對照，直到測量期結(jié)束。利用存活率作為抗體功效的測量，評估了H460-16-2處理組中的死亡風(fēng)險在處理后70天時，為抗體緩沖液對照組的約71。/。(pK).028)。這些數(shù)據(jù)證明H460-16-2處理與對照處理組織相比，賦予存活益處。H460-16-2處理似乎是安全的，因為其不誘導(dǎo)任何毒性跡象，包括減少的體重和臨床不適。因此，H460-16-2處理是有效的，因為其在充分確定的人乳腺癌模型中，與對照處理組相比，延遲腫瘤生長并提高存活率。另外，H460-16-2在確定的體內(nèi)腫瘤模型中證明了針對MDA-MB-231細(xì)胞的抗腫瘤活性(如S.N.10/603,000公開地)。用H460-16-2的處理與標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)治療藥物順鉑進(jìn)行相比較，且顯示出順鉑和H460-16-2處理組與用抗體稀釋緩沖液或同種型對照抗體處理的組相比，具有顯著(pO.001)更小的平均腫瘤體積。H460-16-2處理介導(dǎo)是順鉑化學(xué)療法的約2/3的腫瘤抑審ij，但是無顯著的(19.2。/。)體重減少(pO.003)和臨床不適，包括關(guān)于順鉑處理觀察到的2件與處理有關(guān)的死亡。H460-16-2的抗腫瘤活性及其最小毒性使其成為引人注目的抗癌治療劑。另夕卜，在處理后的期間，H460-16-2顯示出顯著的存活益處(p〈0.02)，因為在處理后〉70天時，H460-16-2組中的死亡風(fēng)險是同種型對照抗體組中的死亡風(fēng)險的約一半。觀察到的存活益處在處理后持續(xù)超過120天，在那時，與H460-16-2處理組的674相比，100%的同種型對照和順鉑處理的小鼠已經(jīng)死亡。H460-16-2通過與同種型對照抗體組相比延遲腫瘤生長26%,來維持腫瘤抑制。在處理后31天時，H460-16-2通過與同種型對照組相比減少腫瘤生長48%，來限制腫瘤尺寸，這與在處理結(jié)束時觀察到的49。/。的減少相當(dāng)。在確定的乳腺癌腫瘤模型中，這些結(jié)果說明了H460-16-2超過處理期維持腫瘤抑制的潛力，并證明了該抗體在哺乳動物中減少腫瘤負(fù)擔(dān)和提高存活率的能力。除在確定的乳腺癌體內(nèi)腫瘤模型中的有益作用外，H460-16-2處理與化學(xué)療法藥物(順鉬)的組合在確定的體內(nèi)前列腺癌模型中具有針對PC-3細(xì)胞的抗腫瘤活性(如S.N.10/810,165中公開地)。利用配對t-檢驗，H460-16-2加順鉑處理在處理期后立即比緩沖液對照(pO.OOOl)、單獨的順鉑處理&=0.004)或單獨的H460-16-2處理(pO.0001)顯著更有效抑制腫瘤生長。在處理期結(jié)束時，給藥H460-16-2加順鉑的小鼠具有僅生長至緩沖液對照組的28.5%的腫瘤。對于PC-3SCID異種移植模型，體重可以用作疾病進(jìn)展的替代指示物。所有組中的小鼠都經(jīng)歷了嚴(yán)重體重減輕。在該研究中，所有組中的小鼠在處理期結(jié)束時都顯示出約23-35%的體重減輕。用H460-16-2處理的組表現(xiàn)出最小程度的體重減輕(21.7%)。處理后，第48天，與緩沖液對照相比，不存在與H460-16-2和順鉑處理有關(guān)的體重減輕的顯著增加(pi.5042)。因此，在充分確定的人前列腺癌模型中，H460-16-2加順鉑處理是有效的，因為其與同種型對照處理組相比延遲了腫瘤生長。為了確認(rèn)H460-16-2表位作為藥物耙標(biāo)，先前確定了H460-16-2抗原在正常人組織中的表達(dá)(S.N.10/603,000)。該工作通過比較抗CD44抗體；克隆L178(在S.N.10/647,818,現(xiàn)在的美國專利7,189,397中公開)和克隆BU75(在S.N.10/810,165中公開)得到擴展。通過用H460-16-2染色I(xiàn)HC，大部分組織未能表達(dá)H460-16-2抗原，包括生命器官諸如肝、腎(除管狀上皮細(xì)胞的邊緣染色外)、心臟、和肺的細(xì)胞。來自組織染色的結(jié)果說明H460-16-2顯示出與多種細(xì)胞類型的有限結(jié)合，但是具有與浸潤巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、和成纖維細(xì)胞的結(jié)合。BU75抗體顯示出類似的染色模型。然而，存在至少一種值得注意的差別；與H460-16-2相比，BU75染色淋巴細(xì)胞更強烈。定位H460-16-2抗原和確定其在人群中，諸如乳腺癌患者中的普遍性，對于評估H460-16-2的治療應(yīng)用和設(shè)計有效的臨床實驗非常重要。為了解決H460-16-2抗原在來自癌癥患者的乳腺腫瘤中的表達(dá)，先前對來自50名個體乳腺癌患者的腫瘤組織樣品進(jìn)行篩選H460-16-2抗原的表達(dá)(S.N.10/603,000)并與L178(S.N.10/647,818,現(xiàn)在的美國專利7,189,397)，BU75(S.N.10/810，165)和抗Her2抗體c-erbB-2(S.N.10/810，165)比較。這些研究的結(jié)果是類似的且顯示出62。/。組織樣品關(guān)于H460-16-2抗原陽性染色，而73%的乳腺腫瘤組織關(guān)于BU75表位是陽性。H460-16-2在患者樣品內(nèi)的表達(dá)似乎特異于癌癥細(xì)胞，因為染色局限于惡性腫瘤細(xì)胞。H460-16-2染色來自乳腺癌患者的10份正常組織樣品中4份，而BU75染色8份。H460-16-2和BU75抗原的乳腺腫瘤表達(dá)似乎主要位于惡性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜，這使得CD44成為引人注目的治療靶標(biāo)。H460-16-2表達(dá)進(jìn)一步基于激素雌激素和孕酮受體的乳腺腫瘤表達(dá)來評估，其在乳腺腫瘤的發(fā)育、治療和預(yù)后中扮演重要角色。在H460-16-2抗原表達(dá)和雌激素或孕酮受體表達(dá)之間相關(guān)性不明顯。當(dāng)基于其階段或癌癥進(jìn)展的程度分析腫瘤時，H460-16-2抗原表達(dá)和腫瘤期之間同樣不存在明顯的相關(guān)性。關(guān)于BU75獲得類似的結(jié)果。在與c-erbB-2的比較中，H460-16-2表現(xiàn)出完全不同的染色特征，其中52。/。的關(guān)于H460-16-2抗原陽性的乳腺腫瘤組織樣品關(guān)于Her2表達(dá)是陰性的，這說明尚未滿足關(guān)于乳腺癌患者的靶向治療需要。關(guān)于H460-16-2和Her2二者都是陽性的乳腺腫瘤組織切片之間也存在染色強度的差別。c-erbB-2抗體也陽性染色正常乳腺組織切片之一。進(jìn)一步定位H460-16-2抗原和確定其在人群中，諸如前列腺癌患者中的普遍性，公開在S.N.11/364,013中。抗體與53份人前列腺腫瘤和3份正常前列腺組織的結(jié)合利用人前列腺正常和腫瘤組織微陣列(Imgenex,圣地亞哥，CA)進(jìn)行。如S.N.11/364,013中公開地，19/53(36%)的接受測試腫瘤關(guān)于H460-16-2是陽性的。H460-16-2特異于腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)成纖維細(xì)胞。細(xì)胞定位主要在膜和細(xì)胞質(zhì)膜，具有或不具有內(nèi)腔定位。陽性細(xì)胞的百分比在<10%->50%范圍內(nèi)，這說明該抗體與腫瘤細(xì)胞的異源結(jié)合。不能適當(dāng)?shù)卦u估抗體結(jié)合與腫瘤期的關(guān)系，這歸因于不同腫瘤期中腫瘤數(shù)量的差異，即腫瘤I,II，III和IV期分別為1/1(100%),4/12(33%),0/2(0%)和11/33(33%)。對Gleason分?jǐn)?shù)G3-G4(36%)存在比對G1-G2(25%)更高度的結(jié)合。全部3份正常前列腺組織切片對該抗體是陽性的。然而，組織特異性是關(guān)于肌上皮和基質(zhì)成纖維細(xì)胞的并且提供(spared)給腺上皮。存在H460-16-2與測試前列腺腫瘤結(jié)合的不均勻性10/53，6/53,3/53陽性腫瘤分別在<10-10%,<50-50%禾口>50%分類中。作為其與前列腺癌細(xì)胞結(jié)合的結(jié)果，H460-16-2的治療益處可以潛在地擴展到治療前列腺癌。進(jìn)一步定位H460-16-2抗原和確定其在人群，諸如肝癌患者中的普遍性，公開在S.N.11/364,013中。H460-16-2抗體顯示出與21/49(43%)的測試肝癌，包括11/37(30%)原發(fā)性，7/8(88%)轉(zhuǎn)移性肝細(xì)胞癌，1/2(50%)原發(fā)性和2/2(100%)轉(zhuǎn)移性膽管癌的結(jié)合。該抗體表現(xiàn)出與早期I和II期相比更顯著高度結(jié)合于晚期腫瘤III和IV期(p=0.03)[I期，0/2(0%);II期，2/17(12%);III期，8/16(50%)和IV期，6/8(75%)]。H460-16-2特異于月中瘤細(xì)胞和浸潤炎性細(xì)胞。細(xì)胞定位主要在膜。一些腫瘤還展現(xiàn)出擴散性細(xì)胞質(zhì)染色模式。該抗體結(jié)合9/9的非腫瘤肝組織。然而，結(jié)合局限于竇狀細(xì)胞和浸潤淋巴細(xì)胞。H460-16-2抗原似乎特異性表達(dá)在晚期肝腫瘤組織上。H460-16-2因此具有作為肝癌治療中的治療藥物的潛力。為了進(jìn)一步擴展H460-16-2的潛在治療益處，先前還確定了該抗原在多種人癌組織中的頻率和定位(S.N.10/603，000)并與克隆L178相比較(S.N.10/647,818,現(xiàn)在的美國專利7,189,397)。這些腫瘤類型中的大部分關(guān)于L178抗原也是陽性的。如關(guān)于人乳腺腫瘤組織，H460-16-2和L178定位發(fā)生在腫瘤細(xì)胞的膜上。然而，與H460-16-2抗體相比，關(guān)于L178存在充分更多的膜定位。而且，在用H460-16-2和L178二者染色的腫瘤類型中，43。/。的組織顯示出關(guān)于L178抗體的更高強度的染色?；谂c來自文獻(xiàn)中的IHC數(shù)據(jù)相比較，似乎不存在嚴(yán)格匹配本文中存在的IHC數(shù)據(jù)的CD44形式。CD44的標(biāo)準(zhǔn)形式通常表達(dá)在人腦內(nèi)；H460-16-2抗原卻不然。針對pan-CD44同種型的抗體不染色肝(包括Kuppfer細(xì)胞)并在生殖周期的所有階段陽性染色子宮內(nèi)膜腺體。H460-16-2抗原清楚地存在于Kuppfer細(xì)胞上并僅存在于生殖周期的分泌性子宮內(nèi)膜腺體上。H460-16-2抗原清楚地存在于組織巨噬細(xì)胞上且只有變體形式V4/5和V8/9顯示出偶然的巨噬細(xì)胞染色。與抗CD44L178和現(xiàn)在的BU75相比，對H460-16-2觀察到的類似但不同的結(jié)合模式說明H460-16-2抗原是CD44的獨特表位。如先前公開地(S.N.10/647,818,現(xiàn)在的美國專利7,189,397)，另外的生物化學(xué)數(shù)據(jù)還說明由H460-16-2識別的抗原是一種形式的CD44。這得到這樣的研究的支持，所述研究顯示針對CD44反應(yīng)的單克隆抗體(L178)通過免疫沉淀識別與H460-16-2結(jié)合的蛋白。Western印跡研究還提示由H460-16-2識別的CD44表位不存在于v6或v10上。H460-16-2表位還以碳水化合物和構(gòu)象依賴性作為特征，而許多抗CD44抗體針對CD44的肽部分。這些IHC和生物化學(xué)結(jié)果證明H460-16-2結(jié)合CD44抗原的變體。因此，占優(yōu)勢的證據(jù)顯示H460-16-2通過連接CD44變體上存在的獨特碳水化合物依賴性構(gòu)象表位而介導(dǎo)抗癌作用。為了本發(fā)明的目的，所述表位定義為"CD44的抗原性部分"，其特征在于其結(jié)合由雜交瘤細(xì)胞系H460-16-2編碼的單克隆抗體，其抗原性結(jié)合片段，其抗原性結(jié)合配體或其抗體綴合物的能力。為了進(jìn)一步說明H460-16-2抗癌作用背后的機制，進(jìn)行了透明質(zhì)酸(HA)結(jié)合測定(如S.N.10/810,165中所公開地)。確定了以50%抑制MDA-MB-231細(xì)胞與HA附著需要平均濃度為1.87(+/-1.01)微克/mL的H460-16-2。這些結(jié)果說明H460-16-2與，至少部分地，CD44上負(fù)責(zé)結(jié)合HA的區(qū)域相互作用并因此可以通過下調(diào)血管發(fā)生或腫瘤侵入ECM而介導(dǎo)其抗癌作用。除HA結(jié)合測定外，進(jìn)行細(xì)胞周期實驗，以確定H460-16-2的體外和體內(nèi)抗癌作用是否歸因于細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)(如S.N.10/810,165中公開地)。24小時和使用20微克/mLH460-16-2后，與同種型對照相比，MDA-MB-231凋亡細(xì)胞的數(shù)量增多。該作用還似乎是劑量依賴性的。因此，H460-16-2的功效還可以歸因于，全部或部分地，其凋亡誘導(dǎo)能力。為了進(jìn)一歩說明H460-16-2作用的機制，當(dāng)乳腺癌異種移植模型中體內(nèi)生長的MDA-MB-231腫瘤凋亡時，進(jìn)行H460-16-2處理(如S.N.11/364,013中公開地)。ApoTag染色的腫瘤的連續(xù)切片隨后進(jìn)行H&E染色并且利用形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)諸如單細(xì)胞缺失、細(xì)胞收縮和染色質(zhì)壓縮為密質(zhì)(densemass)來檢測這些的凋亡細(xì)胞。如以上部分所述進(jìn)行達(dá)到這些標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞的計數(shù)，以提供處理組的平均計數(shù)。緩沖液對照組產(chǎn)生平均總分17個細(xì)胞(士5.29);而H460-16-2處理組產(chǎn)生平均總分22.5個細(xì)胞(士4.20)。因此，如利用細(xì)胞形態(tài)學(xué)所確定地，存在使用H460-16-2處理增加凋亡的趨勢。為了促進(jìn)抗體嵌合物的產(chǎn)生，分別克隆和測序編碼重鏈和輕鏈可變區(qū)的基因(如S.N.11/364,013中公開地)。然后構(gòu)建和表達(dá)人IgGl和IgG2同種型的H460-16-2嵌合輕鏈和重鏈(如S.N.11/364,013中公開地)。為了確定嵌合對比鼠抗體的相對功效，進(jìn)行人乳腺癌的體內(nèi)模型(如S.N.11/364,013中公開地)。鼠H460-16-2和(ch)ARH460-16-2-IgGl在確立的(established)人乳腺癌MDA-MB-231體內(nèi)模型中減少腫瘤生長。在第62天，即施用最后的劑量后5天時，使用H460-16-2處理導(dǎo)致腫瘤生長抑制39%(平均T/C=57%)。該腫瘤生長的減少顯著區(qū)別于對照^=0.0037)。嵌合抗體(ch)ARH460-16-2-IgGl導(dǎo)致增強腫瘤生長抑制64%(平均T/C=26.9%;pO.OOOl)。相反，嵌合抗體的IgG2形式，(ch)ARH460-16-2-IgG2與緩沖液對照相比，沒有顯示出腫瘤生長抑制(腫瘤生長抑制=0%;平均T/C=122%;p=0.7264)。貫穿研究過程不存在毒性臨床跡象。總之，在MDA-MB-231乳腺癌模型中，(ch)ARH460-16-2-IgGl證明了與鼠抗體相比相同或更高的功效。先前進(jìn)行了膜聯(lián)蛋白-V染色(如S.N.11/364,013中公開地)，以確定H460-16-2的嵌合形式是否能夠以與MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞系上的鼠負(fù)體相同的方式誘導(dǎo)凋亡。所有3種抗體顯示出壞死和壞死/凋亡總數(shù)對比其預(yù)期同種型對照百分比的劑量依賴性增加。關(guān)于(ch)ARH460-16-2-IgG2，然后(ch)ARH460-16-2-IgGl和然后H460-16-2觀察到壞死和壞死/凋亡總數(shù)百分比的最大增加?？傊?，該數(shù)據(jù)證明H460-16-2抗原是癌癥相關(guān)的抗原并表達(dá)在人中，且是病理學(xué)相關(guān)癌癥靶標(biāo)。此外，該數(shù)據(jù)還證明H460-16-2抗體與人癌癥組織的結(jié)合，并且可以合適地用于診斷、療法預(yù)測、或預(yù)后測定。另外，該抗原的細(xì)胞膜定位是細(xì)胞癌癥狀態(tài)的指示，這是因為大部分非惡性腫瘤細(xì)胞中缺乏抗原的表達(dá)，且該觀察結(jié)果允許該抗原，其基因或衍生物，其蛋白質(zhì)或其變體用于可以是診斷、療法預(yù)測、或預(yù)后測定的應(yīng)用。其他'研究，包括抗CD44抗體的應(yīng)用，具有不是由H460-i6-2表現(xiàn)出的治療潛力的局限性。H460-16-2證明了體外和體內(nèi)抗腫瘤活性。先前描述的抗體諸如MAK<CD44>M-1.1.12,MAK<CD44>M-2.42.3禾口MAK<CD44>M-4.3.16不具有歸于它們的體外或體內(nèi)細(xì)胞毒性，且VFF-18和MabU36不顯示固有的腫瘤細(xì)胞毒性。另外，其他表現(xiàn)出了體內(nèi)腫瘤作用的抗CD44抗體也具有某些對于H460-16-2不明顯的局限性。例如，ASML1.1,K926,抗CD44和IM-78.1顯示出針對分別在異種移植模型中生長的大鼠、鼠科、大鼠和鼠科腫瘤的體內(nèi)抗腫瘤活性。H460-16-2在人癌癥模型中證明了抗腫瘤活性。H460-16-2還針對人CD44，而抗體諸如ASML1.1僅識別大鼠CD44?？寺?15抗CD44抗體的確抑制人卵巢細(xì)胞系的腹膜腫瘤植入但不阻止或抑制腫瘤生長。H460-16-2能夠在SCID小鼠異種移植模型中抑制人乳腺腫瘤生長。GKW.A3是抗人CD44單克隆抗體，其能夠抑制在小鼠中生長的人轉(zhuǎn)移性黑素瘤在預(yù)防性而非確立的模型中的腫瘤生長。H460-16-2證明了在人乳腺癌的預(yù)防性和確立的鼠異種移植模型中的顯著抗腫瘤活性。因此，非常明顯地，與先前描述的抗CD44抗體相比，H460-16-2具有較高的抗腫瘤特性。證明了在SCID小鼠中對人乳腺腫瘤的體外和體內(nèi)抗腫瘤活性和針對人CD44。還顯示了在人乳腺癌的預(yù)防性和確立的(更臨床相關(guān)的)模型中的活性且顯示了在人前列腺癌的確立的模型中使用順鉑的活性。本發(fā)明描述H460-16-2，其相應(yīng)的嵌合抗體，(ch)ARH460-16-2-IgGl和(ch)ARH460-16-2(VK0VH0)，其相應(yīng)的人源化抗體變體(hu)ARH460-16-2的開發(fā)和應(yīng)用。H460-16-2通過其在患有癌性疾病的哺乳動物中的細(xì)胞毒性測定，腫瘤生長模型和在延長存活時間中的作用確定。本發(fā)明描述癌癥治療領(lǐng)域中的進(jìn)步，其中首次描述了特異性結(jié)合耙分子，CD44上存在的表位的試劑，所述試劑且還作為裸抗體，具有針對惡性腫瘤細(xì)胞而非正常細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性特性，且還作為裸抗體，在人癌癥體內(nèi)模型中直接介導(dǎo)抑制腫瘤生長和存活延長。這與任何其他先前所述的抗CD44抗體相比是一個進(jìn)步，因為尚沒有一個顯示出具有類似的特性。其還在該領(lǐng)域中提供進(jìn)步，因為其清楚地首次證明了CD44直接參與與某些類型腫瘤生長和發(fā)育相關(guān)的事件。還代表了癌癥治療中的進(jìn)步，因為其具有在人患者中展現(xiàn)類似抗癌特性的潛力。另外的進(jìn)步是將這些抗體包括在抗癌抗體文庫中應(yīng)該通過確定不同抗癌抗體的適當(dāng)組合提高靶向表達(dá)不同抗原標(biāo)記的腫瘤的可能性，從而發(fā)現(xiàn)最有效地靶向和抑制腫瘤的生長和a古反冃。總之，本發(fā)明教導(dǎo)了H460-16-2抗原作為治療劑耙標(biāo)的應(yīng)用，即在施用時，可以減小哺乳動物中表達(dá)該抗原的癌癥的腫瘤負(fù)荷，且還可以導(dǎo)致受處理的哺乳動物延長的存活。本發(fā)明還教導(dǎo)CDMABs(H460-16-2,(ch)ARH460-16-2-IgGl，(ch)ARH460-16-2(VKOVHO)禾口變體(hu)ARH460-16-2)，以及它們的衍生物、及其抗原結(jié)合片段、和其誘導(dǎo)細(xì)34胞毒性的配體的應(yīng)用，其靶向它們的抗原，以減少在哺乳動物中表達(dá)所述抗原的癌癥的腫瘤負(fù)荷并導(dǎo)致受治療哺乳動物延長的存活。此外，本發(fā)明還教導(dǎo)在癌性細(xì)胞中檢測H460-16-2抗原的應(yīng)用，所述應(yīng)用可以有效用于攜帶表達(dá)該抗原的腫瘤的哺乳動物的診斷、治療預(yù)測、和預(yù)后。因此，本發(fā)明的一個目的是利用制備針對來源于特定個體的癌性細(xì)胞或一種或多種特定的癌癥細(xì)胞系產(chǎn)生的減輕癌性疾病的抗體(CDMAB)的方法，以分離雜交瘤細(xì)胞系，和所述雜交瘤細(xì)胞系編碼的相對應(yīng)的分離的單克隆抗體及其抗原結(jié)合片段，所述CDMAB對于癌癥細(xì)胞是細(xì)胞毒性的，但是同時對于非癌性細(xì)胞相對是無毒的。本發(fā)明的另一個目的是教導(dǎo)減輕癌性疾病的抗體，其配體和抗原結(jié)合片段。本發(fā)明的另一個目的是產(chǎn)生減輕癌性疾病的抗體，其細(xì)胞毒性通過抗體依賴性細(xì)胞毒作用介導(dǎo)。本發(fā)明的另一個目的是產(chǎn)生減輕癌性疾病的抗體，其細(xì)胞毒性通過補體依賴性細(xì)胞毒作用介導(dǎo)。本發(fā)明的另一個目的是產(chǎn)生減輕癌性疾病的抗體，其細(xì)胞毒性是它們催化細(xì)胞的化學(xué)鍵水解的能力的函數(shù)(flmction)。本發(fā)明的另一個目的是產(chǎn)生減輕癌性疾病的抗體，所述抗體有效用于癌癥診斷、預(yù)后和監(jiān)測的結(jié)合測定。本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點將通過下述描述變得清楚，其中通過舉例說明和實施例的方式描述本發(fā)明的某些實施方案。附圖簡述本專利或申請文件包含至少一幅彩色繪制的附圖。本專利或?qū)＠暾埑霭嫖飵в胁噬綀D的復(fù)印件將根據(jù)要求和繳付必要的費用由官方提供。圖1證明在確立的人乳腺MDA-MB-468癌模型中H460-16-2對腫瘤生長的影響。垂直虛線表示腹膜內(nèi)施用抗體的時期。數(shù)據(jù)點表示平均值+/-SEM。圖2證明在確立的MDA-MB-468乳腺癌模型中H460-16-2對小鼠體重的影響。數(shù)據(jù)點表示平均值+ASEM。35圖3證明在確立的人PC-3前列腺癌模型中H460-16-2對腫瘤生長的影響。垂直虛線表示腹膜內(nèi)施用抗體的時期。數(shù)據(jù)點表示平均值+ASEM。圖4證明在確立的PC-3前列腺癌模型中H460-16-2對小鼠體重的影響。數(shù)據(jù)點表示平均值+/-SEM。圖5證明在確立的人乳腺(MDA-MB-231)癌模型中(ch)ARH460-16-2-IgGl以劑量依賴性方式對腫瘤生長的影響。垂直虛線表示腹膜內(nèi)施用抗體的時期。數(shù)據(jù)點表示平均值+/-SEM。圖6證明在確立的MDA-MB-231乳腺癌模型中(ch)ARH460-16-2-IgGl對小鼠體重的影響。數(shù)據(jù)點表示平均值+/-SEM。圖7是H460-16-2結(jié)合人結(jié)腸腫瘤組織微陣列的概述。圖8.使用H460-16-2(A)或同種型對照抗體(B)獲得的結(jié)腸腫瘤組織上的結(jié)合模式的代表性顯微圖。放大倍數(shù)是200倍。圖9是(ch)ARH460-16-2-IgGl結(jié)合人和獼猴組織微陣列的概述。圖IO.在人脾(白髓)(A)和獼猴脾(白髓)(B)上使用(ch)ARH460-16-2-IgGl的結(jié)合模式的代表性顯微圖。觀察關(guān)于這兩種物種的染色。放大倍數(shù)是40倍。圖ll.用不同初級抗體溶液探測的500微克MDA-MB-231膜蛋白的Western印跡。泳道1-5使用分別與2微克/mL,10微克/mL,100微克/mL,500微克/mL或1000微克/mL非生物素化H460-16-2混合的生物素化H460-16-2探領(lǐng)ij。泳道6-10使用分別與2微克/mL,10微克/mL,100微克/mL，500微克/mL或1000微克/mL非生物素化AR37A335.8混合的生物素化H460-16-2探測。泳道11-15使用分別與2微克/mL,10微克/mL,100微克/mL，500微克/mL或1000微克/mL非生物素化1B7.11混合的生物素化H460-16-2探測。圖12.用不同初級抗體溶液探測的500微克MDA-MB-231膜蛋白的Western印跡。泳道1-5使用分別與2微克/mL,10微克/mL,100微克/mL,500微克/mL或1000微克/mL非生物素化H460-16-2混合的生物素化AR37A335.8探測。泳道6-10使用分別與2微克/mL,10微克/mL，100微克/mL,500微克/mL或1000微克/mL非生物素化AR37A335.8混合的生物素化AR37A335.8探測。泳道11-15使用分別與2微克/mL,10微克/mL,10036微克/mL,500微克/mL或1000微克/mL非生物素化8B1B.1混合的生物素化AR37A335.8探測。圖13.AR37A335.8的結(jié)合親和性。通過表面等離振子共振評估該抗體與純化的重組人CD44的結(jié)合的解離常數(shù)。圖14.RTK列表，所述RTK的磷酸化受到用(ch)ARH460-16-2-IgGl處理MDA-MB-231細(xì)胞以及隨后進(jìn)行血清和增補劑刺激的影響。圖15.輕鏈PCR擴增中使用的引物(按出現(xiàn)的順序分別為SEQIDNOS:10-28)。圖16.重鏈PCR擴增中使用的引物(按出現(xiàn)的順序分別為SEQIDNOS:29-44)。圖17.小鼠H460-16-2VH序列(SEQIDNO:45)。圖18.小鼠H460-16-2VL序列(SEQIDNO:46)。圖19.用于產(chǎn)生嵌合的和變體人源化H460-16-2VH序列的寡核苷酸(按出現(xiàn)的順序分別為SEQIDNOS:47-58)。圖20.用于產(chǎn)生嵌合的和變體人源化H460-16-2VL序列的寡核苷酸(按出現(xiàn)的順序分別為SEQIDNOS:59-68)。圖21.pANT18表達(dá)載體。圖22.人源化H460-16-2VH變體(按出現(xiàn)的順序分別為SEQIDNOS:7禾B9)。在CDRs下劃線。圖23.人源化H460-16-2VL變體(SEQIDNO:8)。在CDRs下劃線。圖24.關(guān)于H460-16-2的嵌合和人源化變體的結(jié)合數(shù)據(jù)。圖25.鼠H460-16-2，及其人源化變體，(hu)ARH460-16-2變體HV1/KV1禾卩(hu)ARH460-16-2變體HV2/KV1的結(jié)合親和性。通過表面等離振子共振評估該抗體與純化的重組人CD44的結(jié)合的解離常數(shù)。發(fā)明詳述一般地，當(dāng)用于概述、描述、實施例和權(quán)利要求中時，下述詞語或短語具有所示的定義。術(shù)語"抗體"以最寬泛的意義使用，并且特別涵蓋，例如，單一的單克隆抗體(包括激動劑、拮抗劑、和中和抗體、去免疫的(de-immunized)、鼠、嵌合的或人源化的抗體)，具有多表位特異性的抗體組合物，單鏈抗體，雙抗體，三鏈抗體，免疫綴合物和抗體片段(見下文)。當(dāng)用于本發(fā)明時，術(shù)語"單克隆抗體"是指從一群基本上均一的抗體獲得的抗體，即，除了可能以較少量存在的天然存在的突變之外，構(gòu)成(comprising)所述群體的個體抗體是相同的。單克隆抗體是高度特異性的，針對單一的抗原性位點。此外，多克隆抗體制劑包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體，與所述多克隆抗體制劑相反，每個單克隆抗體針對抗原上的單個決定簇。除了它們的特異性，因為單克隆抗體可以不被其它抗體污染地合成，所以單克隆抗體是有利的。修飾詞"單克隆"表示該抗體的特征是從基本上均一的抗體群體獲得，并且不被解釋為抗體的生產(chǎn)需要通過任何特定的方法。例如，按照本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過由Kohler箏^#r7Va&w入Z56:邦5(1975)首先描述的雜交瘤(鼠或人)方法制備，或可以通過重組DNA方法(參見，例如，美國專利號4,816,567)制備。"單克隆抗體"還可以從噬菌體抗體文庫分離，例如，使用Clackson等，^然(7Va&j352:624-628(1991)和Marks等，i^ff激學(xué)_^^""Mo/.歷o/J,222:581-597(1991)中所述的技術(shù)。"抗體片段"包括完整抗體的一部分，優(yōu)選地包括其抗原-結(jié)合或可變區(qū)。抗體片段的實例包括小于全長的抗體，F(xiàn)ab,Fab',F(ab')2,和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；單鏈抗體，單結(jié)構(gòu)域抗體分子，融合蛋白，重組蛋白和由抗體片段形成的多特異性抗體。"完整的"抗體是一種包括抗原-結(jié)合可變區(qū)以及輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CO和重鏈恒定結(jié)構(gòu)域CHl、Ch2和Ch3的抗體。恒定結(jié)構(gòu)域可以是天然序列恒定結(jié)構(gòu)域(例如，人天然序列恒定結(jié)構(gòu)域)或其氨基酸序列變體。優(yōu)選地，完整的抗體具有一種或多種效應(yīng)子功能。取決于它們的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，完整抗體可以指定為不同的"種類"。存在5種主要類別的完整抗體IgA,IgD,IgE,IgG,和IgM，并且它們中的一些可以進(jìn)一步分成"亞類"(同種型)，例如，IgGl,IgG2，IgG3，IgG4，IgA,和IgA2。與不同種類的抗體相對應(yīng)的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別叫作a，S，e，Y，和)i。不同種類的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是公知的。38抗體"效應(yīng)子功能"是指歸因于抗體的Fc區(qū)(天然序列Fc區(qū)或氨基酸序列變體Fc區(qū))的那些生物學(xué)活性?？贵w效應(yīng)子功能的實例包括Clq結(jié)合；補體依賴性細(xì)胞毒性；Fc受體結(jié)合；抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC);吞噬作用；細(xì)胞表面受體(例如，B細(xì)胞受體；BCR)的下調(diào)，等。"抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性"和"ADCC"是指細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達(dá)Fc受體(FcRs)的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如，天然殺傷(NK)細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞，和巨噬細(xì)胞)識別在靶細(xì)胞上的結(jié)合的抗體，并且隨后引起該耙細(xì)胞的裂解。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞，即NK細(xì)胞，僅表達(dá)FcyRIII，而單核細(xì)胞表達(dá)FcyRI,FcyRII和FcyRIII。FcR在造血細(xì)胞上的表達(dá)總結(jié)在Ravetch禾QKinet,免疫學(xué)年度綜述(爿""w.iev./m/w"o/J9:457-92(1991)的第464頁表3中。為了評估目的分子的ADCC活性，可以進(jìn)行體外ADCC測定，諸如在美國專利號5,500,362或5,821,337中所述的測定。對于所述測定有用的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細(xì)胞。備選地，或另外地，目的分子的ADCC活性可以在體內(nèi)進(jìn)行評估，例如，在動物模型中，諸如在Clynes等.PA^S(USA)95:652-656(1998)中公開的動物模型中。"效應(yīng)細(xì)胞"是表達(dá)一種或多種FcRs并且執(zhí)行效應(yīng)子功能的白細(xì)胞。優(yōu)選地，該細(xì)胞至少表達(dá)FcyRIII并且執(zhí)行ADCC效應(yīng)子功能。介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞的實例包括外周血單核細(xì)胞(PBMC),天然殺傷(NK)細(xì)胞，單核細(xì)胞，細(xì)胞毒性T細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞；其中PBMCs和NK細(xì)胞是優(yōu)選的。效應(yīng)細(xì)胞可以從其天然來源分離，例如，從血液或PBMCs分離，如本發(fā)明所述。術(shù)語"Fc受體"或"FcR"用來描述結(jié)合抗體的Fc區(qū)的受體。優(yōu)選的FcR是天然人FcR序列。此外，優(yōu)選的FcR是一種結(jié)合IgG抗體的FcR(Y受體)，并且包括FcyRI,FqRII,禾QFcYRIII亞類的受體，包括等位基因變體和這些受體的可變剪接形式。FqRI1受體包括FqRIIA("激活受體")和FcyRIIB("抑制受體")，它們具有主要在它們的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域不同的相似的氨基酸序列。激活受體FcYRIIA在其細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域包含免疫受體基于酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受體FcYRIIB在其細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域包含免疫受體基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(參見在M.Dagron,免疫學(xué)年度綜述(^"rn/.iev./mmw"o/.)15:203-234(1997)中的綜述)。FcRs在Ravetch和Kinet,免疫學(xué)年度綜述(Annu.Rev.Immunol)9:457-92(1991);Capel等，^i^學(xué)^"茲(7mww"omef/7od^4:25-34(1994);禾QdeHaas等,^"凝室游床,學(xué)^^^"a丄W.C7/".MedJ126:330-41(1995)中綜述。其它FcRs，包括將在將來鑒定的那些，包含在本發(fā)明的術(shù)語"FcR"中。該術(shù)語還包括新生兒受體，F(xiàn)cRn，其負(fù)責(zé)將母親的IgGs轉(zhuǎn)運到胎兒(Guyer等，,i^學(xué)z雜,^(7./mmw"o/.力17:587(1976)和Kim等，^f/Z/^i^學(xué)^:^YEur./wmw"o/.J24:2429(1994))。"補體依賴性細(xì)胞毒性"或"CDC"是指在存在補體的條件下分子裂解靶點的能力。補體激活途徑通過補體系統(tǒng)的第一成分(Clq)同與同源抗原復(fù)合的分子(例如，抗體)的結(jié)合而起始。為了評估補體激活，可以進(jìn)行CDC觀!J定，例如，如在Gazzano-Santoro等，^i^學(xué);^茲^^吉"7mmw"o/.MeAod"202:163(1996)中所述。術(shù)語"可變"是指這樣的事實，S卩，在抗體之間，某些可變結(jié)構(gòu)域的部分在序列上大量不同，并且其用于每種特定的抗體對于其特定的抗原的結(jié)合和特異性。然而，在抗體的整個可變結(jié)構(gòu)域中可變性不是均勻分布的。它集中在輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域內(nèi)稱為高變區(qū)的三個片段中?？勺兘Y(jié)構(gòu)域的更高度保守的部分稱為構(gòu)架區(qū)(FRs)。天然重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域分別包括4個FRs，其i要采取卩-折疊構(gòu)型，通過三個高變區(qū)連接，具形成環(huán)連接，并且在某些情形中形成(3-折疊結(jié)構(gòu)的一部分。每條鏈中的高變區(qū)通過FRs緊密相鄰保持在一起，并且與另一條鏈的高變區(qū)一起有助于形成抗體的抗原-結(jié)合位點(見Kabat等，身i^^;^^^歪A^2^^/^^m"cm/Vofe/m1o/Twmwwo/og/ca/T^emstJ,第5公共衛(wèi)生月艮務(wù)(PublicHealthService),全國衛(wèi)生研究所(NationalInstitutesofHealth),Bethesda,Md.(1991))。恒定結(jié)構(gòu)域不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但是表現(xiàn)出多種效應(yīng)子功能，諸如在抗體依賴性細(xì)胞毒作用(ADCC)中的抗體參與。當(dāng)用于本發(fā)明時，術(shù)語"高變區(qū)"是指抗體負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)通常包括來自"互補性決定區(qū)"或"CDR"的氨基酸殘基(例如，在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基24-34(LI),50-56(L2)和89-97(L3)和在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的31-35(HI),50-65(H2)和95-102(H3);Kabat等，克瘦學(xué)共邀游屋/^游,;^/(^Se《we"cas尸rato,m1/m扁"o/og7.C(3//"femy/9,第5應(yīng)公共衛(wèi)生服務(wù)(PublicHealthService),全國衛(wèi)生研究所(NationalInstitutesofHealth),Bethesda,Md.(1991))和/或來自"高變環(huán)"的那些殘基(例如，在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基26-32(Ll)，50-52(L2)和91-96(L3)和在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的26-32(HI),53-55(H2)禾口96-101(H3);Chothia和Lesk，分子生物學(xué)雜志aMo/.歷o/J196:901-917(1987))。"構(gòu)架區(qū)"或"FR，，殘基是除了如本文所定義的所述高變區(qū)殘基之外的那些可變結(jié)構(gòu)域殘基。木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩種相同的抗原-結(jié)合片段，其稱為"Fab"片段，每個具有單個抗原-結(jié)合位點，和剩余的"Fc"片段，它的名稱反應(yīng)了它容易結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生F(ab')2片段，其具有兩個抗原-結(jié)合位點，并且仍然能夠交聯(lián)抗原。"Fv"是包含完整的抗原-識別和抗原-結(jié)合位點的最小抗體片段。該區(qū)域由緊密、非共價締合的一個重鏈和一個輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的二聚體組成。正是在這種構(gòu)型中每個可變結(jié)構(gòu)域的三個高變區(qū)相互作用，以限定在V『VL二聚體表面上的抗原-結(jié)合位點?；\統(tǒng)地，6個高變區(qū)賦予抗體的抗原-結(jié)合特異性。然而，甚至單個可變結(jié)構(gòu)域(或僅包括對抗原特異的3個高變區(qū)的Fv的一半)具有識別和結(jié)合抗原的能力，盡管是以比完整的結(jié)合位點低的親和力結(jié)合。Fab片段還包含輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域和重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(CHI)。Fab，片段不同于Fab片段，其通過在重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基端添加幾個殘基而不同，所述添加的殘基包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸。Fab'-SH在本發(fā)明中是Fab'的名稱，其中恒定結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸殘基攜帶至少一個游離的巰基(thiol)基團。F(ab')2抗體片段最初作為一對Fab'片段產(chǎn)生，其在它們之間具有鉸鏈半胱氨酸?？贵w片段的其它化學(xué)偶聯(lián)也是已知的?；谒鼈兊暮愣ńY(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，來自任何脊椎動物物種的抗體的"輕鏈"可以被指定為兩種明顯不同的類型中的一種，所述兩種明顯不同的類型稱為Kappa(K)和lambda(X)。"單鏈Fv"或"scFv"抗體片段包括抗體的Vh和Vl結(jié)枸域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于單一的多肽鏈中。優(yōu)選地，F(xiàn)v多肽還包括在Vh和Vl結(jié)枸域之間的多肽連接體，其使得scFv能夠形成用于抗原結(jié)合的理想結(jié)構(gòu)。對于scFv的綜述，參見Pliickthun，在單克隆抗體的藥理學(xué)(r/ze尸/zar顧co/ogyo/M。woc/owa/貧沐J央巻113,Rosenburg禾口Moore編,Springer-Verlag,紐約，第269-315頁(1994)。術(shù)語"雙抗體"是指具有兩個抗原-結(jié)合位點的小抗體片段，所述片段包括與在同一多肽鏈(VH-VL)中的可變輕鏈結(jié)構(gòu)域(VO連接的可變重鏈結(jié)構(gòu)域(VH)。通過使用太短而不允許在同一條鏈中的兩個結(jié)構(gòu)域之間成對的連接體，迫使所述結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補結(jié)構(gòu)域成對，并且產(chǎn)生兩個抗原-結(jié)合位點。例如，在EP404,097;WO93/11161;和Hollinger等，夷嵐^^-與學(xué)腐學(xué)叛rrac.—Ato/.」cfld<SW.,90:6444-6448(1993)中更充分地描述了雙抗體。術(shù)語"三鏈抗體"或"三價三聚體"指三個單鏈抗體的組合。用或VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸末端，即不具有任何連接體序列，構(gòu)建三鏈抗體。三鏈抗體具有三個Fv頭部，所述Fv頭部具有以頭-尾的方式環(huán)形排列的多肽。所述三鏈抗體可能的構(gòu)象是具有三個結(jié)合位點的平面，所述結(jié)合位點位于彼此相差120度角的平面上。三鏈抗體可以是單特異性、雙特異性或三特異性的。"分離的"抗體是一種己經(jīng)被鑒定并且與其天然環(huán)境的成分分離和/或從中回收的抗體。它的天然環(huán)境的污染成分是干擾抗體的診斷或治療應(yīng)用的物質(zhì)，并且可以包括酶、激素、和其它蛋白或非蛋白溶質(zhì)。因為將不存在抗體天然環(huán)境的至少一種成分，分離的抗體包括在重組細(xì)胞內(nèi)原位的抗體。然而，一般地，分離的抗體應(yīng)該通過至少一個純化步驟制備。與目的抗原，例如CD44抗原"結(jié)合"的抗體是一種能夠以充足的親和力結(jié)合所述抗原的抗體，以便所述抗體通過靶向表達(dá)所述抗原的細(xì)胞而有效用作治療或診斷劑。在所述抗體是一種結(jié)合CD44的抗體的情形中，與其它受體相反，它通常優(yōu)先結(jié)合CD44，并且不包括偶然發(fā)生的結(jié)合，如非特異性Fc接觸，或不包括與其它抗原所常見的翻譯后修飾結(jié)合，并且可以是一種不與其它蛋白顯著交叉反應(yīng)的抗體。用于檢測與目的抗原結(jié)合的抗體的方法在本領(lǐng)域中是公知的，并且可以包括，但不限于，如FACS、細(xì)胞ELISA和蛋白質(zhì)印跡的測定。42當(dāng)用于本發(fā)明時，表述"細(xì)胞"、"細(xì)胞系"和"細(xì)胞培養(yǎng)物"可以互換地使用，并且所有這樣的名稱包括后代。還應(yīng)該理解，由于故意的或偶然的突變，所有的后代在DNA內(nèi)容物上可能不是精確相同的。包括在初始轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中篩選的具有相同功能或生物學(xué)活性的突變的后代。這將通過使用不同名稱的上下文變得清楚。"治療或處理"是指治療性治療和預(yù)防或預(yù)防性措施，其中目的是預(yù)防或減緩(減輕)目的病理癥狀或病癥。需要治療的那些包括已經(jīng)患有病癥的那些，以及傾向于患有病癥的那些，或要預(yù)防病癥的那些。因此，在本發(fā)明中待治療的哺乳動物可以已經(jīng)診斷患有病癥或可以是傾向于或易受病癥影響的。術(shù)語"癌癥"和"癌性的"是指或描述哺乳動物中的生理狀況，所述生理狀況的典型特征在于失控的細(xì)胞生長或死亡。癌癥的實例包括，但不限于，癌，淋巴瘤，胚細(xì)胞瘤，肉瘤，和白血病或淋巴惡性病。所述癌癥的更具體的實例包括鱗狀細(xì)胞癌(例如，上皮鱗狀細(xì)胞癌)，肺癌，包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌，腹膜癌，肝細(xì)胞癌，胃癌(gastricorstomachcancer)，包括胃腸癌，胰腺癌，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝細(xì)胞瘤，乳腺癌，結(jié)腸癌，直腸癌，結(jié)腸直腸癌，子宮內(nèi)膜癌或子宮癌，唾液腺癌，腎臟或腎癌，前列腺癌，外陰癌，甲狀腺癌，肝的癌癥，肛門癌，陰莖癌，以及頭頸癌。"化療劑"是有效用于治療癌癥的化學(xué)化合物。化療劑的實例包括烷基化試劑，如塞替哌和環(huán)磷酰胺(CYTOXANTM);烷基磺酸酯如白消安，英丙舒凡，和哌泊舒凡；吖丙啶類如苯佐替派(benzodopa),卡波醌，美妥替哌(meturedopa)，禾卩烏王嶄替哌(uredopa);ethylenimines禾口methylamdamines，包括六甲蜜胺，曲他胺，三亞乙基磷酰胺，塞替哌(triethylenethiophosphoramide)禾卩三夢5甲蜜月安(trimethylolomelamine);氮芥(nitrogenmustards)如苯丁酸氮芥,萘氮芥(chlornaphazine),cholophosphamide,雌莫司汀，異環(huán)磷酰胺，氮芥(mechlorethamine),鹽酸氧氮芥，美法侖，新氮芥，苯芥膽甾醇，潑尼莫司汀，曲磷胺，烏拉莫司汀；亞硝基脲(nitrosureas)如卡莫司汀，氯脲菌素，福莫司汀，洛莫司汀,尼莫司汀，雷莫司?。豢股厝绨⒖死顾?aclacinomysins),放線菌素，authramycin,偶氮絲氨酸，博來霉素，放線菌素C,calicheamicin,carabicin,carnomycin,嗜癌霉素，色霉素，放線菌素D,柔紅霉素，地托比星，6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸，多柔比星，表柔比星，依索比星，伊達(dá)比星，馬塞羅霉氣絲裂霉素，麥考酚酸，諾拉霉素，橄欖霉素，培洛霉素，potfiromycin,嘌羅霉素，三鐵阿霉素，羅多比星，鏈黑霉素，鏈佐星，殺結(jié)核菌素，烏苯美司，凈司他丁，佐柔比星；抗代謝物如甲氮喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU);葉酸類似物如denopterin，甲氨喋呤，喋羅呤，三甲曲沙；嘌呤類似物如氟達(dá)拉濱，6-巰嘌呤，thiamiprine，硫鳥嘌呤；嘧啶類似物如安西他濱，阿扎胞苷,6-氮尿苷，卡莫氟，阿糖胞苷，二脫氧尿苷，去氧氟尿苷，依諾他濱，氟尿苷，5-FU/雄激素諸如卡普睪酮，屈他雄酮丙酸鹽，環(huán)硫雄醇，美雄垸，睪內(nèi)酉旨；抗腎上腺藥(anti-adrenals)如氨魯米特，米托坦，曲洛司坦；葉酸補償物如frolinicacid;醋葡醛內(nèi)酯；羥醛磷酰胺配糖(aldophosphamideglycoside);5-氨基酮戊酸；安吖啶；bestrabucil;比生群；依達(dá)曲沙(edatraxate);defofamine;秋水仙胺；地吖醌；elformithine;依利醋銨；依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達(dá)明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌達(dá)醇；尼曲吖啶；噴司他丁；異丙嗪(phenamet);吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide);丙卡巴肼；PSK⑧；雷佐生；西佐喃；鍺螺胺；細(xì)格孢氮雜酸；三亞胺醌；2，2，,2"-三氯三乙胺；烏拉坦(urethan);長春地辛；達(dá)卡巴嗪；甘露莫司?。欢甯事洞?；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴垸；gacytosine;阿拉伯糖苷("Ara-C");環(huán)磷酰胺；塞替哌；紫杉烷類，例如，紫杉醇(TAXOL⑧，Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,新澤西)和多西他賽(TAXOTERE⑧，Aventis,Rhone-PoulencRorer,Antony,法國)；苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-硫鳥嘌呤；巰嘌呤；甲氨喋呤；鉑類似物如順鉑和卡鉬；長春堿；鑰；依托泊苷(VP-16);異環(huán)磷酰胺；絲裂霉素C;米托蒽醌；長春新堿；長春瑞濱；諾維本；諾消靈(novantrone);替尼泊苷；道諾霉素；氨喋呤；適羅達(dá)；伊班膦酸鹽；CPT-11;拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS2000;二氟甲基鳥氨酸(DMFO);視黃酸；esperamicins;卡培他濱；以及任何上述物質(zhì)的藥用鹽、酸或衍生物。下列物質(zhì)也包含在本定義中，它們是作用調(diào)控或抑制激素對腫瘤的作用的抗激素藥劑，諸如抗雌激素藥，包括例如他莫昔芬，雷洛昔芬，抑制4(5)-咪唑的芳香酶，4-羥基他莫昔芬，曲沃昔芬，keoxifene,LY117018,奧那司酮，和托瑞米芬(Fareston);和抗雄激素藥諸如氟他胺，尼魯米特，比卡魯胺，亮丙立德，和戈舍瑞林；以及任何上述物質(zhì)的藥用鹽、酸或者衍生物。用于治療目的的"哺乳動物"是指分類為哺乳動物的任何動物，包括人，小鼠，SCID，或裸鼠或小鼠品系，家畜和農(nóng)場動物，以及動物園、運動或?qū)櫸飫游?，諸如綿羊、狗、馬、貓、牛、等等。在本發(fā)明中優(yōu)選地，所述哺乳動物是人。"寡核苷酸"是長度短的、單鏈或雙鏈的多聚脫氧核苷酸，其通過已知方法化學(xué)合成(如磷酸三酯、亞磷酸酯、或亞磷酰胺化學(xué)，使用周相技術(shù)，如在1988年5月4日公布的EP266,032中所述的，或通過脫氧核苷H-磷酸酯中間物，如Froehler等，孩^^^^TA^c/.爿c/AWas.J14:5399-5407,1986所述)。然后在聚丙烯酰胺凝膠上純化它們。按照本發(fā)明，非人(例如鼠)免疫球蛋白的"人源化的"和/或"嵌合的"形式是指這樣的抗體，所述抗體包含特異的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(如Fv，F(xiàn)ab,Fab',F(ab，)2或抗體的其它抗原-結(jié)合亞序列)，與原始抗體相比較，其導(dǎo)致人抗-小鼠抗體(HAMA)、人抗-嵌合抗體(HACA)或人抗-人抗體(HAHA)反應(yīng)的減少，并且所述抗體包含來源于所述非人免疫球蛋白的、對再現(xiàn)所需要的作用是必需的必需部分(例如，一個或多個CDR(s)、抗原結(jié)合區(qū)、可變結(jié)構(gòu)域等)，同時保留與所述非人免疫球蛋白相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合特征。對于大部分，人源化的抗體是這樣的人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自該受體抗體互補性決定區(qū)(CDRs)的殘基被來自非人物種(供體抗體)CDRs的、具有需要的特異性、親和性和能力的殘基取代，所述非人物種如小鼠、大鼠或兔。在一些情形中，人免疫球蛋白的Fv構(gòu)架區(qū)(FR)殘基被相對應(yīng)的非人FR殘基取代。此外，所述人源化的抗體可以包括在受體抗體和在所引入的CDR或FR序列中都找不到的殘基。進(jìn)行這些修飾以進(jìn)一歩限定和最優(yōu)化抗體性能。通常，所述人源化的抗體應(yīng)該包括基本上不少于至少一個、和典型地兩個可變結(jié)構(gòu)域，其中所有或基本上所有的CDR區(qū)與非人免疫球蛋白的那些相對應(yīng)，并且所有或基本上所有的FR殘基是人免疫球蛋白共有序列的那些。所述人源化抗體優(yōu)化地還應(yīng)該包括至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，典型地是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。"去免疫的(De-immimized)"抗體是對于給定的物種是無免疫原性的或較少免疫原性的免疫球蛋白。去免疫可以通過抗體的結(jié)構(gòu)改變實現(xiàn)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何去免疫技術(shù)。例如，用于使抗體去免疫性的一種適宜的技術(shù)記述在于2000年6月15日公布的WO00/34317中。誘導(dǎo)"程序性細(xì)胞死亡"的抗體是一種通過任何方式誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的抗體，所述方式示例而不限于，膜聯(lián)蛋白V的結(jié)合，胱天蛋白酶活性，DNA的片段化，細(xì)胞收縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹，細(xì)胞片段化和/或膜囊泡的形成(稱為凋亡小體)。當(dāng)用于本文時，"抗體誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性"應(yīng)該理解為意指這樣的細(xì)胞毒性作用，所述細(xì)胞毒性作用來源于由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的雜交瘤上清或抗體，由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體的人源化抗體，由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體的嵌合抗體，及其抗原結(jié)合片段，或抗體配體，所述作用不必與結(jié)合程度相關(guān)。在整個說明書中，備選地，雜交瘤細(xì)胞系以及由其產(chǎn)生的分離的單克隆抗體由它們的內(nèi)部命名H460-16-2(鼠)，(ch)ARH460-16-2-IgGl,(ch)ARH460-16-2(VK0VH0),(hu)ARH460-16-2或保藏命名ATCCPTA-4621指示。當(dāng)用于本文時，"抗體-配體"包括這樣的部分，所述部分表現(xiàn)出針對耙抗原的至少一個表位的結(jié)合特異性，并且其可以是完整的抗體分子、抗體片段、以及至少具有它的抗原-結(jié)合區(qū)或部分(即，抗體分子的可變部分)的任何分子，例如，F(xiàn)v分子,Fab分子,Fab'分子，F(xiàn)(ab，)2分子，雙特異性抗體，融合蛋白，或特異性識別和結(jié)合這樣的抗原的至少一個表位的任何遺傳工程分子，所述抗原與由命名為ATCCPTA-4621(ATCCPTA-4621抗原)的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的分離的單克隆抗體、由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體的人源化抗體、由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體的嵌合抗體及其抗原結(jié)合片段結(jié)合。當(dāng)用于本文時，"減輕癌性疾病的抗體"(CDMAB)是指這樣的克隆抗體及其抗體-配體，所述單克隆抗體以有益于患者的方式減輕癌性疾病過程，例如，通過減少腫瘤負(fù)荷或延長腫瘤攜帶個體的生存的方式。"CDMAB相關(guān)結(jié)合劑"，以其廣義，理解為包括，但不僅限于，競爭結(jié)合于至少一個CDMAB靶表位的任何形式的人或非-人抗體、抗體片段、抗體-配體等。"競爭性結(jié)合劑"理解為包括對至少一個CDMAB靶表位具有結(jié)合親和力的任何形式的人或非-人抗體、抗體片段、抗體-配體等。待治療的腫瘤包括原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤，以及頑固性腫瘤。頑固性腫瘤包括對使用單獨化療劑、單獨抗體、單獨輻射或其組合的治療未能應(yīng)答或?qū)ζ渚哂锌剐缘哪[瘤。頑固性腫瘤還包括表現(xiàn)出受使用所述試劑治療抑制但停止治療后至多5年、有時至多IO年或更長復(fù)發(fā)的腫瘤?？梢灾委煹哪[瘤包括未血管化、或尚未充分血管化的腫瘤，以及血管化的腫瘤?？梢砸虼酥委煹膶嶓w腫瘤實例包括乳腺癌、肺癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和淋巴瘤。所述腫瘤的一些實例包括表皮樣腫瘤，鱗狀細(xì)胞腫瘤，諸如頭頸腫瘤，結(jié)腸直腸腫瘤，前列腺腫瘤，乳腺腫瘤，肺腫瘤，包括小細(xì)胞和非-小細(xì)胞肺腫瘤，胰腺腫瘤，甲狀腺腫瘤，卵巢腫瘤，和肝腫瘤。其他實例包括卡波西肉瘤、CNS瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、毛細(xì)血管成血管細(xì)胞瘤、腦膜瘤和腦轉(zhuǎn)移瘤、黑素瘤、胃腸癌和腎癌和肉瘤、橫紋肌肉瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤優(yōu)選多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、和平滑肌肉瘤。當(dāng)用于本文時，"抗原-結(jié)合區(qū)"意指分子識別耙抗原的部分。當(dāng)用于本文時，"競爭性抑制"意指使用常規(guī)的交互(reciprocal)抗體競爭測定(BelangerL.,SylvestreC.和DufourD.(1973),通過競爭性和夾心方法對cx月臺蛋白的酶聯(lián)免疫測定(Enzymelinkedimmunoassayforafetoproteinbycompetitiveandsandwichprocedures).ClinicaChimicaActa48,15)能夠識別和結(jié)合這樣的決定簇位點，所述決定簇位點是由命名為ATCCPTA-4621的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的單克隆抗體(ATCCPTA-4621抗體)、由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體的人源化抗體、由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體的嵌合抗體、其抗原結(jié)合片段或抗體配體所針對的。當(dāng)用于本文時，"靶抗原"是ATCCPTA-4621抗原或其部分。當(dāng)用于本文時，"免疫綴合物"意指與細(xì)胞毒素、放射性試劑、細(xì)胞因子、干擾素、靶標(biāo)或報告部分、酶、毒素、抗腫瘤藥或治療藥劑化學(xué)或生物學(xué)連接的任何分子或CDMAB，如抗體。所述抗體或CDMAB可以在分子的任何位置處與所述細(xì)胞毒素、放射性試劑、細(xì)胞因子、干擾素、靶標(biāo)或報告部分、酶、毒素、抗腫瘤藥或治療藥物連接，只要它能夠結(jié)合其靶點。免疫綴合物的實例包括抗體毒素化學(xué)綴合物和抗體-毒素融合蛋白。適合于用作抗-腫瘤試劑的放射性試劑是本領(lǐng)域中那些技術(shù)人員已知的。例如，使用131I或211At。利用常規(guī)技術(shù)使這些同位素附著于抗體(例如Pedley等，英國癌癥雜志(Br.J.Cancer)68,69-73(1993))。備選地，附著于抗體的抗-腫瘤試劑是活化前體藥物的酶?？梢允┯眠@樣的前體藥物，所述前體藥物保持其失活形式直到其到達(dá)腫瘤位點，一旦施用抗體復(fù)合物所述前體藥物在該位點處轉(zhuǎn)化為其細(xì)胞毒素形式。實際上，將抗體-酶綴合物施用于患者并容許定位在待治療的組織區(qū)域。然后將前體藥物施用于患者，從而使向細(xì)胞毒性藥物的轉(zhuǎn)化發(fā)生在待治療組織區(qū)域中。備選地，與抗體綴合的抗-腫瘤試劑是細(xì)胞因子，諸如白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素—4GL—4)或腫瘤壞死因子a(TNF-a)。所述抗體耙向針對腫瘤的細(xì)胞因子，以使得細(xì)胞因子在不影響其他組織的條件下介導(dǎo)針對腫瘤的損傷或破壞。利用常規(guī)重組DNA技術(shù)使細(xì)胞因子在DNA水平上與抗體融合。還可以使用干擾素。當(dāng)用于本文時，"融合蛋白"意指任何嵌合蛋白，其中抗原結(jié)合區(qū)與生物活性分子如毒素、酶、熒光蛋白、發(fā)光標(biāo)記、多肽標(biāo)記物、細(xì)胞因子、干擾素、靶標(biāo)或報告部分或蛋白藥物連接。本發(fā)明還預(yù)期本發(fā)明的CDMAB，靶標(biāo)或報告部分與所述CDMAB相連接。靶標(biāo)部分是結(jié)合對的第一個成員?？?腫瘤試劑，例如，與所述對的第二個成員綴合，且由此針對抗原-結(jié)合蛋白結(jié)合的位點。所述結(jié)合對的常見實例是抗生物素蛋白和生物素。在優(yōu)選的實施方案中，生物素與本發(fā)明CDMAB的耙抗原綴合，并由此為抗-腫瘤試劑或與抗生物素蛋白或鏈親和素綴合的其他部分提供靶標(biāo)。備選地，生物素或另一種所述部分與本發(fā)明CDMAB的耙抗原相連接，并用作，例如診斷系統(tǒng)中的報告分子，在所述診斷系統(tǒng)中可檢測的信號-生成試劑與抗生物素蛋白或鏈親和素綴合。48目的。信號生成試劑產(chǎn)生可測量的信號，所述信號是可以通過外部方法，通常電磁輻射測量法檢測的。通常，所述信號生成試劑是酶或發(fā)色團，或由熒光、磷光或化學(xué)發(fā)光引起的發(fā)光。發(fā)色團包括在紫外或可見區(qū)吸收光的染料，且可以是酶催化反應(yīng)的底物或降解產(chǎn)物。而且，在本發(fā)明范圍內(nèi)包括本發(fā)明CDMAB體內(nèi)和體外用于研究或診斷方法的用途，這在本領(lǐng)域中是公知的。為了執(zhí)行如本文中所預(yù)期的診斷方法，本發(fā)明還可以包括試劑盒，所述試劑盒包括本發(fā)明的CDMAB。所述試劑盒應(yīng)該有效用于通過檢測CDMAB的靶抗原在該個體細(xì)胞中的過量表達(dá)而確定處于某種類型癌癥風(fēng)險中的個體。診斷測定試劑盒預(yù)期利用處于診斷測定試劑盒形式的本發(fā)明CDMAB確定腫瘤的存在。通常基于一種或多種腫瘤-特異性抗原，例如在生物學(xué)樣品，諸如血液、血清、尿液和/或腫瘤活組織檢查中的蛋白質(zhì)和/或編碼所述蛋白的多核苷酸的存在，檢測患者中的腫瘤，所述樣品應(yīng)該是獲自所述患者的。所述蛋白起指示具體腫瘤，例如結(jié)腸、乳腺、肺或前列腺腫瘤存在或缺乏的標(biāo)記的作用。還預(yù)期所述抗原應(yīng)該具有檢測其他癌性腫瘤的效用。在診斷試劑盒中包括包含本發(fā)明CDMAB的結(jié)合試劑或CDMAB相關(guān)結(jié)合試劑，允許檢測與生物學(xué)樣品中的試劑相結(jié)合的抗原水平。多核苷酸引物和探針可以用于檢測編碼腫瘤蛋白的mRNA水平，其也指示是否存在癌癥。為了使該結(jié)合測定具有診斷性，產(chǎn)生這樣的數(shù)據(jù)，即所述數(shù)據(jù)與和正常組織中存在的抗原相比具有統(tǒng)計學(xué)顯著性的抗原水平相關(guān)，從而能夠?qū)嵤┳R別確定地診斷癌腫瘤存在的結(jié)合。預(yù)期許多形式應(yīng)該有效用于本發(fā)明的診斷測定，如本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員已知地，從而使用結(jié)合試劑檢測樣品中的多肽標(biāo)記。例如，如Harlow和Lane,抗體實驗室手冊(抗體ALaboratoryManual),7令7,巷實驗室(ColdSpringHarborLaboratory),1988中舉例說明的。還預(yù)期前述診斷測定形式的任意和全部組合、改變或修飾?；颊咧惺欠翊嬖诎┌Y應(yīng)該典型地通過以下確定(a)使獲自患者的生物學(xué)樣品與結(jié)合試劑接觸；(b)檢測樣品中與結(jié)合試劑結(jié)合的多肽水平；和(C)比較多肽水平和預(yù)定截斷值。在舉例說明的實施方案中，預(yù)期該測定應(yīng)該包括使用固定在固體支持物上的基于CDMAB的結(jié)合試劑結(jié)合以及去除樣品的殘余中的多肽。結(jié)合的多肽然后可以利用檢測試劑檢測，所述檢測試劑包含報告基團并特異性結(jié)合于結(jié)合試劑/多肽復(fù)合物。例證性檢測試劑可以包括基于CDMAB的結(jié)合試劑，所述結(jié)合試劑特異性結(jié)合于多肽或抗體或特異性結(jié)合于所述結(jié)合試劑的其他試劑，諸如抗-免疫球蛋白、蛋白質(zhì)G、蛋白質(zhì)A或凝集素。在備選的實施方案中，預(yù)期可以使用競爭測定，其中用報告基團標(biāo)記多肽，并容許其在結(jié)合試劑與樣品一起溫育后結(jié)合于固定的結(jié)合試劑。樣品與固定的結(jié)合試劑的反應(yīng)性指示是所述樣品成分抑制標(biāo)記的多肽與結(jié)合試劑結(jié)合的程度。對于在所述測定中使用合適的多肽包括結(jié)合試劑對其具有結(jié)合親和力的全長腫瘤-特異性蛋白和/或其部分。所述診斷試劑盒具有固體支持物，其可以處于蛋白質(zhì)可以附著的本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員已知的任何材料形式。合適的實例可以包括微量滴定板中的檢測孔或硝化纖維或其他合適的膜。備選地，所述支持物可以是珠或盤，諸如玻璃、玻璃纖維、膠乳或塑料材料諸如聚苯乙烯或聚氯乙烯。所述支持物還可以是磁性粒子或光纖傳感器，諸如例如美國專利號5,359,681中公開的那些。預(yù)期利用多種本領(lǐng)域中那些技術(shù)人員已知的技術(shù)將結(jié)合試劑固定在固體支持物上，這詳細(xì)地記述在專利和科學(xué)文獻(xiàn)中。術(shù)語"固定"指非共價締合諸如吸附和共價附著，其在本發(fā)明的情形中，可以是所述試劑和所述支持物官能團之間的直接連接，或可以是通過交聯(lián)劑的連接。在優(yōu)選但非限制性實施方案中；通過吸附固定于微量滴定板的孔或膜是優(yōu)選的。吸附可以通過使結(jié)合試劑，在合適的緩沖液中，與固體支持物接觸一段合適的時間獲得。接觸時間可以隨溫度變化，且應(yīng)該通常在約1小時-約1天的范圍內(nèi)。結(jié)合試劑與固體支持物的共價附著一般通過首先使該支持物與雙功能試劑反應(yīng)實現(xiàn)，所述雙功能試劑與支持物和結(jié)合試劑上的官能團，諸如羥基或氨基基團二者反應(yīng)。例如，結(jié)合試劑可以通過使用苯醌或通過使支持物上的醛基與結(jié)合配偶體上的胺和活性氫縮合共價附著于具有合適聚合物涂層的支持物(參見，例如，PierceImmunotechnologyCatalogandHandbook(皮爾斯免疫技術(shù)目錄和手冊)，1991,在A12A13)。還預(yù)期所述診斷測定試劑盒采用雙-抗體夾心式測定的形式。該測定可以通過首先使抗體，例如本發(fā)明公開的固定在固體支持物，通常是微量滴定板的孔上的CDMAB，與樣品接觸進(jìn)行，從而容許該樣品中的多肽結(jié)合于固定的抗體。然后從固定的多肽-抗體復(fù)合物中去除未結(jié)合的樣品，并加入包含報告基團的檢測試劑(優(yōu)選地，能夠結(jié)合于多肽上不同位點的二級抗體)。然后使用適合于特異性報告基團的方法確定保持與固體支持物結(jié)合的檢測試劑的量。在具體實施方案中，預(yù)期抗體一旦固定在如上所述的支持物上，應(yīng)該通過使用本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員己知的任何合適封閉劑，諸如牛血清清蛋白或吐溫2()TM(西格瑪化學(xué)公司(SigmaChemicalCo.),St.Louis,Mo.)封閉支持物上剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點。然后使固定的抗體與樣品一起溫育，且容許多肽結(jié)合于所述抗體。溫育前，可以用合適的稀釋劑，諸如磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋樣品。通常，合適的接觸時間(即溫育時間)應(yīng)該進(jìn)行選擇以對應(yīng)于這樣的時間期，所述時間期足以檢測獲自患有特定選擇的腫瘤的個體的樣品中多肽的存在。優(yōu)選地，接觸時間足以獲得在結(jié)合和未結(jié)合多肽之間平衡時獲得的結(jié)合水平的至少約95%的結(jié)合水平。本領(lǐng)域中那些普通技術(shù)人員應(yīng)該承認(rèn)獲得平衡所需的時間可以容易地通過測定經(jīng)過一段時間發(fā)生的結(jié)合水平來確定。還預(yù)期未結(jié)合的樣品應(yīng)該然后通過用合適的緩沖液清洗固體支持物而去除。然后應(yīng)該將包含報告基團的二級抗體加入固體支持物。然后進(jìn)行檢測試劑與固定的抗體-多肽復(fù)合物在一起溫育一段足以檢測結(jié)合的多肽的時間量。隨后，然后去除未結(jié)合的檢測試劑，并利用報告基團檢測結(jié)合的檢測試劑。用于檢測報告基團的方法必須特異于所選報告基團的類型，例如，針對放射性基團，閃爍計數(shù)或放射自顯影法通常是適合的。光譜法可以用于檢測染料、發(fā)光基團和熒光基團。生物素可以利用與不同報告基團(通常，放射性或熒光基團或酶)偶聯(lián)的抗生物素蛋白檢測。酶報告基團可以通常通過添加底物(通常進(jìn)行一段特定時期)，隨后進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)物的光譜或其他分析來檢測。為了使用本發(fā)明的診斷測定試劑盒確定是否存在癌癥，諸如前列腺癌，通常將從保持與固體支持物結(jié)合的報告基團檢測到的信號與對應(yīng)于預(yù)確定截斷值的信號相比較。例如，用于檢測癌癥的例證性截斷值可以是當(dāng)使固定的抗體與來自無癌癥患者的樣品一起溫育時獲得的平均信號。通常，認(rèn)為產(chǎn)生高于預(yù)確定截斷值約3個標(biāo)準(zhǔn)偏差的信號的樣品是癌癥陽性的。在備選的實施方案中，按照Sackett等，臨床流行病學(xué)(ClinicalEpidemiology).臨床醫(yī)學(xué)基本禾斗學(xué)(ABasicScienceforClinicalMedicine),利特爾布朗公司(LittleBrownandCo.),1985,106-7頁的方法，截斷值可以利用接受者操作曲線(ReceiverOperatorCurve)確定。在該實施方案中，截斷值可以從對應(yīng)于關(guān)于診斷檢測結(jié)果的每種可能的截斷值的正陽性率(即靈敏性)和假陽性率(100%-特異性)、對的圖表確定。在最接近左上角的圖表中的截斷值(即包含最大面積的值)是最準(zhǔn)確的截斷值，且可以認(rèn)為產(chǎn)生高于由該方法確定的截斷值的信號的樣品是陽性的。備選地，截斷值可以沿著圖表向左移動，從而最小化假陽性率，或向右移動，從而最小化假陰性率。一般，認(rèn)為產(chǎn)生高于由該方法確定的截斷值的信號的樣品對癌癥是陽性的。預(yù)期可通過所述試劑盒進(jìn)行的診斷測定以流通式或試驗紙檢驗(striptest)形式進(jìn)行，其中結(jié)合試劑固定在膜，諸如硝化纖維膜上。在流通式檢測中，當(dāng)樣品流經(jīng)膜時，樣品中的多肽結(jié)合于固定的結(jié)合試劑。第二種標(biāo)記的結(jié)合試劑在包含該第二種結(jié)合試劑的溶液流經(jīng)該膜時，再結(jié)合于結(jié)合試劑-多肽復(fù)合物。結(jié)合的第二種結(jié)合試劑的檢測可以然后如上所述進(jìn)行。在試驗紙檢驗形式中，將結(jié)合試劑結(jié)合的膜的一端浸沒在包含樣品的溶液中。該樣品沿該膜移動經(jīng)過包含第二種結(jié)合試劑的區(qū)域，并到達(dá)固定的結(jié)合試劑的區(qū)域。所述第二結(jié)合試劑在固定的抗體區(qū)域處的濃度指示癌癥的存在。.在結(jié)合位點形成可以視覺讀取的圖案，諸如線，指示陽性檢測。缺乏所述圖案指示陰性結(jié)果。一般，選擇固定在膜上的結(jié)合試劑的量，從而在生物學(xué)樣品包含足以在處于上述形式的雙-抗體夾心式測定中產(chǎn)生陽性信號的多肽水平時，產(chǎn)生視覺可辨別的圖案。對于在本診斷測定中使用的優(yōu)選結(jié)合試劑是目前公開的抗體，其抗原-結(jié)合片段、和如本文中所述的任何CDMAB相關(guān)結(jié)合試劑。固定在膜上的抗體的量應(yīng)該是有效引起診斷測定的任意量，且可以在約25毫微克-約1微克的范圍內(nèi)。典型地，所述檢測可以利用非常小量的生物學(xué)樣品進(jìn)行。另夕卜，本發(fā)明的CDMAB由于其識別其靶抗原的能力，可以用在進(jìn)行研究的實驗室中。為了更充分地理解本文所述的本發(fā)明，進(jìn)行了下述描述。本發(fā)明提供特異性識別和結(jié)合ATCCPTA-4621抗原的CDMAB(即，ATCCPTA-4621CDMAB，由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體的人源化抗體、由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體的嵌合抗體、其抗原結(jié)合片段或抗體配體)。通過以保藏號PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體的CDMAB可以以任何形式存在，只要它具有這樣的抗原-結(jié)合區(qū)，所述抗原-結(jié)合區(qū)競爭性抑制由雜交瘤ATCCPTA-4621產(chǎn)生的分離的單克隆抗體與其靶抗原的免疫特異性結(jié)合。因此，具有與ATCCPTA-4621抗體相同的結(jié)合特異性的任何重組蛋白(例如，融合蛋白，其中所述抗體與第二蛋白如淋巴因子或腫瘤抑制性生長因子結(jié)合)均落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述CDMAB是ATCCPTA-4621抗體。在其它實施方案中，所述CDMAB是抗原結(jié)合片段，其可以是Fv分子(如單鏈Fv分子)、Fab分子、Fab，分子、F(ab，)2分子、融合蛋白、雙特異性抗體、異種抗體或具有ATCCPTA-4621抗體的抗原-結(jié)合區(qū)的任何重組分子。本發(fā)明的CDMAB針對所述ATCCPTA-4621單克隆抗體針對的表位。本發(fā)明的CDMAB可以在分子內(nèi)進(jìn)行修飾，即，通過氨基酸修飾，以產(chǎn)生衍生物分子?；瘜W(xué)修飾也可以是可能的。通過直接突變、親和力成熟方法、噬菌體展示或鏈改組的修飾也可以是可能的。親和力和特異性可以通過突變CDR和/或苯丙氨酸色氨酸(FW)殘基和篩選具有所需特征的抗原結(jié)合位點進(jìn)行改進(jìn)或改良。(例如，Yang等;分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.),(1995)254:392-403)。一種方法是隨機化各個殘基或殘基的組合，從而在其它方面相同的抗原結(jié)合位點群中，2-2053個氨基酸的子集存在于特定位置處。備選地，突變可以通過易錯PCR方法在一定范圍的殘基中誘導(dǎo)(例如，Hawkins箏分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.),(1992)226:889-96)。在另一個實例中，包含重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的噬菌體展示載體可以在大腸桿菌(Eco//)突變菌株中增殖(例如，Low^(分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.),(1996)250:359-68)。這些誘變方法是許多本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知方法的例證。增加本發(fā)明抗體親和力的另一種方式是進(jìn)行鏈改組，其中重鏈或輕鏈與其他重鏈或輕鏈隨機配對，從而制備具有較高親和力的抗體?？贵w中的多種CDR也可以利用其他抗體中相對應(yīng)的CDR改組。衍生物分子將保留所述多肽的功能特性，即，具有這樣的取代的分子仍然允許所述多肽與所述ATCCPTA-4621抗原或其部分結(jié)合。這些氨基酸取代包括，但不必要限于，本領(lǐng)域內(nèi)已知為"保守的"氨基酸取代。例如，充分確定的蛋白質(zhì)化學(xué)原理認(rèn)為，通?？梢栽诘鞍踪|(zhì)內(nèi)頻繁進(jìn)行稱為"保守氨基酸取代"的特定的(certain)氨基酸取代，而不改變該蛋白質(zhì)的構(gòu)象或功能。這樣的變化包括用異亮氨酸(I),纈氨酸(V)，和亮氨酸(L)中的任一種取代這些疏水性氨基酸中的任意其它一種；用天冬氨酸(D)取代谷氨酸(E)，并且反之亦然；用谷氨酰胺(Q)取代天冬酰胺(N)，并且反之亦然；和用絲氨酸(S)取代蘇氨酸(T)，并且反之亦然。其它取代也可以被認(rèn)為是保守的，這取決于特定氨基酸的環(huán)境及其在蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)中的作用。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)常常可以互換，同樣丙氨酸和纈氨酸(V)也可以互換。相對疏水性的甲硫氨酸(M)常?？梢耘c亮氨酸和異亮氨酸互換，并且有時可以與纈氨酸互換。賴氨酸(K)和精氨酸(R)常常在這樣的情形中互換，在所述情形中，氨基酸殘基的重要特征是其電荷，并且這兩種氨基酸殘基的不同的pK's并不顯著。在特定的情形中，還有其它的變化可以被認(rèn)為是"保守的"。實施例1關(guān)于人MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞的體內(nèi)腫瘤實驗以前證明了(如S.N.10/603,000中公開)H460-16-2針對MDA-MB-231人乳腺癌異種移植模型的功效。為了擴展該發(fā)現(xiàn)，在MDA-MB-468人乳腺癌異種移植模型中測試H460-16-2。參考圖1和2，對8-10周齡雌性無胸腺裸鼠通過在每只小鼠的右腰處皮下注射而植入在100微升PBS溶液中的500萬人乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-468)。將小鼠隨機分成2個處理組，每組10只。在植入后第35天，即當(dāng)小鼠平均腫瘤體積達(dá)到約83mr^時，在用含有2.7mMKC1,1mMKH2P04,137mMNaCl和20mM,Na2HP04的稀釋劑從儲備的濃縮液稀釋后，對每組腹膜內(nèi)施用300微升體積的20mg/kg的H460-16-2檢測抗體或緩沖液對照。然后，在約三周內(nèi)每周施用所述抗體和對照樣品三次。大約每3-10天用測徑器測量腫瘤生長。在8劑抗體后，結(jié)束處理。在腫瘤測量的同時記錄動物的體重。在研究結(jié)束時，一旦它們達(dá)到終點，按照CCAC指導(dǎo)將所有動物處死。H460-16-2在人乳腺癌細(xì)胞的MDA-MB-468體內(nèi)確立模型中顯著抑制腫瘤生長。如在第79天，即最后抗體劑量后26天時確定地，與緩沖液處理組相比，用ARIUS抗體H460-16-2處理減少MDA-MB-468腫瘤生長62.8%(p=0.005506，t-檢驗)。腫瘤生長抑制通過用對照和處理組減去最初腫瘤體積計算。在整個研究過程中，不存在明顯的臨床毒性跡象。以每周時間間隔測量的體重是健康和不能健壯生長的替代品。從研究的開始到結(jié)束，所有組中的平均體重均增加(圖2)。在第35天和第79天之間，平均體重在對照組中增加1.82g(7.2%)和在H460-16-2處理組中增加2.30g(9.9%)。在處理期間內(nèi)，各組間不存在顯著差別?？傊?，H460-16-2在人乳腺癌異種移植模型中是良好耐受的，并且顯著抑制腫瘤生長。實施例2關(guān)于人PC-3前列腺癌細(xì)胞的體內(nèi)腫瘤實驗以前證明了(如S,N.10/810,165中公開)H460-16-2與化療劑順鉑結(jié)合針對PC-3人前列腺癌異種移植模型的功效。為了確定在缺乏該藥物時是否能證明該功效，在不同的小鼠品系異種移植模型中單獨地測試H460-16-2。參考圖3和4，對8-10周齡雄性無胸腺裸鼠通過在每只小鼠的右腰處皮下注射而植入在100微升PBS溶液中的500萬人前列腺癌細(xì)胞(PC-3)。將小鼠隨機分成2個處理組，每組10只。在植入后第6天，即當(dāng)小鼠平均腫瘤體積達(dá)到約95mm3時，在用含有2.7mMKC1,1mMKH2P04，137mMNaCl和20mMNa2HP04的稀釋劑從儲備的濃縮液稀釋后，對每組腹膜內(nèi)施用300微升體積的20mg/kg的H460-16-2檢測抗體或緩沖液對照。然后，在約三周內(nèi)每周施用所述抗體和對照樣品三次。大約每4-10天用測徑器測量腫瘤生長。在10劑抗體后，結(jié)束處理。在腫瘤測量的同時記錄動物的體重。在研究結(jié)束時，一旦它們達(dá)到終點，按照CCAC指導(dǎo)將所有動物處死。H460-16-2在人前列腺癌的PC-3體內(nèi)確立模型中顯著抑制腫瘤生長。如在第71天，即最后抗體劑量后44天時確定地(圖3)，與緩沖液處理組相比，用ARIUS抗體H460-16-2處理減少PC-3腫瘤生長61.9%(p=0.002414,t-檢驗)。腫瘤生長抑制通過用對照和處理組減去最初腫瘤體積計算。在整個研究過程中，不存在明顯的臨床毒性跡象。以每周時間間隔測量的體重是健康和不能健壯生長(failtothrive)的替代品。從研究的開始到結(jié)束，所有組中的平均體重均增加(圖4)。在第6天和第71天之間，平均體重在對照組中增加3.47g(14.3。/。)和在H460-16-2處理組中增加3.86g(15.1%)。在處理期間內(nèi)，各組間不存在顯著差別?？傊?，H460-16-2在這種人前列腺癌異種移植模型中是良好耐受的，并且單獨作為抗體，顯著抑制腫瘤生長。實施例3關(guān)于人MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的體內(nèi)腫瘤實驗以前證明了(如S.N.10/603,000中公開)H460-16-2針對MDA-MB-231人乳腺癌異種移植模型的功效。為了確定有效劑量水平，在確立的MDA-MB-231人乳腺癌異種移植模型中測試處于多種劑量的(ch)ARH460-16-2-IgGl。參考圖5禾B6，對8-10周齡雌性SCID小鼠通過在每只小鼠的右腰處皮下注射而植入在100微升PBS溶液中的500萬人乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231)。當(dāng)小鼠平均腫瘤體積達(dá)到約100mm3時，將小56鼠隨機分成5個處理組，每組10只。在植入后第ll天，在用含有2.7mMKC1，1mMKH2P04,137mMNaCl和20mMNa2HP04的稀釋劑從儲備的濃縮液稀釋后，對每組腹膜內(nèi)施用300微升體積的20、10、2或0.2mg/kg的(ch)ARH460-16-2-IgGl檢測抗體或緩沖液對照。然后，在約三周內(nèi)每周施用所述抗體和對照樣品三次。大約每4-7天用測徑器測量腫瘤生長。在IO劑抗體后，結(jié)束處理。在腫瘤測量的同時記錄動物的體重。在研究結(jié)束時，一旦它們達(dá)到終點，按照CCAC指導(dǎo)將所有動物處死。(ch)ARH460-16-2-IgGl證明了在人乳腺癌的MDA-MB-231體內(nèi)確立模型中的劑量依賴性腫瘤生長抑制和退化，第11天_第32天之間處理期間內(nèi)的最低劑量為0.2mg/kg，且在給藥后繼續(xù)維持腫瘤生長抑制。如在第55天，即最后抗體劑量后23天時確定地，與緩沖液-處理組相比，使用20、10、2或0.2mg/kg劑量的ARIUS抗體(ch)ARH460-16-2-IgGl處理分別以91.3，89.0,86.1或63.5%(p<0.00001,t-檢驗)減小MDA-MB-231腫瘤的生長(圖5)。在整個研究過程中，不存在明顯的臨床毒性跡象。以每周時間間隔測量的體重是健康和不能健壯生長的替代品。從研究的開始到結(jié)束，所有組中的平均體重均增加(圖6)。在第0天和第55天之間，平均體重在對照組中增力口2.33g(11.9%)和在劑量為20、10、2和0.2mg/kg的H460-16-2處理組中分別增加2.44g(12.8%),2.0g(10.0%),2,0g(10.5%),和2.0g(10.5%)。在處理期間內(nèi)，各組間不存在顯著差別?？傊?，(ch)ARH460-16-2-IgGl在這種人乳腺癌異種移植模型中在所有測試的劑量以劑量依賴性方式是良好耐受的，并且顯著抑制腫瘤生長并產(chǎn)生腫瘤尺寸的退化。實施例4人結(jié)腸腫瘤組織染色進(jìn)行了關(guān)于人結(jié)腸腫瘤組織的IHC研究，以進(jìn)一步評估H460-16-2與人癌癥的結(jié)合。進(jìn)行了IHC最優(yōu)化研究，從而確定其他實驗條件。利用人結(jié)腸腫瘤組織微陣列(Imgenex，圣地亞哥，CA)進(jìn)行H460-16-2與59份人結(jié)腸腫瘤組織的結(jié)合。組織切片通過在58°C溫箱中干燥1小時去石蠟并通過浸沒在科普林缸(Coplinjar)的二甲苯5次，4分鐘/次脫蠟。在通過一系列分級乙醇清洗(100%至75%)處理后，使切片在水中重新水合。將載玻片浸沒在10nM檸檬酸鹽緩沖液pH6(Dako，多倫多，安大略)中，然后以高、中、和低能量設(shè)置各微波處理5分鐘，并且最后浸沒在冷PBS中。然后將載玻片浸沒在3%過氧化氫溶液中6分鐘，用PBS清洗3次，5分鐘/次，干燥并在通用封閉溶液(Dako,多倫多，安大略)中室溫溫育5分鐘。H460-16-2，抗人肌肉肌動蛋白(克隆HHF35，Dako，多倫多，安大略),或同種型對照抗體(針對黑曲霉(力^^W〃w"/gw)葡糖氧化酶，即在哺乳動物組織中既不存在也不可誘導(dǎo)的酶；Dako,多倫多，安大略)在抗體稀釋緩沖液中(Dako，多倫多，安大略)稀釋到其工作濃度(除了抗肌動蛋白被稀釋到0.5微克/mL夕卜，每種抗體為5微克/mL)，并在濕潤室內(nèi)室溫溫育1小時。然后用PBS清洗載玻片3次，5分鐘/次。使用如提供的HRP綴合的二級抗體(Dako預(yù)見系統(tǒng)(DakoEnvisionSystem),多倫多，安大略)在室溫下檢測/顯現(xiàn)初級抗體的免疫反應(yīng)性30分鐘。在該步驟后，載玻片用PBS清洗3次，5分鐘/次，并且通過添加DAB(3,3'-二氨基聯(lián)苯胺tetrahydrachloride,Dako,多倫多，安大略)發(fā)色團底物溶液以在室溫下進(jìn)行免疫過氧化物酶染色10分鐘形成顏色反應(yīng)。在自來水中洗滌載玻片終止發(fā)色反應(yīng)。在用梅爾蘇木精(SigmaDiagnostics(西格瑪診斷)，Oakville,ON)復(fù)染色后，載玻片用分級乙醇(75-100%)脫水并用二甲苯透明化。利用封固劑(mountingmedia)(DakoFaramount,多倫多，安大略)圭寸蓋載玻片。禾!j用Axiovert200(Ziess加拿大，多倫多，ON)顯微鏡法檢驗載玻片，并用NorthernEclipseImagingSoftware(北方日食圖像軟件)(Mississauga，ON)獲得和保存數(shù)字圖像。由組織病理學(xué)家對結(jié)果進(jìn)行閱讀、評分和解釋。圖7顯示人結(jié)腸腫瘤組織陣列的H460-16-2染色結(jié)果的總結(jié)。由該表，36/59(61。/。)的測試腫瘤對于H460-16-2是陽性的。H460-16-2特異于腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)成纖維細(xì)胞(圖8)。細(xì)胞定位主要在膜和細(xì)胞質(zhì)膜。陽性細(xì)胞的百分比在<10%—>50%的范圍內(nèi)，這說明該抗體與腫瘤細(xì)胞的異源結(jié)合。不能準(zhǔn)確評估抗體結(jié)合和腫瘤階段(AmericanJointCommitteeonCancer,AJCCstaging)的關(guān)系，這歸因于不同腫瘤階段之間腫瘤數(shù)量的差異，即I,II,III和IV期分別為0/0,19/29(66%)，14/25(56%)禾卩3/5(60%)?？辜拥鞍?，作為陽性抗體對照，顯示出與肌肉組織預(yù)期的陽性結(jié)合。IgG同種型陰性對照顯示出與檢測組織的陰性結(jié)合。作為其結(jié)合結(jié)腸癌細(xì)胞的結(jié)果，H460-16-2的治療益處可以擴展到治療結(jié)腸癌。實施例5正常人和獼猴交叉反應(yīng)性進(jìn)行IHC研究，以表征正常獼猴組織上的H460-16-2抗原。使用抗體(ch)ARH460-16-2-IgGl(FITC，由LifeSpan標(biāo)記，西雅圖，WA,美國)和同種型對照抗體(Sigma(西格瑪)，由LifeSpan標(biāo)記，西雅圖，WA,美國)進(jìn)行抗體滴定實驗，以確定將導(dǎo)致最小背景和最大檢測信號的濃度。為了最優(yōu)化，以20微克/mL,10微克/mL,5微克/mL，和2.5微克/mL在福爾馬林固定的、石蠟包埋的和新鮮冷凍的組織上進(jìn)行連續(xù)稀釋?？贵w(ch)ARH460-16-2-IgGl和同種型對照抗體用作初級抗體，二級抗體是在兔中制備的抗-FITC抗體(DAKO，Mississauga,0N，加拿大)。主要檢測系統(tǒng)由具有DAB作為發(fā)色團的DAKOEnvision過氧化物酶標(biāo)記聚合物(DAKO，Mississauga，ON,加拿大)組成，其用于產(chǎn)生褐色沉淀。陰性對照由在缺乏初級抗體的條件下在相鄰切片上進(jìn)行完整免疫組化程序組成。用與尼康(Nikon)顯微鏡連接的DVC1310C數(shù)碼相機捕獲載玻片的高能量圖像。用裝備有萊卡(Leica)DMLA顯微鏡的LifeSpan專有成像儀(ALIASsystem)捕獲完整切片的圖像。用AdobePhotoshop將圖像作為TIFF文件保存?？贵w(ch)ARH460-16-2-IgGl在2.5微克/mL顯示出陽性人對照組織的強染色，更高抗體濃度時背景更高。因此，濃度2.5微克/mL用于進(jìn)一步免疫組化研究。同樣地，福爾馬林固定、石蠟包埋的組織顯示出比冷凍切片更少的背景染色；因此，固定的組織用于進(jìn)一步IHC研究?？傊?，由關(guān)于有限數(shù)量樣品的最優(yōu)化研究，信號存在于人和靈長類動物樣品的福爾馬林固定組織上，盡管人皮膚比靈長類動物皮膚組織更陽性染色。關(guān)于16份正常人和獼猴(血液、骨髓、腦、結(jié)腸、眼睛、心臟、腎、肝、肺、骨骼肌、卵巢、胰腺、皮膚、脾、睪丸和甲狀腺)福爾馬林固定石蠟包埋組織進(jìn)行擴展的IHC(圖9和10)。在人樣品中，(ch)ARH460-16-2-IgGl證明在下述細(xì)胞類型中對中度細(xì)胞質(zhì)或膜染色很微弱嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的子集、骨髓中的myeloidseries、漿細(xì)胞子集、II型肺細(xì)胞、表皮角化細(xì)胞和皮膚附器。白質(zhì)束也微弱陽性。微弱的細(xì)胞核染色見于神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)、腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、和睪丸和呼吸上皮之一的樣品。其他細(xì)胞類型和組織是陰性的，包括紅細(xì)胞系列和巨核細(xì)胞，神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)，結(jié)腸上皮，平滑肌，內(nèi)皮，成纖維細(xì)胞，除巨噬細(xì)胞外的眼睛，心臟，肝，卵巢，胰腺，骨骼肌，淋巴細(xì)胞和脾內(nèi)皮，和甲狀腺。IgG同種型對照抗體在測試的所有人組織中是陰性的。在猴組織內(nèi)，在許多組織中存在與人樣品相比更高水平的細(xì)胞核染色。也在嗜中性粒細(xì)胞、神經(jīng)元子集、結(jié)腸上皮細(xì)胞子集、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞子集、偶然收集的管、卵巢和眼睛中的多種細(xì)胞類型、精母細(xì)胞中觀察到對中等細(xì)胞質(zhì)染色很微弱。細(xì)胞核染色見于大多數(shù)也對細(xì)胞質(zhì)染色陽性的細(xì)胞類型中。以下細(xì)胞類型在缺乏細(xì)胞質(zhì)或膜染色的條件下表現(xiàn)出細(xì)胞核染色神經(jīng)膠質(zhì)，腦膜細(xì)胞，心肌細(xì)胞，腎小球和腎小管和腎管中的細(xì)胞子集，膽管上皮，呼吸上皮和肺細(xì)胞、和胰島。獼猴組織中的IgG同種型對照表現(xiàn)出神經(jīng)元中的微弱細(xì)胞核染色，和結(jié)腸和白質(zhì)束中神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的微弱細(xì)胞質(zhì)染色。當(dāng)比較這兩種物種之間的染色模式時，跨越若干細(xì)胞類型證明了獼猴樣品增加的細(xì)胞核染色，包括神經(jīng)元、心肌細(xì)胞、腎小管上皮、和膽管。關(guān)于細(xì)胞質(zhì)或膜染色，觀察到以下區(qū)別在獼猴結(jié)腸上皮細(xì)胞、神經(jīng)元、卵巢的卵母細(xì)胞和卵泡上皮，和精母細(xì)胞中觀察到略微增加的染色。人骨髓髓樣前體比獼猴樣品中觀察到的早期前體更加陽性。其他組織，包括外周血樣品、肺、骨骼肌、胰腺、皮膚、脾、和甲狀腺在獼猴和人樣品之間顯示出類似的染色。為了進(jìn)行在一些切片，特別是獼猴組織中的那些切片中過程的細(xì)胞核染色，關(guān)于人和獼猴肺、皮膚、和心臟組織，以2.5,1.25,0.6,0.3,0.15,0.08,和0.04微克/mL的(ch)ARH460-16-2-IgGl濃度使用冷凍切片，從而確定在膠原蛋白和結(jié)締組織中保持初級信號但降低背景的濃度，并還評估一些福爾馬林固定的組織中存在的細(xì)胞核染色。然后將處于該濃度的載玻片與以前關(guān)于這兩種物種中相同器官的福爾馬林固定組織的研究進(jìn)行比較。在濃度1.5微克/mL時，細(xì)胞核染色人和靈長類動物的福爾馬林固定組織樣品中均基本降低，且在冷凍樣品內(nèi)，細(xì)胞核染色大量缺乏，這強烈地提示福爾馬林固定的組織中普遍的細(xì)胞核染色是人工的，且歸因于方法學(xué)或固定人工制品?？傊?，嵌合抗體(ch)ARH460-16-2-IgGl與獼猴正常組織交叉反應(yīng)。實施例6交叉競爭研究為了進(jìn)一步表征H460-16-2和AR37A335.8(如S.N.11/364,013中公幵地)的結(jié)合特性，通過Western印跡進(jìn)行抗體競爭實驗，從而確定H460-16-2和AR37A335.8識別CD44的相似的還是不同表位。利用制備的孔梳，在非還原條件下對500微克MDA-MB-231總膜制劑進(jìn)行SDS-PAGE，所述孔梳橫跨2個10%聚丙烯酰胺凝膠的每一個的完整長度。將來自該凝膠的蛋白質(zhì)以150V，在4°C轉(zhuǎn)移到PVDF膜2小時。在旋轉(zhuǎn)平臺上用處于TBST中的5%脫脂奶，在4。C封閉該膜約17小時。該膜用約20mLTBST清洗2次，并置于產(chǎn)生20個單獨通道的Western多銀幕儀中，在其中應(yīng)用不同的探測溶液。以前，利用EZ-連接NHS-PEO固相生物素化試劑盒(Pierce,Rockford，IL)制備了生物素化的H460-16-2和AR37A335.8。初級抗體溶液通過混合生物素化的H460-16-2或生物素化的AR37A335.8和不同濃度的非生物素化的抗體而制備。具體地，制備溶液含有在處于TBST中的3%脫脂奶中的1微克/mL生物素化的H460-16-2加上2微克/mL，10微克/mL,100微克/mL,500微克/mL或1000微克/mL非生物素化的抗體。所用的非生物素化的抗體是H460-16-2,AR37A335.8和對照抗體1B7.11(同種型對照，抗TNP鼠IgGl，內(nèi)部純化)。含有1微克/mL生物素化的AR37A335.8的溶液利用以上列出的相同濃度的非生物素化的抗體AR37A335.8,H460-16-2和對照抗體8B1B.1(同種型對照，抗藍(lán)舌病病毒鼠IgG2b，內(nèi)部純化)制備。在搖動平臺上，將初級抗體溶液在所述膜上的單獨的通道內(nèi)室溫溫育2小時。在搖動平臺上，將每個通道用TBST清洗3次，IO分鐘。將處于61TBST中的3%脫脂奶中的0.01微克/mL過氧化物酶綴合的鏈霉抗生物素蛋白的二級溶液(Jacksonlmmunoresearch(杰克遜免疫研究)，WestGrove,PA)應(yīng)用到所述膜上的每個通道中。將該膜在二級溶液中，在搖動的平臺上室溫溫育l小時。在搖動平臺上，將每個通道用TBST清洗3次，10分鐘。將該膜從多銀幕儀中取出并用增強的化學(xué)發(fā)光檢測溶液(GEHealthcare(GE衛(wèi)生保健)，LifeSciences(生命科學(xué))，以前的AmershamBiosciences(Amersham生物科學(xué))，Piscataway,NJ)，按照制造商的指導(dǎo)，進(jìn)行溫育。然后對該膜進(jìn)行拍照和顯影。圖11和12顯示抗體競爭實驗的結(jié)果。生物素化的H460-16-2的結(jié)合，在與濃度為100微克/mL以上(IOO倍過量；圖11，圖A,泳道l-5)的非生物素化的H460-16-2混合時，受到完全地抑制，而生物素化的AR37A335.8的結(jié)合，在與濃度為10微克/mL以上(10倍過量；圖12，圖B，泳道6-10)的非生物素化的AR37A335.8混合時，受到完全地抑制。生物素化的H460-16-2的結(jié)合在任何含有IgGl同種型對照抗體的樣品中不受抑制(圖11，圖C，泳道11-15)，且生物素化的AR37A335.8的結(jié)合在任何含有IgG2b同種型對照抗體的樣品中不受抑制(圖12，圖C，泳道11-15)。這說明關(guān)于與相同非生物素化抗體混合的生物素化抗體觀察到的結(jié)合抑制歸因于抗原結(jié)合位點被非生物素化抗體，而不是單獨的過量抗體的非特異性相互作用而占據(jù)。生物素化的AR37A335.8的結(jié)合，在與濃度為500微克/mL以上(500倍過量;圖12,圖A,泳道l-5)的非生物素化的H460-16-2混合時，受到完全地抑制，且生物素化的H460-16-2的結(jié)合，在與所有測試濃度(圖11,圖B,泳道6-10)的非生物素化的AR37A335.8混合時，受到完全地抑制。這些結(jié)果說明H460-16-2的結(jié)合阻止AR37A335.8的結(jié)合，且反之亦然?？傊偁嶹estern印跡的結(jié)果提示CD44分子的由H460-16-2和AR37A335.8識別的表位是相同或在空間上彼此非常接近的，這樣一種抗體的結(jié)合可以完全封閉另一種抗體的結(jié)合。實施例7確定AR37A335.8與rhCD44的結(jié)合親和性AR37A335.8與重組CD44(rhCD44)的結(jié)合親和性通過表面等離振子共振(SPR)確定。利用標(biāo)準(zhǔn)胺偶聯(lián)程序固定重組人CD44/Fc(R&D系統(tǒng)，Minneapolis,MN,美國)。通過注射104微升0.4MEDC和0.1MNHS的1:1混合物(流速10微升/分鐘)激活CM5傳感器芯片(GEHea他care(GE衛(wèi)生保健),Piscataway,NJ，美國，以前的Biacore)的表面。rhCD44以20微克/mL(稀釋在10mM乙酸鈉，pH5.5)的濃度注射以達(dá)到約500RU。最后，在該表面上注射119微升1.0M乙醇胺-HClpH8.5，以封閉傳感器芯片表面上任何未占據(jù)的活化位點。注射不同濃度的AR37A335.8抗體。為了后繼注射再生傳感器芯片表面通過以50微升/分鐘的流速注射10mM甘氨酸-HC1pH2.070秒實現(xiàn)。抗體稀釋在運行緩沖液(HBS-EP+,GEHealthcare(GE衛(wèi)生保健)，Piscataway，NJ美國，以前的Biacore)中并以0.67-667nM范圍內(nèi)的濃度連續(xù)注射，并在每個周期之間再生表面。作為對照，也在參考表面上注射各種抗體濃度，其不使得rhCD44固定在該表面上。利用BiacoreT100評估軟件1.1版，利用簡單的1:1相互作用模型對獲得的sensograms進(jìn)行動力學(xué)分析。結(jié)合和解離率常數(shù)用于計算抗體的KD。實驗利用BiacoreT100系統(tǒng)(GEHealthcare(GE衛(wèi)生保健)，Piscataway,NJ美國，以前的Biacore)進(jìn)行。該實驗的結(jié)果關(guān)于AR37A335.8產(chǎn)生0.09425nM的KD圖13)。這些結(jié)果說明AR37A335.8具有處于納摩爾以下(sub-nanomolar)范圍內(nèi)的KD，且AR37A335.8的親和性高于H460-16-2的親和性(參考以下實施例IO)。還將結(jié)合率常數(shù)(Ka)和解離率常數(shù)(Kd)列表(圖13)。實施例8磷酸-RTK(受體酪氨酸激酶)蛋白質(zhì)組Profiler印跡為了確定受嵌合的(ch)ARH460-16-2-IgG1處理影響的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑，利用蛋白質(zhì)組profiler人磷酸-RTK抗體陣歹lJ(ARYOOl,R&DSystemsInc.(R&D系統(tǒng)公司)，Minneapolis,MN)對來自用(ch)ARJH460-16-2-IgGl處理的細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物進(jìn)行篩選。處理和制備細(xì)胞以前的工作(如S.N.11/364,013中公開地)利用在重度聯(lián)合免疫缺損小鼠(SCID)中生長的MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞，證明了(ch)ARH460-16-2-IgGl在乳腺癌異種移植模型中的體內(nèi)功效。因此，對胞內(nèi)信號傳導(dǎo)分子活性的篩選利用MDA-MB-231細(xì)胞系進(jìn)行。MDA-MB-231細(xì)胞生長至接近匯合，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，并然后在血清和增補齊U-缺乏的培養(yǎng)基中37°C饑餓過夜。此后，將(ch)ARH460-16-2-IgGl(20微克/mL)或人IgGl(Sigma-Aldrich，St.Louis,MI)(20微克/mL)加入到細(xì)胞中并容許在4°C結(jié)合20分鐘。然后通過向細(xì)胞中加入胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺和丙酮酸鈉以提供10。/。FBS,1%L-谷氨酰胺,和1%丙酮酸鈉的最終濃度來剌激細(xì)胞。將細(xì)胞置于37"C溫育器中并在刺激后1小時收集細(xì)胞溶胞產(chǎn)物。通過用PBS清洗細(xì)胞2次和在NP-40溶胞緩沖液(20mMTHs-HCl(pH8.0),137mM氯化鈉,10%甘油，2mMEDTA,1mM原釩酸鈉，10微克/mL牛胰蛋白酶抑制齊U，10微克/mL抑酶醛肽，1%NP-40(IgepalCA-630,Sigma-Aldrich,St.Louis,MI))中收獲來收集溶胞產(chǎn)物。通過吸移管吹吸重新混懸細(xì)胞，將其轉(zhuǎn)移到1.5mL微量離心管中并通過渦旋在4°C混合30分鐘。然后以14000xg離心溶胞產(chǎn)物5分鐘，并將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的管中。蛋白質(zhì)濃度通過二辛可寧酸(BCA)蛋白測定(Pierce,Rockford,IL)確定。人磷酸-RTK抗體陣列人磷酸-RTK抗體陣列按照制造商所述的流程，針對MDA-MB-231細(xì)胞溶胞產(chǎn)物篩選(第3修訂版，2005年11月，R&D系統(tǒng)抗體陣列ARYOOl)。簡言之，每種人磷酸-RTKprofiler膜通過在1.5mL陣列緩沖液1(Partno.895477:R&D系統(tǒng)抗體陣列ARY001)中，在搖動平臺搖動器中溫育1小時制備。對于每種處理，150微克總蛋白用陣列緩沖液l稀釋達(dá)到1.5mL的總體積。將該混合物加入到制備的profiler膜中，并在搖動平臺搖動器中4°C溫育過夜。然后在IX清洗緩沖液(由25X儲液(Partno.895003:R&D系統(tǒng)抗體陣列ARY001)在純化蒸餾水中稀釋)中清洗每個膜三次并與稀釋在IX陣列緩沖液2(5X陣列緩沖液2，Partno.895478:R&D系統(tǒng)抗體陣列ARY001)中的1.5mL抗磷酸酪氨酸-HRP檢測抗體混合物(Partno.841403:R&D系統(tǒng)抗體陣列ARY001)—起溫育2小時。在IX清洗緩沖液中清洗膜三次，并使其暴露于ECL+Western檢測試劑(GEHealthcare(GE衛(wèi)生保健),LifeSciences(生命科學(xué))，Piscataway,NJ)，以顯影。膜暴露于化學(xué)發(fā)光膠片(Kodak(柯達(dá))，Rochester,NY)并利用X-射線醫(yī)學(xué)處理器顯影。顯影的X-射線膠片上的磷酸-RTK陣列數(shù)據(jù)通過在發(fā)送模式掃描儀上掃描膠片和利用圖像J分析軟件(ImageJ1.37v,NIH)分析陣列圖像文件量化。對于每種RTK，利用膜上透明區(qū)域的像素密度計算關(guān)于相應(yīng)復(fù)制點的平均像素密度，并從背景信號中減去。對于各相應(yīng)磷酸-蛋白靶標(biāo)，(ch)ARH460-16-2-IgGl處理樣品的平均標(biāo)準(zhǔn)化像素密度除以同種型對照，人IgGl處理樣品的平均標(biāo)準(zhǔn)化像素密度，以獲得相對變化比。磷酸-蛋白信號的減少百分比通過由1減去相對變化比并乘以100確定。來自用(ch)ARH460-16-2-IgGl溫育的磷酸-RTK陣列的結(jié)果顯示在圖14中。與同種型對照相比，(ch)ARH460-16-2-IgGl處理用免疫球蛋白樣和EGF樣結(jié)構(gòu)域l(Tie-l)誘導(dǎo)RTK酪氨酸激酶磷酸化的減少(約51%)。Tie-1和Tie-2—起形成血管生成素、促進(jìn)血管發(fā)生的生長因子的受體。血管生成素與其受體的結(jié)合誘導(dǎo)Tie-1和Tie-2的磷酸化和啟動促進(jìn)細(xì)胞生長的細(xì)胞信號傳導(dǎo)。(ch)ARH460-16-2-IgGl在受到血清和增補劑刺激時，可以減少Tie-1的磷酸化，這提示(ch)ARH460-16-2-IgGl可以通過活化血管生成素/Tie-l/2受休配體復(fù)合物阻斷生長因子誘導(dǎo)細(xì)胞分化和腫瘤進(jìn)展。實施例9H460-16-2的人源化重組DNA技術(shù)利用本領(lǐng)域中公知的方法，和適當(dāng)時，這些方法中所用酶的廠商使用說明進(jìn)行。詳細(xì)實驗室方法也記述如下。利用多聚A束系統(tǒng)1000(PolyATractSystem1000)mRNA提取試劑盒(PromegaCorp.,Madison，WI)，按照制造商的說明，由雜交瘤H460-16-2細(xì)胞提取mRNA。反轉(zhuǎn)錄mRNA如下對于k輕鏈，5.0微升mRNA與1.0微升20pmol/微升MuIgG口VL-3，引物OL040(圖15)和5,5微升無核酸酶水(PromegaCorp.,Madison，WI)混合。對于人輕鏈，5.0微升mRNA與1,0微升20pmol/微升MuIgG口VL-3，引物OL042(圖15)和5.5微升無核酸酶水(PromegaCorp.,Madison,WI)混合。對于Y重鏈，5微升與1.0微升20pmol/微升MuIgGV『3，引物OL023(圖16)和5,5微升無核酸酶水(PromegaCorp.，Madison，WI)混合。將全部三種反應(yīng)混合物置于被設(shè)置為70°C的預(yù)熱的熱循環(huán)器塊中5分鐘。將這些在冰上冷凍5分鐘，隨后分別加入到4.0微升ImPromII5x反應(yīng)緩沖液(PromegaCorp,.Madison，WI)，0.5微升RNasin核糖核酸酶抑制劑(PromegaCorp,.Madison,WI),2.0微升25mMMgCl2(PromegaCorp,.Madison，WI),1.0微升10mMdNTP混合物(Invitrogen，Paisley,UK)和1.0微升ImpromII反轉(zhuǎn)錄酶(PromegaCorp.，Madison,WI)中。將反應(yīng)混合物在室溫下溫育5分鐘，隨后轉(zhuǎn)移到設(shè)置為42。C的預(yù)熱PCR塊中1小時。此后，通過在PCR塊中70°C溫育15分鐘熱滅活反轉(zhuǎn)錄酶。如下由cDNA擴增重鏈和輕鏈序列PCR總混合物通過將37.5微升10x高保真擴展PCR緩沖液(Roche(羅氏)，Mannheim,德國)，7.5微升10mMdNTP混合物(Invitrogen,Paisley,英國)和3.75微升高保真擴展DNA聚合酶(Roche(羅氏)，Mannheim,德國)加入到273.75微升無核酸酶水中制備。將該總混合物在冰上分配為容納在15個薄壁PCR反應(yīng)管中的21.5微升等分試樣。向這些管中的6個加入2.5微升MulgVH-3'反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物和1.0微升重鏈5，引物集合HA-HF(關(guān)于引物序列和引物集合組成參見圖16)。向另外7個管中加入2.5微升MuIgKVL-3'反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和1.0微升輕鏈5'引物集合LA-LG(圖15)。向最后的管中加入2.5微升MuIgKVL-3，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和1.0微升X輕鏈引物MuIgXVL5'-LI。將反應(yīng)置于熱循環(huán)器塊中并加熱到95。C2分鐘。進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)反應(yīng)在94°C進(jìn)行30秒，55°C進(jìn)行1分鐘和72°C進(jìn)行30秒的循環(huán)，進(jìn)行40次。最后在72。C加熱PCR產(chǎn)物5分鐘，并然后保持在4。C。利用pGEM-T易載體(easyVector)系統(tǒng)I(PromegaCorp.,Madison，WI)試劑盒，將擴增產(chǎn)物克隆到pGEM-T易載體中并測序。由此生成的VH和VL序列分別顯示在圖17和18中。為了生成嵌合抗體，利用引物OL437和OL438通過PCR擴增VH區(qū)基因(圖19);設(shè)計這些，從而利用來自所述cDNA克隆之一的質(zhì)粒DNA作為模板在5，Mlul和3'HindIII限制性酶位點中進(jìn)行改造。向0.5mLPCR管中，將5微升10x高保真擴展PCR緩沖液(Roche(羅氏)，Mannheim,德國)，1.0微升10mMdNTP混合物(Invitrogen,Paisley,英國)，0.5微升引物OL437,0.5微升引物OL438,1.0微升模板DNA禾P0.5微升高保真擴展DNA聚合酶(Roche(羅氏)，Mannheim,德國)加入到41.5微升無核酸酶水中。利用寡核苷酸OL439和OL090(圖20)以相似的方法擴增VL區(qū)，從而在BssHII和BamHI限制性酶位點中改造。將反應(yīng)置于熱循環(huán)器塊中并加熱到95。C2分鐘。進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)反應(yīng)在94。C進(jìn)行30秒，55。C進(jìn)行1分鐘和72°C進(jìn)行30秒的循環(huán)，進(jìn)行30次。最后在72°C加熱PCR產(chǎn)物5分鐘，并然后保持在4。C。然后，分別在Mlul/Hindlll和BssHII/BamHI位點處將PCR產(chǎn)物的VH禾QVL區(qū)分別克隆到雙載體pANT18(圖21)中。pANT18是基于pAT153的質(zhì)粒，其包含人Ig重鏈和輕鏈表達(dá)盒和dhfr選擇基因。所述重鏈盒由受hCMVie啟動子驅(qū)動的具有下游人IgG多聚A區(qū)的人基因組IgGl恒定區(qū)基因組成。所述輕鏈盒包含受hCMVie啟動子驅(qū)動的具有下游輕鏈多聚A區(qū)的基因組人k恒定區(qū)。人Ig引導(dǎo)序列和恒定區(qū)之間的克隆位點容許可變區(qū)基因的插入。pANT18還包含受SV40啟動子驅(qū)動的具有下游SV40多聚A區(qū)的倉鼠W#基因。人源化V區(qū)基因利用用于PCR的小鼠H460-16-2VH和VL模板構(gòu)建，所述PCR使用長重疊寡核苷酸引入來自同源人VH和VL序列的氨基酸。用于生成不同人源化VH和VL序列的寡核苷酸分別顯示在表19和20中。還將人源化變體直接克隆到表達(dá)載體pANTl8中。人源化VH和VL變體的序列分別顯示在圖22和23中。將由此產(chǎn)生的嵌合(ch)ARH460-16-2(VK0VH0)，和人源化構(gòu)建體通過電穿孔轉(zhuǎn)染到CHO/dhfr-細(xì)胞(ECACC，94060607)中，并在缺乏次黃嘌呤和胸苷的培養(yǎng)基(具有L-谷氨酰胺和丙酮酸鈉的高葡萄糖DMEM(Invi加gen,Paisley,英國)+5%滲析的FBS(目錄號26400-044Invitrogen,Paisley,英國)，脯氨酸(Sigma(西格瑪)，Poole,英國)和青霉素/鏈霉素(Invitrogen,Paisley,英國)中選擇。如通過下述人IgGl/k捕獲ELISA所測量地，基于在培養(yǎng)基中分泌的人IgG水平選擇集落。擴大選擇的集落并通過使用1mLHiTrapMabSelectSuRe柱(GEHealthcare(GE衛(wèi)生健康)，Amersham,英67國)的蛋白A親合層析法，遵照制造商建議的條件從細(xì)胞培養(yǎng)物上清中純化抗體。純化的抗體過濾滅菌，隨后+4。C保存(在PBSpH7.4中)?？贵w濃度通過使用純化的人IgGl/k(Sigma(西格瑪)，Poole,UK)作為標(biāo)準(zhǔn)物的hlgGl/kappa捕獲ELISA計算。免疫吸附96孔板(Nalgenunc,Hereford,英國)用在IXPBS(pH7.4)中以1:1500稀釋的小鼠抗人IgGFc-特異性抗體(16260Sigma(西格瑪)，Poole,UK)在37°C包被1小時。在PBS+0.05。/。吐溫20中清洗板三次，隨后加入稀釋在2。/oBSA/PBS中的樣品和標(biāo)準(zhǔn)物。室溫下溫育板1小時，隨后在PBS/吐溫中清洗三次并加入在2%BSA/PBS中以1:1000稀釋的100微升/孔檢測抗體山羊抗人k輕鏈過氧化物酶綴合物(A7164Sigma(西格瑪)，Poole,英國)。在室溫下溫育板1小時，隨后用PBS/吐溫清洗5次，并用OPD底物(Sigma(西格瑪)，Poole，英國)檢測結(jié)合的抗體。該測定在黑暗中顯影5分鐘，隨后通過加入3MHC1終止。然后在MRXTCII板讀數(shù)器(DynexTechnologies(Dynex技術(shù))，Worthing,英國)中在490nm讀該測定板。嵌合(ch)ARH460-16-2(VK0VH0)，和人源化變體抗體在利用H460-16-2小鼠抗體的基于ELISA的競爭測定中測試，利用生物素標(biāo)記物微型生物素化試劑盒(Biotintagmicrobiotinylationkit)(Sigma(西格瑪)，Poole，英國)生物素化。生物素化的小鼠H460-16-2用于在存在不同濃度的競爭抗體的條件下結(jié)合重組的人CD44(R&Dsystems(R&D系統(tǒng)),Abingdon,英國)。將重組人CD44以處于0.05M碳酸鹽緩沖液pH9.0(Sigma(西格瑪)，Poole,英國)中的5微克/mL，在+4。C，在免疫吸附96孔微滴定板(Nalgenunc,Hereford,英國)上固定過夜。將生物素化的小鼠H460-16-2抗體稀釋到0.2微克/mL并與處于0-20微克/mL濃度范圍內(nèi)的等體積的競爭抗體混合。CD44板在PBS+0.05。/。吐溫20中清洗3次。將100微升抗體混合物轉(zhuǎn)移到CD44包被的板的孔中，并將其在室溫下溫育1小時。清洗該板，并且通過加入鏈霉抗生物素蛋白-HRP綴合物(Sigma(西格瑪)，Poole,英國)(以l:500稀釋)和TMB底物(Sigma(西格瑪)，Poole,英國)檢測結(jié)合的生物素化的小鼠H460-16-2。該測定在黑暗中顯影5分鐘，隨后通過加入3MHC1終止。然后在MRXTCII板讀數(shù)器(DynexTechnologies(Dynex技術(shù))，Worthing,英國)中以450nm處的吸光度讀該說明書第59/67頁測定板。吸光度相對測試抗體濃度作圖，以提供圖24中所示的圖表。顯示出，嵌合(ch)ARH460-16-2(VK0VH0)抗體和2種人源化變體在與生物素化的H460-16-2抗體競爭結(jié)合重組CD44中與小鼠H460-16-2抗體等效。.實施例10確定鼠科H460-16-2和(hu)ARH460-16-2變體與rhCD44的結(jié)合親和性通過確定結(jié)合重組CD44(rhCD44)后各自的解離常數(shù)，比較H460-16-2:(hu)ARH460-16-2變體1禾卩(hu)ARH460-16-2變體2的結(jié)合親和性。利用標(biāo)準(zhǔn)胺偶聯(lián)程序固定重組人CD44/Fc(R&DSystems(R&D系統(tǒng)),Minneapolis,MN，美國)。通過注射104微升0.4MEDC和0.1MNHS的1:1混合物(流速10微升/分鐘)激活CM5傳感器芯片(GEHea他care(GE衛(wèi)生保健)，Piscataway,NJ美國以前的Biacore)的表面。以濃度20微克/mL(稀釋于10mM乙酸鈉pH5.5中)注射rhCD44以達(dá)到約500RU。最后，將119微升1.0M乙醇胺-HCLpH8.5注射到該表面上，從而封閉傳感器芯片表面上的任何未占據(jù)活化位點。注射不同濃度的H460-16-2,(hu)ARH460-16-2變體1或(hu)ARH460-16-2變體2。為了后繼注射再生傳感器芯片表面通過以50微升/分鐘的流速注射10mM甘氨酸-HClpH2.070秒實現(xiàn)?？贵w稀釋在運行緩沖液(HBS-EP+,GEHealthcare(GE衛(wèi)生保健)，Piscataway，NJ美國，以前的Biacore)中并以0.67-667nM范圍內(nèi)的濃度連續(xù)注射，并在每個周期之間再生表面。作為對照，也在參考表面上注射各種抗體濃度，其不使得rhCD44固定在該表面上。利用BiacoreT100評估軟件1.1版，利用簡單的1:1相互作用模型對獲得的sensograms進(jìn)行動力學(xué)分析。結(jié)合和解離常數(shù)用于計算抗體的KD。實驗利用BiacoreTlOO系統(tǒng)(GEHealthcare(GE衛(wèi)生保健)，Piscataway,NJ美國，以前的Biacore)進(jìn)行。這些實驗的結(jié)果關(guān)于鼠H460-I6-2產(chǎn)生4.19nM的數(shù)值，而發(fā)現(xiàn)(hu)ARH460-16-2變體HV1/KV1和(hu)ARH460-16-2變體HV2/KV1的KD分別為6.32和3.17nM(圖25)。這些結(jié)果說明所有抗體具有處于納摩爾范圍內(nèi)的KD，且人源化抗體的親和性類似于母體鼠H460-16-2的親和性。還將結(jié)合常數(shù)(Ka)和解離常數(shù)(Kd)列表(圖25)。實施例11分離競爭性結(jié)合劑給定抗體，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以產(chǎn)生競爭性抑制CDMAB，例如競爭性抗體，其是一種識別相同表位的抗體(BdangerL箏C//"/caC/n7m'c"Jcto^&75-M(1973))。一種方法需要(entails)用這樣的免疫原進(jìn)行免疫，所述免疫原表達(dá)被所述抗體識別的抗原。樣品可以包括，但不限于，組織、分離的蛋白或細(xì)胞系。得到的雜交瘤可以使用競爭測定進(jìn)行篩選，所述競爭測定是一種鑒定抑制測試抗體結(jié)合的抗體的測定，諸如ELISA，F(xiàn)ACS或蛋白質(zhì)印跡。另一種方法可以使用噬菌體展示抗體文庫，和淘選(panning)識別所述抗原的至少一個表位的抗體(RubinsteinJL等.年度生物化學(xué)""G/歷oc/zem)314:294-300(2003))。在每種情形中，基于抗體置換初始標(biāo)記抗體與其靶抗原的至少一個表位的結(jié)合的能力，選擇抗體。因此，這樣的抗體將如初始抗體一樣具有識別抗原的至少一個表位的特征。實施例12克隆H460-16-2單克隆抗體的可變區(qū)以前確定了來自由H460-16-2雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的單克隆抗體的重鏈(VH)和輕鏈(VO的可變區(qū)序列(如S.N.11/364,013中所公開)。為了生成嵌合和人源化IgG，可以將可變輕和可變重結(jié)構(gòu)域亞克隆到合適的載體中表達(dá)(如以上實施例9中所公開)。在另一個實施方案中，H460-16-2或其去免疫的、嵌合的或人源化的形式通過在轉(zhuǎn)基因動物中表達(dá)編碼所述抗體的核酸產(chǎn)生，從而表達(dá)并可以回收抗體。例如，抗體可以以促進(jìn)回收和純化的組織特異性方式表達(dá)。在一個該實施方案中，本發(fā)明的抗體表達(dá)在乳腺中，從而在哺乳期過程中分泌。轉(zhuǎn)基因動物包括但不僅限于小鼠、山羊和兔。(i)單克隆抗體使用常規(guī)方法容易地分離并測序編碼單克隆抗體(如以上實施例9中所公開)的DNA(例如，通過使用能夠特異性結(jié)合編碼所述單克隆抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。雜交瘤細(xì)胞作為這樣的DNA的優(yōu)選70來源。一旦分離，所述DNA可以置于表達(dá)載體內(nèi)，然后將其轉(zhuǎn)染到不另外產(chǎn)生免疫球蛋白的宿主細(xì)胞中，如大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞、猿猴COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、或骨髓瘤細(xì)胞中，以在重組宿主細(xì)胞中獲得單克隆抗體的合成。也可以修飾所述DNA，例如，通過人重鏈和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域編碼序列取代替換同源鼠序列。也可以使用合成蛋白質(zhì)化學(xué)中的已知方法，包括涉及交聯(lián)劑的那些方法，體外制備嵌合抗體或雜交抗體。例如，可以使用二硫化物交換反應(yīng)或通過形成硫醚鍵構(gòu)建免疫毒素。用于這一目的的適當(dāng)試劑的實例包括亞氨基硫羥酸鹽(iminothiolate)和甲基-4-巰基butyrimidate。(ii)人源化抗體人源化抗體具有從非人來源引入其中的一個或多個氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基通常稱為"引入"的殘基，其典型地來自"引入的"可變結(jié)構(gòu)域?？梢酝ㄟ^Winter及合作者的方法用嚙齒類CDRs或CDR序列取代相對應(yīng)的人抗體序列進(jìn)行人源化(Jones等，自然(Nature)321:522-525(1986);Riechmann等，自然(Nature)332:323-327(1988);Verhoeyen等，科學(xué)(Science)239:1534-1536(1988);在Clark,今日免疫學(xué)(Immunol.Today)21:397-402(2000)中的綜述)?？梢酝ㄟ^使用母體和人源化序列的三維模型分析母體序列和多種概念人源化產(chǎn)物的方法而制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型通常是本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的和熟悉的。圖解和展示所選候選免疫球蛋白序列的可能的三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計算機程序是可獲得的。這些展示的觀察允許分析殘基在所述候選免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即，分析影響候選免疫球蛋白與其抗原結(jié)合的能力的殘基。以這種方式，可以從共有和引入序列中選擇FR殘基且組合FR殘基，以便獲得需要的抗體特征，如對靶抗原增加的親和性。通常，CDR殘基直接且最顯著地(mostsubstantially)參與影響抗原結(jié)合。(Hi)抗體片段己經(jīng)開發(fā)了生產(chǎn)抗體片段的各種技術(shù)。這些片段可以通過重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生(綜述于Hudson,現(xiàn)代免疫學(xué)觀點(Curr.Opin.Immunol.)11:548-557(1999);Little等，今日免疫學(xué)(Immunol.Today)21:364-370(2000))。例如，F(xiàn)ab，-SH片段可以直接從大腸桿菌回收，并且化學(xué)偶聯(lián)以形成F(ab')2片段(Carter等,生物技術(shù)(Biotechnology)10:163-167(1992》。在另一個實施方案中，使用亮氨酸拉鏈GCN4促進(jìn)F(ab')2分子的組裝而形成F(ab')2。根據(jù)另一種方法，可以直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物分離Fv,Fab或F(ab')2片段。實施例13包括本發(fā)明的抗體的組合物本發(fā)明抗體可以用作預(yù)防/治療癌癥的組合物。所述包括本發(fā)明抗體的用于預(yù)防/治療癌癥的組合物可以作為它們采用液體制劑的形式施用，或作為適用于人或哺乳動物(例如，大鼠、兔、綿羊、豬、牛、貓、犬、猿猴、等等)的制劑的藥物組合物口服或腸胃外(例如，靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、等等)施用。本發(fā)明抗體可以以本身施用，或可以作為適當(dāng)?shù)慕M合物施用。用于所述施用的組合物可以包含藥用載體，和本發(fā)明抗體或其鹽，稀釋劑或賦形劑。這樣的組合物以適于口服或腸胃外施用的藥物制劑的形式提供。用于腸胃外施用的組合物的實例是可注射制劑、栓劑等。可注射制劑可以包括這樣的劑型，諸如靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)和肌內(nèi)注射，滴注，關(guān)節(jié)內(nèi)注射等等。這些可注射制劑可以通過公知方法制備。例如，可注射制劑可以通過將本發(fā)明抗體或其鹽溶解、混懸或乳化在常規(guī)用于注射的無菌水性介質(zhì)或油性介質(zhì)中而制備。對于水性注射介質(zhì)，存在如生理鹽水，含有葡萄糖和其他輔助試劑的等滲溶液等，其可以與適當(dāng)?shù)脑鋈軇┤绱?例如乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非離子表面活性劑(例如，聚山梨酸酯80,HCO-50(氫化蓖麻油的聚氧乙烯(50mols)加合物))等組合使用。對于油性介質(zhì)，使用例如芝麻油、大豆油等，其可以與增溶劑如苯甲酸節(jié)酯、苯甲醇等組合使用。這樣制備的注射劑通常裝在適當(dāng)?shù)陌碴持?。用于直腸施用的栓劑可以通過將本發(fā)明抗體或其鹽與常規(guī)用于栓劑的基質(zhì)混合而制備。用于口服施用的組合物包括固體或液體制劑，具體為片劑72(包括糖衣和薄膜包被的片劑)，丸劑、粒劑、粉末制劑、膠囊(包括軟膠囊)、糖漿、乳液、混懸液等。這樣的組合物通過公知方法制備，并且可以包含常規(guī)用在藥物制劑領(lǐng)域中的媒介物(vehicle)、稀釋劑或賦形劑(excipient)。用于片劑的媒介物(vehicle)或賦形劑(excipient)的實例包括乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸鎂等。有利地，將上述用于口服或腸胃外應(yīng)用的組合物制備成適于符合活性成分劑量的單位劑量的藥物制劑。所述單位劑量制劑包括，例如，片劑、丸劑、膠囊、注射劑(安瓿)、栓劑、等等。所包含的前述化合物的量通常為5-500mg/劑量單位形式；優(yōu)選地特別是在注射液形式中含有約5-約100mg的上述抗體，并且對于其他形式含有10-250mg的上述抗體。前述包括本發(fā)明抗體的預(yù)防性/治療性藥劑或調(diào)節(jié)劑的劑量可以取決于下列各項而不同被施用的受試者，目的疾病，病癥，施用途徑等等。例如，當(dāng)用于治療/預(yù)防目的時，例如，治療/預(yù)防成年人中的乳腺癌時，有利地以約0.01-約20mg/kg體重、優(yōu)選地約0.1-約10mg/kg體重且更優(yōu)選地約0.1-約5mg/kg體重的劑量靜脈內(nèi)施用本發(fā)明的抗體，約1-5次沃，優(yōu)選約1-3次沃。在其他腸胃外和口服施用中，所述藥劑可以以與上述劑量相對應(yīng)的劑量施用。當(dāng)病癥特別嚴(yán)重時，可以依據(jù)病癥增加劑量。斗、漢Wf幾1平wj"liA興日；5J現(xiàn)W迫35:Ji'日—，JtfJ7^工、/!M川。川丁川tf、J5且合物可以包含藥用載體與前述抗體或其鹽，稀釋劑或賦形劑。這樣的組合物以適于口服或腸胃外施用(例如，血管內(nèi)注射、皮下注射等)的藥物制劑的形式提供。上述每種組合物還可以包含其他活性成分。此外，本發(fā)明抗體可以與其他藥劑聯(lián)合使用，所述其他藥劑例如烷基化試劑(例如，環(huán)磷酰胺，異環(huán)磷酰胺(ifosfamide),等)，代謝拮抗劑(例如，甲氨喋呤，5-氟尿嘧啶，等)，抗腫瘤抗生素(例如，絲裂霉素，阿霉素，等)，植物來源的抗腫瘤藥(例如，長春新堿，長春地辛，泰素，等)，順鉑，卡鉑，依托泊苷，伊立替康，等。本發(fā)明抗體和上述藥物可以同時或以交錯的次數(shù)施用給患者。本文中所述的治療方法，特別是對于癌癥的，也可以同施用其他抗體或化療劑進(jìn)行。例如，也可以施用針對EGFR的抗體，諸如ERBITUX(西妥昔單抗(cetuximab))，特別是當(dāng)治療結(jié)腸癌時。ERBITUX⑧還顯示出73有效治療銀屑病。其他組合使用的抗體包括Herceptin(曲妥單抗)(特別是當(dāng)治療乳腺癌時)，AVASTDv^(特別是當(dāng)治療結(jié)腸癌時)，禾PSGN-15(特別是當(dāng)治療非-小細(xì)胞肺癌時)。施用本發(fā)明的抗體和其他抗體/化療劑可以同時，或者分別，通過相同或不同的途徑進(jìn)行。使用的化療劑/其他抗體方案包括認(rèn)為最佳適合于治療患者病癥的任何方案。不同的惡性腫瘤可以需要使用特異性抗-腫瘤抗體和特異性化療劑，所述特異性抗-腫瘤抗體和特異性化療劑應(yīng)該基于具體患者確定。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，化學(xué)治療與抗體治療同時，或更優(yōu)選地，化學(xué)治療在抗體治療后施用。然而，應(yīng)該強調(diào)的是，本發(fā)明不局限于任何具體的施藥方法或途徑。證據(jù)的優(yōu)勢表明H460-16-2、(ch)ARH460-16-2-IgG2和(ch)ARH460-16-2-IgGl通過與CD44上存在的表位連接而介導(dǎo)抗癌作用。以前還顯示，(如在S.N.10/647,818，現(xiàn)在的美國專利7,189,397中公開地)H460-16-2抗體可以用于從表達(dá)細(xì)胞諸如MDA-MB-231細(xì)胞免疫沉淀關(guān)聯(lián)抗原。此夕卜，可以表明，H460-16-2，(ch)ARH460-16-2-IgG2，(ch)ARH460-16-2-IgG1,(ch)ARH460-16-2(VKOVHO)或人源化變體，(hu)ARH460-16-2可以用于檢測表達(dá)與其特異性結(jié)合的CD44抗原部分的細(xì)胞和/或組織；這使用所示的但不限于FACS、細(xì)胞ELISA或IHC的技術(shù)。如用H460-16-2抗體，其他抗CD44抗體可以用于免疫沉淀和分離CD44抗原的其他形式，且抗原也可以用于利用相同類型的測定抑制那些抗體與表達(dá)該抗原的細(xì)胞或組織的結(jié)合。<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>本說明書中提及的所有專利和出版物象征本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的水平。所有的專利和出版物通過引用結(jié)合于此，以如同每篇單獨的出版物通過引用特別且獨立地指明結(jié)合的相同程度結(jié)合。應(yīng)該理解，盡管示例了本發(fā)明的某些形式，但是不限于本文所述和所示的部分的特定形式或安排。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，在不背離本發(fā)明的范圍的條件下可以進(jìn)行各種變化，并且本發(fā)明不應(yīng)該被視為限于在本說明書中所示和所述的內(nèi)容，這是顯而易見的。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該容易地理解本發(fā)明充分適合實施所述目標(biāo)并且獲得所提及的目的和益處以及其中固有的那些。本發(fā)明所述的任何寡核苷酸、肽、多肽、生物相關(guān)的化合物、方法、步驟和技術(shù)代表目前的優(yōu)選實施方案，意欲是示例性的，并且不意欲作為對范圍的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以實施其中的變化和其他應(yīng)用，所述變化和其他應(yīng)用包括在本發(fā)明的精神內(nèi)，并且由后附的權(quán)利要求的范圍限定。盡管己經(jīng)聯(lián)合特定優(yōu)選實施方案對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但是應(yīng)該理解所要求的本發(fā)明不應(yīng)該不適當(dāng)?shù)叵抻谒鎏囟▽嵤┓桨?。實際上，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的實施本發(fā)明的所述模式的各種改進(jìn)意欲被包括在后附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。ATCC_10801UniversityBlvd.Manassas,VA20110-2209.電話703-365-2700.傳真703-365-2745國際微生物保藏組織以專利程序為目的布達(dá)佩斯條約鄉(xiāng)諒潛按照細(xì)則Rule7.3發(fā)布原始保藏情形中的收據(jù)和按照細(xì)則Rule10發(fā)布的存活證明(譯文)致(保藏人或律師的名稱和地址),阿瑞斯研究公司律師:JenadeSousa-Hitzler55YorkStreet16thFloor多倫多，安大略省加拿大，M5J1R7保藏代表阿瑞斯研究公司保藏人給予的鑒定參考鼠雜交瘤H460-16-2鼠雜交瘤H460-22-1鼠雜交瘤7BDI-60專利保藏命名PTA-4621PTA-4622PTA-4623該保藏物伴隨—科學(xué)描述—以上指出的提議的分類描述。該保藏物于2002年9月4日由本國際保藏機構(gòu)接收，并已被接受。按照您的要求1我們將在30年中通知您關(guān)于該品系的請求。如果簽署布達(dá)佩斯條約的專利局確認(rèn)其接收的權(quán)利，或如果引用該品系的美國專利得到授權(quán)，該品系將成為可以獲得的，且ATCC在美國專利和商標(biāo)局或保藏人的指示下釋放該品系。如果該培養(yǎng)物在保藏有效期內(nèi)死亡或被破壞，您將負(fù)責(zé)用相同的活培養(yǎng)物替換它們。該品系將從保藏日期開始被維持至少30年，或最近一次要求樣品后5年，二者選較長的時期。美國和許多其他國家簽署布達(dá)佩斯條約。以上引用的培養(yǎng)物的存活于2002年9月6日檢測。在該日期時，該培養(yǎng)物是存活的。國際保藏機構(gòu)美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Manassas,VA20]10-2209美國。有權(quán)代表ATCC的人的簽字_日期2002年10月9日MarieHarris,專利專家，ATCC專利保藏cc:FerrisLander先生(參考目錄或案件號2056.009和美國系列號09/727361)7權(quán)利要求1.在哺乳動物中減少人乳腺或前列腺腫瘤的方法，其中所述人乳腺或前列腺腫瘤表達(dá)抗原的至少一個表位，所述抗原特異性結(jié)合由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC中的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的分離的單克隆抗體或其CDMAB，所述CDMAB的特征在于，競爭抑制所述分離的單克隆抗體與其靶抗原結(jié)合的能力，所述方法包括向所述哺乳動物施用有效導(dǎo)致所述哺乳動物乳腺或前列腺腫瘤負(fù)荷減小的量的所述單克隆抗體或其CDMAB。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述分離的單克隆抗體與細(xì)胞毒性部分綴合。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述細(xì)胞毒性部分是放射性同位素。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其CDMAB激活補體。5.權(quán)利要求1的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其CDMAB介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性。6.權(quán)利要求1的方法，其中所述分離的單克隆抗體是由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體的人源化抗體或由所述人源化抗體產(chǎn)生的抗原結(jié)合片段。7.權(quán)利要求1的方法，其中所述分離的單克隆抗體是由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體的嵌合抗體或由所述嵌合抗體產(chǎn)生的抗原結(jié)合片段。8.在哺乳動物中減少易受抗體誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性影響的人乳腺或前列腺腫瘤的方法，其中所述人乳腺或前列腺腫瘤表達(dá)抗原的至少一個表位，所述抗原特異性結(jié)合由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC中的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的分離的單克隆抗體或其CDMAB，所述CDMAB的特征在于，競爭抑制所述分離的單克隆抗體與其靶抗原結(jié)合的能力，所述方法包括向所述哺乳動物施用有效導(dǎo)致所述哺乳動物乳腺或前列腺腫瘤負(fù)荷減小的量的所述單克隆抗體或其所述的CDMAB。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述分離的單克隆抗體與細(xì)胞毒性部分綴10.權(quán)利要求9的方法，其中所述細(xì)胞毒性部分是放射性同位素。11.權(quán)利要求8的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其CDMAB激活補體。12.權(quán)利要求8的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其CDMAB介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性。13.權(quán)利要求8的方法，其中所述分離的單克隆抗體是由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體的人源化抗體或由所述人源化抗體產(chǎn)生的抗原結(jié)合片段。14.權(quán)利要求8的方法，其中所述分離的單克隆抗體是由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體的嵌合抗體或由所述嵌合抗體產(chǎn)生的抗原結(jié)合片段。15.在哺乳動物中減少人乳腺或前列腺腫瘤的方法，其中所述人乳腺或前列腺腫瘤表達(dá)抗原的至少一個表位，所述抗原特異性結(jié)合由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC中的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體或其CDMAB，所述CDMAB的特征在于，競爭抑制所述分離的單克隆抗體與其靶抗原結(jié)合的能力，所述方法包括向所述哺乳動物施用有效導(dǎo)致所述哺乳動物乳腺或前列腺腫瘤負(fù)荷減小的量的所述單克隆抗體或其所述的CDMAB以及至少一種化療劑。16.權(quán)利要求15的方法，其中所述分離的單克隆抗體與細(xì)胞毒性部分綴合。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述細(xì)胞毒性部分是放射性同位素。18.權(quán)利要求15的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其CDMAB激活補體。19.權(quán)利要求15的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其CDMAB介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性。20.權(quán)利要求15的方法，其中所述分離的單克隆抗體是由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體的人源化抗體或由所述人源化抗體產(chǎn)生的抗原結(jié)合片段。21.權(quán)利要求15的方法，其中所述分離的單克隆抗體是由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體的嵌合抗體或由所述嵌合抗體產(chǎn)生的抗原結(jié)合片段。22.單克隆抗體用于減小人乳腺、胰腺、卵巢、前列腺或結(jié)腸腫瘤負(fù)荷的應(yīng)用，其中所述人乳腺、胰腺、卵巢、前列腺或結(jié)腸腫瘤表達(dá)特異性結(jié)合分離的單克隆抗體或其CDMAB的抗原的至少一個表位，所述分離的單克隆抗體由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生，所述CDMAB的特征在于競爭抑制所述分離的單克隆抗體與其靶抗原結(jié)合的能力，所述應(yīng)用包括向所述哺乳動物以有效導(dǎo)致所述哺乳動物的人乳腺、胰腺、卵巢、前列腺或結(jié)腸腫瘤負(fù)荷減小的量施用所述單克隆抗體或其CDMAB。23.權(quán)利要求22的方法，其中所述分離的單克隆抗體與細(xì)胞毒性部分綴合。24.權(quán)利要求23的方法，其中所述細(xì)胞毒性部分是放射性同位素。25.權(quán)利要求22的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其CDMAB激活補體。26.權(quán)利要求22的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其CDMAB介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒作用。27.權(quán)利要求22的方法，其中所述分離的單克隆抗體是由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體的人源化抗體。28.權(quán)利要求22的方法，其中所述分離的單克隆抗體是由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體的嵌合抗體。29.單克隆抗體用于減小人乳腺、胰腺、卵巢、前列腺或結(jié)腸腫瘤負(fù)荷的應(yīng)用，其中所述人乳腺、胰腺、卵巢、前列腺或結(jié)腸腫瘤表達(dá)特異性結(jié)合分離的單克隆抗體或其CDMAB的抗原的至少一個表位，所述分離的單克隆抗體由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生，所述CDMAB的特征在于競爭抑制所述分離的單克隆抗體與其靶抗原結(jié)合的能力，所述應(yīng)用包括向所述哺乳動物以有效導(dǎo)致所述哺乳動物的人乳腺、胰腺、卵巢、前列腺或結(jié)腸腫瘤負(fù)荷減小的量施用所述單克隆抗體或其CDMAB以及至少一種化療劑。30.權(quán)利要求29的方法，其中所述分離的單克隆抗體與細(xì)胞毒性部分仝MA^又□o31.權(quán)利要求30的方法，其中所述細(xì)胞毒性部分是放射性同位素。32.權(quán)利要求29的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其CDMAB激活補體。33.權(quán)利要求29的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其CDMAB介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒作用。34.權(quán)利要求29的方法，其中所述分離的單克隆抗體是由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體的人源化抗體。35.權(quán)利要求29的方法，其中所述分離的單克隆抗體是由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體的嵌合抗體。36.減輕人乳腺、胰腺、卵巢、前列腺或結(jié)腸腫瘤的方法，所述腫瘤表達(dá)與分離的單克隆抗體特異性結(jié)合的人CD44抗原的至少一個表位，所述分離的單克隆抗體由具有ATCC保藏號PTA-4621的雜交瘤細(xì)胞系H460-16-2產(chǎn)生，所述方法包括向患有所述人腫瘤的個體施用至少一種分離的單克隆抗體或其CDMAB，所述分離的單克隆抗體或其CDMAB結(jié)合與由具有ATCC保藏號PTA-4621的雜交瘤細(xì)胞系H460-16-2產(chǎn)生的分離的單克隆抗體結(jié)合的表位相同的一種或多種表位；其中所述一種或多種表位的結(jié)合導(dǎo)致乳腺、胰腺、卵巢、前列腺或結(jié)腸腫瘤負(fù)荷的減小。37.減輕人乳腺、胰腺、卵巢、前列腺或結(jié)腸腫瘤的方法，所述腫瘤表達(dá)與分離的單克隆抗體特異性結(jié)合的人CD44抗原的至少一個表位，所述分離的單克隆抗體由具有ATCC保藏號PTA-4621的雜交瘤細(xì)胞系H460-16-2產(chǎn)生，所述方法包括向患有所述人腫瘤的個體施用至少一種分離的單克隆抗體或其CDMAB，以及至少一種化療劑，所述分離的單克隆抗體或其CDMAB結(jié)合與由具有ATCC保藏號PTA-4621的雜交瘤細(xì)胞系H460-16-2產(chǎn)生的分離的單克隆抗體結(jié)合的表位相同的一種或多種表位；其中所述施用導(dǎo)致腫瘤負(fù)荷的減小。38.確定選自人腫瘤的組織樣品中癌細(xì)胞的存在的結(jié)合測定，所述人腫瘤被由具有ATCC保藏號PTA-4621的雜交瘤細(xì)胞系H460-16-2產(chǎn)生的分離的單克隆抗體、由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體的人源化抗體或由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體的嵌合抗體特異性結(jié)合，所述結(jié)合測定包括提供來自所述人腫瘤的組織樣品；提供所述分離的單克隆抗體、所述人源化抗體、所述嵌合抗體或其CDMAB中的至少一種，其識別與由具有ATCC保藏號PTA-4621的雜交瘤細(xì)胞系H460-16-2產(chǎn)生的分離的單克隆抗體識別的表位相同的一種或多種表位；使至少一種所述提供的抗體或其CDMAB與所述組織樣品相接觸；并確定所述至少一種提供的抗體或其CDMAB與所述組織樣品的結(jié)合；由此指示所述癌性細(xì)胞在所述組織樣品中的存在。39.確定表達(dá)CD44的細(xì)胞的存在的結(jié)合測定，所述CD44被由具有ATCC保藏號PTA-4621的雜交瘤細(xì)胞系H460-16-2產(chǎn)生的分離的單克隆抗體、由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體的人源化抗體或由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體的嵌合抗體特異性識別，所述結(jié)合測定包括提供細(xì)胞樣品；提供由具有ATCC保藏號PTA-4621的雜交瘤細(xì)胞系H460-16-2產(chǎn)生的分離的單克隆抗體，所述人源化抗體，所述嵌合抗體或其CDMBAD;使所述分離的單克隆抗體或所述抗原結(jié)合片段與所述細(xì)胞樣品相接觸；禾口確定所述分離的單克隆抗體或其CDMAB與所述細(xì)胞樣品的結(jié)合；由此確定表達(dá)CD44的抗原的細(xì)胞的存在，所述CD44被所述分離的單克隆抗體或所述其CDMAB特異性結(jié)合。40.用于確定靈長類動物組織樣品中細(xì)胞存在的結(jié)合測定法，，所述靈長類動物組織樣品與由具有ATCC保藏號PTA-4621的雜交瘤細(xì)胞系H460-16-2產(chǎn)生的分離的單克隆抗體，由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體的人源化抗體或由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體的嵌合抗體特異性結(jié)合，所述結(jié)合測定包括提供來自所述靈長類動物的組織樣品；提供至少一種所述分離的單克隆抗體，所述人源化抗體，所述嵌合抗體或其CDMAB，所述分離的單克隆抗體，所述人源化抗體，所述嵌合抗體或其CDMAB識別與由具有ATCC保藏號PTA-4621的雜交瘤細(xì)胞系H460-16-2產(chǎn)生的分離的單克隆抗體所識別的那些相同的一個或多個表位；使至少一種所述提供的抗體或其CDMAB與所述組織樣品相接觸；和確定所述至少一種提供的抗體或其CDMAB與所述組織樣品的結(jié)合；由此指示所述組織樣品中存在所述癌細(xì)胞。41.用于減少癌細(xì)胞生長和存活的方法，所述癌細(xì)胞在細(xì)胞表面上表達(dá)CD44的至少一種表位，所述至少一種表位，在與由以PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體或由所述分離的單克隆抗體產(chǎn)生的抗原結(jié)合片段結(jié)合時，導(dǎo)致細(xì)胞毒作用，所述方法包括提供由以PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體或由所述分離的單克隆抗體產(chǎn)生的抗原結(jié)合片段，和使所述癌細(xì)胞與所述分離的單克隆抗體或所述抗原結(jié)合片段相接觸；由此細(xì)胞毒性作為所述分離的單克隆抗體或所述抗原結(jié)合片段與所述CD44的至少一個表位結(jié)合的結(jié)果發(fā)生。42.權(quán)利要求41的方法，其中所述分離的單克隆抗體與細(xì)胞毒性部分綴合。43.權(quán)利要求42的方法，其中所述細(xì)胞毒性部分是放射性同位素。44.權(quán)利要求41的方法，其中所述分離的單克隆抗體激活補體。45.權(quán)利要求41的方法，其中所述分離的單克隆抗體介導(dǎo)細(xì)胞毒作用。46.權(quán)利要求41的方法，其中所述單克隆抗體是由以PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體的人源化抗體或由所述人源化抗體產(chǎn)生的抗原結(jié)合片段。47.權(quán)利要求41的方法，其中所述單克隆抗體是由以PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體的嵌合抗體或由所述嵌合抗體產(chǎn)生的抗原結(jié)合片段。48.用于減少癌細(xì)胞生長和存活的方法，所述癌細(xì)胞在細(xì)胞表面上表達(dá)CD44的至少一種表位，所述至少一種表位，在與由以PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體或由所述分離的單克隆抗體產(chǎn)生的抗原結(jié)合片段結(jié)合時，導(dǎo)致細(xì)胞毒作用，所述方法包括提供分離的單克隆抗體，所述分離的單克隆抗體競爭抑制由以PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體或由所述分離的單克隆抗體產(chǎn)生的抗原結(jié)合片段的結(jié)合，并且在與所述CD44的至少一種表位結(jié)合時，導(dǎo)致細(xì)胞毒性；和使所述癌細(xì)胞與所述分離的單克隆抗體或所述抗原結(jié)合片段相接觸；由此細(xì)胞毒性作為所述分離的單克隆抗體或所述抗原結(jié)合片段與所述CD44的至少一種表位結(jié)合的結(jié)果發(fā)生。49.一種單克隆抗體，其特異性結(jié)合與由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體相同的一種或多種表位。50.—種分離的單克隆抗體或其CDMAB，其特異性結(jié)合人CD44，其中所述分離的單克隆抗體或其CDMAB與人CD44的一種或多種表位反應(yīng)，所述表位與由具有ATCC保藏號PTA-4621的雜交瘤細(xì)胞系H460-16-2產(chǎn)生的分離的單克隆抗體相同；所述分離的單克隆抗體或其CDMAB的特征在于競爭抑制所述分離的單克隆抗體與其靶人CD44抗原結(jié)合的能力。51.—種分離的單克隆抗體或其CDMAB，其識別與由具有ATCC保藏號PTA-4621的雜交瘤細(xì)胞系H460-16-2產(chǎn)生的分離的單克隆抗體識別的表位相同的一種或多種表位；所述單克隆抗體或其CDMAB的特征在于競爭抑制所述分離的單克隆抗體與其一種或多種耙表位結(jié)合的能力。52.—種人源化抗體，其特異性結(jié)合人CD44的一種或多種表位，所述表位與由具有ATCC保藏號PTA-4621的雜交瘤細(xì)胞系H460-16-2產(chǎn)生的分離的單克隆抗體相同，所述人源化抗體包括包括互補決定區(qū)氨基酸序列SEQIDNO:l,SEQIDNO:2，和SEQIDNO:3的重鏈可變區(qū)；和包含互補決定區(qū)氨基酸序列SEQIDNO:4，SEQIDNO:5，或SEQIDNO:6的輕鏈可變區(qū)；或其人CD44結(jié)合片段。53.—種人源化抗體，其特異性結(jié)合人CD44的一種或多種表位，所述表位與由具有ATCC保藏號PTA-4621的雜交瘤細(xì)胞系H460-16-2產(chǎn)生的分離的單克隆抗體相同，所述人源化抗體包括包括互補決定區(qū)氨基酸序列SEQIDNO:l,SEQIDNO:2，禾BSEQIDNO:3的重鏈可變區(qū)；和包含互補決定區(qū)氨基酸序列SEQIDNO:4,SEQIDNO:5，或SEQIDNO:6的輕鏈可變區(qū)；和來自人抗體或人抗體共有構(gòu)架的重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域構(gòu)架區(qū)；或其人CD44結(jié)合片段。54.特異性結(jié)合人CD44的人源化抗體，其中所述單克隆抗體包括SEQIDNO:7的重鏈可變區(qū)氨基酸序列；和選自SEQIDNO:8的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列；或其人CD44結(jié)合片段。55.有效治療人胰腺、前列腺、卵巢、乳腺或結(jié)腸腫瘤的組合物，包括處于組合形式的權(quán)利要求1,2,3,6，7,8，17，49,50或54中任一項的抗體或CDMAB;所述抗體或其抗原結(jié)合片段與選自由細(xì)胞毒性部分、酶、放射性化合物、細(xì)胞因子、干擾素、耙標(biāo)或報告部分和造血細(xì)胞組成的組中的成員的綴合物；和需要量的藥用載體；其中所述組合物有效治療所述人乳腺或前列腺腫瘤。56.有效治療人乳腺或前列腺腫瘤的組合物，包括處于組合形式的權(quán)利要求1，2,3,6,7,8,17,49,50或54中任一項的抗體或CDMAB;和需要量的藥用載體；其中所述組合物有效治療所述人乳腺或前列腺腫瘤。57.有效治療人乳腺或前列腺腫瘤的組合物，包括處于組合形式的權(quán)利要求1,2,3，6,7,8，17,49,50或54中任一項的抗體、抗原結(jié)合片段、或CDMAB與選自由細(xì)胞毒性部分、酶、放射性化合物、細(xì)胞因子、干擾素、靶標(biāo)或報告部分和造血細(xì)胞組成的組中的成員的綴合物；和需要量的藥用載體；其中所述組合物有效治療所述人乳腺或前列腺腫瘤。58.用于檢測人癌性腫瘤存在的測試試劑盒，其中所述人癌性腫瘤表達(dá)特異性結(jié)合分離的單克隆抗體或其CDMAB的抗原的至少一種表位，所述分離的單克隆抗體由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生，所述CDMAB的特征在于競爭抑制所述分離的單克隆抗體與其靶抗原結(jié)合的能力，所述試劑盒包括所述由以保藏號PTA-4621保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生的分離的單克隆抗體或其CDMAB，和用于檢測所述單克隆抗體或其CDMAB是否結(jié)合多肽的工具，所述多肽以特定截斷水平的存在診斷所述人癌性腫瘤的存在。全文摘要CD44，即單鏈透明質(zhì)酸(HA)結(jié)合糖蛋白，其表達(dá)在多種正常組織、全部造血細(xì)胞和若干癌癥組織中。針對來自雜交瘤H460-16-2的CD44的單克隆抗體，以前顯示為是減輕癌性疾病的抗體(CDMAB)，在癌癥模型包括前列腺癌和乳腺癌中通過細(xì)胞毒性抑制腫瘤生長和減小腫瘤負(fù)荷，所述雜交瘤H460-16-2以保藏號PTA-4621保藏在ATCC中。還分離和測序了該單克隆抗體的可變區(qū)，從而制備具有比該單克隆抗體提高的抗癌活性的嵌合抗體?，F(xiàn)在制備與母體PTA-4621單克隆抗體具有相似CD44結(jié)合活性的人源化抗體。所述單克隆、嵌合和人源化抗體可以與毒素、酶、放射性化合物、細(xì)胞因子、干擾素、靶標(biāo)或報告部分和造血細(xì)胞綴合，從而治療癌癥。這些抗體還用在結(jié)合測定中以確定CD44在細(xì)胞上的表達(dá)。文檔編號A61P35/00GK101687930SQ200880022591公開日2010年3月31日申請日期2008年5月23日優(yōu)先權(quán)日2007年5月30日發(fā)明者戴維·S·F·楊,海倫·P·芬德利,福爾圖娜塔·麥康基,蘇珊·E·哈恩,莉薩·M·切凱托申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司