用于皮膚增強的蘆薈制劑的制作方法

文檔序號：1144104閱讀：948來源：國知局

專利名稱：用于皮膚增強的蘆薈制劑的制作方法
用于皮膚增強的蘆薈制劑相關申請的交互參照本申請要求于2007年5月11日提交的美國臨時專利申請第60/928， 924號的優(yōu) 先權，在此通過弓I用將其公開內容并入本文。

背景技術：
在一個方面，本發(fā)明涉及從庫拉索蘆薈(Aloe vera)植物或其部分制備、分離、提取、以其為基礎或從其衍生的生物活性組合物用于皮膚增強和用于疼痛減輕的用途。本發(fā) 明還涉及免疫剌激性組合物、穩(wěn)定化的免疫剌激性組合物以及制備和使用所述組合物的方法。戸薈屬(百合科)是具有肉質長葉的灌木熱帶/亞熱帶植物。在超過360種已知的戸薈中，翠葉戸薈(Aloe barbadensis Miller)(庫拉索戸薈)由于商業(yè)和其治療性能而使用最廣泛。庫拉索蘆薈植物含有兩種主要的汁液材料第一種，含有高濃度的蒽醌化合物的黃色滲出液，其已經在數個世紀以來被用作泄藥和用于藥用清洗；第二種，透明的粘質凝膠，其自古以來就被用于治療燒傷和其他傷口，被認為可以提高愈合率并減少感染的風險。參見Grindlay，D. Reynolds, T. ， J. Ethnopharmcol. 1986， 16 (2-3) ， 117-151 ;和Joshi， S. P. ， J. Med. Aromat. Plant Sci. 1998， 20 (3) ， 768-773。數個世紀以來，蘆薈植物被認為具有并已經使用了其藥用和治療性能，而對于這些性能的基礎沒有任何明確的認識或科學分析。亞里斯多德(Aristotle)認識到，蘆薈的愈合性能對于戰(zhàn)斗中受傷的士兵是無價的，并建議他的學生亞歷山大三世(Alexander III(" the Great"))征服一切成長蘆薈的土地，尤其是東部非洲海岸的索科特拉島。 PedaniusDioscorides是羅馬軍隊中的醫(yī)生，在他的百科全書Greek herbal DeMateria Medica(大約75BC)中提到了藥用蘆薈。此外，已知新鮮蘆薈植物的生物活性衰退的相當迅速。過去的幾十年中，對于蘆薈的活性組分的了解產生了高度興趣，因為其在加強免疫功能方面提供了有益效果。在這個領域中的研究主要側重于多糖和諸如糖蛋白等其他含有碳水化合物的物質。根據美國專利第7， 196,072號(〃 '072專利〃 )、第5， 902， 796號、第4， 735， 935 號、第4， 851， 224號、第4， 917， 890號、第4， 957， 907號、第4， 959， 214號和第4， 966， 892號的記載，蘆薈葉的活性化學物質和混合物，包括例如多糖或其他含有碳水化合物的物質，已經被鑒定、分離和穩(wěn)定化。 —組活性化學物質被稱為庫拉索戸薈粘多糖(mucilaginouspolysaccharide)，其由多糖的混合物構成。術語"多糖"廣義上包括碳水化合物或單糖的低聚物和多聚物，并且在本文中以類似方式使用。一組這樣的多糖已被命名為乙?；事毒厶?acema皿an)。
根據文獻記載，乙?；事毒厶鞘强蓮腃arrington Laboratories, Inc. (Irving, Tex.)得到的基本上乙?；母事短菃误w的有序線性聚合物，并在實驗室研究中顯示出，在 48小時內將組織培養(yǎng)中的成纖維細胞復制增多至300%，已知成纖維細胞負責治愈燒傷、潰瘍和皮膚及胃腸道內襯(gastrointestinal lining)的其他傷口。
在三年時間內，對實驗室大鼠進行了測試，它的胃的反應類似于人類的。乙?；?露聚糖被發(fā)現相當于或優(yōu)于目前用于胃潰瘍治療的藥物。大多數這類產品起抑制胃中鹽酸的作用。乙?；事毒厶且圆煌砥鹱饔茫@然沒有改變消化酸的自然流動。參見美國專利第5， 902， 796號，第2欄，第20-25行。乙酰化甘露聚糖已被證實是通過在培養(yǎng)物中的人外周血貼壁細胞產生IL-I和前列腺素E2(PGE2)的誘導劑。IL-I是一種文獻報道的重要的巨噬細胞產物，影響淋巴細胞、成纖維細胞、B淋巴細胞和內皮細胞的活性和產生。參見01d， Scientific American, 258(5) :59-60,69-75(1988)。 IL-1誘導對于傷口愈合至關重要的成纖維細胞增殖。IL-1還(1)增強骨髓的活
性；它在骨髓降低的個體中可以是治療性的；和(2)通常增強免疫系統(tǒng)。根據文獻記載，使用混合的淋巴細胞培養(yǎng)物(MLC)的一系列實驗表明，乙?；?br> 露聚糖以劑量相關方式提高了這些淋巴細胞的同種抗原反應。單核細胞與乙?；事毒厶?br> 的孵育允許單核細胞驅動的信號增強T淋巴細胞對凝集素的反應。乙?；事毒厶菍LC
影響的相關研究表明，吞噬作用和自然殺傷細胞的活性增加。在這些體外測試系統(tǒng)中，乙酰
化甘露聚糖被認為是無毒性的并且是免疫增強劑。據稱，乙?；事毒厶秦菁ち馨图毎置诹馨鸵蜃?，并導致HIV-感染的淋巴細胞
通過類似于糖苷酶I抑制劑的機制產生改變的糖蛋白(GP-120)。參見Gruters等人，Nature
330 :74-77(1987)和Pal等人，Intervirol. 30 :27-35(1989)。乙?；事毒厶潜煌淌?，并
顯然被泵至單核細胞的高爾基/糖蛋白器，在那里直接干擾糖蛋白的合成。蘆薈產品的其他用途已被記載在例如美國專利第5， 106， 616號、第5， 118， 673號、
第5， 308， 838號、第5， 441， 943號和第5， 443， 830號中。所描述的研究主要偏重于庫拉索戸
薈的生物活性化學物質作為抗病毒藥物、抗腫瘤藥物、免疫增強劑、免疫調節(jié)劑、疫苗佐劑、
減少機會性感染的手段、控制炎癥的手段、剌激免疫系統(tǒng)和傷口愈合過程的手段的活性。在專利文獻中和他處，已經公開了基于從庫拉索蘆薈分離的含多糖部分的許多其
他產品。例如，據報道分子量為275， 000 374， 000道爾頓的聚糖醛酸酯可用于治療表面
傷口 (參見Farkas，A.，美國專利第3， 103,466號(1963))。另據報道，70kD的多糖Aloeferon也具有治療潛力(參見Madis， V. H. ;Omar， M. M. ;Madis， V.，美國專利第4， 861， 761號(1989))。從蘆薈分離的其他活性組分包括由等量葡萄糖和甘露糖構成的420，000 520，000道爾頓的多糖(參見Farkas， A.，美國專利第3， 362， 951號(1968))。
此外，幾個研究組已經用酶法從蘆薈中天然存在的碳水化合物制備了改變的多糖組合物(參見Strickland, F. M. ;Pelley， R. P. ;Kripke， M. L.，美國專利第5， 824， 659號 (1998))。庫拉索蘆薈多糖在受控研究中也顯示出提高動物愈合率。庫拉索蘆薈多糖在動物研究中也被證明可有效地治療胃潰瘍。庫拉索蘆薈凝膠的抗炎活性已通過口頭陳述和有關的科學雜志而被報道。 Rubel [Cosmetics and Toiletries, 98 :109-114 (1983)]討論了戸薈凝膠的抗炎作用的可能機制。Ukai等人，[Journal ofPharmacobio-Dynamics， 6 (12) :983-990(1983)]指出了從若干真菌的子實體提取的多糖的抗炎活性。據稱，這種多糖對角叉菜膠誘導的水腫表現出顯著的抑制作用。一種聚合物，0-乙酰化-D-甘露聚糖(T-2-HN)對于燙傷痛覺過敏也表現出比苯基丁氮酮更加顯著的抑制作用。Ukai等人，同上。這篇文章中的觀點(即多糖據說沒有蛋白和脂質)表明，抗炎作用僅是由于乙?；母事毒厶窃斐傻摹?
其他研究人員也報道了復合多糖[Saeki等人，Japanese Journal ofPharmacology，24(1) :109-118 (1974)]、糖蛋白[Arita等人，Journal ofBiochemistry， 76(4) :861-869(1974)]和硫酸化的多糖[Rocha等人，Biochemical Pharmacology, 18 : 1285-1295(1969)]的抗炎作用。因此，可能的是，庫拉索蘆薈植物組分粘質凝膠(其基本上是多糖)和其中的組分對庫拉索蘆薈的藥用性能負部分責任。據說一系列化學純化步驟解決了關于該多糖是否是葡甘露聚糖、甘露聚糖、果膠或者具有其他一些組成的爭議。Yagi等人，[Planta Medica，31 (1) : 17-20 (1977)]，使用略加修改的提取方法；從木立戸薈(Aloe arborescens Millervar. natalensis)分離出乙?；母事毒厶?戸薈甘露聚糖)。然而，Ovodova[Khim， Prior, Soedin， 11 (1) :325-331 (1975)]，更早地分離出作為同一蘆薈種的主要組分的果膠。
近來已經對庫拉索蘆薈凝膠進行了許多其他的藥理學研究。結果包括更快速愈合輻射燒傷[Rowe， J. Am. Pharm. Assoc. ，29 :348-350(1940)]和加速傷口愈合[Lushbaugh 等人，Cancer,6 :690-698(1953)]。用庫拉索戸薈凝膠處理熱燒傷愈合地比未經處理的燒傷快得多[Ashley等人，Plast. Reconstr. Surg. ，20 :383-396(1957)， Rovatto，同上， Rodriguez-Bigas等人，J. Plast. Reconstr. Surg. ，81 :386-389 (1988)]。這種凝膠可用于治療腿部潰瘍[El Zawahry等人，Int. J. Dermatol. ， 12 :68-73(1973)]和加速手術后愈合 (Payne，提交到貝勒大學學系(Waco， Tex.)的論文，碩士學位)。實驗證據表明，庫拉索蘆薈提取物具有抗感染特性[Solar，Arch. Inst. Pasteur Madagascar, 47 :9-39(1979)]和加強吞噬作用[St印anova， Fiziol. Akt. Veshchestva， 9 :94-97 (1977)]。
在蘆薈產品的商業(yè)加工和質量控制過程中，微生物分析被認為是一個重要的問題 (Waller TA等人，In Aloes :The genus Aloe ;ReynoldsT， Ed. ;CRC Press :NY，2004 ;第8 章，pp 139-205)。微生物可以源自諸如環(huán)境等外部來源和蘆薈植物本身的內部。內源性菌群是蘆薈內自然存在的微生物，在獨特的環(huán)境中進化生長良好。對內源性細菌的主要興趣在于控制其由于收獲后的不恰當處理方法(例如缺少巴氏殺菌或不正確的巴氏殺菌)導致的潛在過度生長。此外，已經強調指出，蘆薈產品中的高細菌負荷很可能會導致生物活性的損失。這已被如下觀察所報道，即高細菌含量(> 100，000生物體/克凝膠)與蘆薈保護皮膚免疫系統(tǒng)免于紫外線誘導抑制的能力的損失相關(Waller TA等人，InAloes :The genus Aloe ;Reynolds T， Ed. ;CRC Press :NY， 2004 ;第8章，pp 139-205)。本領域中的參考文獻記載了蘆薈中有關內毒素(也稱為脂多糖)污染的細菌組分，其在評價聲稱的活性物質(如乙?；事毒厶嵌嗵?的生物活性時作為混雜因素 (Confounding factor)。例如，Tizard(Tizard IR禾口 Ramamoorthy L. In Aloes :The genus Aloe ;Reynolds T，Ed. ;CRCPress :NY，2004 ;第13章，pp 311-332)強調了這一點"難于生產無污染內毒素的蘆薈碳水化合物溶液。對這種材料的早期研究中含有少但顯著量的細菌內毒素，并且有可能的是，歸因于乙?；事毒厶堑囊恍┥锘钚钥赡苁莾榷舅刈饔?。因此，蘆薈制劑中的細菌產物被認為是污染物。美國專利第5， 902， 796號描述了從庫拉索蘆薈獲得不同因子的多種方法和分離過程。所描述的一種因子被稱為"微顆粒因子(microparticulate factor)"，可通過使從蘆薈溶液的低速離心(180g)得到的上清液在20，000g下離心，作為沉淀獲得。也描述了使用過濾獲得這種因子的方法。這種微顆粒因子是巨噬細胞的活化劑。該微顆粒因子的大小估計約為1 P m。微粒(microparticles)的表征記載在后面的論文中(Ni Y等人，International Immunopharmacology，2004，4 :1745-1755)。據報告，微粒含有富半乳糖的多糖，組成如下 40. 2%的半乳糖，32. 2%的甘露糖，20. 6%的葡萄糖和其他次要糖。該論文將微粒鑒定為葉肉細胞的退化的細胞器，并總結如下"在通過均質化破壞漿肉之后，通過連續(xù)離心分離出三種組分。它們是薄的透明片、微粒和粘性液體凝膠，基于形態(tài)和化學分析，它們對應于葉肉細胞的細胞壁、退化的細胞器和液體內含物"。顯然，這些微粒不被認為是細菌，而是具有明確的碳水化合物組成，并且是植物結構組分(即，葉肉細胞的退化的細胞器)。
革蘭氏陽性微球菌細菌種類是最常見的蘆薈相關生物體。這些細菌在蘆薈植物內進化生長良好，而在其他環(huán)境中沒有很好地生長(Waller TA等人，In Aloes :The genus Aloe ;Reynolds T， Ed. ;CRC Press :NY， 2004 ;第8章，pp 139-205)。最近的研究表明，食入含有某些革蘭氏陽性細菌的食物會對免疫系統(tǒng)產生有益影響。對于酸奶和類似食物中發(fā)現的益生乳酸菌乳酸桿菌(Lactobacillus)和雙歧桿菌 (Bifidobacterium)菌株的攝入進行了最廣泛的研究(參見，Nutr Rev. ，2006,64:1-14)。這些免疫增強作用中的許多并不需要存活的細菌細胞，因為可以通過食入熱滅活生物體模仿所述作用。常常與變老有關的問題包括皮膚彈性損失以及肌肉或關節(jié)疼痛。這些癥狀可能是也可能不是相關的，盡管在了解衰老過程中正邁出重大多步，但很多仍是未知的。皮膚彈性治療在本質上往往只有化妝品。通過用化妝品覆蓋皮膚，在某些情況下可以獲得更年輕的外觀。有些產品實際上使松弛的皮膚膠粘在一起，從而顯得更緊。還有手術方法，在通常被稱為"拉皮(face-lifts)"的過程中可以包括去除多余的皮膚和/或收緊皮膚。然而，如果皮膚彈性可以通過使用攝入或局部施用的且實際上直接影響皮膚彈性的制劑而加以改善，那么手術可以推遲或完全避免，需要的化妝品可能更少。類似地，關節(jié)疼痛也有許多可能的病因，包括關節(jié)炎，并且有許多策略來治療它們。這些策略包括局部產品(topical products)、藥物制劑和甚至關節(jié)置換手術。但是，對于關節(jié)疼痛或皮膚彈性，仍然需要改進治療方法。如果活性成分是純天然的產品可用于提供主要減輕，或可與其他策略相結合，則這種結果將是高度期望的。

發(fā)明內容
在一個方面中，本發(fā)明涉及衍生于庫拉索蘆薈的表現出至少一定量免疫剌激活性的材料("IAvD")。如通過在濃度約250ii g/mL以下，THP-1單核細胞中NF-k B指導的熒光素酶表達測量的有資格作為IAvD所需的免疫剌激活性程度為，由濃度約10 g/mL的細菌脂多糖實現的最大NF-k B指導的熒光素酶表達的至少約50%。這種測量的標準是從 Sigma Chemical Co.獲得的細菌的粗脂多糖"ELPS"(大腸桿菌，血清型026 :B6)。
本發(fā)明的另一方面是組合物，其包括脂蛋白和脂多糖和任選地至少一種多糖的混合物，所有這些都可以從庫拉索蘆薈分離，盡管所述混合物可以合成產生。該混合物在本文稱為"PLL"。 IAvD和PLL混合物可以含有任意組合的兩種或更多種材料。這些混合物可以與藥物載體或賦形劑共混。在優(yōu)選的實施方案中，免疫剌激性組合物包括以下中至少任意兩種的混合物(1)衍生于蘆薈的多糖，(2)衍生于蘆薈的脂蛋白，和(3)衍生于蘆薈的脂多糖，所述混合物表現為由濃度約10 y g/mL的細菌脂多糖實現的最大NF- k B指導的熒光素酶表達的至少約50%的免疫剌激活性，其中該免疫剌激活性通過在濃度約250 ii g/mL以下，THP-1單核細胞中NF-KB指導的熒光素酶表達而測量。所述混合物可以包括衍生于蘆薈的多糖、衍生于蘆薈的脂蛋白和衍生于蘆薈的脂多糖。在優(yōu)選的實施方案中，PLL是特定的混合物，本文稱作〃 AloeEx〃，包括1) '072專利中公開的衍生于庫拉索蘆薈的多糖，特此通過引用將其公開內容并入，2)衍生于蘆薈的脂蛋白〃 ALP〃，和3)衍生于蘆薈的脂多糖〃 ALPS"。優(yōu)選地，這種混合物包括足夠的免疫剌激活性，從而有資格作為本文所述的IAvD。優(yōu)選地，PLL包括約0. 01% 約50%重量比的Aloeride多糖和約0. 0001 % 約10%重量比的ALP和ALPS(ALP和ALPS的總組合量)。在其他實施方案中，Aloeride多糖為約1%至約15%重量比，ALP和ALPS為約O. 0001% 約10%重量比。在另一個實施方案中，Aloeride多糖為IAvD的約10_15%重量比，ALP和ALPS為IAvD的約0. 0001% 約10%重量比。據認為，這些ALP和ALPS實際上來自與庫拉索蘆薈相關的微生物。還認為，ALP和ALPS具有獨立的免疫剌激性能。除了或者代替衍生于蘆薈的免疫剌激性多糖(其包括例如'072專利的那些)，還可以使用這些，以在治療或預防本領域此前所述的與在先蘆薈衍生物相關的任何狀態(tài)及其它中提供多種益處，所述狀態(tài)如治療燒傷和傷口、治療皮膚和胃腸道潰瘍、增強骨髓抑制個體中的骨髓活性、整體上增強免疫系統(tǒng)、作為抗病毒藥物、抗腫瘤藥物、免疫剌激劑、免疫調節(jié)劑、疫苗佐劑、減少感染的手段、控制炎癥的手段、剌激傷口愈合過程的手段、提高愈合率的手段、抑制燙傷痛覺過敏、輻射燒傷和熱燒傷的快速愈合、治療腿部潰瘍、加速術后愈合、抗感染應用、增強吞噬作用、治療免疫缺陷病癥、癌癥、傳染病或其他疾病和狀態(tài)、改善癥狀、降低肌肉和關節(jié)疼痛、改善代謝過程、改善皮膚的外觀、肌理、硬度和/或彈性、以及作為膳食補充劑或營養(yǎng)助劑。在本發(fā)明的另一個方面中，免疫剌激性組合物包括衍生于蘆薈的脂蛋白。所述衍生于蘆薈的脂蛋白表現出由濃度約10i! g/mL的細菌脂多糖實現的最大NF-k B指導的熒光素酶表達的至少約50%的免疫剌激活性，其中該免疫剌激活性通過在濃度約250ii g/mL以下，THP-1單核細胞中NF-k B指導的熒光素酶表達而測量。在本發(fā)明的另一個方面中，所述組合物是包括一種或多種IAvD的藥物組合物。在一個實施方案中，所述組合物是包括一種或多種PLL以及與PLL組合的藥物載體或賦形劑的藥物組合物。在優(yōu)選的實施方案中，PLL是AloeEx。這些藥物組合物可用于與PLL相關的以上所述的任何目的。根據本發(fā)明可以使用的某些IAvDs可能難以操作和配制。在分散或溶解特定的IAvD并產生其均質混合物方面可能會有問題。當配制劑型時，這特別地可以成為問題。非均質混合物存在使劑型至劑型并因而劑量至劑量的劑量變化處于不可接受水平的風險。因此，非常希望找到合適的加工助齊U、溶劑或賦形劑，所述加工助齊U、溶劑或賦形劑與IAvD相容，并且對IAvD的免疫剌激性能或穩(wěn)定性不會產生不利影響，并且更優(yōu)選不會不必要地稀釋活性，從而需要更大量的較昂貴的材料。根據本發(fā)明的另一個方面，各種"第二"材料可以與PLL或IAvD —起使用。已經發(fā)現，與"第二"材料的組合可以允許制備PLL或IAvD的均質分散液、乳液、懸浮液或溶液等。這些"第二"材料可以是也可以不是衍生于蘆薈的材料，并且的確可以是也可以不是IAvD，例如，它們可以不具備有資格作為本文定義的IAvD的足夠的免疫剌激性。
然而，在一個優(yōu)選的實施方案中，這些第二材料衍生于庫拉索蘆薈。特別地，已經發(fā)現，可以使用第二衍生于蘆薈的材料而分散、懸浮、乳化和/或溶解某些高度活性的第一IAvD，在一些優(yōu)選實施方案中，所述第二衍生于蘆薈的材料是第二 IAvD，例如，符合本文所述的對IAvD的活性要求的衍生于蘆薈的材料。在其他優(yōu)選實施方案中，第二材料是衍生于蘆薈的材料，其如果具有任何的免疫剌激活性，則表現出低于IAvD水平的活性。所述第二、非IAvD的衍生于蘆薈的材料通常具有顯著的多糖含量，其中約50%以上的多糖的分子量約1，500，000道爾頓以下。例如，250 ii g/ml的MagnAloe AG表現出小于25%的活化。此外，所述第二材料也應該改善或增強第一 IAvD的加工性。第二衍生于蘆薈的材料(不論是第二 IAvD或第二非IAvD)的用量應該是足以允許制備所需要的第一 IAvD的均質分散液、溶液、懸浮液或乳液的量。通常，相對于第一 IAvD和第二衍生于蘆薈的材料的重量百分比，需要至少約10%的該第二衍生于蘆薈的材料。在根據本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，第一材料是PLL，第二材料是非IAvD、具有上述多糖含量(通常至少50%小于1， 500， 000道爾頓)并允許形成穩(wěn)定的均質分散液、溶液、懸浮液或乳液的衍生于蘆薈的材料。在特別優(yōu)選的實施方案中，PLL是AloeEx，第二材料是MagnAloeAG。還涉及制備這些制劑的方法。在本發(fā)明的再一個方面中，提供治療肌肉或關節(jié)疼痛、用于改善皮膚的外觀、肌理、硬度和/或彈性和/或用于提供新皮膚細胞的加速生長的方法，包括給予有此需要的個體治療劑量的IAvD或PLL組合物。組合物可以口服、局部或透皮給予，每天一次或數次，可以單獨給予、與藥學上可接受的載體或賦形劑一起給予和/或與其他活性或非活性成分一起給予。在這方面的一個實施方案中，IAvD是PLL。
在一個特定的實施方案中，PLL是AloeEx。在另一個實施方案中，IAvD組合物包括衍生于蘆薈的多糖或多糖的混合物，例如但不限于'072專利中記載的衍生于蘆薈的多糖。本發(fā)明的另一個方面是制備IAvD的方法，包括提供庫拉索蘆薈來源材料；從庫拉索蘆薈來源材料提取液體蘆薈溶液；過濾液體蘆薈溶液；加入絮凝劑，從而產生含有微生物或微生物組分/碎片的聚集體；和收集聚集體。在另一個實施方案中，可以處理收集的聚集體，以除去可能存在的蒽醌類。
在一個實施方案中，庫拉索蘆薈來源材料選自庫拉索蘆薈凝膠、全葉庫拉索蘆薈、庫拉索蘆薈外皮、庫拉索蘆薈粘液和庫拉索蘆薈幼體(pup)。庫拉索蘆薈幼體是小的庫拉索蘆薈植物，常被認為是廢品。
在優(yōu)選的實施方案中，庫拉索蘆薈來源材料包括庫拉索蘆薈外皮和庫拉索蘆薈粘液?？梢允褂闷渌J薈基材料，如常被認為是廢棄材料的來自其他過程的用過的蘆薈材料。
在本發(fā)明的另一個方面中，制備化學標準化的衍生于庫拉索蘆薈的材料的方法包括提供衍生于庫拉索蘆薈的材料；測定衍生于庫拉索蘆薈的材料中的2， 3_ 二羥基丙基半胱氨酸的含量；和將衍生于庫拉索蘆薈的材料中的2，3-二羥基丙基半胱氨酸的量與標準制劑中的2，3-二羥基丙基半胱氨酸的量作比較，從而確定衍生于庫拉索蘆薈的材料的標準化值。在一個實施方案中，所述方法還包括在測定衍生于庫拉索蘆薈的材料中的2，3_ 二羥基丙基半胱氨酸的含量之前，純化衍生于庫拉索蘆薈的材料. 在本發(fā)明的再一個方面中，制備生物標準化的衍生于庫拉索蘆薈的材料的方法包括提供衍生于庫拉索蘆薈的材料；測定衍生于庫拉索蘆薈的材料的免疫細胞的活化水平；和將衍生于庫拉索蘆薈的材料的活性水平與標準免疫剌激性值作比較，從而確定衍生于庫拉索蘆薈的材料的標準化活性值。在一個實施方案中，所述方法還包括在測定衍生于庫拉索蘆薈的材料的免疫細胞的活化水平之前，純化衍生于庫拉索蘆薈的材料。在本發(fā)明的另一個方面中，增強免疫功能的方法包括給予有此需要的個體治療劑量的至少一種IAvD。

圖1示出占總碳水化合物摩爾％的AloeEx批號56 (ALOE 056)的糖基殘基組成。
圖2示出按秒計的平均皮膚反彈時間的統(tǒng)計顯著降低(皮膚彈性或硬度提高的指標)。圖3示出按性別和年齡的皮膚彈性研究的人口統(tǒng)計學。
圖4示出研究小組成員的人口統(tǒng)計學。
圖5示出測量隨機化參數。
圖6示出治療/組隨機化。圖7A-圖7D示出對于試驗材料組和安慰劑組的彈性測量儀(Cutometer)測量的統(tǒng)計分析。圖8A-圖8B示出分配到積極治療的測試受試者的問巻調查結果。圖9A-圖9B示出分配到安慰劑治療的測試受試者的問巻調查結果。圖10A-圖10B示出TLR2參與AloeEx的NF_ k B活化。圖11示出THP-1細胞對AloeEx (批號056)和AloeEx粗部分的反應。圖12示出AloeEx苯酚層部分的4% SDS提取物的蛋白酶K消化和SDS聚丙烯酰
胺凝膠分析。圖13示出AloeEx苯酚層部分的4% SDS提取物的脂蛋白脂肪酶消化。
圖14示出THP-1細胞對不同的庫拉索戸薈葉部分的反應。
具體實施例方式
雖然本說明書以特別指出和明確要求保護本發(fā)明的權利要求書作為結束，但是據認為，從下面的說明可更好地理解本發(fā)明。除非另有指定，本文所用的所有百分比和比率均按總組成的重量計，并且所有測
量均在25t:和常壓下進行。除非另有指明，所有溫度均為攝氏度。本發(fā)明可以包括(開放式)本發(fā)明的組分以及本文所述的其他成分或要素，或者基本上由它們構成。本文所用的"包括"指引述的要素，或其結構或功能的等同物，加上未引述的任何其他的一個或多個要素。術語"具有"和"包括"也應解釋為開放式的，除非上下文另有提示。本文所用的"基本上由...構成"是指，本發(fā)明可以包括除了權利要求所引述之外的成分，但只有當另外的成分沒有實質上改變所要求保護的發(fā)明的基本和新穎特征時。優(yōu)選地，這些添加劑根本不存在或僅存在微量。然而，可以包括重量高達約10%重量比的可能會實質上改變發(fā)明的基本和新穎特征的材料，只要組合物的實用性(而不是效用度)得以保持。本文引述的全部范圍均包括端點，包括引述在兩個值之間的范圍的那些。諸如"大約"、"通常"和"基本上"等都被解釋為修飾術語或值，使得它們不是絕對的，但是不包括現有技術。這類術語應根據它們所修飾的情況和術語限定，而那些術語是本領域技術人員可以理解的。最低限度，這包括對于用來測量一個值的給定技術而言，預期的實驗誤差、技術誤差和儀器誤差的程度。應指出，雖然本說明書和權利要求書可以指本發(fā)明的例如含有顆粒(具有一定的粒徑或分布)或某種類型的例如填料的片劑或其他劑型，但是可能很難分辨滿足引述的最終劑型。然而，例如，如果使用的材料在最終混合和配制之前滿足這一引述，則可以滿足這樣的引述。在另一個實例中，雖然可能很難知道在最終劑型中實際存在的包衣對包被顆粒貢獻的重量增加或其粒徑分布，但是如果確定，用來制備劑型的包被顆粒在例如最終混合和壓縮步驟之前(在片劑情況下)的確表現出所需的包衣水平和/或粒徑，則是充分的。
實際上，可能很難建立特定組分在特定制劑中的含量，或者特定組分在最終制劑中的活性。如果這可以基于起始或中間材料建立，則是充分的。實際上，對于任何無法從最終產品直接確定的性能，如果這種性能剛好在最終制備之前的制劑中存在，則是充分的?？梢岳斫獾氖?，足以如本文所述定義IAvD的免疫剌激活性可以在配制之前或之后的任何時間建立。本文所用的治療和/或改善，當用于關節(jié)疼痛或皮膚彈性或者本文所述的確實其他狀態(tài)時，指關節(jié)或肌肉疼痛的任何減輕(無論長期或者臨時的，持久或短暫的)，或皮膚彈性的任何增加，這些都可以歸因于PLL和/或IAvD組合物的給予或與PLL和/或IAvD組合物的給予有關。治療和改善還包括本文所述產品在防止狀態(tài)或其復發(fā)中的應用。還要注意改善和治療可以互換使用，除非文本或上下文另有所指。特別地，為在本文中有資格作為IAvD，材料必須對組合物的免疫剌激性能作出實質貢獻。本文中所使用的短語，對組合物的免疫剌激性能"作出實質貢獻"指本文所述的免疫剌激作用。本文所用的術語免疫剌激性、免疫剌激作用或免疫剌激性能和/或活性指根據本發(fā)明的IAvD引起巨噬細胞活化的能力，特別是如前所述的、由THP-1單核細胞中NF-kB指導的熒光素酶表達的表達增加所指示的免疫剌激活性(相當于在濃度250 g/mL以下，10 g/mL的ELPS的約50% )。這可基于任何單獨的衍生于戸薈的組分或其集合物或其混合物來測量。因此，活性可以例如反映衍生于蘆薈的多糖或其與ALP和/或ALPS組合的活性。測量這種類型的巨噬細胞活化的方法公開在'072專利，第5欄第12行至第6欄第22行中，通過引用并入本文。通常，巨噬細胞活化可以在THP-1人單核細胞中使用熒光素酶報告基因檢測進行測量。這種檢測測量通過NF- k B驅動的熒光素酶報告基因的表達增加所指示的免疫剌激活性。在37"、5% 0)2和95%空氣下，在用胎牛血清(10% v/v)和丁胺卡那霉素(60mg/L)補充的RPMI1640-培養(yǎng)基中培養(yǎng)THP-1細胞。使用DEAE-葡聚糖(10 y g/1 X 106細胞)和含有NF-kB的兩個結合位點的pBIIXLUC報告基因質粒(IP g/lXl()6細胞)瞬時轉染積極生長的細胞。將含有THP-l細胞的轉染溶液在37t:水浴中溫育7分鐘。然后，將轉染的細胞重懸浮在10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，并以2 X 105細胞/孔的細胞密度鋪在96孔板中。24小時后，將測試樣品加到轉染的細胞中。加入樣品4小時后，收獲細胞，并測量熒光素酶活性。使用Packard過濾板收獲細胞，并使用30 iiL的熒光素酶混合物(1 : 1，LucLiteTM熒光素酶lXPBS，lmM Ca和Mg)使其裂解。使用單光子模式的Packard微孔板閃爍計數器測量熒光素酶光發(fā)射。活化報道為相對于10yg/mL ELPS(作為陽性對照)造成的NF-k B的最大活化的百分比。其他檢測方法也包括在本發(fā)明中。
本文所用的術語非免疫剌激性的衍生于庫拉索蘆薈的材料和表明這種概念的其他詞語定義作沒有滿足本文定義的IAvD的免疫剌激性要求的衍生于庫拉索蘆薈的材料。
術語衍生于蘆薈的脂蛋白或〃 ALP〃指庫拉索蘆薈內源細菌的細菌脂蛋白。這并不意味著，細菌必須來自庫拉索蘆薈，因為細菌也可以單獨培養(yǎng)或培育。革蘭氏陽性微球菌的細菌種類是最常見的蘆薈相關生物體。這些細菌在蘆薈植物內進化生長良好，而在其他環(huán)境中沒有很好地生長(Waller TA等人，In Aloes :The genus Aloe ;Reynolds T，Ed. ;CRCPress :NY， 2004 ;第8章，pp 139-205)。革蘭氏陽性細菌含有脂蛋白，但沒有脂多糖。如本文所公開的，脂蛋白被認為是革蘭氏陽性細菌對體外巨噬細胞活化的重大貢獻者。由于革蘭氏陽性菌是蘆薈中細菌的最常見類型，因而脂蛋白代表了衍生于蘆薈的重要積極分子。
最近的研究表明，食入含有某些革蘭氏陽性細菌的食物會對免疫系統(tǒng)產生有益影響。對于酸奶和類似食物中發(fā)現的益生乳酸菌乳酸桿菌(Lactobacillus)和雙歧桿菌(Bifido bacterium)菌株的攝入進行了最廣泛的研究(參見，Ezendam和van Loveren，Nutr Rev. ，2006,64 :1_14)。這些免疫增強作用中的許多并不需要存活的細菌細胞，因為可以通過食入熱滅活生物體模仿所述作用。本文所用的術語衍生于庫拉索蘆薈的脂多糖和ALPS指包括通過共價鍵連接的脂質和多糖(碳水化合物)的大分子。ALPS是庫拉索蘆薈中發(fā)現的或與其有關的革蘭氏陰性細菌外膜的主要組分，其對細菌的結構完整性作出了重大貢獻，并保護膜免受某種化學攻擊。ALPS是內毒素，誘導正常動物免疫系統(tǒng)的強烈反應。 LPS通常起原型內毒素的作用，因為它結合CDl 4/TLR4/MD2受體復合體，所述CD14/TLR4/MD2受體復合體促進許多細胞類型中但尤其是在巨噬細胞中的促炎性細胞因子分泌。免疫學中的"LPS攻擊(challenge)"是使受試者暴露于可能起毒素作用的LPS。 LPS也增加了細胞膜的負電荷，并有助于穩(wěn)定整體膜結構。LPS還是外源熱源(外部發(fā)熱誘導組合物)。ALP不同于ALPS(其也是本發(fā)明的PLL的所需組分)，因為它們的免疫剌激活動被認為是通過Toll樣受體2介導的，而ALPS被認為是通過Toll樣受體4介導的。
—些IAvD組合物沒有對組合物的免疫剌激性能起實質性貢獻的ALP或ALPS存在。然而，其他IAvD組合物不包括多糖，但非對組合物的免疫剌激性能起實質性貢獻的ALPS。還有一些IAvD組合物僅具有對組合物的免疫剌激性能起實質性貢獻的ALP。
優(yōu)選地，有多糖、ALP和/或ALPS中的兩種或更多種，它們中的任一種或所有單獨或協同地對IAvD組合物的免疫剌激活性起實質性貢獻。 —些IAvD組合物包括具有免疫剌激活性的衍生于微生物(如在庫拉索蘆薈中發(fā)現的或與其有關的某些細菌、酵母菌、真菌、霉菌等)的ALP和/或ALPS。這些ALP和ALPS也可以從已經培養(yǎng)的微生物回收，只要該屬和種可在庫拉索蘆薈中發(fā)現或與其有關?？稍趲炖魈J薈植物上或其內發(fā)現的這些ALP和ALPS可被濃縮或合成，可以與多糖一起使用或代替多糖使用，以在關節(jié)和肌肉疼痛等的治療中，和增強皮膚的外觀、肌理、硬度和/或彈性中提供多種益處。含有衍生于蘆薈的多糖(如在'072專利中記載的)以及ALP和APLS的PLL的這些用途也包括在本發(fā)明中。本文所用的術語衍生于蘆薈的材料，指庫拉索蘆薈中包含的或其上存在的任何材料，包括但不限于衍生于蘆薈的多糖、脂蛋白和脂多糖。所述材料可以從蘆薈植物分離出來和/或被合成。本文所用的術語合成的或被合成，指人造和/或制造的并具有與天然存在的那些材料相同或類似組成的材料。在ALP和ALPS的情況下，也指單獨培養(yǎng)的。
本文所用的術語〃 AloeEx〃指從庫拉索蘆薈提取的或合成產生的免疫剌激性PLL混合物，包括'072專利的多糖以及ALP和ALPS。諸如AloeEx的PLL可以從庫拉索戸薈葉的外皮和/或粘液(即，內部凝膠和外部外皮之間的區(qū)域)中分離出來，并可以從蘆薈廢棄材料(即，在其他過程中使用并在目前工業(yè)標準中被認為是廢品的用過的外皮)獲得。
通常，根據本文所述技術測量的AloeEx的免疫剌激活性為5 y g/mL。這意味著濃度約5 ii g/mL的AloeEx，使THP-1單核細胞中NF- k B指導的熒光素酶表達增加至通過使用濃度10 y g/mL的ELPS實現的表達的50%以上的水平。當然，在這種活性水平內可以發(fā)生批間變化。本文所用的術語Aloeride(與下面討論的商標八乙0￡1110￡@相區(qū)分)指從庫拉索蘆薈分離的或合成產生的免疫剌激性多糖組合物，其中多糖的表觀分子量大于約200萬道爾頓，并包括'072專利中報道的葡萄糖、半乳糖、甘露糖和阿拉伯糖。特別地，Aloeride多糖組合物可以包括約25 % 約70 %的葡萄糖、約0. 5 %至35 %的鼠李糖、約5 % 約30%的半乳糖、約3% 約25%的甘露糖和約0% 約15%的阿拉伯糖(按摩爾百分比)。在'072專利中，Aloeride多糖也稱作NP18298。為本發(fā)明目的，Aloeride和NP 18298指同一組合物。本文所用的術語MagnAloe AG指具有http:〃www. f irstaloevera. com/magnAloeinformation, htm中記載的分子量分布的衍生于蘆薈的多糖的粉末狀混合物。為本文所述IAvD或非IAvD的目的，涉及包含高分子量衍生于蘆薈的多糖材料的任何混合物。
產生'072專利的初步發(fā)現表明，以前已知的蘆薈組分不能解釋在粗蘆薈汁液和凝膠中的可檢測水平的免疫剌激。市售蘆薈制劑(200 g/mL)在巨噬細胞檢測中僅造成微不足道的NF-k B活化。解釋這種活性的Aloeride "NP18298"被發(fā)現包括含有多糖的部分，其中存在的多糖的表觀分子量超過200萬道爾頓。其中報道的它的主要糖基組分包括葡萄糖、半乳糖、甘露糖和阿拉伯糖。根據'072專利中使用和報道的純化程度和方法，據認為Aloeride不包括實質水平的ALP和/或ALPS。在研究含有Aloeride的材料的大規(guī)模生產的其他來源和方法時，后來發(fā)現，其他部分，可以包括'072專利中描述的部分的部分以及包括ALP和ALPS的其他材料，具有所希望的免疫剌激活性。使用所述起始材料，'072專利中描述的方法提供了相對純的含多糖部分，其沒有足夠的ALP和ALPS以提供顯著的另外的免疫剌激活性。不希望受到任何特定的操作理論的約束，據認為，ALP和ALPS具有獨立的免疫剌激性能，可以與多糖一起使用，或者代替多糖，用來在關節(jié)和肌肉疼痛等的治療和皮膚彈性增強中提供多種益處。測試結果表明，包括Aloeride多糖、ALP和ALPS的AloeEx全體地對AloeEx的巨噬細胞活化性能(免疫剌激性能)負責。 IAvD可以包括PLL、 AloeEx、 ALP和ALPS的混合物、多糖和Aloeride多糖(基本上沒有ALP和ALPS) 。 IAvD還可以包括其他材料，包括市售多糖制劑，所述制劑具有免疫剌激性的衍生的組成并已被證明導致THP-1細胞中NF- k B指導的熒光素酶表達的一定程度的活化，以致符合本文對于IAvD所述的標準。由于需要IAvD的穩(wěn)定化制劑和組合物，因此這些制劑可以包括與IAvD材料組合的第二衍生于蘆薈的非IAvD材料。第二衍生于蘆薈的非IAvD材料包括較低免疫剌激活性的材料和至少50%的通常分子量為1， 500， 000道爾頓以下的多糖。如果IAvD與第二衍生于蘆薈的材料混合，無論是第二 IAvD或非IAvD，當然，單個碳水化合物的百分比以及總體分子量可以改變。此外，混合物的整體活性可能會改變。例如，AloeEx和MagnAloe AG20% : 80%的混合物對于多糖通常具有較低的總體分子量，具有比AloeEx低的整體活性，并具有作為最普遍的碳水化合物的甘露糖。
這些第二非IAvD的衍生于蘆薈的材料的非限制性實例包括選自以下的那些MagnAloe AG、庫拉索蘆薈凝膠1 X (天然的磨粹片、微粉化的片或者脫色的)、庫拉索蘆薈凝膠10X (天然的或脫色的)、庫拉索蘆薈凝膠200X (脫水的粉末或噴霧干燥的粉末)、庫拉索蘆薈全葉噴霧干燥的粉末100X、庫拉索蘆薈全葉脫色的液體(1X、2X、4X或10X)乙?；事毒厶?、庫拉索蘆薈粘多糖(AVMP)和蜜露寶(Manapol)。相對于第二衍生于蘆薈的材料和第一 IAvD的總量，存在于制劑中的第二衍生于蘆薈的材料的量通常是至少約10% 約90%重量比。第二衍生于蘆薈的材料溶解、懸浮、乳化和/或分散第一 IAvD的能力越大，以及第二衍生于蘆薈的材料的活性越大，其需要量就越小。在一個優(yōu)選的實施方案中，第二衍生于蘆薈的材料是MagnAloe AG，并且MagnAloeAG的量大于AloeEx的量，在一個特別優(yōu)選的實施方案中，以MagnAloe AG比AloeEx 4 : 1重量比提供它們。在由這兩種物質形成的所得均質混合物中，MagnAloe AG為其約80X。如本文所述和定義的，MagnAloe AG不被認為有資格作為本文定義的IAvD。
其他IAvD和非IAvD包括市售多糖制劑，如庫拉索蘆薈粘多糖(AVMP)和蜜露寶，其可從Carrington Laboratories Inc. (Irving, TX)得到，具有免疫剌激性的衍生的組成并已被證明在200 g/mL下導致THP-1細胞中NF- k B指導的熒光素酶表達的活化。特別地，AVMP和蜜露寶被認為是非IAvD，其具有的所報道的活化處于相對于lOii g/mLELPS的NF-kB最大活化的2-4^范國。上述組合物中的任一種均可以在本發(fā)明中單獨使用或組合使用。
皮膚治療本發(fā)明的一個方面是在有此需要的受試者中改善皮膚的外觀、肌理、硬度和/或彈性或者治療皮膚彈性下降的方法。有此需要的受試者是需要增強或改善皮膚彈性的任何哺乳動物，特別是人。通過給予有此需要的受試者有效量的IAvD組合物足以獲得受試者皮膚彈性改善的時段來實現。就皮膚彈性而言，根據本發(fā)明的改善或治療都不需要超過主觀基礎上的某種可辨別的、可測量的改善。除非另有說明，這可以是例如基于視覺和觸覺觀察的主觀基礎的任何受試者的改善。然而，通?；诮y(tǒng)計顯著性改善測量改善。根據ANOVA測定，當該方法與臨床研究中待測試的受試者限定組使用時，通過本文所述的任一種測試來測量測試。例如，彈性測量儀參數Ur/Ue描述了皮膚彈性，因為它涉及拉伸和收縮。第一組受試者中的70%在彈性測量儀參數Ur/Ue中表現出改善。相對于基線，參數Ur/Ue的顯著增加相當于攝取本發(fā)明補充劑的受試者在第12周29%的改善。實現統(tǒng)計顯著性所需的改善的量由若干因素控制，包括但不限于受試者的數量、測試長度、用于測量彈性改善的技術、受試者的狀態(tài)、劑型種類、使用的日劑量等。此外，本發(fā)明不要求使用每一種測試方法都達到統(tǒng)計顯著性，只要在至少一種彈性測試中取得即可。本發(fā)明的IAvD組合物可以通過任何正常途徑給予。然而，口服和局部途徑(包括透皮途徑)是優(yōu)選的。當然，給予途徑可以控制用于實現給予的劑型設計中的許多。
—次劑量中IAvD組合物的量受到是否局部施用或攝入和為了什么目的使用它的影響。然而，一般來說，不論選擇何種劑型，用于治療皮膚彈性的根據本發(fā)明使用的IAvD組合物的量為每天約0. 0025mg 約lg。這是指IAvD的量，而不是指衍生于戸薈的材料的總量。可能無法區(qū)分IAvD制劑的單個組分。足以實現這些目的是，IAvD在與其他材料混合之前具備這些性能。例如，IAvD和衍生于戸薈的非IAvD可以存在，或者IAvD可以存在。
改善皮膚彈性的IAvD制劑可以作為單劑量或作為分次劑量在一天給予，給予的劑量次數為每天1至約6次，更優(yōu)選每天1至4次，最優(yōu)選每天1至2次。這是基于表現出活性的IAvD，所述活性的特征在于，濃度約5 ii g/mL下測試時( 一般在AloeEx中發(fā)現)，將THP-1細胞中NF- k B指導的熒光素酶表達增大至如本文所記載的由濃度約10 ii g/mL的ELPS實現的約50%水平。應注意，單核細胞/巨噬細胞活化的水平隨批次有變化，因而可能需要或多或少的PLL來提供同等水平的活性。此外，與PLL相比，其他IAvD可能或多或少具有免疫剌激性?？赡苄枰欢康拿恳环N提供與PLL可比擬的活性的這些IAvD。
因此，根據本發(fā)明的每種劑型中的IAvD組合物的量可以為約0. 0005毫克約1克，其隨日劑量、劑量次數以及給予途徑變化。最優(yōu)選地，對于通過口服改善的皮膚彈性和/或加速的皮膚細胞更新，IAvD組合物的量為每天約0. 2毫克(mg)至約5克(g)，更優(yōu)選約5mg至約lg，最優(yōu)選約10mg至約500mg。當局部提供時，該量為約0. 0005mg至約2. 5mg，更優(yōu)選約0. 0025mg至約0. 25mg，再更優(yōu)選約0. 0025mg至約0. 025mg。這些量基于使用約5微克/毫升(y g/mL)活性的AloeEx。產生類似結果的其他IAvD的量也在本發(fā)明的范圍中。在根據本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，IAvD組合物的每日給予持續(xù)至少7天，更優(yōu)選至少2周，更優(yōu)選至少2月。最優(yōu)選地，本發(fā)明的材料在受試者的整個生命內持續(xù)給予以改善和保持皮膚彈性。然而，治療給予的量可能最終降低到實現維持一定所需水平的皮膚彈性或加速的皮膚細胞更新。因此，在治療一段時間之后，一旦皮膚彈性有所改善，可以給予較低劑量以進行維護。當局部施用時，劑量可以在受折磨區(qū)域直接展開。在某些情況下可以將其擦到皮
膚中。在其他情況下，它不被操作，而是允許被吸收或留在施用的應用區(qū)域上。IAvD也可以
應用于閉塞繃帶(occlusivebandage)或一些其他類型的含有它的包裹上。可選擇地，IAvD可以配制成貼片。這些局部應用可被設計成將IAvD輸送到皮膚
表面或皮膚本身的某個或某些層。可選擇地，也可以將其配制成將IAvD透皮輸送，從而更
深入的局部或全身分布。本文討論了可用于配制口服和局部劑型的更多材料類型。當口服給予時，IAvD組合物可以片劑、膠囊、粉末、香粉、錠劑、口香糖或任何其他
可攝取形式提供。IAvD也可以作為在攝取之前首先在液體中溶解或與其混合的液體或固體
提供。劑型可以是可吞咽的，或可以在口中是固體并且在攝取之前在口中崩解。IAvD甚至
可以灑在食物上，并與其一起攝取。應注意，"加速的細胞再生"是其自身權利的終點，并且使用IAvD組合物增強加速的細胞再生的方法和使其完成的產品也在本發(fā)明中。加速的細胞再生是，在希望脫落的死亡的皮膚層下，皮膚細胞的再生。使用針對皮膚彈性所述的相同技術和產品可實現這一點。
關節(jié)/肌肉疼痛本發(fā)明的另一個方面是通過使用根據本發(fā)明的IAvD組合物，在有需要的受試者中改善或治療關節(jié)和/或肌肉疼痛。一般來說，前面根據皮膚彈性所討論的給予途徑和劑型同樣適用于這些方法。局部應用可以影響特定的肌肉或肌肉群和/或特定的關節(jié)。系統(tǒng)性給予(口服或透皮)可以減少同一位置的疼痛和/或可以對許多肌肉群和/或關節(jié)提供更廣泛的減輕。同樣如之前針對皮膚彈性所提到的，根據本發(fā)明這一方面的治療是指關節(jié)疼痛和
/或肌肉疼痛降低，其可以針對不同受試者在主觀上測量。然而，更優(yōu)選地，根據本發(fā)明的成
功產品當長時間給予至治療的受試者組時，可以統(tǒng)計顯著性方式提供充分的治療。希望的
是，至少75%的受試者在治療12周后，將表現出更低頻率的肌肉和/或關節(jié)疼痛、疼痛強度
降低或疼痛持續(xù)時間縮短。這可以是全身或特定的肌肉或關節(jié)中的疼痛。關節(jié)疼痛和/或肌肉疼痛中受試者狀態(tài)的改善經常通過主觀評分系統(tǒng)確定，由每
一個人對治療之前、期間和/或之后他或她的特定部位或全身的疼痛評分。同樣如以前所指出的那樣，根據本發(fā)明這一方面給予的IAvD組合物的量隨給予
途徑、待治療區(qū)域、疼痛的程度和類型等變化。然而，該量一般與之前關于改善皮膚彈性的
方法在同一范圍。在該方法和改善皮膚彈性的方法中，也可能同時或在同一天內，或者以一
些替代或補充的時間表，既口服又局部給予IAvD組合物，從而提供一般和更具體靶向的減
輕或改善。
根據本發(fā)明可以使用任何IAvD組合物。例如，可以使用表現出本文所述的免疫剌激性能的任何PLL、任何AloeEx或任何Aloeride多糖制劑。本發(fā)明包括使用任選地與可接受的藥物載體或賦形劑組合的IAvD的藥物組合物和方法。
組合物適用于本發(fā)明的藥物組合物包括含有有效量的活性成分以實現其預期目的的組合物。更具體地說，治療有效量指，有效地防止正接受治療的受試者的現有癥狀發(fā)展或使其減輕的量。有效量的確定在本領域技術人員的能力范圍內，特別是參照本文提供的詳細公開內容。組合物的給予量取決于正接受治療的狀態(tài)、正接受治療的受試者、受試者體重、痛苦的嚴重程度、給予方式和個人的醫(yī)生或個人的判斷。如上所述，合適的給予途徑例如可以包括口服、透粘膜、局部或透皮。本發(fā)明的藥物組合物可以本身已知的方式制造，例如，通過常規(guī)混合、溶解、?；?br> 包糖衣、粉化、研粉、乳化、包囊、包封或凍干過程。因此，根據本發(fā)明使用的藥物組合物可以常規(guī)方式使用一種或多種包括賦形劑和助劑的生理可接受的載體配制，所述賦形劑和助劑促進組合物和化合物加工成可作為藥物使用的制劑。適宜的制劑取決于選擇的給予途徑。對于口服給予，組合物可以單獨給予，或者通過將活性組合物與本領域公知的藥學上可接受的載體組合而容易地配制。這種載體能夠使本發(fā)明的組合物配制作為片劑、丸劑、糖衣丸、膠囊、液體、凝膠劑、糖漿、漿液、混懸液等，用于將要接受治療的患者的口部攝取。口服和/或局部使用的藥物制劑可以按下述步驟獲得使用固體賦形劑，任選地研磨或碾碎制劑和/或所得混合物的單個組分，如果需要，在加入合適的助劑后，加工顆粒組分和/或混合物，從而獲得例如乳霜、洗劑、血清、粉末、泡騰制劑、片劑或糖衣丸核心 (dragee cores)。然而，?；瘍H是可以使用的許多已知技術中的一種。適合的賦形劑特別是填料，如糖類，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纖維素制劑，例如，玉米淀粉、小麥淀粉、大米淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可以加入崩解劑，如PVP、羥基乙酸淀粉鈉、交聯的聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或海藻酸或其鹽(如海藻酸鈉)。糖衣丸核心具有適當的包衣。為此，可以使用濃縮的糖溶液，其可以任選地含有阿拉伯樹膠、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝膠、聚乙二醇和/或二氧化鈦、漆用溶液以及適當的有機溶劑或溶劑混合物。染料或顏料可以加到片劑或糖衣丸包衣中，以識別或表征活性組合物劑量的不同組合。可以口服使用的藥物制劑包括由明膠制成的推入配合(push-fit)膠囊以及由明膠和增塑劑(如甘油或山梨醇)制成的密封軟膠囊。推入配合膠囊可以含有活性成分，所述活性成分與填料(如乳糖)、粘結劑(如淀粉)和/或潤滑劑(如滑石粉或硬脂酸鎂)以及任選的穩(wěn)定劑混合。在軟膠囊中，活性組合物可以溶解或懸浮于合適的液體中，如脂肪油、液體石蠟或液態(tài)聚乙二醇。此外，可以加入穩(wěn)定劑。所有口服給予的制劑均應是適于這種給予的劑量。
對于口腔給予，組合物可以采用以常規(guī)方式配制的片劑或錠劑的形式。
對于局部給予，還可以制備乳液、微乳液或其他局部乳霜、洗劑、洗面奶、洗滌劑、藥膏、血清或凝膠。AloeEx可能直接乳化，例如制備AloeEx水包油乳液，其中疏水核心或油相主要由AloeEx構成。可以加入其他表面活性劑或藥典賦形劑以物理地穩(wěn)定乳液。
適于局部給予的藥物制劑特別是含有約0. 05% 約5%重量比的IAvD組合物的乳霜、藥膏和凝膠以及糊劑、泡沫、酊劑和溶液。優(yōu)選地，制劑是約0. 5%重量比的IAvD組合物。這些組合物包括衍生于蘆薈的材料的總量，其根據需要包括至少一種IAvD和任何其他基于蘆薈的材料。在臨床研究所討論的制劑中，例如，O. 5% IAvD組合物由AloeEx和 MagnAloe AG的1 : 4混合物構成。乳霜或洗劑可以是通常含有超過50%水的水包油乳液。用作油基的，特別是脂肪醇，特別是含有12 18個碳原子的那些，例如月桂醇、十六烷醇或硬脂醇，脂肪酸，特別是含有10 18個碳原子的那些，例如棕櫚酸或硬脂酸，液體蠟到固體蠟，例如肉豆蔻酸異丙酯、羊毛蠟或蜂蠟，和/或烴類，特別是液體、半固體或固體物質或其混合物，例如凡士林油 (礦脂)或石蠟油。合適的乳化劑是主要具有親水性能的表面活性物質，如相應的非離子型乳化劑，例如多元醇的脂肪酸酯或其環(huán)氧乙烷加成物，特別是具有(聚)乙二醇、(聚)丙二醇或山梨醇的相應的脂肪酸酯，脂肪酸部分尤其含有10 18個碳原子，尤其是甘油的脂肪酸偏酯或聚羥基乙烯山梨聚糖的脂肪酸偏酯，如聚甘油脂肪酸酯或聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯(吐溫)，以及聚氧乙烯脂肪醇醚或脂肪酸酯，脂肪醇部分尤其含有12 18個碳原子，脂肪酸部分尤其含有10 18個碳原子，特別是具有約2 23個乙二醇或環(huán)氧乙烷單元的那些，如聚羥基乙烯十六烷基硬脂基醚(例如Cetomacrogol)、聚羥基乙烯_(4)_月桂基醚和聚羥基乙烯甘油脂肪酸酯(例如Tagat S)，或者相應的離子型乳化劑，如脂肪醇硫酸鹽的堿金屬鹽，特別是脂肪醇部分具有12 18個碳原子，如十二烷基硫酸鈉、十六烷基硫酸鈉或十八烷基硫酸鈉，它們通常在脂肪醇(例如十六烷醇或硬脂醇)存在下使用。
水性相的添加劑是防止乳霜干燥的試劑，例如保濕劑，如多元醇，如甘油、山梨醇、丙二醇和/或聚乙二醇，以及防腐劑、香料等。藥膏或洗劑可以是油包水乳液，其通常含有高達70%但優(yōu)選約20% 約50 %的水或水性相。烴類特別適合作為脂肪相，例如凡士林油、石蠟油和/或硬質石蠟，為了提高水結合能力，優(yōu)選含有合適的羥基化合物，如脂肪醇或其酯，例如，十六烷基醇或羊毛蠟醇，或羊毛蠟。乳化劑是相應的親脂性物質，如山梨聚糖脂肪酸酯(Spans)，例如山梨聚糖油酸酯和/或山梨聚糖異硬脂酸酯。水性相的添加劑是保濕劑，如多元醇，例如甘油、丙二醇、山梨醇和/或聚乙二醇，以及防腐劑、香料等。微乳液是基于以下四種組分的同向性體系水、乳化劑(例如，上述類型的，如表面活性劑，例如emulgin)、脂質(如非極性油，例如，石蠟油)和含有親脂性基團的醇(例如 2-辛基十二烷醇)。如果需要，其他添加劑可以加到微乳液中。脂肪藥膏是無水的，并尤其是含有烴類作基質，例如石蠟、凡士林油和/或液體石蠟，以及天然或部分合成的脂肪，如甘油的脂肪酸酯，例如椰子脂肪酸甘油三酯，或優(yōu)選硬化的油，例如氫化的落花生油或蓖麻油，以及甘油的脂肪酸偏酯，例如甘油單硬脂酸酯和甘油二硬脂酸酯，以及例如提高水吸收能力的脂肪醇、針對藥膏所述的乳化劑和/或添加劑。
關于凝膠，在水性凝膠、無水凝膠和具有低含水量的凝膠之間作出區(qū)分，凝膠由可溶脹的成凝膠材料構成。尤其可以使用基于無機或有機大分子的透明的水凝膠。具有凝膠形成性能的高分子量無機組分主要是含水的硅酸鹽，如硅酸鋁，例如膨潤土，硅酸鎂鋁，例如Veegum或膠體硅酸，例如氧相二氧化硅。用作高分子量有機物質的有例如天然、半合成或合成的大分子。天然和半合成的聚合物例如衍生自含有很多種碳水化合物組分的多糖，如纖維素、淀粉、黃蓍膠、阿拉伯樹膠和瓊脂以及明膠、海藻酸和其鹽(例如，海藻酸鈉)及其衍生物，如低級烷基纖維素，例如甲基或乙基纖維素、羧基或羥基低級烷基纖維素，例如，羧甲基或羥乙基纖維素。合成的凝膠形成大分子的組分例如是適當取代的不飽和的脂肪族化合物，如乙烯醇、乙烯吡咯烷、丙烯酸或甲基丙烯酸。這種聚合物的實例是聚乙烯醇衍生物，如polyviol，聚乙烯吡咯烷，如三甲基吡啶，聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯，特別是其具有約80， 000至約100萬的分子量，或其鹽，如Rohagit S、 Eudispert或卡波姆。常用的添加劑，如防腐劑、穩(wěn)定劑或香料，可以加到凝膠中。例如從壓力容器給予泡沫，其是氣溶膠形式的液態(tài)水包油乳液；未取代的或鹵代烴類，如烷烴，例如丙烷或丁烷，或氟氯低級烷烴，例如二氯二氟甲烷和二氯四氟乙烷，被用作推進劑。作為油相，可以使用烴類，如石蠟油，脂肪醇，如十六烷醇，脂肪酸酯，如肉豆寇酸異丙酯和/或其他蠟，等等。作為乳化劑，可以使用具有主要是親水性能的乳化劑的混合物，如聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯，和具有主要是親脂性能的乳化劑，如山梨聚糖脂肪酸酯，等等。也可以加入常用的添加劑，如防腐劑等。酊劑和溶液一般具有乙醇基質，水可以加入其中，還可以加入多元醇，例如甘油、乙二醇和/或聚乙二醇，作為降低蒸發(fā)的保濕劑，和脂肪恢復(fat-restoring)物質，如低分子量聚乙二醇的脂肪酸酯，即在水性混合物中可溶解的親脂性物質，作為通過乙醇從皮膚去除的脂肪物質的替代，并且在必要時，可以加入其他輔劑及添加劑，等等。通過適當的裝置，還可以噴霧形式使用適合的酊劑或溶液。可局部給予的藥物制劑的生產以本身已知的方式進行，例如通過在基質中或者在必要時在其部分中，溶解或懸浮活性成分。當活性成分以溶液形式給予時，一般在乳化之前，將其溶解在兩相中的一相中；當活性成分以懸浮液形式給予時，在乳化后將其與一部分基質混合，然后加到制劑的其余部分中。 —種IAvD組合物或多種IAvD組合物的組合可以作為局部藥物應用，起到局部作用，如增強的皮膚彈性和/或加速的皮膚細胞生長或再生。這是一種施用于皮膚并在施用部位直接起作用的治療。它必須放置在病理部位，通過皮膚直接吸收，并發(fā)揮作用。據認為，對于這種作用的發(fā)生不需要全身吸收。 IAvD組合物或IAvD組合物的組合可以作為局部藥物應用，起到全身作用。這是一種施用于皮膚并在遠離施用部位的部位起作用的治療，用于降低肌肉或關節(jié)疼痛，增強皮膚彈性或二者兼有。這種藥物可以在身體的任何部位施用并實現其作用。這種制劑必須通過皮膚吸收，進入血流，在血液中達到有效水平，然后前往其作用部位以發(fā)揮其作用。
本領域技術人員已知的是，皮膚滲透增強劑可以用于促進IAvD的一種或多種組合物的全身性輸送或者甚至更深的肌肉或關節(jié)滲透。在這一方面，滲透增強劑已經被用來增加皮膚表面對藥物的滲透性，并常常是接受質子的溶劑，如二甲基亞砜(DMS0)和二甲基乙酰胺。已經研究和報告的其他有效滲透增強劑包括2-吡咯烷、N， N- 二乙基間甲苯甲酰胺(Deet) 、1-十二烷基-氮雜環(huán)庚烷_2-酮、N， N_ 二甲基甲酰胺、N_甲基-2-吡咯烷，巰基乙酸鈣、己醇、脂肪酸和酯、吡咯烷酮衍生物、l，3-二氧雜環(huán)己烷和1，3-二氧戊環(huán)的衍生物、1-N-十二烷基-2-吡咯烷酮-5-羧酸、2-戊基-2-氧代吡咯烷乙酸、2-十二烷基-2-氧代-1-吡咯烷乙酸U-氮雜環(huán)庚烷_2-酮-2-十二烷基乙酸和氨基醇衍生物，包括1，3- 二氧雜環(huán)己烷的衍生物，等等。 IAvD組合物或IAvD組合物的組合可以包含在用于治療任何反應性狀態(tài)的劑型中，如關節(jié)疼痛、肌肉疼痛、皮膚彈性損失或皮膚皺紋。藥物組合物還可以包含適合的固體或凝膠相載體或賦形劑。這些載體或賦形劑的實例包括但不限于碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖、淀粉、纖維素衍生物、明膠以及諸如聚乙二醇的聚合物。提供穩(wěn)定的組合物，用于治療、預防或減輕任何狀態(tài)、疾病、痛苦和傷口等，包括但不限于關節(jié)或肌肉疼痛的一種或多種癥狀，以及用于增強皮膚彈性。本文提供的組合物是免疫剌激性庫拉索蘆薈提取物或其衍生物的穩(wěn)定制劑，其處于藥理適合的流體中，在長期儲存過程中是穩(wěn)定的。該組合物可以適合直接給予到有此需要的受試者或者可以是濃縮形式。藥理適合的流體包括但不限于極性流體，包括質子流體。在某些實施方案中，該組合物是水性溶液。在其他實施方案中，該組合物是非水性的或者是乳液。 IAvD組合物可以用藥理適合的流體或溶劑配制。藥理適合的流體包括但不限于極性溶劑，包括但不限于含有羥基或其他極性基團的化合物。這類溶劑包括但不限于水或醇類，如乙醇、異丙醇和二醇類(包括丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇醚、甘油和聚氧乙烯醇)。極性溶劑也包括質子溶劑，包括但不限于水、含有一種或多種藥學上可接受的鹽的鹽水溶液、醇類、二醇類或其混合物。對于作為溶劑或作為其組分的鹽水溶液，特別適合的鹽是在給予后沒有顯示出或僅顯示出微不足道的藥理活性的那些。本文提供的組合物還可以包括賦形劑和添加劑。用于長期儲存的組合物中使用的特定賦形劑或添加劑可以使用本領域技術人員公知的方法憑經驗確定。賦形劑和添加劑是任何藥理適合的且治療有用的物質，但不是活性物質。賦形劑和添加劑一般沒有藥理活性，或至少沒有不希望的藥理活性。賦形劑和添加劑包括但不限于表面活性劑、穩(wěn)定劑、絡合劑、抗氧化劑、延長最終藥物制劑使用期限的防腐劑、香料、維生素或本領域中已知的其他添加劑。絡合劑包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)或其鹽(如二鈉鹽)、檸檬酸、次氮基三乙酸和其鹽。在一個實施方案中，絡合劑是EDTA。防腐劑包括但不限于防止溶液被致病粒子污染的那些，包括苯扎氯銨或苯甲酸或苯甲酸鹽(如苯甲酸鈉)?？寡趸瘎┌ǖ幌抻?維生素、維生素原、抗壞血酸、維生素E或其鹽或其酯。本文提供的組合物還可以包括助溶劑，所述助溶劑增大添加劑或活性成分的溶解
度。用于本文所提供的長期儲存的組合物中的特定助溶劑可以使用本領域技術人員公知的
方法憑經驗確定。本文所用的助溶劑包括但不限于羥基化的溶劑或其他極性溶劑，如醇類，
如異丙醇，二醇類，如丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇醚、甘油和聚氧乙烯醇。在其他實施方案中，組合物還含有緩沖劑，包括但不限于檸檬酸/磷酸鹽、醋
酸鹽、巴比妥、硼酸鹽、Britton-Robinson、卡可基酸鹽、檸檬酸鹽、三甲基吡啶、甲酸鹽、馬來酸鹽、Mcllvaine、磷酸鹽、Prideaux-Ward、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽-磷酸鹽-硼酸鹽 (Teorell-Stanhagen)、醋酸巴比妥、MES(2-(N-嗎啉代)乙磺酸)、BIS-TRIS(雙(2-羥基乙基)亞氨基-三-(羥基甲基)甲烷)、八0八(^(2-乙酰氨基)-2-亞氨基二乙酸)、 ACES(N-(氨基甲?；谆?-2-氨基乙磺酸)、PIPES(哌嗪-N， N'-雙(2-乙磺酸))、 M0PS0(3-(N-嗎啉代)-2-羥基丙磺酸)、BISTRISPR0PANE(l，3-雙(三(羥基甲基)甲基氨基)丙烷)、BES(N，N-雙(2-羥基乙基)-2-氨基乙磺酸)、M0PS(3-(N-嗎啉代)丙磺酸)、 TES(N-三(羥基甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)、HEPES(N-(2-羥基乙基)哌嗪-N' -(2_乙磺酸)、DIPS0(3-(N，N-雙(2-羥基乙基)氨基)-2-羥基丙磺酸)、M0BS(4-(N-嗎啉代)-丁磺酸)、TAPS0(3-(N-三(羥基甲基)甲基氨基)-2-羥基丙磺酸)、TRIZMA.RTM.(三(羥基甲基氨基甲烷)、HEPPS0(N-(2-羥基乙基)哌嗪-N' -(2-羥基丙磺酸)、P0PS0(哌嗪-N， N' _雙(2-羥基丙磺酸))、TEA(三乙醇胺)、EPPS(N-(2-羥基乙基)哌嗪-N' -(3_丙磺酸)、TRICINE(N-三(羥基甲基)甲基甘氨酸)、GLY-GLY(雙甘氨肽)、BICINE(N， N-雙 (2-羥基乙基)甘氨酸)、HEPBS(N-(2-羥基乙基)哌嗪-N' - (4-丁磺酸))、TAPS (N-三 (羥基甲基)甲基_3-氨基丙磺酸)、AMPD (2-氨基-2-甲基-1， 3-丙二醇)和/或本領域技術人員已知的任何其他緩沖劑。對于本文提供的給定組合物的特定緩沖劑和緩沖劑濃度，可以使用本領域技術人員公知的標準穩(wěn)定性測定法根據經驗確定。如有需要，組合物可以置于可以含有一種以上含有活性成分的單位劑型的包裝或分配裝置中。該包裝可以包括例如金屬或塑料箔，如泡罩包裝。包裝或分配裝置可以伴隨著給予說明書。也可以制備在可兼容藥物載體中配制的含有本發(fā)明組合物的組合物，將其放置在適當的容器內，并打上治療所指狀態(tài)的標簽。在標簽上標明的適宜狀態(tài)可以包括對狀態(tài)的治療。制劑還可以含有任選的成分，包括例如草藥、維生素、礦物質、促進劑、著色劑、甜味劑、調味劑和惰性成分等。這種任選的成分可以是天然存在的或濃縮的形式。選擇這些成分中的一種或幾種是配制、設計、消費者喜好和最終用戶的問題。根據本發(fā)明的另一個方面，已經發(fā)現可被用來允許制備IAvD的均質分散液、乳液、懸浮液和溶液等的多種材料。特別是，已經發(fā)現，某些高度活性的但一般不溶解的IAvD 可以通過使用第二衍生于蘆薈的材料而分散、懸浮、乳化和/或增溶。第二衍生于蘆薈的材料可以是第二 IAvD或沒有足夠活性來有資格作為IAvD的材料。第二衍生于蘆薈的材料的量應該是，足以允許根據需要制備第一 IAvD的均質分散液、溶液、均質懸浮液或均質乳液的量。一般地，相對于第一 IAvD和第二衍生于蘆薈的材料的總重量的重量百分比，需要按重量百分比計至少約10%的第二衍生于蘆薈的材料。在根據本發(fā)明的特別優(yōu)選實施方案中，第一 IAvD是AloeEx。可以使用能夠改善第一 IAvD的可加工性的任何衍生于蘆薈的材料。第二衍生于蘆薈的材料通常由多糖構成，其中至少50%的多糖的分子量為1，500，000道爾頓以下。第二衍生于蘆薈的材料可以包括但不限于選自以下的蘆薈基材料MagnAloe AG、庫拉索蘆薈凝膠1 X (天然的磨粹片、微粉化的片或者脫色的)、庫拉索蘆薈凝膠10X (天然的或脫色的)、庫拉索蘆薈凝膠 200 X (脫水的粉末或噴霧干燥的粉末)、庫拉索蘆薈全葉噴霧干燥的粉末100X 、庫拉索蘆薈全葉脫色的液體(1X、2X、4X或10X)、乙?；事毒厶恰炖魈J薈粘多糖(AVMP)和蜜露寶。MagnAloe AG是可從Costa Rica， S. A.的First Aloe得到的粉末。可以從www. firstAloevera. com/magnAloe_information. htm獲得信息。MagnAloe AG的多糖水平超過 800千道爾頓(KDa)，如下所示。比市售的噴霧干燥的200-1庫拉索蘆薈粉末平均高40% 。據報道，MagnAloeAG含有42. 65mg/g的分子量(麗)為50_200KDa的多糖、118. 5mg/g的麗為 200-800KDa的多糖、366. 2mg/g的麗800-1400KDa的多糖、155. 8mg/g的麗1400-2000KDa 的多糖，總多糖為683. lmg/g。 MagnAloe的水溶解性通常為約15%。庫拉索蘆薈凝膠1 X (天然的磨粹片、微粉化的片或者脫色的)、庫拉索蘆薈凝膠 10X (天然的或脫色的)、庫拉索蘆薈凝膠200X (脫水的粉末或噴霧干燥的粉末)、庫拉索蘆薈全葉噴霧干燥的粉末100X、庫拉索蘆薈全葉脫色的液體(1X、2X、4X或10X)均可以從Improve USA， Inc. ， 215Dalton Drive, Suite D，DeSoto，TX 75115得到。庫拉索戸薈凝膠200 X的水溶解性通常為約90-100 % 。乙酰化甘露聚糖、庫拉索蘆薈粘多糖(AVMP)和蜜露寶可以從Carrington Laboratories, Irving， TX得到。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，IAvD中一種最常用的碳水化合物是葡萄糖，第二衍生于蘆薈的材料中一種最常用的碳水化合物是甘露糖。
在一個實施方案中，按第一 IAvD和第二衍生于蘆薈的材料的總量計，第一 IAvD的量為約10X 約90X重量比，按第一IAvD和第二衍生于蘆薈的材料的量計，第二材料的量為約90% 約10%。在一個優(yōu)選的實施方案中，第二材料的量大于第一 IAvD的量，在特別優(yōu)選的實施方案中，以第二材料第一IAvD 4 : l重量比提供它們。在由這兩者形成的所得均質混合物中，第二材料為其約80 % 。在另一個優(yōu)選方面中，第一 IAvD是AloeEx，第二材料是含有多糖的衍生于蘆薈的材料，其中至少50%的多糖的分子量為約1， 500， 000 道爾頓以下，如MagnAloe A G，并且按AloeEx和MagnAloe的量計，AloeEx的量為約10% 約90X重量比，按AloeEx和MagnAloe AG的量計，MagnAloe AG的量為約90X 約10%。在一個優(yōu)選的實施方案中，MagnAloe AG的量大于AloeEx的量，在特別優(yōu)選的實施方案中，以MagnAloe AG :AloeEx 4 : 1重量比提供它們。在由這兩者形成的所得均質混合物中， MagnAloe AG為其約80% 。在一個實施方案中，AloeEx和第二材料，優(yōu)選第二衍生于蘆薈的材料可以通過混合原料AloeEx與已加熱到約8(TC的水來配制。該混合物攪拌至少10分鐘，以均質化材料。然后過濾該混合物，優(yōu)選使用孔徑不大于15微米的過濾器。由此產生的濾液可以用于配制本文所述的多種IAvD組合物。取決于使用的設備，AloeEx的均質化可能需要或不需要加熱。例如均質器可以用作過程的一部分，以得到均一的微粒懸浮液。公知的"彩色"均質器可以用于減小AloeEx粒徑，以配制水性AloeEx懸浮液和/或乳液。 AloeEx的表征顯示在圖1中。這種材料形成棕色至綠色的片狀粉末。參照圖l，該圖示出一個批次的AloeEx材料(批號56)以及按總碳水化合物摩爾
百分比計的相關的糖含量。圖1不出由The University of Georgia, Complex CarbohydrateResearch Center進行的糖基組合物分析結果，其借助經酸性甲醇解從樣品制備的單糖甲基糖苷的 per-0-三甲基甲硅烷基(TMS)衍生物的聯用氣相色譜/質譜(GC/MS)。
甲基糖苷首先通過在1M HC1的甲醇中在8(TC下進行甲醇解(18-22小時)，然后在甲醇中用吡啶和乙酸酐再N-乙?；?用于檢測氨基糖)，從而從本發(fā)明人提供的干樣品制備。然后，樣品在80。C下用Tri-Sil (Pierce)處理(0. 5小時)而進行per-O-三甲基甲硅烷基化。[根據之前Merkle和Poppe (1994)Methods Enzymol. 230 :1-15 ;York等人 (1985)Methods Enzymol. 118 :3-40中的記載進行這些過程。]經加入Tri Sil立即注意到顯著程度的沉淀。使用All Tech EC-1熔融二氧化硅毛細管柱(30mX0. 25mm ID)，在連接到5970MSD的HP 5890GC上，進行TMS甲基糖苷的GC/MS分析。通過與標準相比的保留時間鑒定單糖，它們的碳水化合物特征由其質譜證實。為了解釋質譜數據，碎片離子73是所有TMS甲基糖苷的特征基礎碎片，204和217具有中性糖的特征，173具有氨基糖的特征。碎片217也具有糖醛酸的特征，碎片離子298具有唾液酸的特征。圖1鑒定了糖基殘基組成，按摩爾百分比計。各值表示為總碳水化合物的摩爾百分比?？偘俜直忍妓衔镉嬎銥?.6%。測得的成分值為葡萄糖61. 1%，阿拉伯糖9.5%，半乳糖9. 2%，半乳糖醛酸7. 9%，甘露糖6. 6%，木糖1. 6%，核糖1. 5%，鼠李糖1. 4%和海藻糖1. 1%。臨床研究-皮膚彈性_局部制劑下面描述的臨床研究證實了一種以商標ALOERIDE⑧出售的IAvD組合物的效
果。ALOERIDE⑧可以局部給予，以改善皮膚彈性，也可以用作一種營養(yǎng)補充劑的成分。
在臨床研究中由Fairfield, NJ的Consumer Product Testing, Inc.測定
ALOERIDE⑧凝膠0. 5%產品ftl0849LL，批#11939對皮膚彈性或硬度的影響。測試制劑 (八乙0￡11106@凝膠0. 5% )含有按重量4 : 1的MagnAloe AG和AloeEx的混合物，并與水、醇(10% )和少量卡波姆(0. 5% )混合，然后使用均質器分散。AloeEx、水、醇和少量卡波姆的分散液用于構成測試凝膠懸浮液。測試產品以小容器供應，以致當施用到確定的面部區(qū)時足以持續(xù)8周(醇作為防腐劑)。臨床試驗是AloeEx功能的雙重測試卡波姆傾向于是干燥的，負面測試性能因子估計為(_)15%。臨床試驗證明了 AloeEx/MagnAloe AG的以下能力1)在4周和8周時，統(tǒng)計學多數的測試對象中細線和皺紋減少；2)AloeEx克服與卡波姆相關的任何負面干燥的能力。該臨床試驗中使用的AloeEx是非分散性/不溶性的，并難于均質化。然而，當以 1 : 4與MagnAloe AG混合時，得到均質凝膠/乳液。 31名合格的男性和女性受試者，年齡從40至65歲，被選作研究。測試材料表明4 周和8周評估間隔時，皮膚反彈時間均顯著減少。研究參與者在研究結束時，皮膚彈性或硬度達到72%的改善(圖2)，100%的研究參與者經歷了皮膚彈性的普遍改善?；谀挲g和性別的研究人口統(tǒng)計學顯示在圖3中。受試者在測試第一天以清潔的面部在實驗室報道，用于基礎測量。在進行任何讀數或評分之前，受試者在以下環(huán)境條件下，在環(huán)境受控的房間中平衡15分鐘溫度在 21°C +/_2°C ;相對濕度在40% +/-2%。使用Shanahan. R. W.等人，Parameters for Assessing the Efficacy ofSkin Care Products (護膚品功效評價參數).Drug&Cosmetic Industry, 140， No. 1， 42-48， 1987公開的掐捏測試(pinch test)，測量皮膚彈性(硬度)。通過專家測試者在拇指和食指之間抓住眼睛的側眼眶下區(qū)域的皮膚，來獲得皮膚彈性或硬度評分。釋放由此產生的褶皺，觀察從釋放直到沒有進一步移動的皮膚所有可見運動的時間，并測量到最接近的百分之一秒。將評分記錄在數據記錄表上，對測量進行統(tǒng)計分析。如果在基線測量和隨后的4周和8周治療后評分間隔之間的平均得分統(tǒng)計顯著性 (使用非獨立t-檢驗的P小于或等于0. 05)下降，那么皮膚彈性改善被認為得到證實。
圖2示出按秒計的平均皮膚反彈時間的統(tǒng)計顯著性下降(皮膚彈性或硬度增大的指標)。左和右測量的所有基線測量的平均值分別為2.09秒和1.96秒。在第4周測試間隔觀察到顯著下降，分別產生1. 60秒和1. 53秒。在第8周測試間隔時測量到對于左和右，平均皮膚反彈時間進一步下降到1. 19秒和1. 18秒。如前所述，結果是有統(tǒng)計顯著性的，因為對于所有測量間隔，計算的P小于或等于零(圖2)。下面描述的另一項臨床研究證實了口服給予的另一種IAvD組合物改善肌肉和/ 或關節(jié)疼痛和皮膚彈性的效果。臨床研究-皮膚彈性_關節(jié)/肌肉疼痛_ 口服制劑由Clinical Research Laboratories, Inc.進行研究，評估被設計用于改善皮膚彈性和硬度以及減少肌肉和關節(jié)疼痛的本發(fā)明的口服補充劑在12周內的功效。(雙盲安慰劑對照試驗研究，以評估被設計用于減少衰老的口服補充劑的安全性和功效，研究號 CRL34706，通過引用其整體并入本文)。在臨床研究中使用的安慰劑片劑含有微晶纖維素、交聯羧甲基纖維素鈉、硬脂酸、二氧化硅和硬脂酸鎂。活性片劑含有與安慰劑片劑相同的無活性成分以及50mg MagnAloe AG和AloeEx的4 : 1的混合物。這些片劑每天給予兩次，口服，起床和就寢時間各一次。該研究在2006年8月30號啟動，并于2006年12月15日完成。最初，對每個受
試者進行如下的安全篩選。安全評價血液分析在指定的研究訪問時，從每個受試者抽取血液，進行以下的血液測試
全血球計數(CBC)并分類，以及血小板計數。化學板(Chemistry Panel) +HDL AST (GOT) 、 ALT (GPT) 、 y Gt、 LDH (LD)、總蛋白 (TP)、尿酸(UA)、總膽紅素、脲氮(UN)、總膽固醇(HDL、LDL、TG)、Na、K、Ca、Cl。
尿液分析在指定的研究訪問時，從每個受試者獲得尿液樣品，進行以下的尿液化驗
葡萄糖，蛋白，尿膽素原，血液，pH
坐姿生命體征在篩選訪問時，記錄對坐姿生命體征的評價(即，脈搏，血壓和呼吸)。
妊娠檢查在篩選訪問時，對所有小組成員進行尿液妊娠檢查(除了絕經后婦女)。
皮膚評價為了確定治療對皮膚的影響，CRL技術人員對每個受試者的面部進行皮膚評價，檢查存在的紅斑、水腫和干燥。利用以下評分表記錄皮膚剌激證據的程度和/或嚴重度
紅斑、水腫和干燥的評分表
0 =無，1 =輕度，2 =中度，3 =嚴重
功效評價
彈性測量儀通過可變真空泵產生吸力，光學測量皮膚滲入探針的深度，精度至0. Olmm。探針連
接到計算機，它控制真空應用并作為時間的函數繪制皮膚變形。從得到的曲線，可以外推許
多變量，包括即時、延遲、最終延伸和即時回縮(Eisner 1990)。這些變量估計皮膚的彈性、粘彈性和純粘性行為(Barel等人1995)。測量以下的參數在10秒時測量最終延伸Uf 。在0. 1秒時測量即時延伸Ue。延遲延伸，Uv。即時回縮，Ur。變形參數是依賴于皮膚厚度的外部參數。為了繞開皮膚厚度的測量，使用以下的比例來評估皮膚的彈性性質(Ei sner 1990， Cua等人1990， Krushe和Wonet 1995和Dobrev 1995): Ur/Ue是皮膚的生物彈性。其測量皮膚在變形后恢復到其初始結構的能力。值為 l表示100%的彈性。 Uv/Ue是延遲和即時變形之間的比例，即它是粘彈性與彈性的比例。該比值的增大
表明，變形的粘彈性部分增加和/或彈性部分相對減少。
Ur/Uf是皮膚凈彈性的量度。本研究包括預篩選訪問，在此期間，由臨床研究技術員檢查受試者，以確定資格。符合條件的受試者在面部的眼角皺紋區(qū)域表現出輕度至中度的細線和皺紋，并經歷慢性肌肉和/或關節(jié)疼痛。此時，受試者被告知在預定的篩選訪問之前，晚上9點后不要吃或喝，以預備血液和尿液分析。在研究啟動之前，受試者抵達進行預定篩選訪問的CRL實驗室。從各個受試者抽取血液，將血液采集用的前臂記錄在病例報告表上。從每個小組成員獲得尿液樣品，進行尿液分析，對坐姿生命體征(即，脈搏、血壓和呼吸)進行評價和記錄，對所有小組成員進行尿液妊娠檢查(除了絕經前受試者)。在余下的調節(jié)期和在研究持續(xù)期，受試者停用所有的口服補充劑，除了在研究持續(xù)期間為每個受試者提供的口服補充劑。為在基線標準化研究人群的皮膚狀態(tài)并使由于使用不同護膚療程的變化最小，進行為期一周的調節(jié)期后開始研究。受試者需要接受為期一周的調節(jié)期，在此期間，甘油肥皂被用于在研究開始之前所有的面部清洗。在篩選訪問時，每個受試者被提供了詳細的研究說明，一塊甘油肥皂以用于所有面部清洗，Cetaphi產每日面部潤膚露SPF15以每天使用一
次，以及日記以記錄肥皂的使用和核查遵守。受試者開始用肥皂每天兩次清洗面部(早上和晚上)，在基線訪問7天之前開始。在該篩選訪問中，每個受試者完成篩選問巻。
根據前面提到的篩選訪問安全評價，合格的受試者具有正常的血液和尿液化驗結果，每個小組成員的生命體征在正常范圍內。此外，同意后續(xù)訪問和研究要求并符合所有入選/排除標準的合格受試者將被列為研究對象。回到基線訪問的CRL測試設施，受試者在評價之前適應實驗室環(huán)境條件30分鐘。在適應期后，由經過訓練的CRL技術員對每個受試者的面部進行皮膚評價，判斷是否存在紅斑、水腫和干燥。對于每個受試者，經由計算機生成的隨機碼確定，選擇臉部的右側或左側進行測量(圖4)。測量指定在整個研究中保持一致。從臉部同一側的眼睛下方的顴骨區(qū) 捕獲彈性測量儀讀數。所有的測量都得到適當的記錄。每個受試者完成了基線消費者感知調查問巻，以評價肌肉和關節(jié)疼痛的類型和頻率。將指定的測試材料隨機分配給每個受試者，以致第一組的小組成員收到活性片劑，第二組收到安慰劑片劑。根據計算機生成的隨機碼確定受試者組指定。治療指定/組分配在整個研究中保持一致(圖5-圖6)。每個受試者被供給指定的測試材料，詳細的研究指示和新的日記，其中以記錄補充劑使用的每天次數、每天應用的Cetaphil⑧每日面部潤膚露SPF15和任何有關補充劑使用的意見。打印的研究指示詳細列出了每次訪問的研究程序以及回訪Clinical Research Laboratories, Inc.的預約日期和次數。受試者被指示繼續(xù)使用提供的甘油肥皂，每日2
次，以及使用Cetaphil⑧每日面部潤膚露SPF15，每天1次。每個受試者通過電話與CRL技術員聯系，第4周進行依從檢查。攝入指定口服補充劑8周，之后，受試者向CRL測試設施報道，并且每個小組成員適應環(huán)境溫度和濕度30分鐘的時段。適應后，由經過訓練的CRL技術員對每個受試者的面部進行皮膚評價。采集彈性測量儀讀數。按先前對基線研究間隔的解釋，進行這些程序和評價，并進行記錄。
受試者在12周的補充劑使用后，向Clinical Research Laboratories, Inc.報道，每個受試者適應環(huán)境溫度和濕度30分鐘的時段。血液抽取自各個受試者，血液采集用的前臂被記錄在病例報告表上。從每個小組成員獲得最終尿液樣品。由經過訓練的CRL技術員對面部進行皮膚評價，確定紅斑、水腫和干燥是否存在。從臉部同一側的眼睛下方的顴骨區(qū)捕獲彈性測量儀讀數。所有的測量都得到適當的記錄。在第12周，所有受試者都完成了最終調查問巻，返回未用的測試材料部分和日記。統(tǒng)計方法對于這項研究產生顯著結果的主要功效參數是彈性測量儀測量和消費者感知問巻調查。單向AN0VA測試(重復測量)被應用于每個小組，以確定對于所有參數是否在基線和第8周之間以及在基線和第12周之間有差異。如果整體F檢驗是顯著性的，那么進一步應用圖基(Tukey)多重比較測試，以確定是否存在顯著性差異。ANOVA測試使用F-檢驗，以確定是否在治療方法或時間間隔之間存在顯著性差異。當F-檢驗拒絕零假設時，通常需要進行因素水平作用性質的全面分析。圖基測試是一種多重比較程序。該方法同時檢查或比較多于一對的方法或比例，但將整體顯著性水平控制到與一對比較所明確的相同。
第一組(分配給本發(fā)明測試材料補充劑的受試者)和第二組(分配給安慰劑測試材料補充劑的受試者)之間的比較基于在每個時間間隔(第8周和第12周)從基線的百分比變化。應用雙樣品t-檢驗，以確定是否在第一組和第二組之間存在顯著性差異(圖 8A-圖8D)。 0.05以下的雙尾p-值是顯著性的標準，相應于置信水平為95X。所有的統(tǒng)計計算使用Microsoft Excel或SAS⑧統(tǒng)計分析軟件。
結果 20名受試者完成了研究。一名受試者(#7)出于與測試材料無關的理由停止了研究參與。不良事件在2006年11月20日，受試者恥(分配給安慰劑產品)報告說，在2006年11月 17日，在約9周的安慰劑片劑攝入后，她發(fā)現在她面部兩側的臉頰區(qū)域和她的前胸上部出現紅色皮疹和麻疹樣腫塊。這個受試者還報告說，她的這些區(qū)域癢。在2006年11月20日，經CRL認證的皮膚科醫(yī)生檢查，這個受試者被診斷出接觸過毒藤。受試者恥繼續(xù)參與研究。調查人員確定，這種中度嚴重的不良事件絕對與測試材料的使用無關。CRL技術人員進行了后續(xù)電話拜訪，并將每次通話信息記錄如下在2006年11月22日，受試者報告說，麻疹已消失，面部發(fā)紅正在減弱。在2006年11月27日，受試者恥表示，皮疹在干燥，并且?guī)缀跛邪l(fā)紅都消失。在 2006年12月8日，受試者報告說，中毒消失，不良的面部皮膚狀態(tài)已完全解決。
儀器測量、皮膚評價和調查問巻答復對于兩組受試者，圖7A-圖7D總結了在每一指定研究間隔時每個小組成員的彈性測量儀測量。表VI列出了為比較第8周和第12周測量與基線之間的差異而確定的統(tǒng)計變量。對于每個受試者，表VII列出了紅斑、水腫和干燥存在的基線、第8周和第12周皮膚評價的分數。表VIII列出了篩選調查問巻的調查問巻數據[兩個受試者組相結合]，基于百分比。表IX和表X列出了對于第一組(分配給活性片劑的受試者)和第二組(分配給安慰劑片劑的受試者)的基線和第12周(最終)食入者感知調查問巻的調查問巻數據，基于百分比。開放式的問題也包括在這些調查問巻表格中。
結i侖對于每個受試者，研究程序包括血液和尿液分析、坐姿生命體征、妊娠檢查(除了絕經前的小組成員)、彈性測量儀測量結果和食入者感知調查問巻。
血液分析對于每個受試者，如上所述，在基線和第12周研究間隔進行血液分析。相對于基線所揭示的，在第12周沒有確定臨床顯著發(fā)現。
尿液分析如上所述，尿液樣品在基線和第12周研究間隔從每個受試者獲得。相對于基線所揭示的，在第12周沒有確定臨床顯著發(fā)現。
功效評價根據彈性測量儀參數Ur/Ue的分析，對于第一組受試者(分配給原料成分測試材料補充劑，10853LLA)，在基線和第12周之間存在統(tǒng)計顯著性差異。彈性測量儀參數Ur/Ue 描述了皮膚彈性，因為它涉及到拉伸和收縮。70X的第一組受試者的彈性測量儀參數Ur/Ue 改善。相對于基線，參數Ur/Ue的這種顯著增加相當于在第12周時29X的改善，這表明攝入 10853LLA本發(fā)明補充劑的第一組受試者的皮膚彈性和擴張性改善。圖7A-圖8D總結了研究結果的統(tǒng)計分析。圖7D示出從基線到第12周的Ur/Ue統(tǒng)計顯著性改善(P = 0. 0109)。
通過Z-分值分析的調查問巻答復包括在第12周(最終)調查問巻中的問題序號 10 15。在每個受試者完成的調查問巻中，如下所列的、適用于Z分值分析的、在第12周(最終訪問)的研究人群的有利的食入者感知調查問巻答復被測量為具有統(tǒng)計顯著性(Z分值大于或等于絕對值1. 96)。顯著比例的分配給10853LLA活性片劑的第一組研究人群在補充劑使用12周后，感知到改善，并且受試者對于下列治療功效給出了有利的答復約85%的受試者同意，使用產品12周后，他們經歷的肌肉和/或關節(jié)疼痛的頻率更低。約85%的受試者同意，使用產品12周后，總體疼痛的強度更低。約90%的受試者同意，使用產品12周后，疼痛不再持續(xù)那么長。約85%的受試者同意，該產品對關節(jié)和/或肌肉疼痛產生了積極作用。詳細的統(tǒng)
計結果顯示在圖SA-圖8B中。對于分配給10853LLB安慰劑片劑的第二組研究人群，補充劑使用12周后，沒有有利的答復報告。結果顯示在圖9A-圖9B中。
研究的參考文獻 Basel, Courage and Clarys， Handbook of Non-InvasiVe Methods andthe
Skin(非侵入性方法與皮膚手冊)，Serup andjemec， eds. 1995. Blichman and Serup， Acta Derm Venereol， 1988. Cua，Maibach and Wilhelm，Dermatologica Research, 1990. Dobrev，Sixth Congress of Dermatology and Venerology，Pleve，Bulgaria,May
11-13，1995. Eisner, Eighth International Symposium 〃 B ioengineering and theskin，〃 Stresa/ltalia， June 1990. Frankowski， Chen and Huth， Photonics West Annual Symposium, Electronics Imaging 2000， San 了ose，了a麗ry 23_28，2000.Fiorentini， Becheroni， Iorio. Int. J. Cosmet. Sci. 26-29. 1988. Friedman,Skover，Payonk and Geronemus，Seminars in CutaneousMedicine and Surger，200，21(4) :266-273. Krushe and Worre， Archives of Dermatologica Research. 287-293，1995.
Morganti，Randazzo and Cardillo. Appl. Cosmet. 10-12，1986.
Randeau， Kurdian， Sirvent， Closs and Girard， Cosmetics andToiletries Manufacture Worldwide 2002. Simon，Arzliche Kosmetologie，256-259，1984. 上面提到的所有參考文獻都通過引用明確地并入本申請中。單核細胞活化分析用方法單核細胞活化分析用于評價免疫剌激活性。用上述包含兩拷貝HIV/IgK的NF- k B 基序的熒光素酶報告基因構建體，轉染THP-l人單核細胞細胞系。該單核細胞活化分析是體外檢測系統(tǒng)的實例，其可以用于庫拉索蘆薈提取物和產品材料的生物活性基標準化。
Toll樣受體2 (TLR2)表達載體實驗的方法在37°〇、5% C02下，在用胎牛血清(10%)和1 %青霉素_鏈霉素補充的DMEM/F 12培養(yǎng)基中培養(yǎng)HEK 293細胞。使用電穿孔(150V和一個70毫秒脈沖)用適當的質粒瞬時轉染積極生長的細胞。在電穿孔后，將細胞以每培養(yǎng)基孔200iU的5乂104細胞的密度接種。48小時后，將待測試的試劑加到轉染的細胞中。加入樣品6小時后，收獲細胞并進行熒光素酶活性測量。NF- k B質粒構建體(pBIIXLUC)包含兩拷貝的HIV/IgK的NF- k B基序。共表達人CD14和人TLR2的質粒(pDU0-hCD14/TLR2)購自InvivoGen。酵母聚糖購自 Sigma，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)肽聚糖購自Fluka，超純明尼蘇達沙門氏菌(Salmonella mi皿esota) LPS購自List Biological Laboratories, Inc.。
AloeEx通過TLR2依賴性過程在體外活化NF_ k B。圖10A-圖10B描繪AloeEx (批號2_5_05)通過TLR2作用。用含有NF_ k B的兩個結合位點的熒光素酶報告基因構建體單獨(圖10A)或與pDU0-hCD14/TLR2表達質粒結合(圖10B)瞬時轉染HEK 293細胞(最小TLR表達的細胞系)。pDU0-hCD14/TLR2表達質粒表達支持TLR2-(CD14和TLR2)依賴性NF-k B活化的蛋白。轉染48小時后，用指定濃度 (yg/ml)的AloeEx TLR2激動劑肽聚糖(PG)或酵母聚糖(Z)或TLR4激動劑超純明尼蘇達沙門氏菌脂多糖(LPS)處理細胞。在加入試劑的6小時后測定熒光素酶活性。
TLR2特異性(肽聚糖或酵母聚糖)或TLR4特異性(超純LPS)配體或者AloeEx，在單獨用報告基因質粒轉染的HEK 293細胞中都不活化NF-KB-依賴性熒光素酶表達(圖 10A) 。 AloeEx在支持TLR2-依賴性(表達CD12和TLR2)活化的細胞中活化NF-k B(圖 10B)。肽聚糖和酵母聚糖也在表達TLR2和CD14的細胞中活化NF- k B，而超純LPS不活化 NF_k B。 ALPS和ALP在AloeEx中的存在本發(fā)明者已經證實，AloeEx含有最可能源于與庫拉索蘆薈相關的微生物的細菌 LPS和細菌脂蛋白。在AloeEx中存在的這些細菌組分被認為有助于從AloeEx衍生的產品的治療性能。在7(TC下用90^水性苯酚水(1 : 1)提取AloeEx。經冷卻提取物并隨后離心，形成兩層(水和苯酚)和不溶性材料沉淀。水層包含ALPS。由于脂蛋白上的非極性脂質部分，苯酚層含有ALP。使用此過程，AloeEx(批號056)分離進水層部分、苯酚層部分和不溶性材料中。水層部分被凍干(8.9%產率)。通過加入2體積的醚丙酮(1 : 5)和4體積的乙酸乙酯，使苯酚層中的材料沉淀。用乙酸乙酯和異丙醇充分洗滌苯酚層沉淀，然后在 6(TC下干燥(45%產率)。對原始AloeEx材料、水層部分、苯酚層部分和不溶性材料都進行單核細胞分析(圖11)。用NF- k B熒光素酶報告基因質粒轉染24小時后，用所示樣品處理細胞4小時(濃度yg/ml)。測定熒光素酶活性，并作為LPS-處理的細胞最大光輸出的百分比記錄。水層和苯酚層均表現出實質單核細胞活性，被認為分別是由于細菌ALPS和ALP 的原因。不溶性材料也是活性的，這通過在5ii g/ml下測試時，它將NF-k B活化增強35% 的能力指示。在AloeEx苯酚層部分中的ALP的表征用4%的十二烷基硫酸鈉(SDS) (26mg/ml)在10(TC下提取苯酚層部分材料30分鐘，進行三次。通過離心除去SDS不溶性材料，當在單核細胞分析中測試時，SDS不溶性材料僅占原始苯酚層部分中存在的總活性的約1_2%。在50mM TRIS(pH 7. 5)、5mM P-巰基乙醇和5mM CaCl2中，將來自白色念球菌 (Tritirachium album)的0. lmg/ml (3. 9單位/ml)蛋白酶K(Sigma)與苯酚層部分的SDS提取物在5(TC下溫育2小時。然后在9『C下加熱消化10分鐘。對照樣品，沒有蛋白酶K，在相同條件下實驗。對于SDS聚丙烯酰胺凝膠分析，提取物(蛋白酶K處理和未經處理的)與1體積的Tris-Tricine樣品緩沖液(Bio-Rad)混合，并上樣到16. 5% Tris-Tricine預制凝膠(Ready Gel，Bio-Rad)的不相鄰泳道中。上樣樣品量代表130 y g AloeEx苯酚層部分中存在的SDS可提取材料。寬分子量范圍蛋白標志物(Sigma)在凝膠中運行。將各凝膠泳道切為12等長段(0. 5cm/段)，并在95。C下用150 yl的1. 5%辛基葡糖苷、2. 5mMTRIS(pH7. 5) 、5mM CaCl2提取5分鐘。收集樣品上清液，并在單核細胞活化分析中評價活性。
圖12表明，該蛋白似乎不直接負責AloeEx苯酚層部分對單核細胞的活化，然而，該蛋白是對該活性負責的分子的一部分。這一點由在蛋白酶K處理后的活性化合物的表觀大小下降表明，其通過在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上的分離來確定。在蛋白酶K處理后，在66kDa和6. 5kDa之間區(qū)域的活性存在實質降低，而在6. 5kDa和凝膠前沿之間區(qū)域的活性增大。這一結果與使用細菌脂蛋白所得的結果相似，因為蛋白酶K消化不會降低脂蛋白的活性(即，脂蛋白的蛋白組分對于單核細胞活化是不必要的)，但是當在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離時，蛋白酶K處理的確減少了脂蛋白大小。圖12中〃 C〃和〃 PK〃標記的黑條分別代表在凝膠分離之前未經處理和蛋白酶K處理的AloeEx苯酚層部分的活性。
為確定AloeEx苯酚層部分的4% SDS提取物對脂蛋白脂肪酶的敏感性，使用SDS-out試劑(Pierce)在0. 88%辛基葡糖苷存在下除去SDS。然后將樣品調節(jié)到最終濃度10 ii M AEBSF蛋白酶抑制劑雞尾酒溶液(Sigma)和0. 2% BSA (Sigma號A-9418)。將來自假單胞菌(Pseudomonas)物種的39， 600單位/ml (lmg/ml)脂蛋白脂肪酶(Sigma號L9656)與該樣品在37t:下溫育16小時。對照樣品(沒有脂蛋白脂肪酶)在相同條件下實驗。使用單核細胞活化分析評價脂蛋白脂肪酶處理和未處理的樣品的活性。圖13所示的結果表明，AloeEx苯酚層部分的4X SDS提取物中存在的活性被用脂
蛋白脂肪酶的處理完全消除。該結果與圖12中提出的結果一起證實，AloeEx苯酚層部分
中的活性是由于ALP的原因。這個過程表明，AloeEx含有ALP，其被認為是源于與庫拉索蘆
薈相關的微生物。該細菌組分的存在(其與AloeEx中的其他組分相組合)，被認為對該產
品的治療性能起顯著貢獻。 AloeEx中的ALPS的表征以下總結了在AloeEx (批號056)和兩種源于這種材料的部分(水層部分和苯酚
層部分)中存在的ALPS的量。 AloeEx (批號056) 625_6250EU/mg AloeEx水層部分62， 500-625， OOOEU/mg AloeEx苯酚層部分< 4. 8EU/mg 使用Pyrosate LAL分析試劑盒(Associates of C即e Cod Inc)，根據生產商說明，估計ALPS的量。正如所料，與苯酚層部分相比，水層部分基本上含有AloeEx中存在的所有ALPS。這一數據證明，AloeEx含有被認為是源于與庫拉索蘆薈相關的微生物的ALPS。與AloeEx中的其他組分相組合的該細菌組分的存在被認為對該產品的治療性能起貢獻。
在庫拉索蘆薈中，外皮和粘液含有大部分單核細胞活化組分。庫拉索蘆薈葉可分為三個基本結構部分凝膠、外部外皮和粘液(在凝膠和外部外皮之間的層)。進行了一項實驗，以確定蘆薈葉的哪部分含有最高水平的單核細胞活化組分。通過使刀平行于內部外皮表面通過，從一片庫拉索蘆薈葉仔細切下凝膠。除去凝膠后，將葉子在小瓶邊緣刮擦，收集粘液部分，并將其與外部外皮分離。所有的三種組分和全葉蘆薈的一部分被冷凍干燥并研磨成細粉末。然后，用甲醇充分提取每種樣品，以除去在單核細胞活化分析中具有抑制作用的非極性物質，如蒽醌。除去非極性物質的樣品被制備成在水中的微細懸浮液。用NF-k B熒光素酶報告基因質粒轉染24小時后，使用制備的樣品處理THP-1細胞4小時。測定熒光素酶活性，并記錄為ELPS-處理的細胞的最大光輸出的百分比。圖14示出不同庫拉索蘆薈葉部分和整個葉材料的反應。這一數據表明，粘液層和外部外皮含有蘆薈葉中的大部分單核細胞活化組分。在這個實驗中，每個葉部分占蘆薈葉總干重的百分比是凝膠(8. 7% )、粘液層(6. 2% )和外皮(85. 1% )。
由于外部外皮和粘液層含有大部分單核細胞活化組分，并且這些部分也包括蘆薈葉中的大部分干固體，因此本發(fā)明人認為，外部外皮和粘液層是有市售利益的。通常，在取出凝膠后或已將整個蘆薈葉加工以產生蘆薈汁后，外部外皮被作為廢品棄去。另一種廢品是蘆薈幼體(在較大植物外生長的小的蘆薈植物)。由于蘆薈幼體主要含有外皮，凝膠極少，而且被認為幾乎沒有市售價值。外皮和蘆薈幼體的廢品可以被加工，以產生例如增強免疫功能的膳食補充劑。干的外皮可以磨成粉末，并被加工以除去蒽醌。這種材料可以進一步通過提取而加工，以產生粗提取物和純化組分。粗提取物和純化組分的目標是濃縮AloeEx 和/或與庫拉索蘆薈相關的微生物和微生物碎片/組分的量。
AloeEx中的單核細胞活化組分在洗滌劑中是可提取和可溶的
為開發(fā)各種產品(如化妝品)，可能需要增溶AloeEx材料中的免疫增強組分。免疫增強組分包括Aloeride多糖、源于與庫拉索蘆薈相關的微生物的ALP和ALPS。如前文所述，AloeEx材料的免疫增強組分的顯著部分可以被分成水層部分和苯酚層部分。苯酚層部分(ALP)中存在的免疫增強活性可以用4% SDS在10(TC下完全提取/增溶。水層(ALP和 Aloeride多糖)中存在的免疫增強活性是水溶性的，也是SDS可溶解性的。
用SDS提取AloeEx代表增溶該材料中存在的免疫增強組分的顯著部分的潛在方法。數據表明，其他已知的洗滌劑(包括與產品配制更兼容的那些)也可以潛在地用于 AloeEx材料中的免疫增強組分的提取/增溶。這種洗滌劑提取的方法也可以用來增溶源于原料如全葉、外皮、蘆薈幼體等的單核細胞活化組分(即，Aloeride多糖和與庫拉索蘆薈相關的微生物組分)。通過分離與庫拉索蘆薈相關的微生物和微生物組分/碎片來制備提取物的方法
經證實，來自與庫拉索蘆薈相關的微生物的細菌產品對AloeEx的免疫增強性能的顯著部分負責。已經表明，AloeEx占據庫拉索蘆薈體外單核細胞/巨噬細胞活化潛力的大部分。因此，據認為，來自微生物的細菌產品對庫拉索蘆薈的免疫增強性能的顯著部分負責。濃縮與庫拉索蘆薈相關的微生物和/或微生物組分/碎片的量的提取物可以從粗蘆薈材料和/或庫拉索蘆薈原料制備，包括廢料(例如剩余的外皮、蘆薈幼體等)。粗提取物可被加工，以通過用溶劑提取細菌脂蛋白和/或其他細菌組分而產生純化部分。這些部分含有更高水平的與庫拉索蘆薈相關的細菌組分?？梢杂糜谥苽浼兓糠值娜軇┌ㄏ礈?劑，如SDS、水、水可混溶劑如醇，以及這些溶劑或本領域中公知的其他溶劑的組合。
以下程序可用于制備濃縮與庫拉索蘆薈相關的微生物和/或微生物組分/碎片的提取物。庫拉索蘆薈原料(凝膠、全葉、外皮、蘆薈幼體等)可以使用本領域已知的方法液化。液體可以經過粗過濾，以去除纖維材料。食品級絮凝劑(凈水劑或類似物質)可以加到液化的蘆薈中，以產生顆粒(細菌、其他微生物、微生物碎片/組分)的聚集體。然后，這些聚集的顆粒可以使用本領域已知的方法與其余的液體分離。這些方法包括離心、過濾、沉降后傾倒、采用網從液體過濾聚集體等。最終收集的材料也可以被加工，以除去蒽醌(如果存在)，其使用諸如洗滌/用醇提取等技術。如果需要，可以干燥由此產生的材料。
制備標準化庫拉索蘆薈產品的方法生物和化學標準化代表了可用于標準化本發(fā)明所述的含有免疫增強劑的庫拉索蘆薈產品的兩種方法。這兩種方法均可用于標準化提取物材料或原料。標準化的目的是確保每一批產品材料都含有相同水平的活性成分。在一個方法中，制備含有有效量的免疫剌激活性的生物活性標準化的庫拉索蘆薈
產品。在此方法中，體外測試庫拉索蘆薈產品材料對免疫細胞的活化，然后將生物活性與標
準制品的免疫剌激性值比較，以確定該產品的標準化的活性值。體外測試系統(tǒng)的實例是前
面描述的單核細胞活化分析。當活性組分的化學含量由于不明的構效關系和/或多種活性
物質之間復雜的相互作用而與生物活性無關時，產品材料的生物活性基標準化是重要的。
在這種情況下，活性物質的量不足以反映產品材料的效力，通過使用生物分析來標準化是
所期望的。生物活性標準化已應用于生物制藥如胰島素和細胞因子的制藥業(yè)。在另一種方法中，制備含有有效量的源于與庫拉索蘆薈相關的微生物的免疫剌激
性脂蛋白的化學標準化的庫拉索蘆薈產品。可以用于標準化的化學標志物是2，3_ 二羥基
丙基半胱氨酸。這種經修飾的半胱氨酸氨基酸被認為對于得自原核生物的免疫剌激性脂蛋
白是獨特的。在此方法中，庫拉索蘆薈產品材料被測試2，3-二羥基丙基半胱氨酸的量，然
后與標準制品的2，3_ 二羥基丙基半胱氨酸的量相比，以確定該產品的標準化值。在某些實施方案中，食品級絮凝劑、凈水劑或凝結劑可用于形成微生物聚集體。實
例包括但不限于例如明礬、聚合氯化鋁、硫酸鋁、氧化鈣、氯化鐵(ni)、硫酸鐵(n)、聚丙
烯酰胺、鋁酸鈉、硅酸鈉及其組合。也可作為絮凝劑的天然產品包括殼聚糖、辣木(Moringa oleifera)種子、木瓜蛋白酶、馬錢子物種(種子)魚膠及其組合。其他的這類材料是本領域技術人員眾所周知的。雖然已經參照特定實施方案描述了本發(fā)明，但應該理解，這些實施方案只是用于說明本發(fā)明的原理和應用。因此，應該理解，在不背離所附權利要求書限定的本發(fā)明精神和范圍下，可以對示例性實施方案作出多種修改和設計其它配置。
權利要求
免疫刺激性組合物，包括以下中至少任意兩種的混合物(1)衍生于蘆薈的多糖，(2)衍生于蘆薈的脂蛋白，和(3)衍生于蘆薈的脂多糖，所述混合物表現為通過濃度約10μg/mL的細菌脂多糖實現的最大NF-κB指導的熒光素酶表達的至少約50％的免疫刺激活性，其中通過在濃度約250μg/mL以下，THP-1單核細胞中NF-κB指導的熒光素酶表達測量所述免疫刺激活性。
2. 如權利要求1所述的組合物，其中所述混合物包括衍生于蘆薈的多糖、衍生于蘆薈的脂蛋白和衍生于蘆薈的脂多糖。
3. 如權利要求1所述的組合物，其中所述混合物包括約0. 01 % 約50%的衍生于蘆薈的多糖和總量約0. 0001% 約10%的衍生于蘆薈的脂蛋白和衍生于蘆薈的脂多糖。
4. 如權利要求3所述的組合物，其中所述混合物包括約1% 約20%的衍生于蘆薈的多糖。
5. 如權利要求1所述的組合物，其中所述衍生于蘆薈的多糖的表觀分子量大于約200萬道爾頓并包括葡萄糖、半乳糖、甘露糖和阿拉伯糖。
6. 如權利要求1所述的組合物，其中所述混合物從蘆薈外皮、蘆薈粘液、蘆薈凝膠、全葉蘆薈或其組合得到。
7. 如權利要求1所述的組合物，還包括與所述混合物混合的藥物載體或賦形劑。
8. 如權利要求7所述的組合物，其中所述混合物包括約0. 01% 約50%的衍生于蘆薈的多糖和總量約0. 0001% 約10%的衍生于蘆薈的脂蛋白和衍生于蘆薈的脂多糖。
9. 免疫剌激性組合物，包括衍生于蘆薈的脂蛋白，其中所述衍生于蘆薈的脂蛋白表現為通過濃度約10 ii g/mL的細菌脂多糖實現的最大NF- k B指導的熒光素酶表達的至少約50%的免疫剌激活性，其中通過在濃度約250ii g/mL以下，THP-1單核細胞中NF-k B指導的熒光素酶表達測量所述免疫剌激活性。
10. 治療關節(jié)和/或肌肉疼痛的方法，包括給予有需要的受試者有效量的衍生于庫拉索蘆薈(Aloe vera)的材料，所述衍生于庫拉索蘆薈的材料表現為通過濃度約10 y g/mL的細菌脂多糖實現的最大NF-KB指導的熒光素酶表達的至少約50X的免疫剌激活性，其中通過在濃度約250 ii g/mL以下，THP-1單核細胞中NF- k B指導的熒光素酶表達測量所述免疫剌激活性。
11. 如權利要求io所述的方法，其中所述受試者是人類。
12. 如權利要求IO所述的方法，其中所述受試者是動物。
13. 治療關節(jié)和/或肌肉疼痛的方法，包括給予有需要的受試者治療劑量為每天約0. 2毫克(mg)至約1克(g)的至少一種衍生于庫拉索蘆薈(Aloe vera)的免疫剌激性組合物。
14. 增強皮膚的外觀、肌理、硬度和/或彈性的方法，包括給予有需要的受試者有效量的衍生于庫拉索蘆薈(Aloe vera)的材料，所述衍生于庫拉索蘆薈的材料表現為通過濃度約lOii g/mL的細菌脂多糖實現的最大NF-k B指導的熒光素酶表達的至少約50X的免疫剌激活性，其中通過在濃度約250ii g/mL以下，THP-1單核細胞中NF-k B指導的熒光素酶表達測量所述免疫剌激活性。
15. 如權利要求14所述的方法，其中所述受試者是人類。
16. 如權利要求14所述的方法，其中所述受試者是動物。
17. 增強皮膚的外觀、肌理、硬度和/或彈性的方法，包括給予有需要的個體治療劑量為每天約0. 0005毫克(mg)至約1克(g)的至少一種衍生于庫拉索蘆薈(Aloe vera)的免疫剌激性組合物。
18. 治療疾病或狀態(tài)的方法，包括給予有需要的受試者有效量的衍生于庫拉索蘆薈(Aloe vera)的材料，所述衍生于庫拉索蘆薈的材料表現為通過濃度約10 y g/mL的細菌脂多糖實現的最大NF- k B指導的熒光素酶表達的至少約50%的免疫剌激活性，其中通過在濃度約250 g/mL以下，THP-1單核細胞中NF- k B指導的熒光素酶表達測量所述免疫剌激活性，和其中所述疾病或狀態(tài)選自免疫缺陷、癌癥、細菌感染、病毒感染、真菌感染和傷口。
19. 如權利要求18所述的方法，其中所述受試者是人類。
20. 衍生于庫拉索戸薈(Aloe vera)的組合物，包括第一衍生于庫拉索蘆薈的免疫剌激性組合物；禾口第二衍生于庫拉索蘆薈的材料，選自第二衍生于庫拉索蘆薈的免疫剌激性組合物和衍生于庫拉索蘆薈的非免疫剌激性材料；禾口其中所述第二衍生于庫拉索蘆薈的材料的量等于或大于所述第一衍生于庫拉索蘆薈的免疫剌激性組合物的量，和其中所述組合物是基本上均質的溶液、懸浮液、分散液或乳液。
21. 如權利要求20所述的組合物，其中所述第二衍生于庫拉索蘆薈的材料選自MagnAloe AG、庫拉索戸薈凝膠1 X 、庫拉索戸薈凝膠10X 、庫拉索戸薈凝膠200X 、庫拉索蘆薈全葉噴霧干燥的粉末100X，庫拉索蘆薈全葉脫色的液體、乙?；事毒厶恰炖魈J荼粘多糖(mucilaginous polysaccharide)禾口蜜露寶(Manapol)。
22. 制備用于治療疼痛或增強皮膚的外觀、肌理、硬度和/或彈性的衍生于庫拉索蘆薈(Aloe vera)的組合物的方法，包括a) 組合第一衍生于庫拉索蘆薈的免疫剌激性組合物與第二衍生于庫拉索蘆薈的材料；b) 形成所述第一衍生于庫拉索蘆薈的免疫剌激性組合物、所述第二衍生于庫拉索蘆薈的材料和溶劑的混合物；禾口c) 使所述混合物均質化，其中所述第二衍生于庫拉索蘆薈的材料的量等于或大于所述第一衍生于庫拉索蘆薈的免疫剌激性組合物的量，和所述組合物是基本上均質的溶液、懸浮液、分散液或乳液。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過向有治療需要的個體給予有效量的衍生于庫拉索蘆薈(Aloe vera)的免疫刺激性組合物，為該個體提供皮膚增強和疼痛減輕的方法。提供了口服和局部方法和組合物。還提供了衍生于庫拉索蘆薈的免疫刺激性組合物和制備所述組合物的方法。
文檔編號A61K36/886GK101720226SQ200880023047
公開日2010年6月2日申請日期2008年5月9日優(yōu)先權日2007年5月11日
發(fā)明者埃爾文·尼德曼, 埃里克斯·帕施沃斯基, 大衛(wèi)·斯坦利·帕斯科, 尼爾莫·德里克·瑟里·普格, 迪奈斯·蒂保恩申請人:蘆薈研究實驗室公司;密西西比大學

完整全部詳細技術資料下載