專利名稱：蛋白酶局部摧毀瘤實(shí)體結(jié)構(gòu)并滅殺癌細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種癌癥的治療方法。
木目轉(zhuǎn)綱i青,X， 此項(xiàng)專利申請(qǐng)要求了申請(qǐng)日為2007年7月5日，美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)枮?1/825， 246的優(yōu)先權(quán)，是要求了申請(qǐng)日為2005年10月3日，美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)枮?0/723， 499優(yōu)先權(quán)，申請(qǐng)日為2006年10月3日，美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?1/542,442的部分延續(xù)。
序列表、表格或計(jì)算機(jī)程序光盤附件的引用不適用
背景技術(shù)：
癌癥是一大類致命疾病的總稱，其特點(diǎn)是細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)失控，具有入侵和在身體其他部位建立位點(diǎn)(轉(zhuǎn)移)的能力。癌細(xì)胞還可以通過表達(dá)自我識(shí)別分子的機(jī)制來逃脫癌癥患者免疫系統(tǒng)的監(jiān)控。當(dāng)癌細(xì)胞表達(dá)免疫系統(tǒng)的識(shí)別分子的機(jī)制時(shí)，就能入侵免疫系統(tǒng)。癌借助淋巴系統(tǒng)、血液流動(dòng)和局部腫瘤的快速擴(kuò)增得以轉(zhuǎn)移。 癌癥是由細(xì)胞遺傳物質(zhì)的改變引起的遺傳性疾病，遺傳物質(zhì)的改變包括DNA序列、染色體結(jié)構(gòu)和染色體數(shù)目的改變。雖然同一遺傳變化可能發(fā)生在人體的不同部位，但是不同類型的癌癥通常由不同的遺傳變化引起。除了具有最復(fù)雜遺傳變異的黑色素瘤外，類似的癌癥可能有類似的基因變化。 一個(gè)腫瘤內(nèi)的癌細(xì)胞也不盡相同并有不穩(wěn)定的基因組。由于染色體結(jié)構(gòu)和染色體數(shù)目的改變，成百上千的基因非正常表達(dá)。并不奇怪作用于一個(gè)或數(shù)個(gè)基因產(chǎn)物或調(diào)節(jié)途徑開發(fā)的抗癌藥物極少成功。 當(dāng)腫瘤在早期發(fā)現(xiàn)并且手術(shù)刀可以介入時(shí)，手術(shù)仍是最有效和可靠的潛在治愈方法。但是，如果癌細(xì)胞已經(jīng)擴(kuò)散或轉(zhuǎn)移，或癌癥發(fā)生在手術(shù)刀無法介入的部位，由于技術(shù)的局限性，手術(shù)可能無效。 放射療法是另一種滅殺瘤的局部療法。然而，放療有很大的副作用，包括損傷與瘤毗鄰的正常組織，特別是含有快速分裂細(xì)胞的組織，如皮膚，骨髓，毛囊，以及口腔、食道和腸道黏膜。細(xì)胞遺傳物質(zhì)的損傷可能導(dǎo)致癌癥復(fù)發(fā)，誘發(fā)新的癌癥，或兩者兼而有之。當(dāng)瘤過大或癌細(xì)胞已擴(kuò)散時(shí)，放射治療將無效。 其他局部療法包括冷凍療法和紫外局部療法，與手術(shù)或放射療法相似，可適用于人體有限的部位。 當(dāng)相應(yīng)的化療藥物生理耐受劑量下無法滅殺瘤時(shí)，腫瘤內(nèi)注射化療藥物如順鉑，是一種局部提供化療藥物并滅殺腫瘤的新方法。但是，由于化療藥物通常是不能限制在局部的小分子，超過全身化療時(shí)發(fā)生的主要不利作用是不可避免的。 化療藥物的靶標(biāo)通常是癌細(xì)胞和正常細(xì)胞中的活躍分裂細(xì)胞的DNA分子。因此，在安全生理劑量下，這些化療藥物對(duì)實(shí)體瘤沒有療效，但有包括損傷活躍分裂正常細(xì)胞的副作用。其他全身性療法，包括免疫療法、激素療法和基因療法，可用于滅殺已擴(kuò)散的癌細(xì)胞。不過，正如化療，這些療法對(duì)具有不同抗原或突變的實(shí)體瘤細(xì)胞的治療效果并不理想。因此，當(dāng)轉(zhuǎn)移瘤中有少量實(shí)體瘤時(shí)，根據(jù)癌癥的類型、時(shí)期(腫瘤大小、結(jié)相關(guān)度、轉(zhuǎn)移進(jìn)展
3及病理分類)和患者的健康狀況，可綜合全身和局部療法，包括手術(shù)，放療，化療和免疫療 法，來進(jìn)行治療。 不幸的是，在許多轉(zhuǎn)移瘤中，殘留有太多的實(shí)體瘤需要用現(xiàn)有的局部療法處理。僅 在美國(guó)，平均每天超過1000個(gè)癌癥患者死亡。亟需發(fā)現(xiàn)新的副作用小的療法，以局部清除 多個(gè)實(shí)體瘤。

發(fā)明內(nèi)容
通過提供一種可以清除多個(gè)腫瘤，如果需要可以多次進(jìn)行且只有有限局部副作用 的新局部療法，這種療法至少可以部分解決上述問題。這種新療法含有蛋白酶，蛋白酶可切 斷胞外基質(zhì)蛋白，包括許多維持細(xì)胞生存的蛋白質(zhì)，導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡。蛋白酶K是其中的一 種。蛋白酶K裂解胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)C-端甘氨酸(G或Gly)、丙氨酸(A或Ala)、纈氨酸(V或 Val)、亮氨酸(L或Leu)、異亮氨酸(I或Ile)、苯丙氨酸(P或Phe)、酪氨酸(Y或Tyr)和色氨 酸(W或Try)殘基，在體內(nèi)和體外瘤內(nèi)癌細(xì)胞。Tumorase (美國(guó)申請(qǐng)商標(biāo))包含蛋白酶K和可 保護(hù)瘤周圍正常細(xì)胞免受酶解的"緩沖"蛋白質(zhì)。在安全劑量(約O. 25mg/約100mi^瘤)下， 瘤內(nèi)瘤酶(Tumorase)療法滅殺了裸鼠模型體內(nèi)的135個(gè)實(shí)體瘤，顯示了 100%有效性。滅 殺的實(shí)體瘤源自人黑色素瘤(CRL-1676或麗-266-4， 20/20， 100% )、人前列腺癌(CRL-2505 或22Rvl， 15/15， 100% )、人乳腺癌(HTB-26或MDA-MB-231， 18/18， 100% )、人乳腺導(dǎo)管瘤 (HTB-129或MDA-MB-435S， 12/12， 100% )、人支氣管肺泡瘤(CRL-5807或NCI-H358， 41/41， 100%)、人肺瘤(HTB-177或NCI-H460， 15/15， 100% )和人結(jié)腸腺瘤(CCL-231或SW48， 14/14， 100% )。由于瘤內(nèi)微量給藥并具有腫瘤特異性，瘤酶療法副作用有限，可用于清除多 場(chǎng)合多地點(diǎn)的多種瘤，減輕瘤實(shí)體結(jié)構(gòu)引起的疼痛，更重要的是，針對(duì)癌轉(zhuǎn)移，單獨(dú)或結(jié)合 其他全身療法，延長(zhǎng)癌癥患者的生存期。需要人體臨床試驗(yàn)來證明瘤酶在人類癌癥治療中 的安全性和有效性。 參照示意圖、圖表、照片和詳細(xì)說明有助于更好地理解本發(fā)明的目的、優(yōu)點(diǎn)和特 性。


為了更好地理解本發(fā)明和更清楚地顯示同樣的方法是如何起效的，通過舉例，提 供與示意圖相一致的參考。 圖1是使用蛋白酶從C-端摧毀瘤實(shí)體結(jié)構(gòu)并滅殺癌細(xì)胞的示意圖。 圖2是使用蛋白酶從N-端摧毀瘤實(shí)體結(jié)構(gòu)并滅殺癌細(xì)胞的示意圖。 圖3是使用蛋白酶從N-端和C-端摧毀瘤實(shí)體結(jié)構(gòu)并滅殺癌細(xì)胞的示意圖。 圖4A，4B，5A，5B顯示的是瘤酶在體內(nèi)作用，摧毀了裸鼠109內(nèi)人黑色素實(shí)體瘤的
實(shí)體結(jié)構(gòu)并滅殺了其內(nèi)所有的癌細(xì)胞的一組照片。 圖6A，6B，7A和7B顯示的是瘤酶在體內(nèi)作用，摧毀了裸鼠135內(nèi)兩前列腺實(shí)體瘤 的實(shí)體結(jié)構(gòu)并滅殺了其內(nèi)所有的癌細(xì)胞的一組照片。 圖8A，8B，9A和9B顯示的是瘤酶在體內(nèi)作用，摧毀了裸鼠178和179內(nèi)兩乳腺實(shí) 體瘤的實(shí)體結(jié)構(gòu)并滅殺了其內(nèi)所有的癌細(xì)胞的一組照片。
具體實(shí)施例方式
癌癥被定義為任意惡性腫瘤，通常源于單個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。根據(jù)細(xì)胞類型的來源，癌癥 可分為幾類，并相應(yīng)地命名。大約90%的人類癌癥源于上皮組織(覆蓋人體外表面和各種 器官以及腺體管道內(nèi)表面的細(xì)胞層)。其余的10%是分別源于皮膚色素細(xì)胞(黑色素細(xì) 胞)、人體支持組織(骨骼，肌肉和血管)、血液、淋巴腺和神經(jīng)組織的黑色素瘤、肉瘤、白血 病、淋巴瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤。 術(shù)語"癌組織"和"瘤"指組織水平的癌。術(shù)語"癌細(xì)胞"指源自癌組織的活癌細(xì) 胞或細(xì)胞水平的瘤。術(shù)語"癌細(xì)胞遺傳物質(zhì)"或"腫瘤細(xì)胞遺傳物質(zhì)"指分子水平癌細(xì)胞的 DNA和基因組。為了更好地理解癌癥，有必要簡(jiǎn)要說明這一疾病在不同層次水平的特點(diǎn)特 征。 在組織水平，癌癥的特點(diǎn)是組織或瘤的生長(zhǎng)失控，且形狀不規(guī)則。癌組織侵襲周圍 的正常組織或器官，并通過淋巴系統(tǒng)，血液流和局部擴(kuò)張轉(zhuǎn)移。通常，在瘤及其周圍正常組 織之間有一邊界。這一邊界的特點(diǎn)是瘤細(xì)胞的胞外基質(zhì)為多種功能蛋白質(zhì)形成密集蛋白質(zhì) 網(wǎng)絡(luò)。良好組織的瘤實(shí)體結(jié)構(gòu)使得癌比周圍正常組織具全面優(yōu)勢(shì)，包括在極端不利環(huán)境下 的存活和避免機(jī)械損傷。國(guó)際通用的TNM(根據(jù)腫瘤大小，結(jié)相關(guān)度和轉(zhuǎn)移進(jìn)展程度)分期 方法廣泛應(yīng)用于臨床上，顯示癌癥發(fā)展的各個(gè)階段。這個(gè)分期方法適用于很多癌癥包括乳 腺癌、膀胱癌、前列腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌癥、直腸癌、腎癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胃癌、甲 狀腺癌和子宮癌。該分期方法覆蓋了癌癥發(fā)展的所有階段，用于描述診斷結(jié)果。例如，對(duì)乳 腺癌而言，T1期指"腫瘤最大處尺寸為2厘米或更小。與周圍特化的、短時(shí)間內(nèi)大小無變化 的正常組織不同，癌組織或腫瘤持續(xù)生長(zhǎng)并從腫瘤周圍的血管中吸收更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。當(dāng) 癌已擴(kuò)散或轉(zhuǎn)移時(shí)，患者體內(nèi)很多部位都可發(fā)現(xiàn)有腫瘤組織或瘤。 在細(xì)胞水平，瘤是由活躍分裂的、大小不等的癌細(xì)胞組成，特征在于細(xì)胞分裂、生 長(zhǎng)和擴(kuò)散并在遠(yuǎn)端形成新的腫瘤的能力失控。癌細(xì)胞在細(xì)胞分裂調(diào)控、生長(zhǎng)調(diào)控和分化程 序不按正常的細(xì)胞調(diào)節(jié)途徑進(jìn)行，而且不進(jìn)行細(xì)胞凋亡。瘤內(nèi)的癌細(xì)胞借助其高度表達(dá)的 功能胞外基質(zhì)蛋白，作為整體的實(shí)體結(jié)構(gòu)共同網(wǎng)絡(luò)作用。其中許多蛋白質(zhì)是腫瘤生長(zhǎng)和癌 細(xì)胞的生存必需的。在細(xì)胞水平，癌通過腫瘤局部擴(kuò)散和單個(gè)癌細(xì)胞脫離瘤并擴(kuò)散到淋巴 系統(tǒng)和血液流實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移?；颊叩拿庖呦到y(tǒng)視癌細(xì)胞為'自我的'，并不攻擊它們。
在分子水平，瘤在很多方面與周圍的組織或器官不同。首先，癌細(xì)胞中的遺傳物質(zhì) 發(fā)生了突變并且是異質(zhì)的。這些突變可能包括，但不限于DNA序列缺失、重復(fù)、倒置、易位， 以及染色體數(shù)目從二倍體轉(zhuǎn)變?yōu)槎啾扼w或非整數(shù)倍體。因此成千上萬基因的拷貝數(shù)、調(diào)控 和表達(dá)模式都改變了，此外，還有原癌基因表達(dá)、抑癌基因缺失或被抑制。除此以外，腫瘤中 癌細(xì)胞基因組不斷突變的特性，可以解釋為什么以一種或幾種與癌癥相關(guān)抗原為靶標(biāo)的抗 癌藥物，對(duì)實(shí)體瘤沒有療效。在腫瘤細(xì)胞中，盡管由于遺傳差異，基因表達(dá)模式、水平、途徑 和分子種類不同于正常細(xì)胞，但癌細(xì)胞自我識(shí)別分子模式的表達(dá)，包括第一類組織相容性 復(fù)合物MHC I是不會(huì)改變的，這使他們能夠逃脫患者免疫識(shí)別系統(tǒng)的監(jiān)控。此外，當(dāng)癌細(xì)胞 突變株免疫識(shí)別分子模式的表達(dá)，如第二類組織相容性復(fù)合物MHC II，他們開始滲透或入 侵淋巴系統(tǒng)以轉(zhuǎn)移。其次，腫瘤細(xì)胞的胞外基質(zhì)蛋白ECMP在腫瘤外層形成了實(shí)體結(jié)構(gòu)或屏 蔽。這種結(jié)構(gòu)對(duì)抗癌藥物，無論是在生化，還是在物理上都可能是個(gè)障礙。大多數(shù)的ECMP， 即使不是全部，都是功能蛋白并且是細(xì)胞生存所必需的。這些蛋白C-端、N-端或兩者的永
5久性損害將導(dǎo)致癌細(xì)胞和活躍分裂正常細(xì)胞的死亡。分化細(xì)胞的ECMP含有糖蛋白、脂蛋 白、甲基化蛋白和有限的特定功能蛋白，此外還有結(jié)構(gòu)蛋白和自我識(shí)別分子模式。腫瘤周圍 的正常細(xì)胞可能只有極少數(shù)與生存有關(guān)蛋白并表達(dá)可抑制糖蛋白、脂蛋白、甲基化蛋白等 ECMP的蛋白酶。這使得瘤酶可以作用于腫瘤細(xì)胞的胞外基質(zhì)蛋白，特異地滅殺腫瘤細(xì)胞而 幾乎不損傷周圍的正常細(xì)胞。 瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的功能不同。正常細(xì)胞經(jīng)歷分化過程，并根據(jù)其位置、周圍環(huán)境 及區(qū)域行使功能。分化后，正常細(xì)胞可以轉(zhuǎn)變?yōu)槌^200種不同的細(xì)胞類型，作為特異化的 細(xì)胞滿足人體各部位的不同需求。正常細(xì)胞一個(gè)特別重要的功能是當(dāng)有需要時(shí)可以進(jìn)行細(xì) 胞程序性死亡或凋亡。由于這一特殊功能，正常的非活躍分裂的細(xì)胞沒有這些致命蛋白，如 活躍分裂細(xì)胞包括癌細(xì)胞所必需的生長(zhǎng)因子受體。與正常細(xì)胞不同，癌細(xì)胞不分化，并且沒 有細(xì)胞周期、分裂和生長(zhǎng)調(diào)控，是一種高效和選擇性吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以構(gòu)建更大實(shí)體瘤的疾 病。在腫瘤周圍通常會(huì)有血管形成以滿足新癌細(xì)胞分裂和在腫瘤外表面生長(zhǎng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需 求。胞外基質(zhì)蛋白在選擇性吸收供給腫瘤生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和單個(gè)癌細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)和擴(kuò)張 的生長(zhǎng)因子受體信號(hào)起關(guān)鍵作用。致命蛋白，如生長(zhǎng)因子受體和細(xì)胞骨架蛋白等的去除或 永久性損傷，將導(dǎo)致細(xì)胞死亡或壞死。 在以前的專利申請(qǐng)(11/542-442， 2006年10月3日)中，提出了將生物刀 (bioknives)用于腫瘤細(xì)胞的減少治療。用實(shí)驗(yàn)來測(cè)試該概念時(shí)，出現(xiàn)了幾個(gè)令人驚奇的發(fā) 現(xiàn)。首先，一些蛋白酶，包括鏈霉蛋白酶和蛋白酶K，能比胰蛋白酶更迅速和徹底地將團(tuán)聚的 癌細(xì)胞分離為單個(gè)細(xì)胞；其次，這些蛋白酶能夠在體外殺死癌細(xì)胞；第三，盡管相同數(shù)量的 細(xì)胞按與胰蛋白酶分離細(xì)胞相同的程序進(jìn)行處理，蛋白酶K分離的癌細(xì)胞不能在裸鼠上形 成腫瘤。最后，單獨(dú)使用蛋白酶K不僅能摧毀瘤的實(shí)體結(jié)構(gòu)，還能滅殺游離的癌細(xì)胞。輔以 適當(dāng)?shù)呐浞?，副作用可顯著的下降。這一新產(chǎn)品被命名為已是美國(guó)商標(biāo)申請(qǐng)的Tumorase。
人類癌細(xì)胞系包括那些從人黑色素瘤(CRL-1676或麗_266_4)、前列腺癌 (CRL-2505或22Rvl)、人乳腺癌(HBT-26或MDA-MB-231)、人乳腺導(dǎo)管癌(HTB-129 或MDA-MB-435S)、人細(xì)支氣管肺泡癌(CRL-5807或NCI-H358)，人肺癌(HTB-177或 NCI-H460)和人類結(jié)腸腺癌(CCL-231或SW-48)獲得的株系均購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心 (ATCC， Manassas, Virginia)。癌細(xì)胞培養(yǎng)在添加有5%胎牛血清(FBS， ATCC， Manassas， Virginia)的RPMI-1640培養(yǎng)基(ATCC， Manassas, Virginia)，培養(yǎng)器皿是25cm2組織培養(yǎng) 瓶(Becton DickinsonLabware，F(xiàn)ranklin Lakes,New Jersey) 、75cm2組織培養(yǎng)瓶(Greiner Bio_OneGmbH， Frickenhausen， Germany)禾口 24-孑L板(Corning Incorporated, Corning, NewYork)，在5 % C02、37 °C下濕度98 %紅外二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)(Forma Scientific, Waltham， Massachusetts)培養(yǎng)。癌細(xì)胞同樣培養(yǎng)在添加有5% FBS的Leibovitz' sL_15 培養(yǎng)基中(ATCC， Manassas, Virginia) ， 37°C和98 %濕度、空氣自由交換的培養(yǎng)箱(VVVR Scientific, West Chester, Pennsylvania)內(nèi)。當(dāng)用倒置顯微鏡(PhotoZoom， Cambridge Instruments, Cambridge, Massachusetts)觀察到細(xì)胞團(tuán)聚或覆蓋組織培養(yǎng)瓶90%以上的 面積時(shí)，將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)到其內(nèi)具有無菌環(huán)境的生物安全柜(Biosafety Cabinet) (NuAir公司， Plymouth, Minnesota)。所有的步驟包括培養(yǎng)基更換，使用各種緩沖液、溶劑或蛋白酶處理 細(xì)胞都在無菌條件下進(jìn)行。 用無菌蒸餾水配制各種試劑或復(fù)原酶。20 ii L、200 y L和1000 y L的無菌槍頭并輔以移液槍(pipetmans) ，2mL、10mL、25mL和50mL的無菌移液管和真空Pipet-Aid(Brooma11， Pennsylvania)在生物安全柜內(nèi)被用于吸取各種無菌試劑。在酶作用的最佳條件下，使用胰 蛋白酶或其他蛋白酶、或幾種蛋白酶的組合來使癌細(xì)胞分離。用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的分 離程度。溶解在無MgS(^的Hanks平衡鹽溶液中的豬胰蛋白酶(0. 25% )和胰蛋白酶的替 代品Tryple Express購(gòu)白位于Carlsbad, California的Invitrogen公司。AccutaseTM、 AccumaxTM和實(shí)驗(yàn)室化學(xué)品購(gòu)自位于St. Louis，Missouri的Sigma-Aldrich公司。其他蛋白 酶包括羧肽酶B、 II級(jí)凍干彈性蛋白酶、木瓜蛋白酶、豬胃蛋白酶、人纖溶酶、鏈霉蛋白酶、 蛋白酶K、Glu-C內(nèi)切蛋白酶，Asp-N內(nèi)切蛋白酶，Lys-C內(nèi)切蛋白酶，Arg-C內(nèi)切蛋白酶，胰 凝乳蛋白酶和羧肽酶Y，購(gòu)自位于India卿olis， Indiana的RocheDiagnostics Corp.，位 于Rockford， Illinois的Pierce Biotechnology, Inc.禾口位于Piscataway， New Jersey的 GE Healthcare。 使用蛋白酶分離和滅殺的腫瘤細(xì)胞可以歸納為三類。圖1是用蛋白酶從ECMP的
c-端摧毀腫瘤實(shí)體結(jié)構(gòu)以滅殺癌細(xì)胞的示意圖。圖1的上部描繪了實(shí)體瘤中的一個(gè)癌細(xì)
胞?？梢詰?yīng)用一種或數(shù)種蛋白酶在保持細(xì)胞膜完整的同時(shí)從C-端剪切癌細(xì)胞的ECMP。圖 1的下部描述了蛋白功能失調(diào)的癌細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞外的部分致命蛋白包括生長(zhǎng)因子受體和細(xì) 胞骨架蛋白被永久性地破壞時(shí)，細(xì)胞壞死并發(fā)生凋亡。當(dāng)所有跨膜蛋白細(xì)胞外的c-端被切 除后，腫瘤的實(shí)體結(jié)構(gòu)就被摧毀，這些細(xì)胞變?yōu)閳A形。這些癌細(xì)胞不能再存活，且因?yàn)闆]有 完整的自我識(shí)別的分子模式成為"外來的"。如果ECMP的C-端如胰蛋白酶裂解中一樣被部 分地切除，癌細(xì)胞仍可以存活。保持細(xì)胞膜完整也是很重要的，這樣可以將對(duì)非癌細(xì)胞的不 利影響減少到最低程度。 圖2是用蛋白酶從ECMP的N-端摧毀瘤實(shí)體結(jié)構(gòu)以滅殺癌細(xì)胞的示意圖。圖2的 上部描繪了實(shí)體瘤中的一個(gè)癌細(xì)胞。可以應(yīng)用一種或數(shù)種蛋白酶在保持細(xì)胞膜完整的同時(shí) 從N-端剪切癌細(xì)胞的ECMP。圖2的下部描述了蛋白功能失調(diào)的癌細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞外的部分 致命蛋白包括生長(zhǎng)因子受體和細(xì)胞骨架蛋白被永久性地破壞時(shí)，細(xì)胞壞死并發(fā)生凋亡。當(dāng) 腫瘤的實(shí)體結(jié)構(gòu)被摧毀后，癌細(xì)胞成為圓形并不能再存活。這些細(xì)胞將會(huì)因?yàn)槠渥晕易R(shí)別 分子模式如MCH I被破壞而受到患者免疫系統(tǒng)的攻擊。值得注意的是，所有跨膜蛋白細(xì)胞 外的N-端都被剪切到細(xì)胞膜的表面。如果破壞如用Asp-N內(nèi)切蛋白酶酶解一樣是部分的， 癌細(xì)胞仍可以存活。保持細(xì)胞膜的完整同樣是重要的，這樣周圍正常細(xì)胞的細(xì)胞膜不會(huì)被 破壞，這樣可以以極少的副作用去除腫瘤。 圖3是用蛋白酶從ECMP的C-端和N_端摧毀瘤實(shí)體結(jié)構(gòu)并滅殺癌細(xì)胞的示意圖。 圖3的上部描繪了實(shí)體瘤的一個(gè)癌細(xì)胞，下部描述了蛋白功能不正常的癌細(xì)胞。當(dāng)ECMP被 剪切到細(xì)胞膜表面時(shí)，大部分跨膜蛋白包括許多致命蛋白被破壞，細(xì)胞接受死亡信號(hào)并無 其他可以存活的途徑。這些細(xì)胞也是免疫反應(yīng)的目標(biāo)，因?yàn)樗鼈冊(cè)僖矝]有自我識(shí)別的分子 模式。值得注意的是，所有跨膜蛋白的細(xì)胞外C-端和N-端都被剪切。大多數(shù)致命蛋白質(zhì) 被永久性破壞導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡。保持細(xì)胞膜的完整性同樣重要，這樣周圍正常細(xì)胞的細(xì)胞 膜不會(huì)被打破，這樣可以以極少的副作用去除腫瘤。 當(dāng)癌細(xì)胞系被處理以在裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)為腫瘤，用胰蛋白酶或其他蛋白酶將聚合的 細(xì)胞分離，并用胎牛血清(FBS)中和，并在含10XFBS的培養(yǎng)基中以125Xg離心8分鐘。 將細(xì)胞沉淀懸浮于磷酸緩沖液(PBS)中，再以125Xg離心8分鐘。重復(fù)這一步驟以再次清洗細(xì)胞，然后將含有少量PBS細(xì)胞的置于冰桶中。細(xì)胞總數(shù)用梯度稀釋法計(jì)算，懸浮細(xì)胞沉 淀用磷酸緩沖液稀釋為107個(gè)細(xì)胞/mL的懸浮液。制備的細(xì)胞懸浮液在用于裸鼠皮下注射 前先置于冰桶上1小時(shí)。 120只無胸腺裸鼠(3-4周大，NCR皿/皿，雌雄各60只)購(gòu)自Simonsen實(shí)驗(yàn) 室(Gilroy， California),并直接送至lj Molecular Diagnostics Services (SanDiego， California)的無菌中心。40只雄性裸鼠皮下注射人前列腺癌細(xì)胞CRL-2505或22Rvl (含 lxl()6個(gè)細(xì)胞的磷酸緩沖液或PBS 100pL/動(dòng)物)，所用的注射器針頭的大小是27號(hào)。同 樣，40只雌性裸鼠皮下注射人乳腺癌細(xì)胞HTB-26或MDA-MB-231 (含lx108個(gè)細(xì)胞的 PBS 100 ii L/動(dòng)物)，20只雄性裸鼠和20只雌性裸鼠皮下注射人肺癌細(xì)胞HTB-177或 NCI-H460 (含lxlO8個(gè)細(xì)胞的PBS100pL/動(dòng)物)。 非常奇怪的是，接種的120只裸鼠中沒有一只產(chǎn)生了腫瘤。此外，在繼代培養(yǎng)中， 3種細(xì)胞系全部死于蛋白酶K處理。盡管如此，按類似的實(shí)驗(yàn)步驟皮下注射用胰蛋白酶處 理瘤細(xì)胞系，卻能在裸鼠體內(nèi)產(chǎn)生腫瘤。60只裸鼠中的46只產(chǎn)生了源自人細(xì)支氣管肺泡 癌系(CRL-5807或NCI-H358)的腫瘤，20只中的17只產(chǎn)生了源自人肺癌系(HTB-177或 NCI-H460)的腫瘤，20只中的14只產(chǎn)生了源自人乳腺導(dǎo)管癌系(HTB-129或MDA-MB-435S) 的腫瘤和20只中的14只產(chǎn)生了源自人結(jié)腸癌系(CCL-231或SW-48)的腫瘤。
在7個(gè)試驗(yàn)性研究中，使用量為0. 05至0. 5mg蛋白/腫瘤的蛋白酶K瘤內(nèi)處理體 積約為50-100mm3的實(shí)體瘤。低濃度顯示有部分療效，最高濃度有太多的不利影響。0. 25mg 蛋白酶K可以有效地消除41個(gè)源自人細(xì)支氣管肺泡癌系(CRL-5807或NCI-H358)中的41 個(gè)(100%)、15個(gè)源自人肺癌系(HTB-177或NCI-H460)中的15個(gè)(100% ) 、5個(gè)源自乳腺導(dǎo) 管癌系(HTB-129或MDA-MB-435S)中的5個(gè)(100%)以及14個(gè)源自人結(jié)腸癌系(CCL-231 或SW-48)中的14個(gè)(100% )實(shí)體瘤。然而，不利作用包括出血明顯，以及在處理時(shí)間內(nèi)超 過90%的癌細(xì)胞并沒有被完全滅殺?；诘鞍酌窴的療效和降低其副作用的進(jìn)一步開發(fā)產(chǎn) 生了瘤酶。如以下的實(shí)驗(yàn)所示，瘤酶能以更小的不利作用更完全地去除腫瘤和滅殺癌細(xì)胞。
80只裸鼠(3-4周大，NCR nu/皿，雌雄各40)，購(gòu)自Simonsen實(shí)驗(yàn)室(Gilroy， California)，并直接送至ljAnti-cancer， Inc (San Diego， California)的無菌中心。
注射了人黑色素瘤癌細(xì)胞(CRL-1676或麗_266_4)的裸鼠中，20只雄性裸鼠中的 14只，20只雌性裸鼠中的13只產(chǎn)生了黑色素瘤。觀察到腫瘤的起始、腫瘤生長(zhǎng)速度、腫瘤 形狀和腫瘤結(jié)構(gòu)都有很大的不同。包括7只用作對(duì)照的裸鼠，每個(gè)動(dòng)物被視為擁有個(gè)人資 料包括腫瘤體積和照片的"患者"。當(dāng)首次有瘤內(nèi)施用瘤酶(100m^的腫瘤50i!L)，20個(gè)腫 瘤被100%消除。四只(20% )動(dòng)物被治愈。8只(40% )動(dòng)物經(jīng)過多次連續(xù)瘤內(nèi)瘤酶治療 被治愈。另外8只(40%)動(dòng)物，雖經(jīng)過多次治療，但腫瘤生長(zhǎng)復(fù)發(fā)了。持續(xù)的瘤內(nèi)施用瘤 酶能夠控制腫瘤癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，并幫助裸鼠"患者"生存至其正常的壽命。
圖4A，4B，5A，和5B顯示了瘤酶瘤內(nèi)治愈了裸鼠109內(nèi)源自人黑色素瘤的實(shí)體瘤。 裸鼠109是只需在瘤內(nèi)使用一次瘤酶，無需重復(fù)治療就可以完全治愈帶有腫瘤動(dòng)物的典型 例子(圖4)。圖4A顯示有一個(gè)黑色素腫瘤(CRL-1676or麗-266-4)的雄性裸鼠109在瘤內(nèi) 注射瘤酶前的照片。圖4B顯示了同一只雄性裸鼠109在瘤內(nèi)注射瘤酶(50ii L)兩小時(shí)后 的照片。值得注意的是l)腫瘤的顏色發(fā)生了改變，2)腫瘤的實(shí)體結(jié)構(gòu)消失，3)瘤酶的作 用主要局限于腫瘤而很少作用于活躍分裂的正常細(xì)胞。
圖5A顯示了同一只雄性裸鼠109經(jīng)瘤酶處理消除一個(gè)黑色素瘤35天后無復(fù)發(fā)的 照片。圖5B顯示了同一只雄性裸鼠109經(jīng)瘤酶處理消除一個(gè)黑色素瘤49天后無復(fù)發(fā)的照 片。瘢痕區(qū)被用于組織病理學(xué)評(píng)價(jià)。 對(duì)瘤酶處理位點(diǎn)的組織病理學(xué)評(píng)價(jià)表明裸鼠109的折疊區(qū)有皮下淋巴結(jié)。真皮有 稀疏的單核細(xì)胞浸潤(rùn)，并沒有明顯的組織病理病變。尸檢沒有發(fā)現(xiàn)在身體的其他部位有任 何腫瘤。 第二組瘤酶療法實(shí)驗(yàn)是消除裸鼠模型中源自人前列腺癌(CRL-2505或22Rvl)細(xì) 胞系的實(shí)體瘤。15只接受瘤內(nèi)瘤酶治療的雄性裸鼠，在第一次治療后腫瘤100%消除。3只 (20% )動(dòng)物完全治愈。6只(40% )動(dòng)物腫瘤有復(fù)發(fā)，但進(jìn)一步瘤內(nèi)注射瘤酶后得以治愈。 其余6只(40%)動(dòng)物雖經(jīng)多次的瘤內(nèi)瘤酶注射治療，但未完全治愈。雖然如此，這些動(dòng)物 腫瘤的生長(zhǎng)已在瘤酶的控制下。 雄性裸鼠135是體內(nèi)長(zhǎng)有兩個(gè)瘤并經(jīng)瘤內(nèi)瘤酶治療數(shù)次的例子。圖6A，6B，7A，和 7B顯示了瘤酶對(duì)抗裸鼠135源自人前列腺癌CRL-2505或22Rvl細(xì)胞系的實(shí)體瘤。可以觀 察到有有效性和安全性。瘤酶特異地并極小破壞腫瘤周圍的正常細(xì)胞地作用于腫瘤。當(dāng)提 供人類醫(yī)用棉吸收死亡或消除腫瘤的廢物，瘢痕可以消除。 圖6A顯示裸鼠135長(zhǎng)有兩個(gè)前列腺腫瘤(前面的113mm3，后面的98mm3)。照片前 面的腫瘤在進(jìn)行瘤酶治療之前拍攝。在后方的腫瘤和尾巴的基部之間標(biāo)記裸鼠。
圖6B是比圖6A中晚4天的同一只裸鼠135。請(qǐng)注意1)注射50 y L瘤酶4天后， 前面的腫瘤已消除，2)未經(jīng)處理的靠后的腫瘤生長(zhǎng)至254mm3，3)裸鼠長(zhǎng)了許多毛發(fā)。
圖7A是比圖6A中晚11天的同一只裸鼠135。請(qǐng)注意1)前面的腫瘤已消失11 天，2)靠后的大腫瘤，已用相同劑量的瘤酶處理了一星期，3)已開始對(duì)位于靠后腫瘤附近 的第三個(gè)腫瘤(94mm3)進(jìn)行瘤酶治療。 圖7B是比圖6A中晚14天的同一只裸鼠135。請(qǐng)注意1)前面的腫瘤已消失14 天，2)后面的腫瘤已治療了 10天，3)第三個(gè)腫瘤已用30iiL瘤酶治療3天了。
注射了癌細(xì)胞HTB-26或MDA_MB_231的20只雌性裸鼠中，有16只產(chǎn)生了人乳腺 瘤。15只長(zhǎng)有腫瘤的雌性裸鼠，在第一次瘤內(nèi)施用瘤酶后，腫瘤全都消失。15只中的6只 (40% )得到痊愈，剩余的60%，盡管經(jīng)多次治療癌的生長(zhǎng)已在瘤酶的控制下，但并未治愈。
圖8A， 8B， 9A，和9B顯示了瘤酶從瘤內(nèi)摧毀裸鼠178和179上的兩個(gè)乳腺癌腫瘤的 實(shí)體結(jié)構(gòu)并滅殺癌細(xì)胞。這種腫瘤源自人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231。經(jīng)過瘤酶治療后，這 些裸鼠體內(nèi)無腫瘤及癌細(xì)胞。圖8A顯示的是長(zhǎng)有乳腺癌腫瘤的雌性裸鼠178在瘤酶治療前 的照片。圖8B顯示的是瘤內(nèi)注射瘤酶(50iiL)22天后的同一只裸鼠。圖9A顯示的是長(zhǎng)有 乳腺癌腫瘤的雌性裸鼠179在瘤酶治療前的照片。圖9B顯示的是瘤內(nèi)注射瘤酶(50iiL)43 天后的同一只裸鼠179。 總之，瘤酶療法具有腫瘤特異性，但并非癌癥類型特異性。這可以通過瘤酶能破壞 位于細(xì)胞膜上、內(nèi)或跨膜的所有致命蛋白分子，以及多達(dá)3000種其他功能膜蛋白來解釋。
與傳統(tǒng)手術(shù)相比，瘤酶療法具有許多優(yōu)點(diǎn)(a)它可以在有效地消除實(shí)體瘤的同 時(shí)保存腫瘤周圍的正常組織或器官；(b)它可在身體有實(shí)體瘤的任何組織或器官進(jìn)行操 作，包括手術(shù)刀無法介入的部位；(c)它可用于多場(chǎng)合的多個(gè)部位；(d)手術(shù)后患者可能無 需住院；(e)患者無需經(jīng)歷與傳統(tǒng)手術(shù)一樣的大量疼痛且(f)常規(guī)手術(shù)所引起的失血、免疫功能的抑制或下游調(diào)節(jié)可能不會(huì)發(fā)生。 由于其用量極微，瘤酶療法也可與放射療法相比。并且，它有許多超過放射療法的 優(yōu)點(diǎn)(l)腫瘤周圍的正常細(xì)胞，特別是活躍分裂的細(xì)胞，如皮膚、骨髓、毛囊、口腔、食道和 腸細(xì)胞，在遺傳物質(zhì)層面不會(huì)受到損傷。(2)癌癥復(fù)發(fā)或新癌癥的發(fā)生可大大降低。(3)患 者可能沒有放射治療相關(guān)的副作用，包括疼痛和脫發(fā)。 由于其作用于細(xì)胞外致命蛋白的獨(dú)特機(jī)理，瘤酶有超過許多以DNA為靶標(biāo)的化療 藥物的優(yōu)勢(shì)。首先，瘤酶不會(huì)引起DNA突變，對(duì)癌細(xì)胞殺傷力僅限于腫瘤，由于蛋白酶K分子 的尺寸、藥效動(dòng)力學(xué)、藥物動(dòng)力學(xué)和分布，不會(huì)觸及正常分裂的細(xì)胞。這種新療法能用于消 除所有實(shí)體瘤，包括7種已在裸鼠模型中測(cè)試過的實(shí)體瘤。它也可以用于消除多種疾病包 括腎上腺皮質(zhì)癌、盲腸癌、基底細(xì)胞癌、膽管癌、膀胱癌、骨癌、惡性骨肉瘤纖維組織細(xì)胞瘤、 腦干膠質(zhì)瘤、腦腫瘤、腦惡性星形細(xì)胞膠質(zhì)瘤、子宮頸癌、兒童期癌癥、大腸癌、食道癌、尤文 氏家族腫瘤、顱外胚細(xì)胞瘤、眼癌、眼內(nèi)黑色素瘤、膽囊癌、胃癌、胃腸道基質(zhì)瘤(GIST)、生殖 細(xì)胞瘤、性腺外生殖細(xì)胞腫瘤、卵巢妊娠營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞腫瘤、頭頸部癌、肝癌、胰島細(xì)胞癌(內(nèi)分 泌胰臟)、卡波西肉瘤、腎(腎細(xì)胞)癌、腎癌、喉癌、嘴唇和口腔癌、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺 癌、骨惡性纖維組織細(xì)胞瘤/骨肉瘤、梅克爾細(xì)胞癌、間皮瘤、鼻腔和鼻竇癌、鼻咽癌、神經(jīng) 母細(xì)胞瘤、口咽癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖細(xì)胞腫瘤、卵巢低潛在惡性腫瘤、胰臟癌、鼻竇、鼻 腔癌、甲狀旁腺癌、陰莖癌、嗜鉻細(xì)胞瘤、松果體母細(xì)胞瘤，和幕骨背臂的原神經(jīng)外胚層瘤、 垂體瘤、胸膜肺母細(xì)胞瘤、妊娠乳腺癌、妊娠霍奇金淋巴瘤、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、直 腸癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤橫紋肌瘤、唾液腺腫瘤、皮膚癌(非黑色素瘤)、皮膚癌、小腸腫瘤、睪 丸癌、喉嚨癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲狀腺癌、尿道癌、子宮癌、子宮內(nèi)膜癌、陰道癌、視覺通路 與下丘腦膠質(zhì)瘤和腎胚細(xì)胞瘤中的實(shí)體瘤。
權(quán)利要求
治療腫瘤的方法包括在實(shí)體瘤內(nèi)、細(xì)胞外施用蛋白酶，蛋白酶通過剪切胞外基質(zhì)蛋白ECMP或跨膜蛋白的胞外部分EPTMP，在癌細(xì)胞壞死或凋亡前保持細(xì)胞膜完整的同時(shí)摧毀腫瘤的實(shí)體結(jié)構(gòu)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述蛋白酶在C-端剪切ECMP。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述蛋白酶在C-端剪切EPTMP。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述蛋白酶在N-端剪切ECMP。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述蛋白酶在N-端剪切EPTMP。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述蛋白酶在C-端和N-端剪切ECMP。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述蛋白酶在C-端和N-端剪切EPTMP。
8. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，所述蛋白酶選自蛋白酶K、鏈霉蛋白酶、胰蛋白酶、羧肽酶B、彈性蛋白酶、木瓜蛋白酶、纖維蛋白溶酶、Glu-C內(nèi)切蛋白酶、Asp-N內(nèi)切蛋白酶、Lys-C內(nèi)切蛋白酶、Arg-C內(nèi)切蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶Y。
9. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，腫瘤選自腎上腺皮質(zhì)癌、盲腸癌、基底細(xì)胞癌、膽管癌、膀胱癌、骨癌、惡性骨肉瘤纖維組織細(xì)胞瘤、腦干膠質(zhì)瘤、腦腫瘤、腦惡性星形細(xì)胞膠質(zhì)瘤、子宮頸癌、兒童期癌癥、大腸癌、食道癌、尤文氏家族腫瘤、顱外胚細(xì)胞瘤、眼癌、眼內(nèi)黑色素瘤、膽囊癌、胃癌、胃腸道基質(zhì)瘤(GIST)、生殖細(xì)胞瘤、性腺外生殖細(xì)胞腫瘤、卵巢妊娠營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞腫瘤、頭頸部癌、肝癌、胰島細(xì)胞癌(內(nèi)分泌胰臟)、卡波西肉瘤、腎(腎細(xì)胞)癌、腎癌、喉癌、嘴唇和口腔癌、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、骨惡性纖維組織細(xì)胞瘤/骨肉瘤、梅克爾細(xì)胞癌、間皮瘤、鼻腔和鼻竇癌、鼻咽癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、口咽癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖細(xì)胞腫瘤、卵巢低潛在惡性腫瘤、胰臟癌、鼻竇、鼻腔癌、甲狀旁腺癌、陰莖癌、嗜鉻細(xì)胞瘤、松果體母細(xì)胞瘤，和幕骨背臂的原神經(jīng)外胚層瘤、垂體瘤、胸膜肺母細(xì)胞瘤、妊娠乳腺癌、妊娠霍奇金淋巴瘤、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、直腸癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤橫紋肌瘤、唾液腺腫瘤、皮膚癌(非黑色素瘤)、皮膚癌、小腸腫瘤、睪丸癌、喉嚨癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲狀腺癌、尿道癌、子宮癌、子宮內(nèi)膜癌、陰道癌、視覺通路與下丘腦膠質(zhì)瘤、和腎胚細(xì)胞瘤。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種通過從C-端、N-端或兩端同時(shí)剪切致命的ECMP，破壞腫瘤的實(shí)體結(jié)構(gòu)以消除實(shí)體瘤并殺死癌細(xì)胞，并具有保持細(xì)胞膜完整和有限不利影響的蛋白酶療法。該微量瘤內(nèi)瘤酶療法具有腫瘤特異性但非癌癥類型特異性。如需要，瘤酶療法可應(yīng)用于多場(chǎng)合的多個(gè)腫瘤。本方法可用于消除任何實(shí)體瘤以延長(zhǎng)癌癥患者的生存周期。
文檔編號(hào)A61P35/04GK101778639SQ200880023432
公開日2010年7月14日 申請(qǐng)日期2008年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月5日
發(fā)明者錢勇 申請(qǐng)人:生物醫(yī)學(xué)治療有限公司